Állatorvostudományi Egyetem. Magyar Állatorvosok Világszervezete. BECSKEI Zsolt 18.

Átírás

1 Állatorvostudományi Egyetem Belgrád - Szerbia Magyar Állatorvosok Világszervezete VADDISZNÓK CIRKOVIRUS FERTŐZÖTTS TTSÉGE Beregszász április BECSKEI Zsolt beckeizolt@gmail.com

2 ... TÖRTÉNELMI ÁTTEKINTÉS... A vaddisznónak nak és s a vadászatnak a magyar nemzet történelmében nem csak ekonómiai, hanem sorsíró jellege is van

3 ... TÖRTÉNELMI ÁTTEKINTÉS...

4 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... Megváltozott a vaddisznótart tartás és s gondozás s módszere. m A vaddisznó etetése általánossá vált. Több mint etetõhelyen, heti alkalommal etetnek. A nagyvadas és s vegyesvadas területeken, a terület 70%- án n törtt rténik etetés, ez korábban csupán n 3% volt. A hazai nagyvadgazdálkod lkodás s ezzel intenzívebb vebbé vált.

5 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... SZERBIA 3OO vadászter szterület 4 nagy nemzeti park engedélyezett vadászat o.o v.d./ha 35 zárt z vadászter szterület ha Nyitott vadászter szterület ooo ha (1.759ooo ha erdő) Vajdaság g ha vaddisznv addisznó <-> vadász

6 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... MAGYARORSZÁG 113 vadaskert 67.ooo ha (93.ooo) Ez csupán n 1% az össz vadászter szterületnek o.o3-1.o3 v.d/ha Németország g 5.ooo Ausztria 4.ooo

7 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... A vaddisznóá óállományok környezeti k helyzetképe: 2O14 HU 1o5 215 egyed szabadtéri állományok (83,6%) zárttéri ri állományok - vadaskert ( 16,4%)... TERITÉK 2o13/2o14 vadászaati év teriték <-> > vadász

8 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... HU Az évi országos teriték k % zérttz rttéri ri vaddisznó 85% szabadtéri vaddiszmó Az évi teriték k 19,64% külfk lföldi ldi vadászok teritették Nyugat EU forditott az arany

9 ZÁRTTÉRI RI VADTARTÁS VADASKERET 31.ooo ha

10 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... A vaddisznók k tartástechnol stechnológiája (vaddisznóskertek skertek tipusa) I. Egységes ges kert - szaporulatra alapozva - befogasra alapozva - kombinált

11 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... II. Megosztott kert - váltókert - tárolós s kertek - kocatárol rolós s kert - malactárol rolós s kert - kantárol rolós s kert

12 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... III. Intenziv szaporitasra alapozott kert - különálló szaporitókert - elletőkar karámos szaporitókert - kutricás s szaporitókert

13 LAJOSMIZSEI VADDISZNÓKERT

14 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... A vaddisznó intenzív v tartása MAGAS ÁLLOMÁNYSŰRŰSÉG Állategészségügyi gyi gondok

15 ... IRODALMI ÁTTEKINTÉS... PCV2-vel kapcsolatban leírt kórkk rképek (PCVAD) házisertésbensben - választott malacok cirkovirus okozta sorvadása sa (PMWS( PMWS) - dermatitisz nefropátia szindróma (PDNS), - sertések sek légzl gzőszervi tünetegyt netegyüttesettese (PRDC), - magzati miokarditisz és s reproduktív v rendellenességek - granulómás s enterítisz, tisz, - nekrotikus limfadenítisz, - ekszudative epidermítisz és - congenitális tremor. (SAMS), (West és s mtsai.,1999; Ladekjaer és s mtsai., 2001; Kim és s mtsai., 2004; Chae C., 2005; Cheng és s mtsai. 2010)

16 Poxvirus 300 nm PCV2 Család: Genus: Circoviridae Circovirus Legkisebb állati eredetü DNS vírusv (virion 17nm) (Tischer és s mtsai., 1982; Studdert, 1993; Harding, 1997; Mankertz és s mtsai., 1997; Jiang és s mtsai., 2010)

17 Két t tipus: egyes típust pusú sertés s cirkovírus rus (PCV1) kettes típust pusú sertés s cirkovírus rus (PCV2) (Clark, 1996) (hármas típust pusú (PCV1/2a) (Gagnon és s mtsai., 2010) PCV1 - apatogén (Tischer és s mtsai., 1986; Allan és s mtsai., 1995) PCV2 virulens patogén (Meehan és s mtsai., 1996; Krakowka és s mtsai., 2000) Két t genotípus: PCV2a PCV2b (PCV2c) (Gagnon és s mtsai., 2008, 2010) mutáns PCV2a/PCV2b (Guo és s mtsai., 2011) vaddisznó házisertés

