DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS KÓSA ESZTER IMOLA

Átírás

1 DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS KÓSA ESZTER IMOLA KESZTHELY 2009

2 PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskola Témavezetı: Dr. habil. Szabó István biológia tudomány kandidátusa Társtémavezetı: Dr. habil. Páldi Emil MTA doktora ABIOTIKUS STRESSZOROK ÉS STRESSZTOLERANCIÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZİK HATÁSAINAK VIZSGÁLATA KUKORICÁBAN (ZEA MAYS L.) Készítette: Kósa Eszter Imola Keszthely

3 ABIOTIKUS STRESSZOROK ÉS STRESSZTOLERANCIÁT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZİK HATÁSAINAK VIZSGÁLATA KUKORICÁBAN (ZEA MAYS L.) Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Kósa Eszter Imola Készült a Pannon Egyetem Állat- és Agrárkörnyezet-tudományi Doktori Iskolája keretében. Témavezetı: Dr. habil. Szabó István Elfogadásra javaslom (igen / nem). (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton... % -ot ért el. Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: igen /nem Bíráló neve: igen /nem (aláírás) (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...% - ot ért el. Keszthely, A doktori (PhD) oklevél minısítése.... a Bíráló Bizottság elnöke.. az EDT elnöke 3

4 TARTALOMJEGYZÉK KIVONAT... 7 ANGOL NYELVŐ KIVONAT... 9 NÉMET NYELVŐ KIVONAT RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A növényi stresszfolyamatokról általában Az alacsony hımérséklet növényi anyagcserére gyakorolt hatásai Az alacsony hımérséklet hatásai hidegérzékeny növényekre Az UV-B sugárzás hatásai a növényekre Az oxidatív stressz A reaktív oxigénformák típusai Az antioxidáns védekezırendszer Szuperoxid-dizmutázok A víz-víz ciklus Az aszkorbát-glutation ciklus Aszkorbát-peroxidázok Glutation-reduktázok Katalázok A reaktív oxigénformák élettani szerepe A növények fluoreszcencia sajátságai Stresszelt növények leveleinek fluoreszcenciája Az S-metilmetionin élettani szerepe Az SMM-ciklus Az SMM-ciklus szerepe a Met és AdoMet-szint szabályozásában Az SMM metilcsoportjának szerepe Az SMM szerepe a S szállításában és raktározásában, az SMM-ciklus eltolódásai térben és idıben Az SMM szerepe a dimetil-szulfopropionát (DMSP) szintézisében Az SMM hidegstressz elleni védıhatása Az SMM hatása az etiléntermelésre KUTATÁSI CÉLOK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Növényi anyagok, mintavételek és kezelések

5 SMM-kezelés UV-B kísérletek szabadföldön UV-B kamrakísérletek A fluoreszcencia-indukció mérése A több hullámhosszú fluoreszcencia leképezı rendszer mőködése Gázcsere vizsgálatok Relatív klorofilltartalom mérése Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitásuk mérése Antocián kivonás és relatív antociántartalom meghatározása Hajtáshossz mérése Szabadföldi kísérletek UV-B sugárzási adatai és statisztikai értékelésük Statisztikai analízis EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK SMM-kezelések SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására 5 C-on SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására chilling hımérsékleti gradiens (14-6 C) mellett SMM-kezelés hatása a fotoszintézisre chilling hımérsékleti gradiens (14-6 C) mellett A fluoreszcencia indukciós paraméterek változásai A fotoszintetikus aktivitás és az intercelluláris CO 2 tartalom alakulásának összefüggései Az SMM hatása stresszvédı metabolitok keletkezésére SMM-kezelés hatása a relatív klorofilltartalomra chilling hımérsékleti gradiens (14-6 C) mellett Alacsony hımérsékleti stressz és SMM-kezelés hatására történt változások eredményeinek értékelése A magasabb szabadföldi UV-B sugárzás és a növényi antociántartalom alakulásának összefüggései Szabadföldi UV-B kísérletek eredményeinek értékelése UV-B kezelés anyagcserére gyakorolt hatásai kukoricában Az UV-B sugárzás antioxidáns enzimek aktivitására gyakorolt hatása A fluoreszcencia indukciós paraméterek változásai UV-B sugárzás hatására A fotoszintetikus aktivitás változása UV-B sugárzás hatására A relatív klorofilltartalom változásai UV-B sugárzás hatására A relatív antociántartalom változásai UV-B sugárzás hatására UV-B kezelés hatása a növények hajtáshosszára UV-B kamrakísérletek eredményeinek értékelése Az UV-B sugárzás antioxidáns enzimek aktivitására gyakorolt hatása

6 Az UV-B kezelés fotoszintézisre gyakorolt hatása A relatív antociántartalom változásai UV-B sugárzás hatására UV-B kezelés hatása a növények hajtáshosszára ÖSSZEFOGLALÁS IRODALOMJEGYZÉK TÉZISEK THESES KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

7 KIVONAT Részletesen tanulmányoztuk a nemesítés szempontjából fontos két abiotikus stresszfaktor (alacsony hımérséklet, UV-B sugárzás) hatását a kukorica anyagcseréjére. A stresszélettani vizsgálatokat elsısorban Martonvásáron, az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet fitotronjában lévı alacsony hımérsékleti és UV-B kezelést biztosító növénynevelı kamráiban, míg a szabadföldi kísérleteket részben a martonvásári, illetve a második generáció felnevelésének helyt adó Buin-i (Chile) tenyészkertben végeztük. Kísérleteink egyik fontos része - elızetes eredmények alapján - annak bizonyítása volt, hogy a kénanyagcsere intermedier vegyülete, az S-metilmetionin (SMM) mennyiben tudja a fiatalkori kukoricanövények alacsony hımérséklettel szembeni ellenállóságát befolyásolni. Folyadékkultúrás kísérleteink során hımérsékleti gradiens mellett (6-14 C) mértük a második fotokémiai rendszer (PSII) mőködését reprezentáló F v /F m fluoreszcencia indukciós paramétert, nyomon követtük a relatív klorofilltartalom alakulását, valamint tanulmányoztuk a reaktív oxigénformák eliminálásáért felelıs antioxidáns enzimek aktivitás-változását SMM-kezelés hatására. Igazoltuk, hogy az SMM a legalacsonyabb - a kukorica számára károsodást okozó - gradiens hımérsékleteken (8 és 6ºC) növelni tudta a F v /F m hányadost, ami az SMM védıhatását bizonyította az alacsony hımérsékletre igen érzékeny PSII esetében. Ugyanezeken a hımérsékleteken az SMM a kevésbé károsodott struktúrák miatt megakadályozta a klorofilltartalom csökkenését. Megállapítottuk, hogy ha eltérı mértékben is, valamennyi antioxidáns enzim aktivitása szignifikánsan emelkedett a legalacsonyabb gradiens hımérsékleten (6ºC) és a kukorica számára már letális hımérsékleten, 5ºC-on is SMM-kezelés hatására. A kulcsfontosságú szerepet az APX képviseli, mely a gradiens valamennyi hımérsékletén aktivitásemelkedést mutatott. Kísérleteink másik fontos célja - szabadföldi és UV-B kamrás körülmények között - az volt, hogy eltérı rokonsági körökhöz tartozó és különbözı érésidejő beltenyésztett kukoricavonalakban a magasabb ultraibolya sugárzás hatását vizsgáljuk a levelek antociántartalmára, a fotoszintézis paramétereire, és az antioxidáns enzimek aktivitására. Több éves szabadföldi kísérleteink adatai azt igazolták, hogy a chilei 7

8 levélmintákban - a közel 30%-kal nagyobb UV-B sugárzás miatt, 5 év átlagában - 18%-kal magasabb volt az antociánok mennyisége, mint Martonvásáron. UV-B kamrás vizsgálataink azt bizonyították, hogy az UV-B sugárzás eltérı mértékben hatott az antioxidáns enzimek aktivitására. Aktivitás növekedés csak az APX enzim esetében volt megfigyelhetı, de csak a korai tenyészidejő vonal esetében. Legnagyobb mértékben a POD és a GST enzimek aktivitása csökkent. Ez utóbbi enzimek aktivitáscsökkenése jó paraméter lehet a beltenyésztett kukoricavonalak UV-B érzékenységének jellemzésére. 8

9 ANGOL NYELVŐ KIVONAT STUDIES ON THE EFFECT OF ABIOTIC STRESSORS AND FACTORS INFLUENCING STRESS TOLERANCE IN MAIZE (ZEA MAYS L.) Experiments carried out in the temperature gradient chamber of the phytotron at the Agricultural Research Institute of the Hungarian Academy of Sciences proved that S-methylmethionine reduced the low temperature sensitivity of maize plants in the seedling stage by increasing the efficiency of the PSII system, the relative chlorophyll content of the leaves and the activity of antioxidant enzymes. It was confirmed in field experiments that enhanced UV-B radiation induces a rise in the quantity of anthocyanines, which absorb this radiation. Tests in a UV-B chamber proved that the activities of individual antioxidant enzymes respond differently to UV radiation. The reduction in the activity of the POD and GST enzymes could be a suitable parameter for characterising the UV-B sensitivity of inbred maize lines. 9

10 NÉMET NYELVŐ KIVONAT DIE UNTERSUCHUNG DER EFFEKTE DER ABIOTISCHEN STRESSOREN UND DER AUF DIE STRESSTOLERANZ EINWIRKENDEN FAKTOREN IN MAIS (ZEA MAYS L.) Die stressphysiologischen Experimente werden im Phytotron des landwirtschaftlichen Forschungsinstituts der UAdW in Martonvásár gemacht. Das erste Ziel war die Demonstration der Wirkung von S-methylmethionin (SMM) auf die Photosynthese und auf die Aktivität der antioxidativen Enzyme in Mais. Die SMM erhöhte die Wirksamkeit der Photosynthese (PSII) und die Aktivität der antioxidativen Enzyme. Die SMM reduzierte die Empfindlichkeit des Maises gegen die niedrige Temperatur (unter 12 C). Das zweite Ziel war die Untersuchung der Wirkung der UV-B Radiation auf den Stoffwechsel in den differenten Inzuchtlinien des Maises. Die höhere UV-B Radiation erhöhte den Gehalt von Anthocyan in den Blättern und reduzierte die Aktivität der antioxidativen Enzyme, besonders bei POD und GST. 10

11 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A ACC APX AdoHcy AdoMet CAT C i CBF CC CDNB CHS CPD DDH DMS DMSP DTNB EDTA F o F o F m F m fotoszintetikus aktivitás 1-aminociklopropán-1karboxilát aszkorbát-peroxidáz S-adenozil-homocisztein S-adenozil-metionin kataláz intercelluláris széndioxid-koncentráció C-repeat binding factor citozin-citozin 1-kloro-2,4-dinitrobenzén kalkon-szintáz ciklobután típusú pirimidin dimerek DMSP-aldehid dehidrogenáz dimetil-szulfid dimetil-szulfopropionát 5,5 -ditio-bis-(2-nitro-benzoesav) etilén-diamin-tetraecetsav kezdeti fluoreszcencia sötétadaptált állapotban kezdeti fluoreszcencia fényadaptált állapotban maximális fluoreszcencia sötétadaptált állapotban maximális fluoreszcencia fényadaptált állapotban 11

12 F v GR GSH GSSG GST HMT IES LHC Met MMT NADP NADPH PAL PAR POD PPFD PSI PSII Q A Q B qn qp ROS SMM változó fluoreszcencia sötétadaptált állapotban glutation-reduktáz redukált glutation oxidált glutation glutation-s-transzferáz S-metilmetionin:homocisztein S-metiltranszferáz indolecetsav fénygyőjtı komplex metionin S-adenozilmetionin:metionin S-metiltranszferáz β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát, oxidált β-nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát, redukált fenilalanin-ammónia-liáz fotoszintetikusan aktív sugárzás gvajakol-peroxidáz fotoszintetikusan aktív fotonfluxus denzitás elsı fotokémiai rendszer második fotokémiai rendszer elsıdleges kinon akceptor másodlagos kinon akceptor nem-fotokémiai kioltás fotokémiai kioltás reaktív oxigénformák S-metilmetionin 12

13 SMT SOD TC TT szelenocisztein-metiltranszferáz szuperoxid-dizmutáz timin-citozin timin-timin 13

14 1. BEVEZETÉS Az ısidık emberének hiedelemvilágához tartozott, hogy az idıjárás irányítása isteneknek (pl. Napisten, Esıisten) tulajdonítható. A ma embere az objektív adatok között tájékozódva azt gondolhatja, hogy az idıjárás alakulásáért csupán a légkört leíró állapotjelzık (nyomás, sőrőség, hımérséklet, moláris összetétel, stb.), a besugárzás, a felszín tulajdonságai, a légkör átlátszósága, stb. a felelısek. Talán kevesebben vannak azok, akik végiggondolják, hogy az idıjárás nagyléptékő alakítója az ipari forradalom óta maga az ember. A világmérető éghajlatváltozás tény, ugyanis az ipari tevékenység következtében - az üvegház gázok fokozott kibocsátásával - a Föld átlaghımérséklete 0,6ºC-kal emelkedett (HANSEN és mtsai., 2005). A globális klímaváltozás egyik negatív következménye, hogy az - ugyancsak ipari tevékenység során kibocsátott - ózon-antagonista gázok révén, az élılények számára káros UV-B sugárzás ellen védıpajzsként funkcionáló sztratoszférikus ózonréteg vékonyodik (ANDERSON és mtsai., 1991; MCFARLAND és KAYE, 1992; MCKENZIE és mtsai., 1999), így a Földre jutó UV-B sugárzás szintje magasabb. Az ózonréteg vékonyodás a déli féltekén, az Antarktisz és annak közelében lévı területek fölött a legnagyobb mértékő. A változó környezethez való szüntelen alkalmazkodás, a stressz, az élet természetes velejárója E fogalom biológiai értelmezése és az alapjaiban máig elfogadott stresszelmélet megalkotása a magyar származású Selye János ( ) nevéhez főzıdik. Definíciója szerint a stressz egy fajlagos tünetcsoportban megnyilvánuló állapot, mely magába foglal minden nem-fajlagosan elıidézett változást egy biológiai rendszeren belül (SELYE, 1936, 1978). Megfigyelései szerint a szervezet számos olyan reakciót mutat, mely a stresszt kiváltó stresszor fajtájától függetlenül minden esetben lényegében hasonló tüneteket produkál. Ez vezetett az ún. általános adaptációs szindróma elméletének kidolgozásához. Eszerint a szervezetben egy stresszor megjelenését követıen 3 stádium figyelhetı meg: az elsı az alarm, vagy készültségi reakció, amikor az alkalmazkodási készség a normális szint alá kerül. A második az ellenállás stádiuma, amelyben alkalmazkodási és reparációs folyamatok eredményeként ismét normális életmőködések, fokozott ellenálló képesség jellemzı. A 14

15 harmadik a kimerülés szakasza, ami az alkalmazkodóképességet meghaladó intenzitású igénybevétel esetén következik be és fokozatos leromláson át krónikus károsodáshoz, majd a pusztuláshoz vezet. Bár Selye kutatóorvosként fıleg állati és emberi szervezeteket tanulmányozott, elméletének alapjai növényi rendszerekre is érvényesek (LARCHER, 1995). A növények - az állatokkal és az emberrel ellentétben - helyhez kötöttségüknél fogva nem tudnak a kedvezıtlen környezeti feltétételek elıl kitérni, így akár idıjárásból (alacsony, magas hımérséklet, szárazság, áradás stb.), akár emberi tevékenységbıl (UV-B sugárzás erısödése, nehéz fémek, savas esı stb.) adódó kedvezıtlen környezeti tényezık hatására az anyagcsere szintjén stressz-indukált válaszokkal felelnek. E válaszok gyorsasága és eredményessége a növényfajta, adott esetben a faj életképességét is meghatározza. Az idıjárás szélsıségessé válása hazánk mezıgazdaságát is egyre inkább érinti, így a növénynemesítı szakemberek egyik sürgetıvé vált feladata olyan genotípusok elıállítása, amelyek a környezet változásait a lehetı legkisebb mértékő károsodás mellett tolerálják. Ahhoz, hogy ilyen növényeket elı lehessen állítani, elıször a növények egyes védekezı és szabályozási folyamatait kell megismerni. A különbözı növényfajok között az alacsony hımérséklettel és az UV-B sugárzással szembeni érzékenységet tekintve is igen nagy különbségek vannak, hiszen az evolúció során szelekciójuk a termıhely ökológiai adottságainak megfelelıen történt. A szubtrópusi eredető gazdasági növények (pl. kukorica, paradicsom, paprika, szója, rizs stb.) már 10-12ºC alatt jelentıs károsodást szenvedhetnek. Hazánkban és a világ számos más országában az egyik legfontosabb élelmiszer- és takarmánynövény, a kukorica esetében a hideg károsító hatásával elsısorban a növény fejlıdésének kezdeti szakaszában kell számolni. E növényfaj a fokozott UV-B sugárzással szemben is érzékenységet mutat (TERAMURA és SULLIVAN, 1994). Mind elméleti, mind gyakorlati szempontból nagy jelentısége van azon vegyületek vizsgálatának, amelyek a gazdasági növények stressz érzékenységét csökkenteni képesek. Korábbi vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy egy biológiailag aktív, nem fehérjeépítı szabad aminosav, az S-metilmetionin (SMM) - exogén módon bejuttatva - kedvezıen befolyásolja a növények hidegtőrı képességét és hatása számos vonatkozásban hasonlít az ugyancsak stresszvédı poliaminok hatásához (SHEN és mtsai., 2000). 15

16 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A növényi stresszfolyamatokról általában A növények életük során számtalan biotikus és abiotikus stresszhatásnak vannak kitéve. A biotikus stresszorok közül elsısorban a kártevı mikroorganizmusokat, köztük a vírusokat, baktériumokat, gombákat kell említeni, de a rovarok, csigák - okozta rágás is ide sorolható, abiotikus stresszoroknak pedig a növényi környezet extrém megváltozásaiból adódó hatásokat, pl. hıség, fagy, szárazság, fénystressz, UV-stressz, tápanyaghiány, toxikus nehézfémek, stb. tekintik. Mindkét típusba sorolt stresszorok általában a védekezést, a jobb alkalmazkodást szolgáló, többletenergiát, egyes anyagok szintézisét igénylı válaszreakciókat váltanak ki a növényekben, és jelentıs mértékben megváltoztatják a növények anyagcseréjét, ami a stresszor hatásának tartósságától függıen termesztett növények esetén terméscsökkenést, és/vagy minıségcsökkenést okoz Az alacsony hımérséklet növényi anyagcserére gyakorolt hatásai Míg egyes stresszfaktorok (pl. herbicidek) többé-kevésbé jól meghatározható elsıdleges hatóhellyel rendelkeznek, addig a hidegstressz az anyagcsere valamennyi mőködését befolyásolja, érthetı módon, hiszen minden biokémiai folyamat sebessége hımérsékletfüggı, minden enzim meghatározott hımérsékleti optimummal rendelkezik. Az optimálistól eltérı hımérsékleten egyrészt a szubsztrátmolekulák csökkent diffúziója révén, másrészt az enzimek alacsonyabb aktivitása miatt megváltozik az enzimatikus folyamatok sebessége. Az egyes anyagcsere folyamatok eltérı mértékben reagálnak a hideghatásra, a sejt metabolikus egyensúlya felborul. Egyes folyamatoknál az alacsony hımérséklet hatása csak a hidegstressz alatt jelentkezik, majd miután a növény optimális hımérsékletre kerül vissza, a funkció helyreáll. Ezzel szemben más folyamatok tartósan károsodhatnak a stressz következtében, így a csökkent mőködés a hideghatás megszőnése után is kimutatható. Bizonyos esetekben a hidegstressz látható jelei alacsony hımérsékleten nem, csak azt 16

17 követıen, normál hımérsékleten jelentkeznek. A szubtrópusi eredető fajok jelentıs hidegérzékenységgel bírnak, és szélsıséges esetben már rövid hideghatás után sem képesek regenerálódni Az alacsony hımérséklet hatásai hidegérzékeny növényekre Az alacsony hımérséklet hatásait növényekben - fıként a hımérséklettıl és idıtartamtól függıen - többféle szemszögbıl vizsgálják. Például a fiatal kukoricanövények fejlıdéséhez, egyéb környezeti tényezıktıl és genotípustól függıen, 20-27ºC tekinthetı optimálisnak. A 15-20ºC-os hımérsékleti intervallum az ún. szuboptimális tartomány, melyen a növények még megfelelı mértékben fejlıdhetnek. Amennyiben a növények 12-15ºC-os hımérséklettartományban növekednek, kismértékő edzıdés is megfigyelhetı (JANDA és mtsai., 1998). Ez alatti hımérséklettartományban azonban már egyre inkább a károsodás tünetei mutatkoznak (chilling). 7ºC alatt ezek a növények nem növekednek, és egy rövid idı múlva elpusztulnak. A különbözı eredető növényfajok az alacsony, fagypont feletti hımérsékletre eltérı érzékenységet mutatnak. Ugyanakkor egy növényen belül is tapasztalhatunk különbségeket az egyes szövetek, sejttípusok hidegérzékenységében. A növény stressztőrı képességét az adott szövet, vagy szerv kora is befolyásolhatja. Mindemellett az is ismert, hogy például a kukorica mezofillsejtek érzékenyebbek a hideg károsító hatására, mint a hüvelyparenchima sejtek (KRATSCH és WISE, 2000). A növény anyagcseréjének számos folyamata membránhoz kötött. Emiatt a hideghatás alatt a membránokban lejátszódó folyamatoknak kulcsszerepük van mind a hidegkárosodás kialakulásában, mind az alacsony hımérséklethez történı alkalmazkodásban (LYONS és RAISON, 1970; LYONS, 1973; LYONS és mtsai., 1979; MURATA és mtsai., 1983). A membrán lipid fázisátmenet hipotézis hosszú ideig egyféle magyarázatot adott a hideg okozta károsodásokra (LYONS, 1973). Ezen elmélet szerint a membránlipidek valószínőleg folyadék kristályos állapotban vannak, hogy el tudják látni a szemipermeábilis gát szerepét a sejtkompartmentek között, és megfelelı környezetet biztosítsanak az intrinsic membránproteineknek. Hidegérzékeny növényeknél egy kritikus hımérsékleten a membránlipidek egy gélszerő állapotba mennek át, s ez zavart okoz a membránok mőködésében. Újabb eredmények azt mutatják, hogy a fázisátmenet hipotézis eredeti formájában arra alkalmas, hogy 17

18 megmagyarázza a termofil cianobaktériumok membránjainak mőködési zavarait chilling hatására (MURATA, 1989), de magasabb rendő növényeknél ez elég kétséges (MARTIN, 1987). Manapság az elfogadott álláspont, hogy az alacsony hımérsékletre érzékeny növények hidegkárosodásánál a membránlipidek nagy részénél nem történik fázisátmenet, bár elıfordulhat, hogy kisebb lipidfrakciók lokálisan fázisátalakulást szenvedhetnek alacsony hımérsékleten (QUINN, 1988). A membránösszetétel különbségei részben megmagyarázhatják a hidegérzékenységben tapasztalt különbségeket. Ennek közvetlen bizonyítéka az, hogy akár a hidegérzékeny Anacystis nidulans kékalgába, vagy egyes magasabbrendő növényekbe egy a lipidek telítetlenségéért felelıs gén (az ún. desa gén) bevitele a hidegtőrést jelentısen megnövelte (WADA és mtsai., 1990; ISHIZAKI-NISHIZAWA és mtsai., 1996). Hideghatás szempontjából a fotoszintetikus apparátus a növény egyik legérzékenyebb pontja. Hidegstressz hatására a leveleken klorotikus foltok jelennek meg, melynek oka, hogy alacsony hımérsékleten gátolt a klorofill molekulák bioszintézise, az etioplasztok és kloroplasztiszok fejlıdése (BERRY és BJÖRKMAN, 1980; YOSHIDA és mtsai., 1996; BÖDDI és mtsai., 1997). A fénygátlás (fotoinhibíció) jelensége, melynek során a magas fényintenzitásnak kitett növény fotoszintetizáló képessége károsodik (VASS és mtsai., 1992), alacsony hımérséklet hatására már viszonylag alacsony fényintenzitáson is felléphet. A PSII maximális kvantumhatékonyságát jelzı F v /F m paraméter sötétben, 5ºC-on még 2 nap után sem utalt a kukorica növények fotoszintetikus rendszerének károsodására, fényen viszont már pár órás hideghatás után lecsökkent (JANDA és mtsai., 1994; SZALAI és mtsai., 1996). Az alacsony hımérséklet által indukált fotoinhibíció nemcsak a fotoszintetikus folyamatok, hanem egyéb stresszmarkerek, mint például szabad aminosavak és poliaminok szintjén is megnyilvánul (SZALAI és mtsai., 1997). A fénygátlás során fokozott mértékben képzıdnek reaktív oxigénformák. Ennek következtében felborul az egyensúly az elnyelt és a felhasznált energia között, az elektrontranszportlánc túlgerjesztett állapotba kerül. A felborult egyensúly oka egyrészt a Calvin-ciklus enzimeinek nem megfelelı mértékő aktivitása, illetve a zárt gázcserenyílások következtében kialakuló kisebb intercelluláris CO 2 koncentráció (C i ). A Calvin-ciklus csökkent mőködése nyomán a NADP + utánpótlás csökken, így az elektronok a fotoszintetikus elektrontranszportláncról az O 2 18

19 molekulákra juthatnak, és szuperoxid gyökök keletkezhetnek. A PSII-ben kétszeresen redukált és/vagy protonált Q A keletkezik, ami elhagyhatja a kötıhelyét. A P 680 triplet állapotba ( 3 P * 680 ) kerül, ami szinglet oxigén képzıdéséhez vezethet. A szinglet oxigén károsítja a PSII-t, és a D 1 protein degradációját okozza (VASS és mtsai., 1992). A fénygátlás károsító hatásainak kiküszöbölésére különbözı mechanizmusok léteznek (AROCA és mtsai., 2001). A fénygyőjtı rendszert érı gerjesztési energiafelesleg károsító hatásának kivédése bekövetkezhet egyrészt azáltal, hogy az energiának a két fotoszisztéma közötti eloszlása változik meg. Az energia felvételét és továbbítását a növény pl. a fénybegyőjtı protein-pool genetikai szintő szabályozásával, az LHC proteinek foszforilációjával és defoszforilációjával, vagy a PSII-rıl a PSI-re történı közvetlen energiaátadással is tudja szabályozni. Másrészt megtörténhet az energiafelesleg disszipációja hı formájában a violaxantin dezepoxidációja által a xantofill ciklus során keletkezı anteraxantin ill. zeaxantin segítségével. Ugyancsak az energiafelesleg elvezetését szolgálja a kloroplasztiszban az ún. víz-víz ciklus. Ennek során a PSII-bıl a vízmolekuláról származó elektronok a PSI-ben az O 2 redukciójára fordítódnak, így gyakorlatilag az O 2 mennyiségében nem történik változás (ASADA, 1999). A ciklus mőködtetésében antioxidáns enzimek is részt vesznek, úgymint a szuperoxid-dizmutáz (SOD), az aszkorbát-peroxidáz (APX), és a glutation-reduktáz (GR). A fénygátlás károsító hatását csökkenti továbbá a keletkezett reaktív oxigénszármazékok közömbösítése antioxidáns vegyületek és enzimek segítségével (AROCA és mtsai., 2001). Miután az alacsony hımérséklet károsító hatásának egyik fı oka a reaktív oxigénformák felhalmozódása (PRASAD és mtsai., 1994), az antioxidáns rendszer válasza különleges fontosságú a hidegstressz károsító hatásainak kivédésében. A különbözı kukorica genotípusok eltérı hidegérzékenységének hátterében részben az antioxidáns rendszer eltérı mőködése áll (PRASAD és mtsai., 1994). Kukorica levelekben a legtöbb antioxidáns enzim, úgymint SOD, APX, gvajakol-peroxidáz (POD) és GR aktivitásának növekedésérıl számoltak be, egyedül a kataláz aktivitásában mutattak ki csökkenést (LEE és LEE, 2000). A kukoricalevelek kétféle sejttípusának fentebb említett eltérı hidegérzékenysége mögött is részben az eltérı oxidatív hatás áll. A hüvelyparenchima sejtek kloroplasztiszában az O 2 termelés csak kis mértékő, így szuperoxidgyök keletkezésének kisebb az esélye. A mezofill sejtekben 19

20 nagyobb hidrogén-peroxid koncentrációt mutattak ki (DOULIS és mtsai., 1997). Ugyancsak eltérés mutatkozik a két szövet között az antioxidánsok eloszlásában. A NADPH szintézis a mezofill sejtekre jellemzı, így a GR jelenléte is erre a sejttípusra korlátozódik, ugyanakkor az APX fıként a hüvelyparenchima sejtekben található, kataláz mindkét sejttípusban jelen van. Az alacsony hımérséklet hatására még kifejezettebb az eltérés az antioxidáns enzimek eloszlásában (PASTORI és mtsai., 2000). A mezofill sejtekben 15ºC-on fokozódik a glutation-reduktáz aktivitása, míg kataláz aktivitás már nem mutatható ki. A hüvelyparenchima sejtekben hideghatásra megnıtt az aszkorbát-peroxidáz aktivitás. Rizs növényekben alacsony hımérséklet hatására gyors növekedést tapasztaltak az APX és a POD aktivitásában. A SOD és a GR enzimek lassabb aktivitásnövekedést mutattak, míg a kataláz aktivitásában nem történt változás (OIDAIRA és mtsai., 2000). Az alacsony hımérséklethez való akklimatizáció kialakulása hormonális szabályozás alatt áll. Alacsony hımérsékleti kezelés során megnı az abszcizinsav mennyisége (JANOWIAK és DÖRFFLING, 1996). Különbözı kukorica genotípusokban kimutatták, hogy szoros összefüggés van a hidegtolerancia és az abszcizinsav akkumuláció között (JANOWIAK és mtsai., 2002), de ez lehet, hogy csak az alacsony hımérsékleten fellépı vízhiány következménye. Kimutatták, hogy a rövid idejő szárazságstressz fokozza a kukorica (SÁNCHEZ-DÍAZ és mtsai., 1993) vagy a rizs hidegtőrését (KITAGAWA és YOSHIZAKI, 1998). A kutatások külön ágát képezik azok a vizsgálatok, melyek a gazdasági növények stressztőrı képességének növelésére alkalmas vegyületek keresésére irányulnak. Az ilyen vegyületeknél kétféle megközelítés alkalmazható: vagy az adott anyag szintézisét fokozzuk, vagy külsıleg adjuk a növénynek. Az irodalomban mindkét esetre több vizsgálati eredmény is található. 20

21 Az UV-B sugárzás hatásai a növényekre Az UV-B sugárzás ( nm) viszonylag kis részét (kb. 1,5%) képezi a Föld felszínét érı teljes elektromágneses sugárzásnak, azonban már kismértékő növekedése is elegendı ahhoz, hogy a növényekben közvetlenül vagy közvetve számos olyan molekuláris szintő folyamatot befolyásoljon, amelyek változásai a növény növekedésében, fejlıdési fázisainak bekövetkezésében, a primer és szekunder anyagcsere intenzitásában és arányának eltolódásában jelentkezhetnek. Mivel a növények törzsfejlıdésük során szinte állandóan ki voltak téve bizonyos mértékő UV-sugárzásnak, ezért ez a sugárzás természetes stresszfaktornak tekinthetı, és ennek megfelelıen a növények az evolúció által próbára tett védekezési mechanizmusokkal rendelkeznek a sugárzás által kiváltott károsodások kivédésére vagy kijavítására. Azonban a globális klímaváltozás egyik negatív következményeként a sztratoszférában a káros sugárzások ellen védıpajzsként funkcionáló ózonréteg vékonyodik. E negatív jelenség egyik okozója maga az ember, a fıleg ipari tevékenysége során kibocsátott ózon-antagonista gázok - pl. halogénezett szénhidrogének, nitrogén oxidok - révén (ANDERSON és mtsai., 1991; MCFARLAND és KAYE, 1992; MCKENZIE és mtsai., 1999; REDDY és HODGES, 2000). Az elmúlt években korlátozták ugyan az ózonkárosító vegyületek légkörbe bocsátását, azonban a sztratoszférikus ózonréteg vékonyodása és így a földfelszínt elérı UV-B sugárzás mennyiségének növekedése nem állt meg. Ez egyrészt arra vezethetı vissza, hogy az ózonkárosító gázok hosszú ideig tartózkodnak a légkörben, másrészt pedig arra, hogy az üvegházhatású gázok növekvı mennyisége az atmoszféra alsó részét melegíti, ami a sztratoszféra hőlését és további ózonbomlást okoz. Az ózoncsökkenés mértéke nem egyenletes a Föld különbözı pontjain, a sarkoknál a legjelentısebb, különösen a déli féltekén, bár a mérsékelt övben is megfigyelhetı egy egyenletes vékonyodás. A globális ózoncsökkenés évente átlagosan 3%-ra tehetı, amit nagymértékben befolyásol a légkörben lévı szennyezıanyagok és aeroszolok mennyisége is. A becslések szerint minden 1%-nyi ózonszint csökkenés következményeként a bioszférát elérı UV-B sugárzás 1,3-1,8%-nyi emelkedése állhat be (MADRONICH, 1993). A káros sugárzás mértéke természetesen számos tényezıtıl függ, ilyen például az adott hely szélességi foka, tengerszint feletti magassága, az atmoszférikus viszonyok (felhıtakarás, köd, 21

22 pára), a felszín fényvisszaverı képessége stb. (CALDWELL, 1981). Hasonló megállapítást tettek ZEREFOS és mtsai. (1997) is, amikor több éven át mérték az UV-B sugárzást, s annak változását négy, eltérı szélességi fokon és tengerszint feletti magasságon lévı európai városban. Erısebb UV-B sugárzásra a növények válaszreakciói elsısorban fiziológiai és biokémiai szinten következnek be (HOLLÓSY, 2002). A sejteket felépítı vegyületek jelentıs része UV-abszorpcióra képes, így potenciális célpontjai az UV-sugárzásnak. A DNS-molekula az elsıdleges célpont, melynek közvetlen fotonabszorpciója két olyan folyamatot indít el, mely komoly károsodáshoz vezet. Egyrészt ugyanazon a DNSszálon ciklobután típusú pirimidin dimerek (CPD) jöhetnek létre a szomszédos pirimidin bázisok között (TT, TC, CT, CC), másrészt pedig pirimidin (6-4) pirimidon dimer fénytermékek alakulhatnak ki, melyek mutációt okozhatnak a replikáció során. Az UV-B sugárzás emellett okozhat még DNS-protein keresztkötést, DNS-száltörést, bázispárkiesést vagy beépülést is. Az UV-B sugárzás hatására bekövetkezı DNSkárosodás 75%-a a CPD-termékek képzıdésének köszönhetı (HOLLÓSY, 2002). A sejt makromolekulái közül a fehérjék is erısen abszorbeálnak UV-B tartományban, ami elsısorban az aromás aminosavaknak (fenilalanin, triptofán, tirozin, hisztidin) köszönhetı. Az UV-B tartományban tapasztalható nagymértékő abszorpciójuk a szerkezetükben fotokémiai változásokat idéz elı, ami a növényi szövetekben számos fehérjekomponens és enzim (Rubisco, ATP-áz, violaxantindezepoxidáz, PSII, PSI) inaktiválódását eredményezi (PFÜNDEL és mtsai., 1992). Ebben közvetlen szerepet játszik az aminosavak fotokémiai átalakulása, de nagy jelentısége van a fehérjék harmadlagos szerkezetét fenntartó diszulfid-hidak fotolízisének és a reaktív szulfhidrilcsoportok képzıdésének is. Különösen érzékenyek a növényi citoszkeleton fehérjekomponensei, különösen az aromás aminosavakban gazdag mikrotubulus szerkezet, így UV-sugárzás hatására a sejtciklus (S, G1 és G2 fázisok) lelassulása figyelhetı meg. UV-B sugárzás hatására a sejtmembránok integritása is jelentısen megváltozik. A növényi membránok fı alkotói, a foszfolipidek és a glikolipidek telítetlen zsírsavakat tartalmaznak, amelyek szükségesek a membránstruktúra stabilitásához. A telítetlen zsírsavak UV-B sugárzás során O 2 jelenlétében könnyen oxidálódnak és lipid-peroxid gyökök képzıdnek (HOLLÓSY, 2002). Különösen érzékenyek a kloroplasztisz belsı membránjai. A kloroplasztisz 22

23 tilakoidok mono- és digalaktozil-diacilglicerol alkotói közül az elızıek nagyfokú telítetlenséggel rendelkeznek, ami a membránstabilitás fenntartása szempontjából fontos tulajdonság. UV-B sugárzás során a tilakoidok monogalaktozil-diacilglicerol /digalaktozil-diacilglicerol arányának csökkenése a stabilitás csökkenését okozza (PREDIERI és mtsai., 1995). Az UV-B hatására bekövetkezı sejtmembrán-károsodás számos folyamatra hatással van a fotoszintetizáló és nem fotoszintetizáló sejtekben egyaránt. Az UV-B sugárzás hatására a szárazanyag- és biomassza-gyarapodás csökkenése is megfigyelhetı, melynek okai a szén-anyagcsere folyamataiban bekövetkezı változások. A növényi anyagcsere folyamatok közül leggyakrabban az UV-B sugárzás fotoszintézisre kifejtett hatását vizsgálták, mivel a sejtorganellumok közül az UV-B sugárzással szemben a kloroplasztisz tőnik a legérzékenyebbnek. Az UV-B sugárzásnak a fotoszintetikus apparátusra gyakorolt hatásai több komponenst és részfolyamatot érintenek. Az UV-B közvetlen hatása elsısorban a PSII károsodásában jelentkezik, de emellett csökkenhet a PSI mérete, a Rubisco-aktivitás, a CO 2 -fixáció és az O 2 -képzıdés is. Hatása a fotoszintetikus apparátus aktivitására a száraz tömegen kívül a keményítı- és a klorofilltartalom csökkenésében is kimutatható. Az UV-B sugárzás a CO 2 -fixációra nemcsak az elızı folyamatokon keresztül van hatással, hanem közvetve a gázcsere hatékonyságát mérséklı sztómazáródás kiváltásával, a levélbeli fényfeltételek megváltoztatásával és a diffúziós ellenállások növelésén keresztül is (a levélvastagság és levélfelépítés megváltozása). A fotoszintetikus aktivitás csökkenését egyrészt a kulcsfontosságú komponensek - pl. a D 1 protein (VASS és mtsai., 1996) vagy a fotoszintetikus pigmentek (MÉSZÁROS és mtsai., 2001) - direkt fotooxidatív károsodása, másrészt a fotoszintézis szempontjából fontos gének (klorofillok, az LHC-antennaproteinek, a PSII D 1 protein, ATP-szintáz, Rubisco szintéziséért felelıs gének) csökkent mértékő kifejezıdése (MACKERNESS és mtsai., 1999) okozhatja. Az UV-B sugárzás csökkenti a cab gén átírását is, mely az LHCII klorofill a/b kötı fehérjéinek szintéziséért felelıs, így hatására elmarad a funkcionális egységet alkotó LHCII és a PSII reakcióközpont összekapcsolódása. A fotoszintetizáló apparátus komponensei közül a PSII bizonyult az UV-B-vel szemben a legérzékenyebbnek, míg a PSI és a citokróm b/f-komplex jóval ellenállóbb. A PSII rendszeren belül legérzékenyebben a vízbontó Mn komplex reagál. A legújabb adatok 23

24 szerint a D 1 protein degradációja sokkal inkább a Mn komplex inaktiválódására vezethetı vissza, mint a Q A és Q B akceptorok érzékenységére. A D 1 protein metabolizmusa és regenerálódása nagyon komplex folyamat, mely függ a fény mennyiségétıl és összetételétıl is (BERGO és mtsai., 2003). Az UV-B sugárzás során bekövetkezı ultrastrukturális változások közül kiemelendı, hogy a kloroplasztiszban a gránum- és sztrómatilakoidok elvesztik szabályos mintázatukat, a tilakoidok egy része gyengén fellazul, kitágul. A sztróma egy része félkristályos szerkezetet vesz fel, amit az UV-B okozta vízhiány stressznek tulajdonítanak (HOLLÓSY, 2002). Sérülékeny a Calvin-ciklus kulcsenzime, a Rubisco is, egyrészt mivel elnyelést mutat az UV-tartományban, másrészt mivel az enzim nagy alegysége a kloroplasztisz DNS-ben kódolt, és az UV-B sugárzás gátolja a nagy alegység fehérjéit kódoló gének expresszióját. Mindezt azok a kísérletek bizonyítják, melyek során az UV-B megvonás hatására egyrészt a Rubisco aktivitásának, másrészt a sejten belüli koncentrációjának növekedését figyelték meg (BISCHOF és mtsai., 2002). A Rubisco gátlását azonban az UV-B/PAR arány is erısen befolyásolja. Az emelt UV-B sugárzás a Rubisco enzimet csak alacsony PAR mellett gátolja, magas PAR mellett azonban a gátlás mérsékelt, vagy nem mutatható ki. Az UV-B gátolhatja a PSI által közvetített ciklikus fotofoszforilációt is. A kloroplasztisz ultrastrukturális károsodását a keletkezı reaktív oxigéngyökök hatására bekövetkezı lipid-peroxidáció eredményezi. Az UV-B sugárzás hatására - elsısorban alacsony PAR mellett - egyes fajoknál megfigyelték a fénygyőjtı-pigment proteinkomplexhez kapcsolódó fényvédı xantofill ciklus kulcsenzimének, a violaxantin dezepoxidáz aktivitás csökkenését és emiatt a violaxantin-anteraxantin-zeaxantin átalakulás gátlását (PFÜNDEL és mtsai., 1992). Ezzel azonban nagymértékben növekszik a reaktív oxigénformák képzıdésének kockázata, ugyanis a zeaxantin - és valószínőleg az anteraxantin is - részt vesz a fotoszintetikus apparátusban a gerjesztési energiafelesleg hı formájában történı kisugárzásában. Az UV-B sugárzás hatására e védımechanizmusban bekövetkezı gátlás következményeként a kloroplasztisz membránok károsodása, a CO 2 -fixáció csökkenése és a kapcsolódó anyagcsere folyamatok zavara várható. Az UV-B gátolhatja a gerjesztési energia átvitelét a fotorendszerekben az antennapigmentek és a reakciócentrumok között (TURCSÁNYI és VASS, 2000). Az UV- B sugárzás károsíthatja a fotoszintetikus pigmenteket, különösen a klorofillokat, bár 24

25 egyes fajoknál UV-B sugárzás hatására a fotoszintetikus pigmentek mennyiségének növekedését mutatták ki (MIDDLETON és TERAMURA, 1994). A klorofilltartalom csökkenésének az oka egyrészt a fotodestrukció, másrészt a klorofill bioszintézis gátlása. Az UV-B-vel szemben a klorofill-b érzékenyebb, mint a klorofill-a, emiatt a klorofill a/b arány növekedése az UV-B érzékenység jó indikátora lehet. A mezıgazdasági növények vizsgálatával foglalkozó tanulmányok alapján megállapítható, hogy az UV-B sugárzás hatására a klorofilltartalom csökkenése a kétszikő fajokban nagyobb mértékő (10-78%), mint az egyszikőekben (0-33%) (KAKANI és mtsai., 2003). Az UV-B sugárzás során fellépı CO 2 -asszimiláció csökkenést elıidézheti a sztóma konduktancia csökkenése is. A sztóma konduktanciában UV-B expozíció során bekövetkezı csökkenést azzal magyarázzák, hogy UV-B sugárzás hatására a sztómazárósejtek membránjának ionpermeabilitása megváltozik és a zárósejtek K + -ion koncentrációja csökken (NEGASH és BJÖRN, 1986). Az UV-B nemcsak a sztómanyitottságra lehet hatással, KOSTINA és mtsai. (2001) terepi vizsgálatai igazolták, hogy az emelt szintő UV-B sugárzás hatására a sztómaméret és a sztómasőrőség is nı. Az emelt szintő UV-B sugárzás növekedésre való hatásával kapcsolatos eredmények alapján elmondható, hogy a növények érzékenysége eltérı az egyes fejlıdési stádiumokban, így nemcsak a fiatal és idıs levelek, hanem a magoncok, a csemeték és a kifejlett, idıs növények válaszai is nagyon eltérıek lehetnek. Az UV-B sugárzás a növényi szervek közül a leveleken okozhatja a legfeltőnıbb változásokat (perzselıdés, bronzosodás, klorózis, a levélalak torzulása). A növények különbözı levélmorfológiai és anatómiai változások révén elkerülhetik, hogy az UV-B sugárzás a mélyebben elhelyezkedı asszimiláló szövetekhez nagy dózisban bejuthasson. A levélepidermisz UV-B áteresztıképessége a különbözı növénycsoportokban és termıhelyeken azonban jelentıs eltérést mutat. UV-B sugárzásnak kitett növényeken különbözı növekedési és fejlıdési rendellenességek léphetnek fel. A levélterület, amelynek nagysága a fényabszorpció hatékonyságát döntıen meghatározza, legtöbbször jelentısen csökken, egyes fajoknál akár 60%-kal is (KULANDAIVELU és mtsai., 1997). Ugyanakkor a levelek vastagságában vagy a hajtáshosszban fajtól függıen pozitív és negatív irányú változásokat egyaránt megfigyeltek (JOHANSON és 25

26 mtsai., 1995). SANTOS és mtsai.(1993) levél vékonyodásról számoltak be a nagyobb UV-B kitettség következményeként. A növekedési rendellenességek molekuláris okai a DNS és/vagy a fitohormonok szerkezetében bekövetkezı változások. A megnyúlásos növekedést stimuláló fitohormon, az indolecetsav (IES) az UV-B-tartományban jól abszorbeál, és ennek következményeként fotolitikusan bomlik. Az IES-koncentráció csökkenése és a bomlás során képzıdı gátló hatású termék (3-metilén-oxindol) pedig csökkenti a hosszanti növekedést (ROS és TEVINI, 1995). Az UV-B sugárzásnak a növekedésre és a fejlıdésre gyakorolt hatását kapcsolatba hozzák az etilénprodukció megemelkedésével (PREDIERI és mtsai., 1995) is. Az UV-B hatására növekszik a peroxidázok (pl. IES-oxidáz) aktivitása is, amelyek meghatározó szerepet játszanak a sejtmegnyúlás csökkentésében és az oxidatív gyökök közömbösítésében. Az UV-B hatására csökken a gyökér/hajtás arány is (POULSON és mtsai., 2002), ami a fajok közötti kompetíciós viszonyokat és egyes fajoknál a mikorrhizagyökér kapcsolatok kialakulását is befolyásolhatja (VAN DE STAAIJ és mtsai., 2001). Az UV-B sugárzás hatására a növény föld feletti részein kisebb levelek, rövidebb hajtás, de több hajtás és több levél kialakulása jellemzı. Az UV-B sugárzás során változás léphet fel a virágzási idıben és idıtartamban (STAXÉN és BORNMAN, 1994), sıt a virágok számában is. Dél-Amerikában, különösen Chilében, ahol az UV-B sugárzás jelentısen emelkedett az elmúlt években, a kukorica esetében a porzós és a termıs virágok érésének aszinkronitása ma is aktuális problémát jelent. BARNES és mtsai.(1990) és TEVINI (1993) tanulmányaikban arról tesznek említést, hogy a mesterséges körülmények között alkalmazott nagyobb UV-B sugárzás a kukorica virágzási idejét 2-3 nappal késlelteti, valamint szignifikánsan növeli a portok falában a sugárzást abszorbeáló pigmentek mennyiségét, és hatással van a pollen termékenyítı képességére is (SANTOS és mtsai., 1998). Az UV-B sugárzásnak a kukorica pollenre gyakorolt negatív hatásáról számolt be WALBOT (1999) is. Többek között megállapította, hogy a károsítás mértéke nagymértékben a sugárzás idıtartamától függ. Transzgénikus Bt kukoricákkal végzett kísérletek eredménye viszont az, hogy a hosszabb ideig tartó UV-B kezelés a pollen rovarral szembeni toxicitására nincs hatással (OHLFEST és mtsai., 2002). FLINT és CALDWELL (1984) megállapította, hogy a portok fala az UV-B abszorbeáló pigmentek nagymértékő felhalmozódásának köszönhetıen az UV-B közel 80%-át képes elnyelni. A bibére 26

27 kerülı pollent azonban az UV-B közvetlenül károsíthatja, és ez különbözı rendellenességeket okozhat nemcsak a megtermékenyítés folyamatában, hanem a fejlıdı növény tulajdonságaiban is. A levelek epidermisze az elsı, napsugárzásnak közvetlenül kitett szövet, amely azonban a belsı szövetekbe bejutó fény mennyiségét és összetételét képes megváltoztatni. Fontos szerepe van az UV-B sugárzás károsító hatásaival szembeni védelemben, és hatékonysága függ a levélfelszín sajátosságaitól (kutikula, viasz felhalmozódás, levélszırök), valamint az UV-B abszorbeáló pigmentek jelenlététıl (flavonoidok, antociánok). Fényáteresztı képessége fordítottan arányos az UV-B szőrı pigmentek mennyiségével és a levélvastagsággal (DAY és mtsai., 1992). A levélfelszíni tulajdonságok és velük együtt az UV-B áteresztı képesség még ugyanazon faj, ill. levél esetében is nagy változatosságot mutat a fejlıdési fázisoktól vagy a térbeli elhelyezkedéstıl függıen. Fiatal, fejlıdı levelek mindkét oldalukon szırözöttek, a fejlıdés során azonban az adaxiális oldalon lévı szırök folyamatosan eltőnnek (KARABOURNIOTIS és mtsai., 1992). Az epikutikuláris viaszok felhalmozása a növények fontos védelmi mechanizmusa, ami csökkenti egyrészt a transzspirációs vízvesztést, másrészt pedig a levelek belsejébe bejutó UV-B sugárzást. Az UV-B sugárzás hatására a DNS-molekulában képzıdı ciklobután típusú pirimidin dimerek (CPD) javítása a fotoreaktiváció során megy végbe. A javító mechanizmus a DNS-fotoliáz nevő enzimhez kötıdik, amely fényfüggı, és mivel a nm közötti tartomány (kék/uv-a) energiáját használja fel a CPD-k monomerizálásához, ezért elmondható, hogy az UV-A sugárzás jelenléte a javító mechanizmus hatékonyságát nagymértékben meghatározza (QUAITE és mtsai., 1992). Az UV-B abszorbeáló aminosavak átalakulása miatt ez a javító kapacitás csökkenhet, különösen az epidermiszben lokalizálódó fotoliáz esetében. A kloroplasztiszokban az UV-B sugárzás hatására bekövetkezı fotoszintézis aktivitás-csökkenés miatt jelentısen megnövekszik a felesleges gerjesztési energia kisugárzásában résztvevı fotoprotektív folyamatok (pl. xantofill ciklus) szerepe. Nagyobb UV-B dózis vagy hosszan tartó UV-B expozíció során azonban e folyamatok kimerülhetnek vagy sérülhetnek, és reaktív oxigénformák (hidroxil- és szuperoxid gyökök, hidrogén-peroxid) képzıdhetnek (MÉSZÁROS, 2003). A szuperoxid gyökök fıleg a PSI és a PSII közelében keletkeznek, míg a hidroxil gyökök és a H 2 O 2 27

28 mennyisége a tilakoid membránok sztróma felıli oldalán emelkedik meg. A reaktív oxigénformák, mint másodlagos stressztényezık a sejtmembrán-lipidek peroxidációját okozzák (DAWAR és mtsai., 1998), mellyel szemben a szuperoxid-dizmutáz (SOD) nyújt védelmet. A peroxidázok és katalázok mőködése szorosan kapcsolt a SOD aktivitásával. Az UV-B sugárzás által generált reaktív oxigénformákkal szembeni biokémiai védelemben fontos szerepe van a nem enzimatikus antioxidánsoknak, az α- tokoferolnak (E vitamin), a glutationnak (GSH), az aszkorbinsavnak, a ß-karotinnak és a flavonoidoknak is. A növényekben az UV-B sugárzás által kiváltott legáltalánosabb válaszreakció a flavonoidok felhalmozódása (DAY és mtsai., 1992; LÁPOSI és mtsai., 2002) elsısorban az epidermiszben. A flavonoidok az edényes növényekben széles körben elterjedt vízoldékony fenolszármazékok, melyek nm között erıs elnyelést mutatnak, abszorpciós maximumuk 300 nm körül van, és hosszú idın keresztül stabilak maradnak. Az UV-B sugárzás hatására (de a PAR és az UV-A hatására is), ha nem túlságosan nagy a dózisa, fokozódik azon gének kifejezıdése (BUCHHOLZ és mtsai., 1995), melyek a flavonoidok bioszintéziséért felelıs kulcsenzimeket (PAL, CHS) kódolják. A flavonoidok számos csoportja közül a legelterjedtebbek és legjelentısebbek a flavonolok, a flavonok és az antocianinok. A flavonoidok a fenilpropanoid anyagcsereút során képzıdnek (1. ábra) az epidermisz és mezofillum sejtek citoplazmájában, és az adaxiális levélepidermisz vakuólumaiban vagy a levélszırökben halmozódnak fel (HUTZLER és mtsai., 1998) rendszerint O-glikozidok formájában (KARABOURNIOTIS és mtsai., 1992), esetleg a pollenekben, a termı- és porzótáj egyes részeiben, a vakuólumokban és a sejtfalban. A kétszikőek többségére (pl. bab, szója, borsó, mustár, petrezselyem) általában a flavonoidok epidermális felhalmozódása jellemzı, míg az egyszikőek nagy részénél (pl. árpa, rozs, kukorica, rizs) az epidermiszben és a mezofillumban egyaránt felhalmozódnak. A flavonoidok UV-B sugárzás során nemcsak epidermális szőrıként játszanak fontos védıszerepet, hanem részt vesznek a reaktív oxigénformák eltávolításában is (CHALKER-SCOTT, 1999). 28

29 1. ábra. Flavonoid formák eredete növényekben UV-B kezelés során az oxidatív károsodás megelızésében elıször az antioxidáns enzimek (SOD, kataláz, APX) aktivitása növekszik, majd további UV-B expozíció során fokozódik a flavonoid-felhalmozódás, mely vegyületcsoport hatásának végeredménye azonos az antioxidáns enzimekével (DAWAR és mtsai., 1998). A 29

30 szekunder metabolitok különbözı csoportjai közül a flavonoidok rendelkeznek a legnagyobb számú hidroxilcsoporttal, ezek jelenlétének tulajdonítható gyökfogó képességük. A reaktív oxigénformák eltávolításával részt vesznek az oxidatív károsodások elkerülésében és így stabilizálják a membránstruktúrát, gátolják a lipidperoxidációt. Az elmúlt kb. 20 év vizsgálatai alapján világosan látszik, hogy az UV-B sugárzás leggyakoribb hatása az UV-B szőrı pigmentek mennyiségének növekedésében nyilvánul meg (ROZEMA és mtsai., 2002), és ez hatékony védelmet nyújthat a növényekben lévı érzékeny célpontoknak, mint pl. a fotoszintetikus apparátusnak. Ez a védelem gyorsan aktiválható, széles skálán mozog, de fajonként eltérı. Éppen ezért az UV-B sugárzás károsító hatása a növények növekedésére, a fotoszintetikus folyamatokra (levél gázcsere és klorofill-fluoreszcencia), a fotoszintetikus pigmentek koncentrációjára (klorofillok és karotinoidok) nem minden fajnál jelentkezik egyértelmően (SEARLES és mtsai., 2001). A napsugárzás napszakos és évszakos fluktuációja során az UV-B sugárzás magas értékei együtt jelentkeznek a fotoszintetikusan aktív sugárzás (PAR) nagy intenzitásával, és ez utóbbi önmagában is képes a fotoszintetikus apparátus károsítására és fotoinhibíció elıidézésére. Az UV-B sugárzás hatása nagymértékben függ a fotoszintetikusan aktív sugárzás szintjétıl (MEIJKAMP és mtsai., 2001). A növények jóval érzékenyebben reagálnak az UV-B sugárzásra, ha a nevelıkamrákban kisebb a látható fény és az UV-A intenzitása, mint a természetes napsugárzási feltételek között (MIDDLETON és TERAMURA, 1994; MÉSZÁROS és mtsai., 2000). Ezért a nevelıkamrás UV-B expozíciós kísérletek eredményei alapján csak korlátozott mértékben vonhatók le következtetések a termıhelyi hatásokat illetıen. Megfigyelték, hogy minél magasabb a kísérletekben a PAR szintje, annál kisebb mértékő az UV-B sugárzás génszintő hatása a fotoszintetikus rendszerekre (STRID és mtsai., 1994). A különbözı növényfajok az UV-B sugárzással szemben igen eltérı érzékenységet mutatnak. Az evolúció során a termıhely ökológiai adottságaitól függıen szelektálódtak ki a magasabb UV-B szintet tolerálni képes fajok. Számos szerzı tanulmányozta a megemelkedett UV-B sugárzás kultúrnövényekre gyakorolt hatását szántóföldi és üvegházi körülmények között. KAKANI és mtsai. (2003) 30

31 összefoglaló munkája szerint a leggyakrabban vizsgált növények a rizs (DAI és mtsai., 1994), a szója (YANQUN és mtsai., 2003), búza (DAWAR és mtsai., 1998), bab (BOLINK és mtsai., 2001), lóbab (MEIJKAMP és mtsai., 2001), borsó (MACKERNESS és mtsai., 1999), árpa (LIU és mtsai., 1995), napraforgó (ROS és TEVINI, 1995), dohány (IZAGUIRRE és mtsai., 2003), uborka (BALLARÉ és mtsai., 1991), melyek tanulmányozása során jelentıs különbségeket tapasztaltak faj, fajta és populáció tekintetében is az UV-B sugárzás növekedésre, fotoszintézisre és a terméshozamra vonatkozó hatásaival kapcsolatban. Egyértelmő tendenciák a megfigyelt paraméterek esetében nem voltak kimutathatóak. Ugyanazon biokémiai/fiziológiai/növekedési paraméter esetében egyaránt megfigyeltek drasztikus csökkenést (DAI és mtsai., 1994), semleges hatást (TERAMURA és MURALI, 1986) és stimulációt is (TERAMURA és mtsai., 1990). Azonban kísérleti növényként e témában viszonylag kevés tanulmányban találkozhatunk az egyik legfontosabb gazdasági növényünkkel, a kukoricával. HART és mtsai. (1975), SANTOS és mtsai. (1998) a megemelkedett UV-B sugárzásnak a kukorica virágzásának idıtartamára, PFAHLER (1981) a pollen csírázóképességére és a pollentömlı növekedésére, VU és mtsai. (1982), SANTOS és mtsai. (1990) a szénhidrát akkumulációra, BASIOUNY és mtsai. (1978), SANTOS és mtsai. (1993) pedig a levél klorofill és az összes oldható fehérje mennyiségére gyakorolt hatását vizsgálták. CASATI és WALBOT (2003, 2005), valamint LONG és mtsai. (2003) tanulmányaikban a kukorica epidermisz UV-B sugárzás abszorbeálásában szerepet játszó pigment- és viaszrétegének fontosságát hangsúlyozták. BARZIG és MALZ (2000) csemegekukorica levelek mintáit vizsgálva megállapították, hogy a magas UV-B sugárzás nem okozott számottevı károsodást. Ugyanakkor az epidermális sejtrétegek kb. egyharmadánál történı változások - sejtfal és membrándeformálódások - arra figyelmeztetnek, hogy a tolerancia nem véges. TERAMURA és SULLIVAN (1994) a kukoricát az UV-B sugárzásra érzékeny fajok közé sorolta. A mezıgazdasági növények vizsgálata során kapott eredményekkel közelebb kerültünk az UV-B sugárzás hatásainak megértéséhez. A teljesség igénye nélkül megemlítendı ezek közül az UV-B sugárzás potenciális molekuláris célpontjainak meghatározása (STRID és mtsai., 1994), az UV-B akciós spektrumának meghatározása a PSII károsodásában, a karotinoidok és flavonoidok szerepe az UV-B sugárzás elleni 31

32 védelemben, az UV-B génszintő hatása a klorofill bioszintézisre, antioxidáns rendszerek szerepe az UV-B alatti lipid peroxidáció kivédésében (BARABÁS és mtsai., 1998; HIDEG és mtsai., 2002), a reaktív oxigéngyökök szerepe a génaktivációban (MACKERNESS és mtsai., 1999), vagy az UV-B sugárzás növényi hormonokra gyakorolt hatása (ROS és TEVINI, 1995). Az UV-B sugárzás hatására indukálódó kék és zöld fluoreszcencia - mely fajonként eltérı, és amelyet pl. a flavonoidok, a ferulasav, a különbözı fenolvegyületek, NADPH- és flavinnukleotidok sugároznak ki - jól tükrözi a növény fiziológiai állapotát, és detektálása lehetıséget nyújt az UV-B sugárzás hatására felhalmozódó vegyületek elhelyezkedésének megállapítására mezıgazdasági növényekben is (HIDEG és mtsai., 2002) Az oxidatív stressz A legtöbb stresszhatás - így az alacsony hımérsékleti és UV-B stressz is - közvetve vagy közvetlenül oxidatív károsodással jár együtt. A reaktív oxigénformák az aerob anyagcsere eredményeként különbözı mértékben minden növényben jelen vannak. Stressz hatására azonban jelentısen megnıhet a reaktív oxigénformák (ROS reactive oxygen species) koncentrációja a sejtekben. Amennyiben ez a növekedés nagymértékővé válik, a reaktív oxigénformák a legtöbb biomolekulával, elsısorban nukleinsavakkal, lipidekkel, fehérjékkel és szénhidrátokkal reakcióba lépve azokat károsítják, mely folyamat akár a sejt pusztulásához is vezethet (HASEGAWA és mtsai., 2000) A reaktív oxigénformák típusai Gerjesztési energia hatására a molekuláris oxigénbıl szinglet oxigén (¹O 2 ) keletkezik. Ez vizes közegben 4 µs ideig van jelen, majd átadja gerjesztési energiáját, illetve reakcióba lép egyes biológiai vegyületekkel és endoperoxidokat, vagy hidroperoxidokat hoz létre. Egy elektron felvételével a molekuláris oxigénbıl szuperoxid-aniongyök (O 2 ) keletkezik, mely kinonokat vagy átmeneti fémkomplexeket (Fe 3+, Cu 2+ ) redukálhat, így befolyásolva egyes fémtartalmú enzimek aktivitását. Ez közepesen reakcióképes, 32

33 rövid féléletidejő (2-4 µs) ROS, mely nem jut át a sejtmembránon. Vizes oldatban egy proton felvételével hidroperoxil gyökké (HO 2 ) alakul, mely már át tud jutni a sejtmembránon és hidrogén atomok elvonásával lipid autooxidációt indíthat A szuperoxid-gyök további elektronfelvétellel hidrogén-peroxiddá (H 2 O 2 ) alakulhat (VRANOVÁ és mtsai., 2002). A hidrogén-peroxid közepes reakcióképességő, viszonylag hosszú (1 ms) féléletidejő molekula, amely bizonyos távolságra membránokon keresztül is képes diffundálni. Tiol-csoportjuk oxidációja által enzimeket is inaktiválhat (pl. Cu/Zn-SOD, Fe-SOD). A legreaktívabb oxigénforma a hidroxil-gyök (OH ), mely hidrogén-peroxidból keletkezik a Haber-Weiss vagy Fenton reakció során fém katalizátor jelenlétében. A fémionok általában oxidált formában fordulnak elı a sejtekben. Szuperoxid-gyök jelenlétében azonban redukálódnak és így képessé válnak arra, hogy a hidrogénperoxid átalakulását katalizálják hidroxil-gyökké. A hidroxil-gyök bármely biológiai molekulával képes reakcióba lépni, túlzott termelıdése a sejt halálához vezet. A sejtek nem rendelkeznek olyan enzimmel, mely képes lenne eliminálni a hidroxil-gyököt, ezért fontos, hogy szigorú szabályozás alatt álljon a hidrogén-peroxid és a szuperoxidgyök mennyisége a sejtekben Az antioxidáns védekezırendszer Az antioxidáns védekezırendszert enzimatikus és nem-enzimatikus komponensekre különíthetjük el. A nem-enzimatikus rendszert antioxidáns tulajdonságú vegyületek alkotják, melyek lehetnek vízben oldódók, ezek közül kiemelt fontosságú a glutation (GSH, γ-glutamil-ciszteinil-glicin) és az aszkorbinsav, illetve zsírban oldódók, mint például az α-tokoferol, vagy a β-karotin. Az enzimatikus elemek egy része (APX, GR) e vegyületek reakcióit, vagy regenerációját katalizálva vesz részt a reaktív oxigénformák eliminálásában. A legfontosabb enzimatikus antioxidánsokat több nagy rendszerbe sorolhatjuk, amelyek a reaktív oxigénformák keletkezésének helyén fordulnak elı. Ide tartoznak pl. a SOD-ok, a víz-víz ciklus, az aszkorbátglutation ciklus, a katalázok, és a glutation-peroxidáz ciklus (MITTLER, 2002; HOLUIGUE és mtsai., 2007). 33

34 Szuperoxid-dizmutázok A szuperoxid-dizmutázok (SOD; EC ) az oxidatív károsodás elleni védelem elsı vonalát alkotó fém-tartalmú enzimek, melyek a szuperoxid gyököket alakítják át hidrogén-peroxiddá az alábbi reakció alapján: 2 O H + O 2 + H 2 O 2 Minden aerob szervezetben megtalálhatók, növényekben a fém kofaktor alapján háromféle SOD-ot különböztetünk meg: Cu/Zn-SOD, mely elsısorban a citoszolban, de a kloroplasztisz sztrómában és a peroxiszómában is megtalálható, Mn-SOD, mitokondriális és peroxiszomális enzim, Fe-SOD, csak egyes fajok kloroplasztiszaiban azonosították eddig (BUENO és mtsai., 1995) A víz-víz ciklus A víz-víz ciklus lényege, hogy a fotoszintetikus elektrontranszportláncon a PSIen keresztül érkezı elektronok egy része molekuláris oxigénre kerülhet szuperoxidgyököt képezve. Ezt a SOD alakítja hidrogén-peroxiddá, melyet egy, a kloroplasztisz tilakoidmembránjában lokalizált APX monodehidro-aszkorbinsav képzıdése mellett alakít vízzé. Az így keletkezett monodehidro-aszkorbinsav a PSI ferredoxinja segítségével redukálódik ismét (ASADA, 1999). 34

35 Az aszkorbát-glutation ciklus A kloroplasztiszokban nincs katalázaktivitás, így az ott keletkezı H 2 O 2 -ot az ún. aszkorbát-glutation ciklus semlegesíti (2. ábra). A folyamat elsı lépéseként a keletkezett hidrogén-peroxidot a kloroplasztiszok sztrómájában lokalizált APX monodehidro-aszkorbinsavvá redukálja aszkorbinsav felhasználásával. A monodehidro-aszkorbinsav egyrészt spontán aszkorbinsavvá és dehidroaszkorbinsavvá diszproporcionálódik, másrészt NADPH-függı monodehidro-aszkorbinsav-reduktáz segítségével közvetlenül aszkorbinsavvá alakulhat. A diszproporció során keletkezett dehidroaszkorbinsav redukcióját a dehidroaszkorbinsav-reduktáz végzi redukált glutation (GSH) hidrogénjének kárára. Az így keletkezett oxidált glutation (GSSG) redukcióját a GR enzim végzi NADPH felhasználásával. E rendszer enzimei és szubsztrátjai nemcsak a kloroplasztiszban, hanem más sejtkompartmentekben is megtalálhatók (KLAPHECK és mtsai., 1990). 2. ábra. Az aszkorbát-glutation ciklus (Mittler, 2002, Trends in Plant Science alapján) Aszkorbát-peroxidázok Az aszkorbát-peroxidázok (EC ) vastartalmú fehérjék, melyek kulcsszerepet játszanak az oxidatív stressz elleni védelemben (SHIGEOKA és mtsai., 2002). Szemben számos gvajakol-peroxidáz (EC ) izoenzimmel, melyek a vakuólumban, sejtfalban vagy a citoszolban találhatók, az APX-ok a citoszolon kívül több elkülönült sejtkompartmentben, a kloroplasztisz sztrómájában ill. tilakoid 35

36 membránjában, mikroszómákban, úgymint glioxiszómában és peroxiszómákban, vagy membránhoz kötötten helyezkednek el. Mitokondrium membránhoz kötött, ill. kloroplasztiszok tilakoidmembránjának lumenében lokalizált APX jelenlétét is igazolták. Az APX-ok zöme nagy specifitással rendelkezik aszkorbinsavra, mint elektrondonorra nézve, bár egyes izoenzimek bizonyos mértékben képesek mesterséges donorokat (pirogallol, gvajakol) is használni. Jellemzı rájuk, hogy különösen fotooxidatív körülmények között aszkorbinsav hiányában aktivitásukat veszthetik. Aszkorbinsav jelenlétében a következı reakciót katalizálják: 2 aszkorbinsav + H 2 O 2 2 dehidroaszkorbinsav + 2 H 2 O Jelenlegi ismereteink szerint Arabidopsis növényekben az Apx géncsaládot két citoszolikus (AtApx1, AtApx2), két peroxiszómás (AtApx3, AtApx4)és két kloroplasztidális gén (egy tilakoidkötött, tatapx és egy sztróma-lokalizált, satapx) alkotja (SHIGEOKA és mtsai., 2002). Ezzel szemben rizsben jelenleg 8 Apx gén, két citoszolikus, két peroxiszómás és két kloroplasztidális ismert (TEIXEIRA és mtsai., 2004), paradicsomban pedig feltehetıen 7 Apx gén található Glutation-reduktázok A glutation-reduktázok (EC ) NADPH-függı heterotetramer enzimek, melyek a következı reakciót katalizálják: GSSG + NADPH + H + 2 GSH + NADP + Növényekben a GR aktivitás nagy része a kloroplasztiszokban mutatható ki (BIELAWSKI és JOY, 1986), de azonosították a mitokondriumban, a peroxiszómákban és a citoszólban is (FOYER és mtsai., 1991; HOLUIGUE és mtsai., 2007). A fentebb említett aszkorbát-glutation cikluson kívül a citoszolban és a peroxiszómákban részt vesz az ún. glutation-peroxidáz ciklusban is a glutation-peroxidáz enzim hidrogéndonoraként szolgáló redukált glutation (GSH) regenerációja által (HOLUIGUE és mtsai., 2007). Borsólevélben több izoenzimét is kimutatták (EDWARDS és mtsai., 1990). Stresszhatásra általában növekedés tapasztalható az enzim aktivitásában, 36

37 melynek szerepe lehet a tolerancia kialakulásában (FOYER és mtsai., 1991). Egyes vizsgálatok szerint a kukorica hidegtőrése szoros összefüggést mutat a GR aktivitásával. Gátolt enzimaktivitás hatására csökken a növények hidegtőrése (KOCSY és mtsai., 2000), míg a hidegtőrés indukciója során a GR aktivitása megnı (KOCSY és mtsai., 2001). Transzgenikus nyárfa növényeken végzett vizsgálatokból kitőnik, hogy a glutation-reduktázt túltermelı növények fokozott ellenállóságot mutatnak a fotoinhibícióval szemben (FOYER és mtsai., 1995). Ugyanakkor az összglutation szint növelése a glutation-szintetáz enzimet túltermelı transzgenikus növényekben nem eredményezett hasonlóan fokozott stressztoleranciát (FOYER és mtsai, 1995).A GR szerepe nem egyszerően a hidrogén-peroxid detoxifikációjában rejlik, hanem a redukált:oxidált glutation (GSH:GSSG) arány finom szabályozásával részt vesz a sejt redox állapotának kialakításában, a védekezı folyamatok beindításában (FOYER és mtsai., 1991) Katalázok A katalázok (EC ) a hidrogén-peroxid dizmutációval történı közömbösítését végzik az alábbi reakció alapján: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 A H 2 O 2 koncentrációtól függıen azonban a kataláz enzimnek kétféle lehetséges mőködése van (DEISSEROTH és DOUNCE, 1970). Magas H 2 O 2 koncentráció mellett a fent leírt gyorsabb, ún. katalitikus módon mőködik. Ennek során mind a donor, mind pedig az akceptor szerepét a H 2 O 2 tölti be, így a kataláz egyszerre két molekula H 2 O 2 -t képes közömbösíteni, és ehhez nem igényel redukáló erıt. Alacsony hidrogén-peroxid koncentráció (<10-6 M) mellett viszont, az ún. peroxidatikus út mőködik, ahol különbözı vegyületek (etanol, aszkorbát, RH 2 ) tölthetik be a hidrogén-donor szerepét az alábbi reakció szerint: RH 2 + H 2 O 2 R + 2 H 2 O 37

38 A kataláz széles körben elterjedt enzim, mely aerob baktériumoktól kezdve a magasabb rendő növényekig és állatokig minden élılényben elıfordul. A kataláz négy alegységbıl felépülı hem-tartalmú enzim. Elıfordul homo-, illetve heterotetramerként is. A különbözı alegységek expressziója fejlıdés- és szövetspecifikus. A növényi katalázokat egy kis géncsalád kódolja, mely általában három, de legfeljebb négy izoenzim génbıl áll. Kukoricában és dohányban jól ismert a különbözı izoformák elıfordulása, expressziójuk szabályozása (SCANDALIOS és mtsai., 1997). Kukoricában három, egymástól független gént (cat1, cat2 és cat3) találtak, melyek biokémiailag különbözı kataláz enzimeket kódolnak (kataláz1, kataláz2 és kataláz3). A kataláz1 és kataláz2 izoenzimek a glioxiszómákban vagy peroxiszómákban, míg a kataláz3 fehérjék a mitokondriumban találhatók. Ez utóbbi C-terminálisáról hiányzik a feltételezett peroxiszomális lokalizációs szignál (SRL motivum: Ser-Arg-Leu). Ugyanez figyelhetı meg a rizs KatA és az árpa kataláz2 fehérjék esetében is, melyek aminosav-szekvenciájukban nagy hasonlóságot mutatnak. Ezt a fajta kataláz izoenzimet eddig csak egyszikőekben mutatták ki. A kataláz1 és kataláz2 izoenzimek elıfordulnak homotetramerként, de ahol mindkét gén expresszálódik, heterotetramereket is alkothatnak alegységeik. A kataláz3 in vivo csak homotetramer lehet, mert térben elkülönül a másik két izoformától. A háromféle izoenzim közül a kataláz3 biokémiai tulajdonságai térnek el a leginkább a többitıl. Egyrészt nagyobb peroxidatikus aktivitással bír, mint a kataláz1 vagy a kataláz2. A katalitikus és a peroxidatikus út aránya (R P/C ) jellemzi az egyes kataláz enzimeket. A kataláz2 esetében ez R P/C = 0,25, tehát az enzim inkább a katalitikus úton mőködik, míg kataláz3 esetében (R P/C = 17,6) a peroxidatikus út dominál. Másik jelentıs különbség, hogy különféle gátlószerekkel szemben (aminotriazol, cianid, stb.) ellenállóbbnak bizonyul a kataláz3. A kataláz gének expressziója egyrészt változik az egyedfejlıdés során, másrészt a különbözı szövetekben, illetve sejttípusokban is eltérı lehet (SCANDALIOS és mtsai., 1997). A kukorica levélben például a kataláz1 és a kataláz3 izoenzim a mezofillsejtekben fordul elı, a kataláz2 pedig a hüvelyparenchima sejtek peroxiszómáiban (TSAFTARIS és mtsai., 1983). Részletesen vizsgálták különbözı kezelések, stresszek hatását a kataláz enzim expressziójára, és megállapították, hogy az egyes izoenzimek eltérıen reagálnak. Külsıleg alkalmazott H 2 O 2 hatása 38

39 koncentrációfüggı volt. Alacsony H 2 O 2 koncentráció (1 mm) serkentette a cat1 expresszióját, míg magasabb koncentrációk hatására alacsony szintre csökkent. A cat2 expressziója ellenben 10 mm H 2 O 2 felett mutatott indukciót. Alacsony hımérséklet (14ºC, illetve 4ºC) hatására megnıtt a kataláz mennyisége. Ez elsısorban a cat1 indukciójából ered, a kataláz2 növekedése kisebb mértékő (SCANDALIOS és mtsai., 1997). A hidrogén-peroxid lebontásban a kataláznak elsıdleges szerepe van (WILLEKENS és mtsai., 1997). A katalázhiányos transzgenikus dohánynövényeken alacsony fényintenzitás mellett nem látszott kóros elváltozás, magas fényintenzitáson viszont szöveti elhalás történt, ami a fotorespiráció következménye volt. A nekrózis során a H 2 O 2 szint nem emelkedett meg, a kataláz hiányát ebbıl a szempontból kompenzálta a megemelkedett APX és POD aktivitás. Ellenben a sejt redox egyensúlya nem maradt fenn a kataláz hiányában: az oxidált glutation felhalmozódott, és az aszkorbát szint negyedére csökkent (WILLEKENS és mtsai., 1997). A katalázhiányos transzgenikus dohánynövények továbbá érzékenyebbnek bizonyultak a parakvát- só- és ózonstresszre, viszont az alacsony hımérséklettel szemben nem mutattak nagyobb érzékenységet (WILLEKENS és mtsai., 1997) A reaktív oxigénformák élettani szerepe A sejtekben keletkezı reaktív oxigénformák mennyiségét - a fentebb leírtak alapján is látható módon - összetett antioxidáns védekezı mechanizmusok szabályozzák. A reaktív oxigénformáknak sejtkárosító hatásuk mellett azonban szerepük lehet jelátviteli folyamatokban is, elsısorban az antioxidáns és más védekezı mechanizmusok beindításában (PRASAD és mtsai., 1994; FOYER és mtsai., 1997). Az antioxidánsok tehát nemcsak megakadályozzák a reaktív oxigénformák nagy mennyiségő felhalmozódását, hanem lehetıvé teszik kis koncentrációváltozások érzékelését, finom szabályozását. Az elmúlt években számos esetben igazolták a reaktív oxigénformák génexpresszió-reguláló szerepét többek között biotikus stresszfolyamatok (ALVAREZ és mtsai., 1998), ózonstressz (LANGEBARTELS és mtsai., 2002) vagy pl. fénystressz (KARPINSKI és mtsai., 1999; VANDENABEELE és mtsai., 2003; VANDERAUWERA és mtsai., 2005) során. Külsıleg adott abszcizinsav hatására 39

40 megnı a H 2 O 2 mennyisége, így feltételezik, hogy a H 2 O 2 szerepet játszhat a különbözı abszcizinsav-hatások közvetítésében, mint pl. a cat1 expresszió, vagy a sztómazáródás indukciójában. A hidrogén-peroxid számos különbözı stresszhatás következtében aktiválódó jelátviteli folyamat közös komponense, így szerepe lehet a kereszttolerancia jelenségének kialakulásában (PASTORI és FOYER, 2002). Dohány, paradicsom és nyír fajokban az ózon-indukált sejthalált hidrogén-peroxid felhalmozódás elızi meg, ezzel szemben Arabidopsis, Rumex és Malva fajok esetében a szuperoxid-gyök a felhalmozódó reaktív oxigénforma (WOHLGEMUTH és mtsai., 2002). Szójababban a NO és a H 2 O 2 aránya volt döntı a sejthalál indukciójában (OVERMYER és mtsai., 2003). Biotikus stresszválaszok mellett úgy tőnik, hogy abiotikus stresszek esetén is szerepet játszhat a membránkötött NADPH-oxidáz. Kukoricában kimutatták, hogy ozmotikus stresszhatásra, illetve külsıleg adott abszcizinsav hatására megnı a NADPH-oxidáz aktivitása (JIANG és ZHANG, 2002). Ezzel együtt megnıtt a levelek szuperoxid-gyök tartalma, és számos antioxidáns enzim aktivitása fokozódott (szuperoxid-dizmutáz, kataláz, aszkorbát-peroxidáz és glutation-reduktáz) A növények fluoreszcencia sajátságai A növényekben elıforduló anyagok nagy része megfelelı hullámhosszú gerjesztés hatására fluoreszkálni képes. UV-gerjesztés hatására a levelek a kék spektrális tartományban 440 és 460 nm között emissziós maximumot (F440), illetve a zöld tartományban 520 és 530 nm körül egy változó mértékben jelentkezı vállat (F520) mutatnak (CHAPPELLE és mtsai., 1984; STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A zöld levelekben a kék és zöld fluoreszcencia elsısorban a klorofillmentes epidermiszsejtekbıl és a legnagyobb levélerekbıl, sejtfalakból származik (LANG és LICHTENTHALER, 1994; STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A mezofill sejtekben kék és zöld fluoreszcencia emissziót nem, vagy alig tapasztalunk, mert azt a mezofillsejtek fotoszintetikus pigmentjei részben, vagy egészben abszorbeálják (STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A reabszorpció a zöld fluoreszcenciát kevésbé érinti, ezért az a kék fluoreszcenciához képest az erek közötti területen intenzívebb, mint az 40

41 edénynyalábokban, de mindezzel együtt is csak esetenként magasabb, mint a kék fluoreszcencia intenzitása (LICHTENTHALER és mtsai., 1996). SCHWEIGER (1999) vizsgálatai 21 különbözı növényfajban azt mutatták, hogy jelentıs kék fluoreszcencia kibocsátó a sejtfal-poliszaharidokkal észteresített ferulasav. A kék fluoreszcenciához a sejtfal más hidroxifahéjsav származékai, mint a p-kumársav és a kávésav csak csekély mértékben járul hozzá. A zöld spektrális tartományban fluoreszkálnak a kempferol és kvercetin glikozidok (SCHWEIGER, 1999), valamint a berberin és a riboflavin (LANG és mtsai., 1991). Ezen kívül a zöld fluoreszcenciát a karotinoidok általi reabszorpció, és az ezt követı reemisszió is befolyásolhatja (LICHTENTHALER, 1995). A gerjesztı UV-sugárzás, ha nem abszorbeálódik az epidermiszben és eljut a parenchima sejtekig, gerjeszti a klorofill-a vörös (F690) és távoli vörös (F740) fluoreszcenciáját elsısorban a paliszád parenchima sejtek felsı kloroplasztisz rétegében, közvetlenül az epidermisz alatt. A laboratóriumban, vagy üvegházban nevelt növények, melyek általában a szabadföldi körülményekhez képest alacsony és UV-szegény megvilágításon nınek, viszonylag intenzív UV-indukálta klorofill-a fluoreszcenciát mutatnak, ami azonban a növénynevelési fény intenzitásának emelkedésével progresszíven csökken (STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A teljes napfénynek, a természetes UV-sugárzásnak kitett szabadföldi növényekben ugyanis az oldható flavonoidok (flavonok, flavonolok, kalkonok), valamint a fahéjsav származékok szintje többszöröse az üvegházi növényekének (LICHTENTHALER és SCHWEIGER, 1998). Ilyenkor a növényt érı UV-sugárzás legnagyobb részét az epidermisz sejtek abszorbeálják, így csak kevés UV-sugárzás jut a levél mezofillumába, s ennek következtében a szabadföldi növényeknek a klorofill-a-tól származó vörös és távoli vörös fluoreszcenciája viszonylag alacsony lesz. Zöld levelekben a klorofill fluoreszcencia az erek közötti intercostalis területekrıl származik. A kék és/vagy a zöld fluoreszcencia mértéke és aránya a vörös klorofill fluoreszcenciához képest fajonként különbözı. Ismeretes, hogy az egyszikőekben a sejtfalhoz kötött fenolok mennyisége sokkal magasabb, mint a kétszikőekben (HARRIS és HARTLEY, 1976; SCHWEIGER, 1999), ennek megfelelıen az egyszikőek pl. főfélék, sások nagyobb intenzitású kék és zöld fluoreszcenciát emittálnak (CHAPPELLE és 41

42 mtsai., 1985; STOBER és LICHTENTHALER, 1993; JOHNSON és mtsai., 2000). A fluoreszcencia intenzitás egyrészt az emittáló anyag koncentrációjától, a leveleknek a spektrális tulajdonságokat befolyásoló tulajdonságaitól, pl. a sejtek elrendezıdésétıl, a sejtek közötti üregektıl, az emittált fluoreszcencia reabszorpciójától, valamint a vörös és távoli vörös fluoreszcenciát illetıen a fotoszintézis, a hıkibocsátás és a klorofill flureszcencia közötti energia eloszlástól függ (BUSCHMANN és mtsai., 2000). A fluoreszcencia sávok intenzitása egy növényen belül (LANG és mtsai., 1991) és fajok között is nagy variabilitást mutat Stresszelt növények leveleinek fluoreszcenciája A különbözı stresszorok hatására fellépı válaszreakciók során a növényekben jellegzetes fluoreszcencia sajátságokkal rendelkezı metabolitok is felhalmozódnak. Ezek éppen olyan anyagok, melyek a kék és a zöld spektrális tartományban emittálnak. A stresszorok közvetve, vagy közvetlenül a fotoszintetikus apparátus módosulását, vagy akár károsodását is okozhatják, ezért a legfontosabb fotoszintetikus pigment, a klorofill-a fluoreszcencia jellemzıit is megváltoztatják. A fluoreszcencia leképezést - elsısorban a vörös és a távoli vörös régióban - kiterjedten alkalmazzák a fotoszintetikus apparátus mőködésének jellemzésére. E célra kidolgozott speciális technikákkal olyan - a fotoszintetikus mőködést jellemzı - paraméterek is közvetlenül leképezhetık, mint az Fv/Fm, fotokémiai kioltás, nem-fotokémiai kioltás paraméterek (GENTY és MEYER 1994; BAKER és mtsai., 2001; NEDBAL és WHITMARSH, 2004; RALPH és mtsai., 2005). A stresszfiziológiai vizsgálatokban azonban a fotoszintetikus mőködést jellemzı paramétereken kívül nagyon informatív az egyes stresszmetabolitoktól származó, a kék és a zöld spektrális régióban emittált fluoreszcencia mértéke és aránya a vörös és távoli vörös fluoreszcenciához. E fluoreszcenciás sajátságok képszerő megjelenítésére és meghatározására nyújt lehetıséget a több hullámhosszú fluoreszcencia leképezı módszer. Egyes növényi stresszorok, mint pl. a nagy fényfelesleg a klorofill-a vörös fluoreszcenciáját csökkenti akár úgy is, hogy közben a kék és a zöld fluoreszcencia intenzitása változatlan marad, vagy akár nıhet is (LANGSDORF és mtsai., 2000; STOBER és LICHTENTHALER, 1993). A kék és zöld fluoreszcencia intenzitása azért is 42

43 emelkedik, mert tartós stressz esetén a kék és zöld fluoreszcenciát abszorbeáló pigmentek (klorofillok és karotinoidok) mennyisége lassan csökken, másrészt pedig az UV-abszorbeáló, kék és zöld tartományban fluoreszkáló anyagok mennyisége az epidermiszben nı. Ezáltal kevesebb UV sugárzás jut a mezofill sejtekbe, ami ugyancsak a vörös fluoreszcencia csökkenését eredményezi (SCHWEIGER és mtsai., 1996). Ugyanakkor természetesen elıfordul az is, hogy egyes strresszorok hatására a klorofill destrukció fokozódik, vagy a bioszintézis lelassul, ami a klorofill-a fluoreszcenciájának az alacsonyabb klorofilltartalom miatti kisebb önabszorpciója révén, 690 nm-nél nagyobb intenzitású vörös fluoreszcenciát eredményez. Ezért az F690/F740 arány is nagyobb lesz, mely arány az in situ klorofilltartalom inverz indikátora (LICHTENTHALER és mtsai., 1990; SUBHASH és mtsai., 1999; GITELSON és mtsai., 1999). A fiziológiai állapotváltozások tehát a különbözı fluoreszcencia arányokban (F440/F690, F440/F740, F690/F740) jól tükrözıdnek. Egy fotoszintézisgátló herbiciddel, a diuronnal kezelt dohánynövényben a F440/F690 és a F690/F740 fluoreszcencia arányok csökkentek, mivel a klorofill fluoreszcenciája a fotoszintézis gátlása következtében megnıtt, miközben a kék fluoreszcencia intenzitása nem változott szignifikánsan (LICHTENTHALER és mtsai., 1997). Hasonló változások voltak megfigyelhetık a hıkezelt dohánynál (LANG és mtsai., 1996). Stresszorok hatására a kék fluoreszcencia intenzitása általában kisebb ingadozásokat mutat, mint a klorofill fluoreszcencia változásai (LICHTENTHALER és RINDERLE, 1988; STOBER és LICHTENTHALER, 1993), ezért az F440/F690 és az F440/F740 arányok jó és korai stressz indikátorok, melyek érzékenyen reagálnak a megváltozott környezeti feltételekre, és jól tükrözik a megváltozott fotoszintetikus funkciókat is. (HEISEL és mtsai., 1996; BUSCHMANN és LICHTENTHALER, 1998; LANGSDORF és mtsai., 2000). A kék és a zöld fluoreszcencia reabszorpciója is szerepet játszik az arányok változásában, a zöldé lényegesen kisebb mértékő, mint a kéké - mivel a klorofill-a-nak e spektrális régióban nincs elnyelése - és ezért a klorofilltartalom csökkenésekor az F440/F520 fluoreszcencia arány csökkenhet (LICHTENTHALER és mtsai., 1996). Ez az arány rövidtartamú stresszhatás esetén viszonylag stabil, hosszantartó hatás esetén a zöld fluoreszcencia emissziója gyakran fokozódik (LANG és mtsai., 1996; BUSCHMANN és LICHTENTHALER, 1998). Bizonyos kórokozók, pl. növénypatogén 43

44 gombák önmaguk által emittált fluoreszcencia révén is fokozhatják a kék-zöld fluoreszcencia intenzitását (LÜDECKER és mtsai., 1996). A stressz típusa és a növény válaszreakciójának sajátosságai határozzák meg, hogy mely fluoreszcencia arányok csökkennek és melyek nınek Az S-metilmetionin élettani szerepe Az S-metilmetionin (SMM, (CH 3 ) 2 -S-(CH 2 ) 2 -CH(NH 2 )-COOH) - triviális nevén U-vitamin - biológiailag aktív természetes vegyület, egy nem proteinogén jellegő szabad aminosav, mely a növényi kénanyagcsere jelentıs komponense. Növényekbıl elsıként káposztából azonosították, mely nagy mennyiségben halmozza ezt a vegyületet (MCRORIE és mtsai., 1954), késıbb azonban számos egyéb magasabb rendő növényben is kimutatták jelenlétét (WILLIAMS és NELSON, 1974; GIOVANELLI és mtsai., 1980; SCHWENN és mtsai., 1983; DUFOUR, 1986; MACNICOL, 1986; MACNICOL és RANDALL, 1987). Elıfordulása a növényvilágban általánosnak tekinthetı. Az utóbbi évek irodalmi adataiból kiderül, hogy az SMM metioninból (Met) szintetizálódik, szerepe van a metionin és az S-adenozil-metionin (AdoMet) szint szabályozásában (PIMENTA és mtsai., 1998; HACHAM és mtsai., 2002; KOCSIS és mtsai., 2003), részt vesz a sejtben zajló metilálási folyamatokban (RANOCHA és mtsai., 2000), valamint szállított és raktározott kénvegyületként is jelentıs (BOURGIS és mtsai., 1999). Számos abiotikus és biotikus stresszor káros hatását képes mérsékelni az ozmoprotektánsként mőködı dimetil-szulfopropionát (DMSP) termelésének (TROSSAT és mtsai., 1998; KOCSIS és mtsai., 1998) és a poliaminok bioszintézisének fokozása, az etilén termelés leszabályozása révén (LÁSZTITY és mtsai., 1992; KISSIMON és mtsai., 1994; GYETVAI és mtsai., 2002; RÁCZ és mtsai., 1996) (3. ábra). Mindezek számos kedvezı fiziológiai hatását eredményezik (csírázás és növekedés-serkentés, fotoszintetikus aktivitás, fehérje- és nukleinsav- szintézis fokozása) és magyarázzák stresszvédı hatását is szárazság és alacsony hımérsékleti stressz, valamint a biotikus és abiotikus stresszválaszban szerepet játszó metabolitok, pl. antociánok, karotinoidok termelése terén (Rácz I. és Lásztity D. személyes közlése nyomán). Az SMM-et szintetikusan is elıállították, és széles körben használják a 44

45 humán-, illetve állatgyógyászatban a béltraktus fekélyeinek kezelésében, bélfertızések utókezelésében (AUGSPURGER és mtsai., 2005; KOPINSKI és mtsai., 2007). 3. ábra. S-metilmetionin anyagcsere magasabb rendő növényekben Az SMM-ciklus Számos növényfajban nyomon követett metionin metabolizmus igazolta, hogy az SMM szintézise metioninból, metilálási folyamat révén megy végbe. Izotópos jelöléssel végzett vizsgálatok igazolták, hogy az SMM a homocisztein metilálásával visszaalakul metioninná, létrehozva ezzel az SMM-ciklust (4. ábra). 45

46 4. ábra. Az S-metilmetionin (SMM)-ciklus és a kapcsolódó reakciók HANSON és KENDE (1976), MUDD és DATKO (1990), és RANOCHA és mtsai. (2001) mutatták ki a teljes SMM-ciklus meglétét in vivo Ipomoea tricolor, Lemna paucicostata fajokban, és Arabidopsis különbözı szerveiben. Az SMM szintézisét metioninból, sejtmentes közegben, elıször tölgyben vizsgálták (SATO és mtsai., 1958). Az irreverzibilis reakciót katalizáló enzim az S- adenozilmetionin:metionin S-metiltranszferáz (EC , MMT) (GIOVANELLI és mtsai., 1980). Az MMT specifikus az L-metioninra, metildonorként pedig az S- adenozil-metionint (AdoMet) fogadja el (GREENE és DAVIS, 1960). Az MMT-t elsıként Wollastonia biflora-ból (JAMES és mtsai., 1995a), majd árpából izolálták (PIMENTA és mtsai., 1998) és késıbb bizonyítást nyert, hogy ez az enzim a citoplazmában lokalizált (TROSSAT és mtsai., 1996). Arabidopsisban és kukoricában az MMT egykópiás génként van jelen a genomban (BOURGIS és mtsai., 1999; RANOCHA és mtsai. 2001). BOURGIS és mtsai. (1999) szekvenálták meg a W. biflora MMT cdnsét, majd ennek segítségével azonosították az adatbázisokból az Arabidopsis és a kukorica MMT-k szekvenciáját. 46

47 Az SMM-ciklus másik tagja az S-metilmetionin:homocisztein S- metiltranszferáz (EC , HMT), mely 2 M metionin keletkezését katalizálja 1 M SMM-bıl és 1 mol homociszteinbıl. A HMT enzimaktivitását elsıként TURNER és SHAPIRO (1961) mutatta ki, különbözı növényi fajok magjaiból. Szekvencia keresési vizsgálatok 3, egykópiás HMT gént azonosítottak az Arabidopsis genomjában (AtHMT-1, -2, -3), míg kukoricában 4 HMT gént találtak (ZmHMT-1, -2, -3, -4) (RANOCHA és mtsai., 2001). A HMT-k fı metildonora az SMM, de minden esetben megfigyelték az AdoMet kismértékő hasznosítását is (RANOCHA és mtsai., 2000). RANOCHA és mtsai. (2001) megvizsgálták az Arabidopsis és kukorica HMT enzimek aktivitását és génexpresszióját a növények különbözı részeiben. A HMT enzimek esetében a gyökérben találták a legmagasabb enzimaktivitást, melyet elsısorban az AtHMT-1 és -2 erıs expressziója okozhatott. Az AtHMT-3 expressziója viszont a levelekben volt a legmagasabb. Kukoricában a ZmHMT-4 kizárólag a magban, a ZmHMT-1 pedig kismértékben a virágban, de fıleg a magban expresszálódott. A ZmHMT-2 és -3 expressziója szintén a magban volt a legmagasabb. A brokkoliban azonosított BoHMT-1 gén gyökérben, virágban és fiatal levélben egyaránt expresszálódott, idıs levélben azonban nem (LYI és mtsai., 2007). A HMT enzimeknek ez a térben és idıben eltérı expressziója, valamint a metioninra való érzékenységük különbözısége az SMM-ciklus többrétő szerepét, összetett hatását vetíti elıre Az SMM-ciklus szerepe a Met és AdoMet-szint szabályozásában Az SMM-ciklus komponenseinek vizsgálata egyértelmővé tette, hogy a ciklus a növényvilágban mindenütt jelenlevı anyagcsere folyamat. MUDD és DATKO (1990) említi elsıként, hogy az SMM-ciklus fontos szerepet tölthet be a Met szint szabályozásában, abban az esetben, ha túl nagy mértékő átalakulás történik az AdoMet irányába. A Met-szint lecsökkenése esetén ugyanis, az AdoMet SMM-en keresztül gyorsan vissza tud alakulni metioninná, biztosítva ezzel a zavartalan fehérjeszintézishez szükséges szabad Met-szintet. Az SMM-ciklusnak ezt a jelentıségét RANOCHA és mtsai. (2001) számítógépes modell segítségével vizsgálták, szimulálva a Met anyagcserét egy kifejlett Arabidopsis levélben. A modellhez a Met S- izotópos nyomon követésébıl származó adatait, és az egyes komponensek 47

48 növényekben mért mennyiségét használták fel. A modell a teljes SMM-ciklus kiiktatása esetén az AdoMet jelentıs felhalmozódását mutatta. MUDD és DATKO (1990) elméletének részletesebb vizsgálatához a teljes Met-készletet az AdoMet-té alakulás irányába vitték el a modellben. Majd 2 esetet vizsgáltak, az egyikben az SMM-ciklust épen hagyták; míg a másikban az SMM-ciklust kiiktatták, de az AdoMet szintézisét lassították. A Met-szint mindkét esetben hamar helyreállt, míg az AdoMetszint helyreállása az SMM-ciklus jelenlétében gyorsabb volt. A modell mőködésének vizsgálatából így azt tapasztalták, hogy az SMM-ciklus nem szabályozza a szabad Met szintet. A metabolikusan aktív, szabad Met-szint lecsökkenését a fehérjékbıl és a raktározott készletekbıl felszabaduló Met állítja helyre. Ugyanakkor, a modell alapján, az SMM-ciklus egyértelmően meghatározza az AdoMet-szintet. KOCSIS és mtsai. (2003) kísérletesen is igazolták, hogy az SMM-ciklus a Metszintre nem hat, az AdoMet szintet viszont szabályozza. Az SMM-ciklus és az SMM hosszú távú, a növény teljes fejlıdésére kiterjedı hatását tudták megvizsgálni olyan Arabidopsis és kukorica mutánsokban, melyek az MMT génben bekövetkezı mutáció, és ez által az MMT enzim mőködésképtelensége miatt SMM-t nem termeltek, az SMM-ciklusuk hiányzott. Mindkét mutánsban azt igazolták, hogy a vad típushoz hasonló arányban épült be a jelölt Met fehérjékbe, vagyis a szabad Met-készlet nem változott a mutáció következtében. Az MMT mutáns Arabidopsis esetén a Met-szintet közvetlenül is megmérték, és a vad típusnak megfelelınek bizonyult. Az SMM-ciklus hiánya tehát hosszú távon, stresszmentes közegben nem okozott a szabad Met szintben rendellenességet. Ugyanakkor az SMM-ciklus AdoMet-szintre kifejtett hatását mutatja, hogy az MMT mutáns Arabidopsisnál mért AdoMet szint magasabb volt a vadhoz képest. További bizonyítékul szolgál az SMM-nek erre a szerepére az a transzgénikus dohány is, melyben a Met szintézisében résztvevı egyik enzimet, az Arabidopsis cisztationin γ-szintázát túlexpresszáltatták (GAKIÉRE, 2002). A növényben megnövekvı Met- és SMM-szint mellett ugyanis az AdoMet-szint nem változott a vad típushoz képest. Az SMM-nek tehát meghatározó szerepe van az AdoMet szinten tartásában, mely azért is lényeges eleme a növényi anyagcserének, mert a növényekbıl hiányzik az a más eukariótákban meglévı negatív visszacsatolás, mely során az AdoMet saját szintézisét gátolja (SCHRÖDER, 1997). 48

49 Az SMM metilcsoportjának szerepe Az SMM szerkezetébıl adódóan joggal merül fel az a lehetıség, hogy az SMM általános metildonor szerepet tölthet be az élı szervezetben. Így a homocisztein metilálásán kívül más metilálási folyamatban is részt vehet. Ezt támasztja alá az a kísérlet, melyben jelölt metilcsoport beépülését követték nyomon a hajnalka reproduktív fejlıdési fázisba való átmenete során a különbözı merisztéma szövetekben (HANSON és KENDE 1976). Megállapították, hogy - annak ellenére, hogy az SMM Met átalakulása hiányzott a korai fázisban - az SMM metilációs folyamatokban vett részt, ami azt jelenti, hogy a homociszteinen kívül egyéb metilakceptorokkal kellett reagálnia. A szelén metabolizmusában szerepet játszó szelenocisztein-metiltranszferáz enzim (SMT) esetén is megfigyelték, hogy metildonorként AdoMet mellett SMM-t is elfogad (NEUHIERL és mtsai., 1999). Ezen kívül SATO és mtsai. (1958) tölgyben kimutatták az SMM részvételét a pektinek metilálásában, szerepe azonban nem jelentıs e folyamatokban. Az SMM izotóposan jelölt metilcsoportjának nyomon követése Lemnában (MUDD és DATKO 1990) azt igazolta, hogy az SMM metilcsoportja elıször Met-ba kerül át, és az izotópos jel csak ezt követıen jelenik meg olyan komponensekben (foszfatidil-kolin, neutrális lipidek, stb.), melyek metilcsoportja tulajdonképpen a Met-ból származik. Azokban az Arabidopsis és kukorica mutánsokban, melyek mőködı MMT génnel és így SMM szintézissel nem rendelkeztek (KOCSIS és mtsai., 2003), az SMM hiány nem okozott a fejlıdési állapot szintjén megjelenı zavart a metilálási folyamatokban, tehát nem tekinthetı általános, vagy kizárólagos metildonornak. A közvetlen metilálási reakciókon kívül azonban más szempontból is szerepe lehet az SMM-nek a metilcsoport anyagcseréjében. KOCSIS és mtsai. (2003) fent említett MMT mutáns növényeiben, az SMM hiánya 45%-os emelkedést eredményezett az ún. metilációsrátában, azaz az AdoMet/S-adenozil-homocisztein (AdoHcy) arányban. Ez a vadhoz képest magasabb AdoMet és alacsonyabb AdoHcy szintnek volt köszönhetı. Az AdoMet a transzmetilációs folyamatok legfıbb metilforrása, az AdoMet-függı metiltranszferázok fehérjék, DNS, mrns, pektin, szterol, etanolamin, lignin monomerek, fenolok, ozmolitok metilálásában vesznek részt, így jelentıs szerepük van a növény anyagcseréjében, fejlıdésében, stressz tőrésében egyaránt (MOFFATT és mtsai., 2001). A metil-transzferázok mőködését az AdoHcy gátolja, így a metilálási folyamatok 49

50 aktivitását az AdoMet/AdoHcy arány határozza meg, melynek szabályozásában a fenti kísérlet szerint az SMM is részt vesz. GIOVANELLI és mtsai. (1980) felvetése alapján az SMM-ciklus lehetıvé teszi a metil-csoport raktározását is. Abban az esetben, ha a metilcsoport de novo szintézise lecsökkenne a homocisztein szintéziséhez képest, az SMM a homociszteint metilálva helyre tudja állítani a Met, és a belıle származó AdoMet-szintet, biztosítva ezzel a szükséges metil-donor mennyiséget Az SMM szerepe a S szállításában és raktározásában, az SMM-ciklus eltolódásai térben és idıben Az SMM S-szállításában betöltött szerepére kifejlett, a termésérés állapotában lévı búzával végzett kísérletek hívták fel a figyelmet (BOURGIS és mtsai., 1999). Ennek során jelölt kénnel rendelkezı Met-t juttattak a levélbe, majd a kalászhoz közeli szárrészen, levéltetvek segítségével győjtött floem exudátumban vizsgálták a S szállítási formáit. A S-tartalmú komponensek összmennyiségének 80%-át az SMM tette ki, megelızve a glutationt, melynek szerepét már korábban igazolták a szállítási folyamatokban. Ezek alapján BOURGIS és mtsai. (1999) azt feltételezték, hogy bár az SMM-ciklus a növény minden részében teljesen végbe tud menni, a ciklust képzı két reakció aránya eltolódhat. Így a levélben az SMM szintézise lehet aktívabb, mely biztosítja a floemen keresztül szállítódó SMM-t. Ez az érıfélben lévı terméshez jut, ahol pedig az SMM metioninná alakítása felé tolódik el az SMM-ciklus. Az SMM S- szállításban betöltött szerepét számos más növényi fajban is igazolták, kimutatva az SMM jelenlétét a floem exudátumban. Jellegzetes az SMM-ciklus idıbeli eltolódása, az SMM-szint változása a csírázás során, mely arra enged következtetni, hogy az SMM-nek szerepe lehet a S szállításában és raktározásában a csíranövényeknél is. Például búzában a száraz magban és a csírázás kezdetén a HMT bizonyult aktívabbnak, majd a csírázás késıbbi szakaszában az MMT mutatott nagyobb aktivitást (ALLAMONG és ABRAHAMSON, 1977). A csírázó árpában a kezdeti alacsony SMM-szint csak a 4. naptól kezd el emelkedni (DETHIER és mtsai., 1991), az MMT enzim pedig a 3-4. naptól kezdve mutat aktivitásnövekedést (PIMENTA és mtsai., 1998). A csírázó árpa immunohisztokémiai vizsgálata azt mutatta, hogy az MMT enzim az 50

51 endospermiumban és az aleuron sejtekben aktív (PIMENTA és mtsai., 1998). Ennek alapján a kutatók azt feltételezik, hogy az itt raktározott tartalékfehérje lebontásából keletkezı Met az MMT enzim révén SMM-é alakul, mely képes a csíra más részeibe elszállítódni, majd Met-á visszaalakulni, és így a fehérjeszintézisben részt venni. Az adott növényben lévı, különbözı HMT-k eltérı tulajdonságai arra utalnak, hogy a növény különbözı részeiben, és az egyedfejlıdés egyes szakaszaiban más-más HMT játszhat fontos szerepet. Így például kifejezetten metionin inszenzitív HMT-t találtak bab (ABRAHAMSON ÉS SHAPIRO, 1965) és borsó magjában (DODD és COSSINS, 1970) ill. az Arabidopsis csírázása során is elsısorban a metionin inszenzitív AtHMT-2 expresszálódott (RANOCHA és mtsai., 2000). A metionin gátlásának hiánya pedig lehetıvé teszi, hogy a magban, a növény többi részéhez képest nagyobb mértékben halmozódjon fel a metionin (RANOCHA és mtsai., 2000; GIOVANELLI és mtsai., 1980) Az SMM szerepe a dimetil-szulfopropionát (DMSP) szintézisében A dimetil-szulfopropionátot (DMSP) elıször algákban mutatták ki magas koncentrációban. A növényvilágban való elterjedtsége korlátozott, ugyanakkor a cukornád és a sótőrı Spartina és Wollastonia nemzetségek egyes tagjai nagy mennyiségben halmozzák fel (OTTE és mtsai., 2004 összefoglalója alapján; PAQUET és mtsai., 1995; DACEY és mtsai., 1987). A DMSP a magasabb rendő növényekben részt vehet a metilációs folyamatokban, metioninná való visszaalakulása lehetıvé teszi, hogy S raktárként funkcionáljon. Krioprotektáns és antioxidáns szerepét fıleg az algákon elvégzett kísérletek alapján feltételezik, ozmoprotektáns szerepét azonban magasabb rendő növényekben is vizsgálták. Elsısorban bizonyos sótőrı, DMSP-t akkumuláló növényeknél elfogadott, hogy a DMSP ezt a funkciót látja el. Az ozmoregulációban betöltött szerepére szerkezete is utal, ugyanis hasonlóságot mutat a szintén ozmoprotektáns glicinbetainnal (MCNEIL és mtsai., 1999). A DMSP szintézise a magasabb rendő növényekben kétféle útvonalon valósulhat meg. Az Asteraceae családba tartozó Wollastonia bifloraban a DMSP az SMM-bıl DMSP-aldehiden, mint intermedieren keresztül szintetizálódik (JAMES és mtsai., 1995), míg a Poaceae családba tartozó Spartina alternifloraban DMSP-aminon keresztül zajlik a szintézis (KOCSIS és mtsai., 1998). A DMSP szintézis útvonala tehát 51

52 ebben a két, evolúciósan távoli családban egymástól függetlenül fejlıdött ki. A DMSP szintézis lépéseinek sejten belüli helyét W. biflora-ban TROSSAT és mtsai. (1996) vizsgálták sejtfrakcionálást követı enzimaktivitás mérés és immunofestés alapján. Megerısítették, hogy az SMM szintézisért felelıs MMT enzim a citoplazmában található, ugyanakkor azt találták, hogy a DMSP-aldehid DMSP reakciót katalizáló DMSP-aldehid dehidrogenáz (DDH) enzim a kloroplasztiszban lokalizált. SMMinkubált intakt kloroplasztisz DMSP termelése bizonyította, hogy a citoplazmában szintetizálódó SMM transzportálódik a plasztiszba, majd itt alakul át DMSP-aldehiddé és végül DMSP-vé. A növények DMSP akkumuláló képessége így nagyban összefügghet a kloroplasztisz SMM transzportáló hatékonyságával. TROSSAT és mtsai. (1998) azt mutatták ki, hogy a DMSP-t nem akkumuláló növényekben a teljes SMM tartalomnak csupán az 1-15%-a található a kloroplasztiszban, míg a DMSP-t akkumuláló W. biflora esetén ez 40% volt. Sóstressz hatására a kloroplasztisz SMM tartalma tovább emelkedett a W. biflora-ban, az össz SMM 80%-ára, mely változást a DMSP-szint növekedése is követte, biztosítva ezzel a plasztiszban végbemenı folyamatok ozmotikus védelmét Az SMM hidegstressz elleni védıhatása Az SMM lehetséges hidegstressz védı szerepére az a tény hívta fel a figyelmet, hogy a Brassicaceae család tagjaira kifejezetten jellemzı a magas SMM tartalom és a faggyal szembeni ellenállóságuk is ismert. Joggal merült fel a kérdés arra vonatkozóan, hogy az SMM-nek szerepe lehet e növényfajokban a hideggel szembeni ellenállóság biztosításában (GYETVAI és mtsai., 2002; RÁCZ és mtsai., 2008), ennek megfelelıen hidegre érzékeny növényeknél is elérhetı az ellenállóság fokozása SMMkezelés hatására. Hidegkezelt kukoricában megfigyelhetı volt a fotoszintetikus aktivitás javulása SMM adása esetén (KISSIMON és mtsai., 1994). Az SMM kedvezı hatását mutatják azok a vizsgálatok is, melyekben a membránok áteresztı képességének fokozódását, és a sejtek ez általi ionleadását vizsgálták hidegstressz hatására. Borsó, kukorica és különbözı hidegtőréső búza fajtáknál mind a levelekben, mind a gyökerekben, a tápoldaton keresztül felvett SMM kivédte a hidegstressz membránkárosító hatását, ugyanis az SMM kezelést követıen a hidegstressz nem 52

53 fokozta az ionvesztés mértékét (RÁCZ és mtsai., 2008; GYETVAI és mtsai., 2002). GYETVAI és mtsai. (2002) 3 lehetséges utat feltételeznek, melyeken keresztül érvényesülhet az SMM hidegstressz elleni védıhatása. Egyrészt a belıle képzıdı DMSP szintézisének fokozásával biztosítja a sejtek megfelelı ozmotikus állapotát, másrészt fokozza a dimetilszulfid (DMS) képzıdését, melynek gyökfogó tulajdonsága csökkenti a membránkárosító hatásokat. Ezen kívül az SMM kifejtheti hatását a poliaminokon - elsısorban a spermidinen - keresztül is, melyek szintézisét az SMM befolyásolja. A külsıleg adott SMM számos növényben (kukorica, búza, borsó, szója) megnövelte a különbözı poliaminok szintjét, így a putreszcin, agmatin és a spermidin mennyiségét, de nem befolyásolta a spermin-szintet (RÁCZ és mtsai., 2008). Az SMM poliaminok szintézisében játszott szerepe részben az AdoMet-szint szabályozásával is összefügghet, ugyanis az AdoMet dekarboxilált származéka szolgáltatja azt a propilamino-csoportot, mely révén a putreszcinbıl spermidin, majd a spermidinbıl spermin képzıdik. A poliaminok szerteágazó hatása a növényi életfolyamatokra magyarázatul szolgál az SMM sokrétő szerepére, és a poliaminok okozta membrán, fehérje és DNS stabilizálás egybevághat az SMM stressz elleni védımechanizmusával is (GALSTON és KAUR-SAWHNEY, 1995; BOUCHEREAU, 1999) Az SMM hatása az etiléntermelésre Az SMM AdoMet-szintet szabályozó hatása lehetıvé teszi, hogy az SMM részt vegyen azon anyagcsere utakban, melyek az AdoMet-bıl indulnak ki. Ugyanakkor a növények SMM tartalma befolyásolja az etilén szintézisét is, mely Met-on keresztül szintén az AdoMet-bıl indul ki. Az etiléntermelésre gyakorolt hatás összetett. Ennek egyik oka egyrészt az, hogy mind a poliamin, mind az etilén bioszintézisben egyaránt közös intermedier, az AdoMet iránti kompetíció zajlik a két folyamat között, másrészt, hogy a poliaminok az etilén szintézis több pontját (AdoMet-1-aminociklopropán-1- karboxilát (ACC) átalakulást, valamint az ACC - Met átalakulást) gátolják. Ugyanakkor az etilén is gátló hatású a poliaminszintézis során. Az etilén szintézisét végzı 1-aminociklopropán-1-karboxilát (ACC) szintáz enzim mőködését in vitro körülmények között maga az SMM is gátolta, ami ugyanakkor a növényben nem feltétlenül jut érvényre (KO és mtsai, 2004). 53

54 3. KUTATÁSI CÉLOK Munkánk egyik célja az volt, hogy a kukorica alacsony hımérsékleti stressztőrı képességét és az SMM növényi stresszválaszban betöltött szerepét komplex módon vizsgáljuk. Vizsgálataink másik fı céljaként azt tőztük ki, hogy több kukorica genotípus esetében szabadföldi kísérletekben nyomon kövessük a magyarországi viszonyoktól eltérı, magasabb UV-B sugárzási szint hatására bekövetkezı - a védekezı mechanizmusban fontos szerepet játszó - antocián képzıdés mennyiségi változásait, illetve, hogy kontrollált körülmények között mőködı UV-B kamra segítségével tanulmányozzuk az UV-B sugárzás hatását az egyes anyagcsere folyamatokra. A magasabb UV-B sugárzás növényi anyagcserére gyakorolt hatásainak vizsgálata munkánk során azon gyakorlati okból kapott kitüntetett szerepet, mert az északi féltekén lévı nemesítı cégek és intézetek a kukorica hibridek elıállításának gyorsítása végett az évenkénti második, ún. téli generációt a déli féltekén nevelik fel. 54

55 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Növényi anyagok, mintavételek és kezelések SMM-kezelés A növények nevelése és kezelése Martonvásáron, az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet fitotronjában történt. Az SMM-kezelt kukorica (Zea mays L., Norma hibrid) hidegtőrésének vizsgálatához a magokat 5 percig 5%-os nátrium-hipoklorit oldatban fertıtlenítettük, majd a desztillált vízzel lemosott magvakat nedves szőrıpapír között csíráztató szekrényben (típus: G 30, Conviron, Canada) csíráztattuk 72 órán keresztül, 26 C-on, sötétben. A 72 órás csíranövényeket rozsdamentes hálóra rakva (5-7 csíranövény/edény) gyökerüket a következı összetételő Hoagland tápoldatba merítettük: Makroelem összetétel: Mikroelem összetétel: 0,3125 mm KNO 3 11,92 µm HBO 3 0,45 mm Ca(NO 3 ) 2 4,57 µm MnCl 2 4H 2 O 0,0625 mm KH 2 PO 4 0,191 µm ZnSO 4 7H 2 O 0,125 mm MgSO 4 7H 2 O 0,08 µm CuSO 4 5H 2 O 0,024 µm (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O 15,02 µm FeSO 4 7H 2 O 23,04 µm Na 2 EDTA 5H 2 O A növényeket 21 napig (a 3. levél teljes kifejlıdéséig) PGV-36 típusú növénynevelı kamrában (Conviron, Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Canada) neveltük (16 óra fény és 8 óra sötét; 22 C fényben és 20 C sötétben; fényerısség a levelek szintjén 340 µmol /m 2 s PPFD, 70%-os relatív páratartalom). A tápoldatot kétnaponként cseréltük. Az SMM kezelésre a 22. napon került sor, a tápoldat 0,01% SMM-t is tartalmazott. A kontroll növények tápoldata SMM-mentes volt. Az SMM-os tápoldatot 1 nap után nevelési tápoldatra cseréltük és a növényeket gradiens növénynevelı kamrába helyeztük el alacsony hımérsékleti kezelés céljából (TISCHNER 55

56 és VEISZ, 1996). A hımérsékletet kivéve a nevelési paraméterek az elıbbiekben leírtakkal megegyeztek. Az elsı kísérletben az alacsony hımérsékleti kezelés 5 C-on történt, a másikban a hımérsékleti gradiens 6, 8, 10, 12 és 14 C között volt. Az antioxidáns enzimaktivitások vizsgálatához szükséges mintavétel az elsı kísérletben 1, 4 és 6 napos hidegkezelés után, a hımérsékleti gradiens kísérletben a 4. nap után történt. A fotoszintézis hatékonyságának meghatározásával összefüggı vizsgálatokra a hideg kezelés 1., 3. és 4. napján került sor. Mind a mintavételhez, mind az intakt levélen történı mérésekhez a teljesen kifejlett 3. levelet használtuk. A felhasznált vegyszereket a Sigma és Merck cégektıl vásároltuk analitikai minıségben UV-B kísérletek szabadföldön Ugyanazon 10 martonvásári beltenyésztett kukoricavonalat (5 korai: L2-E, L3- E, L4-E, L9-E, L10-E, valamint 5 közép- és késıi tenyészidejő: L1-L, L5-L, L6-L, L7- L, L8-L) négyismétléses kísérletbe állítottuk be Martonvásáron és Buin-ban (Chile) lévı tenyészkertünkben években. Az év egymásnak megfelelı hónapjainak (Martonvásár: május, június, július; Buin: november, december, január) utolsó dekádjaiban (a tenyészanyagok virágzását követıen) történt az antociántartalom vizsgálathoz szükséges mintavételezés. Ismétlésenként mintáztunk, a címer alatti 3-4. levélbıl. A Chile-i minták hazaszállítása szárazjégben, 24 órán belül megtörtént, majd feldolgozásig -80 C-on tároltuk UV-B kamrakísérletek A növények nevelése és kezelése Martonvásáron, az MTA Mezıgazdasági Kutatóintézet fitotronjában történt. A kísérletekhez két beltenyésztett kukorica vonalat használtunk (Zea mays L., CM7 és HMv651). A CM7 korai-, a HMv651 közép tenyészidejő. A nevelıközeg erdei talaj, Vegasca és homok 3:1:1 arányú keverékét tartalmazta. A növényeket a magok elültetésétıl számított 21 napig (a 3. levél teljes kifejlıdéséig) G-48 típusú növénynevelı kamrában (Conviron, Controlled Environments Ltd, Winnipeg, Canada) neveltük a következı paraméterek szerint: 16 óra megvilágítás, 8 óra sötét, fényerısség a levelek szintjén 300 µmol /m 2 s PPFD, 22 C-os levegı hımérséklet fényben, 18 C sötétben, 70%-os relatív páratartalom, a 56

57 kontroll növények UV-B dózisa a levelek szintjén 38 µwatt/cm 2, a kezelteké 430 µwatt/cm 2. A növények megvilágítása 4,3 m 2 -es területen történt, melynek egyik felére a kontroll, másik felére a kezelendı növényeket helyeztük. Az UV-B sugárzást 175 cm hosszú, Philips gyártmányú, 100 W-os, TL 100W/01 típusú Narrowband Ultraviolet-B csövek biztosították, melyek sugárzási hullámhossz-maximuma 311 nm volt (5. ábra). A mérések és a mintavétel a növénynevelés és - kezelés utolsó hetében történtek, a teljesen kifejlett harmadik levélbıl. 5.ábra. UV-B kamra: a kép bal oldalán a kontroll, jobb oldalt az UV-B kezelt növények láthatók A fluoreszcencia-indukció mérése A fluoreszcencia indukciós kísérleteket impulzus amplitúdó moduláció elvén mőködı PAM-2000 típusú klorofill fluoriméterrel (Heinz Walz GmbH, Germany) végeztük. A kifejlett leveleket 20 perc sötétadaptáció után kis intenzitású (kb. 1 µmol /m 2 s, kb. 10 mw /m 2 ), szaggatott, 1,6 khz frekvenciájú vörös fénnyel világítottuk meg. A kibocsátott fluoreszcenciát fotodióda detektálta. Mind a fluoreszcens, mind a gerjesztı fényt száloptikán keresztül vezettük. A készülék a jelet ugyancsak szaggatottan (1,6 khz), a mérıfénnyel szinkronban, szelektíven erısítette (amplitúdó 57

58 moduláció). Az amplitúdó moduláció tette lehetıvé, hogy olyan kis intenzitású modulált mérıfényt alkalmazhattunk, ami nem okozott észlelhetı fluoreszcencia átmeneteket. Így jutottunk az F o, azaz a kiindulási fluoreszcencia-hozamhoz. A maximális (F m ) fluoreszcencia értéket 0,7 s idıtartamú, a PSII elektrontranszportot telítı (kb µmol /m 2 s, minden PSII reakciócentrum zárt állapotban), fehér fényfelvillanás hatására kaptuk meg (fényforrás: Schott, KL 1500 electronic). Az F m meghatározása után a kioltásanalízishez folyamatos, közepes intenzitású aktinikus fényt (kb. 150 µmol /m 2 s) használtunk (F t ). Az indukciós görbe felvétele alatt telítési intenzitású fényfelvillanásokat adtunk, hogy meghatározhassuk a fényadaptált minta maximális fluoreszcencia (F m ), illetve az aktinikus fény kikapcsolása után 3 s idıtartamú, hosszú hullámhosszú vörös fényt (λ=735 nm) bekapcsolva a minimális fluoreszcencia értékét (F o ). A paramétereket a következı egyenletek alapján számoltuk, melynek során a VAN KOOTEN és SNEL (1990) által leírt nomenklatúrát követtük: A PSII maximális kvantumhatékonysága: (F v /F m )=(F m -F o )/F m A PSII aktuális kvantumhatékonysága: ( F/F m )=(F m -F t )/F m 4.3. A több hullámhosszú fluoreszcencia leképezı rendszer mőködése Az ELTE TTK, Biológiai Intézet, Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszékén az országban egyedüliként alkalmazott fluoreszcencia leképezı rendszert egy INCO Copernicus együttmőködés keretében német, francia és magyar kollégákkal közösen alakították ki, hogy növényi minták mérésének lehetıségeit teszteljék Szigeti Zoltán professzor vezetésével. A fluoreszcencia leképezı rendszerben a növényi minta fluoreszcenciáját egy 16,7 Hz-cel villogó (flash) Xe kisülési lámpa gerjeszti, melynek a növényi mintát érı gerjesztı fénye 350 nm hullámhosszú, amit egy DUG 11 (Schott, Jena, Germany) szőrı biztosít. Ez a hullámhossz technikai okokból létrejött kompromisszum eredménye, ami a kék és zöld, valamint a vörös és távoli vörös fluoreszcencia egyidejő gerjesztését lehetıvé teszi. 58

59 A minta által emittált fluoreszcencia egy optikai és erısítı rendszeren keresztül jut a CCD kamerába. A kamerába épített szőrıknek a fényútba helyezése biztosítja, hogy a kibocsátott fluoreszcens fénybıl az éppen vizsgálni kívánt, megfelelı hullámhosszúságú jusson a xenon lámpa villogásával szinkronizáltan mőködı, fél megapixel felbontású CCD kamerába, s képezzen így 440, 520, 690 és 740 nm-nél teljes képet az objektumról. A kis intenzitású fluoreszcens jel felerısítése az intenzitástól függıen változtatható számú (több száz, vagy akár több ezer) kép összegzésével történik. A különbözı hullámhosszaknál egymást követı mérések során kapunk képet. A kamera mőködését számítógépes program vezérli, és ugyancsak ez teszi lehetıvé a képek korrekcióját, analízisét, s a képekkel végzendı mőveleteket (arányok, különbségek képzése). A képeket a kiértékelés során a program a szőrık spektrális érzékenységével korrigálja. A módszer részletes leírását lásd LICHTENTHALER és BABANI (2000), valamint LENK és BUSCHMANN (2006) cikkében Gázcsere vizsgálatok A gázcsere vizsgálatokat nyitott rendszerő LI-6400 típusú infravörös gázanalizátorral (LI-COR, Lincoln, Nebrasca, USA) végeztük. Megvilágító fényforrásként a mérıfejhez csatlakoztatható LED lámpát, hımérsékletszabályozásra beépített Peltier elemet használtunk. A mért víz- és széndioxid mennyiség változásának értékei segítségével VON CAEMMERER és FARQUHAR (1981) módszere szerint határoztuk meg a fotoszintetikus aktivitást (A) és az intercelluláris széndioxid-koncentrációt (C i ) Relatív klorofilltartalom mérése A klorofilltartalom mennyiségét SPAD-502-es típusú automata berendezéssel mértük. A mérés lényege, hogy a levélben lévı klorofill a különbözı hullámhosszúságú fényt különbözı mértékben nyeli el. A klorofill fényelnyelésének mértéke szoros összefüggésben van a levél klorofilltartalmával. A klorofill molekulák fényelnyelési maximuma a kék és a vörös hullámhossz tartományban található. 59

60 Alacsony a fényabszorpció a zöld- és sárga-, közel nulla az infravörös tartományban. Ebbıl adódóan érdemes az infravörös tartományt viszonyítási értéknek választani, és a kék vagy a vörös tartományt használni a méréshez. A SPAD-502 készülék vörös fény mellett mér, mivel ennek elnyelését nem befolyásolja a levél karotintartalma. A klorofilltartalom számítás alapját a levélen áthaladt infravörös és vörös fény erısségének aránya képezi. Ez az arány annál nagyobb, minél több vörös fény nyelıdik el a növény levelében, ami szoros összefüggést mutat a klorofilltartalommal (MARKWELL, 1995; HAWKINS és mtsai., 2009). A SPAD értéktartománya között van (Minolta Camera Co. Ltd. 1989) Antioxidáns enzimek kivonása és aktivitásuk mérése Az izolálás során 0,5 g növényi anyagot (középsı levélér nélküli levelet) kvarchomokkal dörzsöltünk el 2,5 ml jéghideg 3 mm MgCl 2 -ot és 1 mm EDTA-t tartalmazó 0,5 mm TRIS-HCl puffer (ph 7,4) hozzáadásával, mélyhőtött dörzsmozsárban. A homogenizátumot lecentrifugáltuk (4 C, 20 perc, g), a felülúszót Eppendorf csövekbe osztottuk szét. A minták összfehérje koncentrációját BRADFORD (1976) módszerén alapuló Bio-Rad reagenssel határoztuk meg, spektrofotométerben 595 nm-en mérve a reakcióelegy abszorbanciáját. Az enzimaktivitás vizsgálatok során a glutation-reduktáz (GR) aktivitását a friss, míg a többi esetben a -20 C-on tárolt fagyasztott felülúszóból mértük. Az enzimaktivitásokat fotometriásan határoztuk meg (UV-VIS 160A, Shimadzu, Japan). Mérésig a mintákat jégen tartottuk, a méréseket szobahımérsékleten végeztük. Az enzimaktivitásokat 1 g enzimfehérje által 1 perc alatt okozott abszorbancia változásban ( A min -1 g -1 fehérje) adtuk meg. Kataláz A CAT (EC ) aktivitását 240 nm-en mértük, a hidrogén-peroxid fogyását követve nyomon. A reakcióelegy össztérfogata 3 ml volt, és 0,5 mm TRIS pufferben (ph 7,4) 10 mm H 2 O 2 -t és 50 µl növényi mintát tartalmazott (ÁDÁM és mtsai., 1995). A reakciót H 2 O 2 hozzáadásával indítottuk el. 60

61 Gvajakol-peroxidáz A POD (EC ) aktivitását ÁDÁM és mtsai. (1995) módszere szerint határoztuk meg. A gvajakol oxidációja nyomán bekövetkezı abszorbancia-növekedést 470 nm-en mértük. A reakcióelegy 3 ml-éhez 50 µl növényi mintát adtunk. A reakcióelegy 0,1 mm acetát (ph 5,5) pufferben 10 mm H 2 O 2 -ot, és 1 mm gvajakolt tartalmazott. A reakciót H 2 O 2 hozzáadásával indítottuk el. Aszkorbát-peroxidáz Az APX (EC ) aktivitását 25 mm aszkorbinsavat és 0,5 mm H 2 O 2 - tartalmazó TRIS pufferben (0,2 mm ph 7,8) mértük. A reakcióelegy össztérfogata 2,25 ml volt, melyhez 50 µl növényi mintát adtunk, a reakciót H 2 O 2 hozzáadásával indítottuk. Az aszkorbinsav fogyását 290 nm-en követtük nyomon (NAKANO és ASADA, 1987). Glutation-reduktáz A GR (EC ) aktivitásának meghatározásakor SMITH és mtsai. (1988) módszere szerint az 5,5 -ditio-bis-(2-nitro-benzoesav) (DTNB) redukcióját mértük 412 nm-en, melyet az enzimmőködés során keletkezett GSH okozott. A reakcióelegy összetétele: 0,1 M foszfát puffer (ph 7,5), 1 mm EDTA, 0,75 mm DTNB, 0,1 mm NADPH, 1 mm GSSG. A reakcióelegy 1 ml össztérfogata 50 µl növényi mintát tartalmazott. Glutation-S-transzferáz A GST (EC ) enzim aktivitásának meghatározásához 72,7 mm Nafoszfát puffer (ph 6,5), 3,6 mm redukált glutation (GSH), 1 mm 1-kloro-2,4- dinitrobenzén (CDNB) és enzimkivonat (2,75 ml reakcióelegyben 100 µl növényi minta) elegyének abszorbancia növekedését követtük nyomon 340 nm-en (MANNERVIK és GUTHENBERG, 1981). 61

62 4.7. Antocián kivonás és relatív antociántartalom meghatározása A középsı levélér eltávolítása után 250 mg levelet 2x1 ml 1 N HCl-metanol oldatban kvarchomokkal dörzsmozsárban eldörzsöltünk, majd a növényi kivonatot centrifugáltuk (4 C, 20 perc, 12000g). Az antociántartalom meghatározása spektrofotometriásan történt UV-VIS spektrofotométerben (Shimadzu 160-A, Japán). A készüléket az izoláló oldattal nulláztuk. Az antociánokat tartalmazó felülúszó 530 nm-en leolvasott abszorbanciáját a 479 nm-en mért nem-specifikus abszorbancia értékkel korrigáltuk. Az ábrákon az 1 g friss tömegre vonatkozó abszorbancia különbségeket (A 530 -A 479 /g friss tömeg) adtuk meg (LANGE és mtsai., 1970) Hajtáshossz mérése Az UV-B kamrakísérleteknél lemértük az egyes növények hajtáshosszát a talajfelszín és a felszíntıl legtávolabb lévı levélcsúcs közötti távolság cm-ben történı kifejezésével Szabadföldi kísérletek UV-B sugárzási adatai és statisztikai értékelésük Az UV-B sugárzási adatokat Chile és Magyarország Meteorológiai Szolgálata bocsátotta rendelkezésünkre. A statisztikai értékeléshez (két- és háromtényezıs varianciaanalízis) az AGROBASE 99 ANOVA programját használtuk Statisztikai analízis Az eredmények 30 ismétlés átlagai a klorofilltartalom-mérés, 15 ismétlés átlagai a klorofill fluoreszcencia-indukciós és a hajtáshossz mérések, 5 mérés átlagai a gázcsere, 5 mérés átlagai az enzimaktivitás és 4 mérés átlagai az antociántartalom meghatározás esetében. A szignifikancia vizsgálathoz a Student-féle kétmintás t-próbát használtuk. Az eredmények feldolgozása Microsoft Excel programmal történt. 62

63 5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 5.1. SMM-kezelések SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására 5 C-on Kísérleteink elsı részében arra a kérdésre kerestünk választ, hogy 5 C-os hidegkezelés során aktiválódnak-e az egyes antioxidáns enzimek, valamint arra, hogy a kontroll és az SMM-kezelt növények között mutatkozik-e különbség e tekintetben. Ennek érdekében a hidegkezelés 1., 4. és 6. napján a 3. levélbıl vett mintákból mértük a GR, GST, CAT, APX és a POD antioxidáns enzimek aktivitását. Eredményeink alapján (6. ábra) megállapíthatjuk, hogy mindegyik vizsgált antioxidáns enzim aktiválódott az 5 C-os hidegkezelés hatására, bár különbözı mértékben és ütemben. A GR, a GST és a CAT aktivitása már az elsı napra elérte a maximumát. A GR és a CAT aktivitása jelentısebb mértékben, kb. kétszeresére nıtt, a GST ezzel szemben csak mintegy másfélszeresére. A CAT esetében azonban már a 4. naptól csökkenı tendenciát tapasztaltunk, míg a másik két enzim a 6. napig megtartotta magasabb aktivitását. Az APX aktivitása igen nagymértékben emelkedett a hidegkezelés hatására, már az elsı napon kétszeresére, a negyedik napra pedig a maximumát elérve ötszörösére növekedett. A POD az elsı napon még nem mutatott változást, aktivitása a 4. napra is csak kis mértékben, nem szignifikáns mértékben nıtt meg. Az SMM kezelés hatására különbséget mutattunk ki egyes enzimek aktiválódásának ütemében és mértékében. A hidegkezelés során a GR, a GST és a CAT enzimek az elsı napon hasonló mértékben aktiválódtak az SMM-kezelt és a kontroll növényekben, azonban az SMM kezelés hatására aktivitásuk a 4. napra tovább nıtt, és így szignifikáns mértékben meghaladta a kontroll növényekét. A 6. napra azonban már mindhárom enzimnek csökkent aktivitása (a katalázé legnagyobb mértékben). Az APX már az elsı napon nagyobb mértékben aktiválódott az SMM hatására, több mint kétszeresére nıtt az enzim aktivitása. A 4. napon is hasonlóan magas aktivitás volt megfigyelhetı, 6. napon azonban csökkent, így kisebb különbséget mutatott a kontroll növényekhez képest. A POD aktivitása a kontrollhoz viszonyítva korábban, már az elsı napon is jelentıs mértékben megnıtt az SMM-kezelt növényekben. Ez az aktivitás - bár csökkent a hosszú hidegperiódus alatt - még a 6. napon is szignifikánsan magasabb maradt, mint a kontroll növényé (6. ábra). 63

64 A412 min -1 0,10 0,05 0,00 *** * 1.nap 4.nap 6.nap A 22 C 5 C 5 C 5 C A412 min -1 0,10 0,05 0,00 * B 1.nap 4.nap 6.nap 22 C 5 C 5 C 5 C A240 min -1 0,02 0,01 0,00 *** C 1.nap 4.nap 6.nap kontroll SMM 22 C 5 C 5 C 5 C A290 min -1 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00 * D 1.nap 4.nap 6.nap 22 C 5 C 5 C 5 C A470 min -1 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 *** * E 1.nap 4.nap 6.nap 22 C 5 C 5 C 5 C 6. ábra. A hidegkezelés (5ºC, 1, 4, 6 nap) hatása a GR (A), a GST (B), a CAT (C), az APX (D) és a POD (E) aktivitására kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,***: szignifikáns P 0.05, és szinten a kontroll aktivitáshoz képest. 64

65 Az eredmények ismeretében elmondható, hogy az SMM-kezelt növényekben a GR, a GST és a CAT aktivitása a legnagyobb mértékben a hidegkezelés 4. napjára nıtt meg. Az APX-nél az aktiválódás ütemét gyorsította fel az SMM, míg a POD-nál mind az aktiválódás ütemére, mind mértékére pozitív hatással volt az SMM kezelés SMM-kezelés hatása az antioxidáns enzimek aktivitására chilling hımérsékleti gradiens (14-6 C) mellett A továbbiakban a chilling hımérséklet szélesebb tartományában tanulmányoztuk az SMM hatását kukorica csíranövények antioxidáns enzimrendszerére hımérséklet gradiens (14, 12, 10, 8 és 6 C) mellett (7. ábra). Az enzimaktivitás méréseket a hidegkezelés 4. napján végeztük a 3. levélbıl vett minták segítségével. A GR aktivitása a kontroll növényekben 10 C-on kezdett emelkedni, maximumát a 8 C-os hidegkezelés során érte el. Az SMM-kezelés hatására csak 8 Con indult meg az enzim aktiválódása, és 6 C-on még tovább erısödött, így szignifikánsan meghaladta a kontroll növényekben mért értéket. A GST aktivitása a 10 C körüli hımérsékleteken valamivel magasabb volt a kontroll növényekben, mint az SMM-kezeltekben, az alacsonyabb, 6 C-os hımérsékleteken azonban már csökkent a kontroll növényekben. Az SMM hatása viszont ezen a hımérsékleten jelentkezett igazán; a GST aktivitás 6 C-on szignifikánsan magasabbnak bizonyult mind a kontroll növényekéhez, mind pedig a 10 C-hoz közeli hımérsékleteken tartott SMM-kezelt növényekéhez képest. A CAT aktivitása hideg hatására a kontroll és az SMM-kezelt növényekben egyaránt fokozatosan emelkedett, bár végig nagyon alacsony értéket képviselt, szignifikáns különbség nélkül. Az APX aktivitásában nem mutatkozott jelentıs különbség a kontroll növényekben a különbözı mértékő hidegkezelések között. Az SMM-kezelés hatására azonban minden hımérsékleten szignifikánsan magasabb értéket ért el az enzim aktivitása. A legmagasabb aktivitást 8 C-on tapasztaltuk. A POD aktivitása szintén nem változott számottevıen a kontroll növényekben a különbözı hımérsékletek mellett. Az SMM hatására azonban 6 C-on érte el az enzimaktivitás a maximumát, meghaladva a kontroll növényekben 6 C-on mért értéket (7. ábra). 65

66 0,10 A412 min -1 0,05 ** ** A 0,00 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C A340 min -1 0,10 0,05 * ** B 0,00 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C A240 min -1 0,010 0,005 C 0, C 12 C 10 C 8 C 6 C A290 min -1 0,10 0,05 ** ** * *** * D 0,00 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C A470 min -1 0,30 0,20 0,10 ** E 0,00 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C kontroll SMM 7. ábra. GR (A), GST (B), CAT (C), APX (D), POD (E) aktivitása kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid) alacsony hımérsékleti grádiens (14-6ºC, 4. nap) mellett. *,**,***: szignifikáns P 0.05, 0.01 és szinten a kontroll aktivitáshoz képest 66

67 Megfigyeléseink alapján megállapíthatjuk, hogy az SMM-kezelés hatása elsısorban alacsonyabb hımérsékleten számottevı: 6 C-on megnövelte a GR, valamint a GST és a POD aktivitását a kontrollhoz képest. Az APX esetében az alacsony hımérsékleti grádiens valamennyi hımérsékletén megmutatkozott az SMM enzimaktivitást fokozó hatása SMM-kezelés hatása a fotoszintézisre chilling hımérsékleti gradiens (14-6 C) mellett Chilling hımérsékleti gradiens mellett az SMM-kezelés fotoszintézisre gyakorolt hatását is megvizsgáltuk fluoreszcencia-indukció mérés, fotoszintetikus aktivitás, intercelluláris széndioxid-koncentráció és relatív klorofilltartalom meghatározás segítségével. Mindegyik vizsgálatot a hidegkezelés 1., 3. és 4. napján végeztük a legfiatalabb, teljesen kifejlett 3. levélen A fluoreszcencia indukciós paraméterek változásai A PSII maximális kvantumhatékonyságát jelzı Fv/Fm paraméter meghatározás eredményeit a 8. ábra mutatja be. Az eredmények alapján megállapítható, hogy chilling hımérsékleti tartomány legalacsonyabb értékei (6 és 8 C) mellett voltak mérhetık a legalacsonyabb Fv/Fm hányados értékek a kontroll növényekben, a hideg kezelés teljes ideje alatt. SMMkezelés hatására e paraméter értéke e két hımérséklet mellett (6 és 8 C) szignifikánsan növekedett a kontrollhoz képest, a mérés mindhárom napján. A 3. és 4. napon, 12 Con is szignifikáns növekedést mutatott az Fv/Fm érték az SMM-kezelt növényekben, a kontrollhoz viszonyítva. Mindez arra utal, hogy e vegyület védıhatást biztosított a második fotokémiai rendszer mőködése számára a chilling hımérséklet károsító hatásaival szemben. 67

68 Fv/Fm 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 ** *** A 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C Fv/Fm 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 * * ** 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C B control SMM Fv/Fm 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 * * * 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C Hımérséklet ( o C) C 8. ábra. A PSII maximális kvantumhatékonyságát jelzı fluoreszcencia-indukciós paraméter (Fv/Fm) változásai hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,**,***: szignifikáns P 0.05, 0.01 és szinten a kontrollhoz képest. 68

69 A fotoszintetikus aktivitás és az intercelluláris CO 2 tartalom alakulásának összefüggései E kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a chilling hımérsékleti gradiens hogyan befolyásolja a növények fotoszintetikus aktivitását és az intercelluláris szén-dioxid koncentrációt. Az eredményeket a ábra mutatja be. 10 ** *** ** A A [µmol CO2 m -2 s -1 ] C 12 C 10 C 8 C 6 C A [µmol CO2 m -2 s -1 ] 10 5 * * ** B control SMM 0 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C A [µmol CO2 m -2 s -1 ] 10 5 * ** *** C 0 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C Hımérséklet ( o C) 9. ábra. A fotoszintetikus aktivitás változása hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,**,***: szignifikáns P 0.05, 0.01 és szinten a kontrollhoz képest. 69

70 Ci [µmol CO2(mol air) -1 ] * *** *** *** 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C A Ci [µmol CO2(mol air) -1 ] * * * *** 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C B control SMM Ci [µmol CO2(mol air) -1 ] * *** 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C C Hımérséklet ( o C) 10. ábra. Intercelluláris CO 2 -koncentráció (C i ) változásai hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,***: szignifikáns P 0.05 és szinten a kontrollhoz képest. A 9. ábra alapján az a tendencia látszik, hogy a hımérséklet csökkenést többségében fokozatosan csökkenı mértékő fotoszintetikus aktivitás követi mind a kontroll, mind az SMM-kezelt növények esetében. Azonban az SMM-kezelés hatására több esetben is szignifikáns fotoszintézis aktivitás-növekedést tapasztaltunk a 70

71 kontrollhoz képest: a legalacsonyabb hımérséklet mellett, 6 C-on a hideg kezelés mindhárom mérési napján, 8 C-on a 3. napon, 10 C-on az 1. és 3. napon, 12 C-on az 1. és 4. napon. A 10. ábra alapján megállapítható, hogy az intercelluláris szén-dioxid koncentráció értékek korrelálnak a fotoszintetikus aktivitás eredményeivel: a hideg kezelés 3., 4. napján 6 C-on a C i értékek szignifikáns csökkenése volt megfigyelhetı az SMM-kezelt növényekben a kontrollhoz képest, az 1. és 3. napon pedig a 10, 12 és 14 C-os hımérsékletnek kitett növényekben szintúgy Az SMM hatása stresszvédı metabolitok keletkezésére A különbözı mértékő chilling stressz hatására fellépı válaszreakciók során keletkezı stresszvédı fenoloidok keletkezését jellegzetes, 430 és 450 nm között (F440) a kék, illetve nm-nél a zöld tartományban maximumot (F520) mutató fluoreszcencia emissziójuk alapján floureszcencia leképezı módszerrel követtük nyomon, összevetve a fotoszintetikus apparátus állapotváltozásait jellemzı vörös (F690) és távoli vörös (F740) hullámhosszaknál mérhetı, fıként a klorofill-a fluoreszcenciájából adódó emisszió változásokkal. Megállapítottuk, hogy a 22 o C-on nevelt növényekben 4 nappal az SMM kezelést követıen a fenoloidok klorofill-a-hoz viszonyított fluoreszcencia emissziója mind a kék tartományban (440/690, 440/740), mind a zöld tartományban (520/690, 520/740) mintegy 5-8 %-al kisebb, mint a kontroll növényekben. A hidegstressz során azonban az SMM kezelt növényekben sokkal nagyobb mértékben emelkedik a 440 és 520 nm-nél mérhetı fluoreszcencia, mint a kontroll növényeknél. Az SMM hatására bekövetkezı fluoreszcencianövekedés mértéke a 6 o C-os hidegstressznek kitett növényeknél a legmagasabb (1. táblázat). 71

72 1. táblázat. 4 napos hidegstressznek kitett levelek fluoreszcencia arányainak hımérsékletfüggése kontroll és SMM kezelt kukoricában Treatment Control 6 C SMM 6 C Control 8 C SMM 8 C Control 10 C SMM 10 C Control 12 C SMM 12 C Control 14 C SMM 14 C Fluorescence ratio at 440/690 nm Fluorescence ratio at 440/740 Fluorescence ratio at 520/690 Fluorescence ratio at 520/740 Fluorescence ratio at 690/740 1,324 0,806 0,815 0,499 0,647 2,234 1,164 1,210 0,631 0,524 2,948 1,636 1,669 0,928 0,554 3,584 1,935 1,986 1,082 0,515 3,142 1,715 1,688 0,993 0,546 3,328 1,715 1,953 1,006 0,513 3,610 2,060 2,185 1,247 0,572 3,408 1,834 1,905 1,088 0,534 2,562 1,290 1,472 0,742 0,507 2,669 1,881 1,517 0,785 0, SMM-kezelés hatása a relatív klorofilltartalomra chilling hımérsékleti gradiens (14-6 C) mellett A relatív klorofilltartalom alakulása chilling hımérséklet és SMM-kezelés hatására hasonló tendenciát mutatott, mint az Fv/Fm hányados esetében (11. ábra). A két legalacsonyabb hımérsékleten, 6 és 8 C-on szignifikáns relatív klorofill-többlet volt kimutatható az SMM-kezelt növényekben a kontrollhoz képest, a hidegkezelés mindhárom napján. 10 C-on a hidegkezelés elsı és második napján, 14 C-on 1 napos hidegkezelés után a növények relatív klorofilltartalma az SMM-kezelés hatására szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontroll növényeké. Az eredmények azt igazolják, hogy e vegyület a kevésbé károsodott struktúrák miatt megakadályozza a klorofilltartalom csökkenését. 72

73 Klorofill-tartalom (rel.) * *** *** ** A 0 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C Klorofill-tartalom (rel.) * ** *** B kontroll SMM 0 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C Klorofill-tartalom (rel.) ** *** 14 C 12 C 10 C 8 C 6 C C Hımérséklet ( o C) 11. ábra. Relatív klorofilltartalom hımérséklet gradiens (14-6ºC) mellett 1 (A), 3 (B) és 4 (C) nap után kontroll és SMM-kezelt kukoricanövényekben (Norma hibrid). *,**,***: szignifikáns P 0.05, 0.01 és szinten a kontrollhoz képest. 73

74 Alacsony hımérsékleti stressz és SMM-kezelés hatására történt változások eredményeinek értékelése Mind az 5 C-on, mind pedig a chilling hımérsékleti gradiens (14-6 C) mellett végzett végzett kísérletek eredményei kapcsán összefoglaló értékelésként elmondható, hogy a növényi stressztolerancia kialakulása kapcsolatban van az antioxidáns rendszerek aktivitásának emelkedésével. Az alacsony hımérsékleti stressznek kitett növényekben a membránok fluiditása csökken, az elektrontranszportlánc kevésbé mőködik, a membránkötött, illetve hidegérzékeny enzimek aktivitása csökken, vagy elvész. A membránintegritás csökkenése növeli a reaktív oxigén vegyületek keletkezésének és az oxidatív stressznek a veszélyét. A megnövekedett ROS szintje kiváltja az antioxidáns enzimek aktivitásának up-regulációját, mely folyamat megvédi a növényeket az oxidatív stressz károsító hatásaival szemben (DAVEY et al. 2000). Az antioxidáns védekezı rendszer aktivitásának növekedése a kedvezıtlen környezeti stresszorokkal szemben hosszú idı alatt alakul ki és ezt a folyamatot nevezzük adaptációnak. A szubtropikus eredető gazdasági növények közül nagy számban vannak olyanok (pl. kukorica, rizs, paradicsom, paprika, tök, uborka stb.), melyeket a mérsékelt égöv alatt is, de nem optimális körülmények mellett termesztenek, és ezek a fajok eredetileg nem rendelkeztek a fent említett védekezı mechanizmusokkal. Ebben az esetben a növénynemesítés feladata megfelelı toleranciával rendelkezı genotípusok szelektálása és ezek segítségével toleráns fajták elıállítása. Ez a folyamat azonban - fajtól függıen - sok idıt vesz igénybe. Az utóbbi évtizedben egyre több kutató foglalkozott olyan, az anyagcserében is szerepet játszó vegyületekkel, melyek külsı alkalmazásával növelni lehetett az antioxidáns rendszerek teljesítményét. Ilyen vegyületek többek között a poliaminok (ZHANG és mtsai. 2009), a szalicilsav és származékai (JANDA és mtsai. 1999; KANG és mtsai. 2003; WANG és LI, 2006), metiljazmonsav (CAO és mtsai. 2009), valamint az általunk is alkalmazott SMM (GYETVAI és mtsai. 2002; RÁCZ és mtsai. 2008; SZEGİ és mtsai. 2009). Az SMM szabályozza a metionin és az AdoMet szinteket, a kén transzportot és kiinduló vegyülete az eddig ismert legerısebb növényi ozmoprotektáns, a DMSP kloroplasztiszban történı szintézisének (HANSON és mtsai. 1994). Védi a fotoszintetikus apparátust, elsısorban a PSII rendszert, átalakulása révén részt vesz a spermidin szintézisben, amely viszont a 74

75 sejt membránok integritását biztosítja (RÁCZ és mtsai. 2008; SZEGİ és mtsai. 2009). Adataink alapján az SMM hatására emelkedik egyes antioxidáns enzimek aktivitása, és ezen keresztül részt vesz az ROS eliminálásában. Több szerzı kiemeli az APX és GR szerepét a H 2 O 2 szint csökkentésében (NOCTOR és FOYER, 1998; ASADA, 1992; MITTOVA és mtsai., 2000; SHIGEOKA és mtsai., 2002). Mivel a kloroplasztiszokban nincs katalázaktivitás, így az ott keletkezı H 2 O 2 -t az ún. aszkorbát-glutation ciklus semlegesíti az APX segítségével. E folyamat végén keletkezı oxidált glutationt a GR redukálja NADPH felhasználásával. Ezt a megfigyelést támasztja alá chilling hımérsékleten az SMM-kezelt növényekben tapasztalható GR és APX aktivitás növekedése is. Kutatásaink során mi is azt igazoltuk, hogy az APX jelentısége meghatározó, hiszen a kukorica levélben az alacsony hımérséklet gradiens valamennyi értékénél az SMM növelte tudta az enzim aktivitását, hozzájárulva a chilling okozta károk kivédéséhez, ill. enyhítéséhez. A GST-vel kapcsolatban meg kell említeni, hogy összetett funkciójú enzim. Szubsztrátként ugyan glutationt használ, ami redoxállapot-szabályozó a sejtben, így számít a GST mennyisége, illetve rendelkezésre állása. Nagyon fontos a GST, mint az intracelluláris transzportfolyamatokban szállított komplexek létrehozója és méregtelenítı, ugyanis az általa létrehozott glutationhoz kötıdı vegyületek azok, - legyenek akár antociánok, akár toxikus anyagok - amik transzportálhatók. Az összefoglaló munkák rámutatnak arra is, hogy az exogén módon használt vegyületek, a különbözı abiotikus stresszorokhoz hasonlóan nem egyformán hatnak az egyes antioxidáns enzimekre. Ez jól kimutatható a poliaminok, szalicilsav és az SMM esetében is. További kiterjedt vizsgálatokra van szükség ahhoz, hogy az antioxidáns enzimek kedvezıtlen körülmények alatti eltérı viselkedését, azaz aktivitásbeli különbözıségüket meg tudjuk magyarázni. Az SMM fotoszintézisre gyakorolt kedvezı hatása feltehetıen annak köszönhetı, hogy közvetlenül, vagy közvetetten a poliaminokon át megnyilvánuló membránvédı és gyökvédı hatása révén csökkenti a membránkárosodásokat, elısegítve a fotoszintetikus membránok integritásának és a fotoszintetikus elektrontranszport láncban részt venni képes PSII reakciócentrumok, valamint a fotoszintetikus apparátus további szupramolekuláris komplexei épségének és funkcióképességének megırzését. Ez jelentıs funkció megırzı hatást eredményezhet, 75

76 különös tekintettel arra, hogy a javító enzimaktivitások és az új fehérjék és pigmentek szintézise alacsony hımérsékleten jellemzıen kisebb sebességgel megy végbe, vagy nem is történik meg. A fotoszintetikus apparátus kisebb mértékő károsodása az SMM kezelt növényeknél abban is megnyilvánul, hogy az SMM kezelt növények fotoszintetikus aktivitása magasabb értéken marad, mint a kontroll növényeké. Ez feltehetıen azzal magyarázható, hogy a kukorica, lévén C4-es növény, alacsonyabb CO 2 koncentrációknál is maximális hatékonysággal tud széndioxidot megkötni, így a fotoszintezis hatékonysága inkább a fotoszintetikus elektrontranszportlánc mőködésének hatékonyságától, semmint az aktuálisan valamelyest csökkent CO 2 mennyiségtıl függ. Fluoreszcencia leképezı vizsgálatokkal nyomonkövetve a kék és a zöld fluoreszcencia emisszió növekedést elıidézı fenoloidok (hidroxifahéjsav származékok, ferulasav észterek, p-kumársav), és flavonoidok (pl. kempferol és kvercetin) mennyiségében bekövetkezı változásokat megfigyelhetı volt, hogy noha a hidegstressz önmagában is elıidéz növekedést ezen stresszvédı anyagok mennyiségében, az SMM elıkezelést követıen nagyobb mértékben emelkedik a hidegstressz során 440 és 520 nm-nél mérhetı fluoreszcencia, mint a kontroll növényeknél. A fluoreszcencia-növekedés mértéke a 6 o C-os hidegstressznek kitett SMM kezelt növényeknél a legmagasabb. E kísérletek eredményei - összhangban a korábbi vizsgálatok eredményeivel - az SMM sokoldalú szerepét támasztják alá a hidegstressz elleni védelemben, mely a fotoszintetikus apparátus funkcióképességének megóvásában, valamint a stresszvédelemben szerepet játszó metabolitok szintézisének növelésében egyaránt megnyilvánul. 76

77 5.2. A magasabb szabadföldi UV-B sugárzás és a növényi antociántartalom alakulásának összefüggései A 2 kísérleti helyen, Martonvásáron és Buin-ban (Chile), az 5 kísérleti év 3 azonos hónapjára számított biológiailag effektív UV-B sugárzás szignifikánsan eltért egymástól. Ez a különbség Chilében közel +28%-ot jelentett. A legnagyobb különbség 2001-ben volt, amikor is a Chilében mért adatok 37 %-kal voltak nagyobbak, mint Magyarországon. Az adatok elemzése során azt is megállapítottuk, hogy a szórás értéke Magyarországon volt nagyobb. Nálunk a napi adatok között lényeges ingadozás volt megfigyelhetı, ugyanakkor Chilében - e hónapokra jellemzı teljesen felhıtlen égbolt miatt - ez nem volt tapasztalható (12. ábra). 30 Buin 25 MED Martonvásár days 12.ábra. A biológiailag effektív UV-B sugárzás napi összegeinek átlagos menete 5 év ( ) alapján, az év egymásnak megfelelı idıszakaiban Buinban (Chile) [november, december, január] és Martonvásáron [május, június, július] 1 MED=21 mj/m 2, MED= Minimális Erythema Dózis Mind az 5 évben ugyanazzal a 10 beltenyésztett (5 korai: L2-E, L3-E, L4-E, L9- E, L10-E és 5 közép-, illetve késıi tenyészidejő: L1-L, L5-L, L6-L, L7-L, L8-L) kukoricavonallal dolgoztunk. A két- és háromtényezıs varianciaanalízisek eredményei alapján a következıket állapíthatjuk meg: a Chilébıl hozott minták relatív 77

78 antociántartalma - a 10 vonal és az 5 év átlagában - szignifikánsan (16%-kal) nagyobb volt, mint a Magyarországon vett minták (Buin: A = 0,555, Martonvásár: A = 0,478) abszorbancia átlagértékei (2. táblázat). A háromtényezıs varianciaanalízis eredménytáblázatainak MQ értékei alapján megállapítható, hogy a levelek antociántartalmára legnagyobb hatása a helynek volt, ezt követte a genotípusok hatása, míg a tényezık közül a vizsgált tulajdonságra a legkisebb befolyást az évjárat gyakorolta. A kölcsönhatások közül legnagyobb volt a fajta x hely, fajta x év, majd ezt követte az év x hely interakció. A vizsgált tulajdonságnál a tényezık fı hatása és a kölcsönhatások P = 0,1%-os szinten szignifikánsak voltak. 2. táblázat. A relatív antociántartalomban jelentkezı különbségek beltenyésztett kukoricavonalak leveleiben 2 eltérı kísérleti helyen 5 év átlagában. LSD 5% =0,023 (vonalak között), LSD 5% =0,010 (kísérleti helyek között), LSD 5% =0,016 (évek között). A táblázatban szereplı számok az abszorbancia különbségeket (A 530 -A 479 nm/g friss tömeg) mutatják. No. LINES MEAN OF LINES MEAN OF LINES 1 L1-L 0,566 0,800 0,680 0,659 0,684 0,678 0,776 0,616 0,675 0,679 0,622 0,674 2 L2-E 0,257 0,229 0,238 0,312 0,293 0,266 0,358 0,463 0,350 0,578 0,536 0,457 3 L3-E 0,371 0,357 0,434 0,301 0,681 0,429 0,381 0,523 0,512 0,660 0,608 0,537 4 L4-E 0,308 0,387 0,209 0,430 0,311 0,329 0,568 0,580 0,542 0,420 0,291 0,480 5 L5-L 0,692 0,863 0,731 0,672 0,730 0,737 0,564 0,809 0,474 0,640 0,587 0,615 6 L6-L 0,223 0,674 0,501 0,460 0,704 0,513 0,428 0,734 0,370 0,566 0,429 0,506 7 L7-L 0,390 0,590 0,685 0,479 0,333 0,495 0,621 0,447 0,528 0,569 0,464 0,526 8 L8-L 0,472 0,860 0,604 0,344 0,474 0,551 0,595 0,754 0,520 0,682 0,657 0,641 9 L9-E 0,473 0,206 0,390 0,454 0,423 0,407 0,660 0,562 0,483 0,566 0,639 0, L10-E 0,333 0,436 0,385 0,338 0,366 0,372 0,440 0,681 0,639 0,476 0,384 0,524 MEAN OF YEARS MARTONVÁSÁR (HUNGARY) YEARS BUIN (CHILE) YEARS 0,409 0,540 0,486 0,454 0,500 0,478 0,539 0,617 0,509 0,583 0,522 0,554 78

79 A 13. ábrán az egyes években kapott relatív antociántartalom értéket tüntettük fel a két kísérleti helyen. Mind az 5 kísérleti évben a chilei minták átlagértékei voltak magasabbak. 0,8 A530-A479/g 0,6 0,4 0,409 0,539 0,540 0,617 0,486 0,509 0,454 0,583 0,500 0,522 0,2 0, Martonvásár Buin 13. ábra. Tíz beltenyésztett kukoricavonal leveleiben mért abszorbancia értékek 5 év átlagában, 2 kísérleti helyen (Martonvásár, Buin). Mindez arra enged következtetni, hogy a kukoricára is feltehetıen negatívan ható biológiailag effektív és igazolhatóan nagyobb UV-B sugárzás a kukorica genotípusok átlagában anyagcsere szinten történı válaszreakciót eredményezett. Nagyobb UV-B sugárzás hatására az antocián szintézis a legtöbb genotípusnál aktiválódik. Míg a késıi beltenyésztett vonalaknál az amúgy is magasabb antociántartalom értékek gyakorlatilag változatlanok a megnövekedett UV-B sugárzás hatására, addig az 5 korai (F2, CM7, stb. rokonsági körbe tartozó) anyagnál (L2-E, L3- E, L4-E, L9-E, L10-E) igen jelentıs, antociántartalom növekedés volt megfigyelhetı 5 év átlagában. Ezen az anyagoknál az évenkénti chilei értékek is kivétel nélkül mind szignifikánsan magasabbak voltak, az ottani tenyészkerti munkáknál fıleg e genotípusoknál találtunk többször virágzásbeli aszinkronizációt és meddıséget. (Volt olyan év, hogy egyes vonalak fajtafenntartása a nıvirágzat megjelenésének hiányában egyáltalán nem sikerült.) 79

80 A 2. táblázat adatainak részletes elemzése alapján megállapítható, hogy a késıi tenyészidejő vonalaknál az 5 év átlagában mindkét helyen közel azonos és magas értékek voltak. Ezek közül az egyik legkésıbbi tenyészidejő, L1-L jelzéső beltenyésztett vonal szintetizálta a legtöbb antociánt. A korai érésidejőek között találtunk olyan beltenyésztett vonalat, melyek ugyanazon a helyen minden évben szinte azonos reakciót mutattak (pl. L2-E, L4-E). Más korai vonalaknál (L9-E, L10-E) pedig a kapott értékek közötti szórás jóval nagyobb volt. Mindez feltehetıen azt igazolja, hogy az eltérı genotípusú kukoricavonalak között magasabb UV-B sugárzásra adott válaszreakciók tekintetében lényeges különbségek vannak. Az évek és termıhelyek átlagában (14. ábra) e korai anyagoknál a spektrofotometriásan mérhetı növekmény chilei átlagértéke több mint 45%-kal volt magasabb, mint a Magyarországon mért érték. Az L2-E jelzéső vonalnál a chilei relatív antociántartalom növekedésének mértéke meghaladta a 71%-ot, de az L4-E, L9-E és az L10-E vonalaknál is ez az érték 40% feletti volt. 0,8 A530-A479/g 0,6 0,4 +71,9% +25,2% +45,9% +42,8% +41,0% 0,2 0,0 L2-E L3-E L4-E L9-E L10-E Martonvásár Buin 14. ábra. Öt korán érı beltenyésztett kukoricavonal abszorbancia értékei 3 év átlagában ( ) 2 kísérleti helyen. 80

81 Az eredmények alapján megállapítható, hogy vannak olyan genotípusok (vizsgálatainkban a késıi tenyészidejőek), melyek relatív antociántartalma eleve magasabb, így az erısebb UV-B sugárzással szembeni védekezési mechanizmusuk adott, s feltehetıen ezért is maradtak el a látványos válaszreakciók. Kísérleteinkben ezek a vonalak bizonyultak stressztőrıbbeknek. Ezt erısítették meg a fiziológiai állapot jellemzésére szolgáló több hullámhosszú fluoreszcencia leképezés módszerével kapott eredmények is. Az 5 késıi vonalnál az F440/F690 arányok magas értékei azt jelzik (nincs bemutatva), hogy a kék spektrális tartományban fluoreszkáló anyagok (köztük valószínőleg a védelmi rendszerben jelentıs szerepet játszó antociánok) mennyisége ezeknél a legtöbb. Ezek a változások, a stressz akklimációként értékelhetık. Ugyanakkor vannak olyan - fıleg korai tenyészidejő - genotípusok, melyek leveleiben jóval alacsonyabb az antociántartalom, de egy nagyobb UV-B sugárzás következtében annak mennyisége ugrásszerően megnı. Ami viszont nem jelenti biztosan azt, hogy ez által e vonalak stressztőrıbbekké is válnának, mint ahogy erre - a chilei tapasztalataink alapján - a korábbiakban már utaltunk. A stresszeltségi szintet mutató F440/F690 arányok értékei ezeknél lényegesen alacsonyabbak voltak, jelezvén e vonalak kisebb mértékő akklimációs képességét. A több hullámhosszú leképzési technika képi megjelenítését egy késıi (L1) és egy korai (L2) beltenyésztett kukoricavonal leveleiben az UV-B sugárzás hatására (Martonvásár, 2006; UV-B sugárzási dózis: 21 MED) bekövetkezett változással mutatjuk be (15. ábra). Négy hullámhossznál - a kék (F440), a zöld (F520), a vörös (F690) és a távoli vörös (F740) spektrális tartományban - végeztük a fluoreszcencia leképzést. A különbözı stresszfaktorok (jelen esetben az UV-B sugárzás) által okozott funkciócsökkenés, megváltozott állapot képszerően megjeleníthetı, ami lehetıvé teszi a kukoricalevél különbözı részein bekövetkezı, eltérı változások regisztrálását a stressz kezdeti szakaszán már akkor is, amikor a károsodások még szabad szemmel nem láthatóak. A leképzési módszerrel kapott képek megbízható kiértékeléséhez a fotoszintézissel összefüggı, de más módszerekkel kapott értékekre (fotoszintetikus aktivitás, sztóma konduktancia, klorofill-a és -b, valamint antociánok mennyisége stb.) is szükség van. 81

82 15. ábra. Fluoreszcencia leképzési technika alkalmazása UV-B indukált élettani/biokémiai változások képi megjelenítésében L1 késıi (felsı ábra) és L2 korai (alsó ábra) éréső beltenyésztett kukoricavonalak leveleiben. Mintavétel idıpontja: július 25., az UV-B sugárzás mértéke: 21 MED 82