18 PCV2 genóm : nukleotida Fő szekvenciák (ORF1, ORF2, OFR3) ORF2 gén g n (Cap gén) g PCV2 kapszidn fehérje (Cap antigén) 27.8 kda struktút t protein immunog unogén (Nawagitgul és s mtsai., 2000; Cheung K., 2003; Liu és s mtsai., 2006)

19 Kapszid fehérje kDa a.s. immunoreaktív v domén

20 A PMWS első leírása egyes országokban (Chae C., 2004, Csank és mtsai., 2011)

21 Retrospektív v szerológiai eredmények (Grierson és mtsai., 2004; Staebler és mtsai., 2005)

22 Retrospektív v kórszk rszövettani eredmények (Jacobsen és mtsai., 2009)

23 A PMWS diagnózisa a sertésekben sekben akkor megalapozott, ha a következk vetkező kritériumok riumok mindegyike teljesül: - a betegségre gre jellemző klinikai tünetek t és s kórbonctani k elváltoz ltozások kialakultak, - kórszövettanilag a nyirokszövetekben a karakterisztikus elváltoz ltozások szintén n kialakultak, - a PCV2 (antigén n vagy nukleinsav) a limfoid lézil ziókból kimutatható.

24 ...CÉLKIT LKITŰZÉSEK... A kivizsgálások sok elsődleges célja c a PCV2 fertőzés prevalenciájának nak felmérése a vajdasági vaddisznó állományokban. Tovább bbá,, a természetes úton PCV2-vel fertőződött tt vaddisznók k immunrendszer károsodk rosodásának reszletes leírása sa.

25 A kitűzött tt célok c a következk vetkező feladatok által lettel végrehajtva: а) a vaddisznók PCV2 fertőzésének prevalenciája ja; b) a kórszk rszövettani elváltoz ltozások leírása a limfatikus (nyirokcsomók, k, mandulák, lép, l Peyer plakk, illeocökális lis valvula) és s nem limfatikus (tüdő,, máj, m vesék és s szív) v);

26 d) a kórszk rszövettani lézil ziók k evaluáci ciója; e) a PCV2 Cap antigén és s DNS kimutatása az elváltozott ltozott limfatikus és s nem limfatikus szervekből; f) a fertőzött tt sejtek leírása és s immunopozitív v szignál erőss sségének meghatároz rozása ; g) Azon sejtek feltárása melyekben a vírus v aktívan szaporodik.

27 ...ANYAG ÉS S MÓDSZERM DSZER... A vaddisznók k két k t magyarországgal ggal határos vadásztelepr sztelepről származtak. Részletes kórbonctani leíras után n következett k a szövet mintázás s a további kivizsgálásokhoz. sokhoz.

28 A PCV2 fertőzötts ttség g meghatáriz rizása PCR módszerrelm történt a tüdőből, t nyirokcsomóból és s lépbl pből. A genóm m 501bp ORF2 fragmentjének nek kimutatására specifikus oligonukleotid prajmerek voltak alkalmazva: forward PCV2-2A: 2A: 5 -CACCTTCGGATATACTGTCAA-3 i reverse PCV2-2B: 2B: 5 -TACATGGTTACACGGATATTGTA5 TACATGGTTACACGGATATTGTA-3

29 A kórszövettani, az immunohisztokémiai miai és s az in situ hibridizáci ciós kivizsgálásokhoz sokhoz a következk vetkezö szervminták - nyirokcsomók ( - mandulák, - lép, - payer plakk, - tüdő, - máj, - vesék, - szív. szolgálltak lltak alapul: k (szubmandibuláris, mediasztinális, mezenteriális és ingvinális szuperficiális lis);

30 Szövetfiksz vetfikszálás 10% neutrális formalin, óra Szövet proceszuálás: autómatikus szövetprocesszor Szövetbe vetbeágyazás: parafin blokk Szüvetmetsz vetmetszés: : 5 µm Szövetfest vetfestés: s: hematokszilin - eozin (HE)

31 A limfatikus szövetk vetkárosodás s mértm rtékének meghatároz rozása Kritérium limfatikus szövet Paraméter Változatlan (BL) Enyhe (I) Közepes (II) Nagyfokú (III) Limfocita depléció Depléció nélkül A T és B limfociták enyhe depléciója Közepes mértékű T és B limfocita depléció Nagymértékű T és B limfocitás depléció, a follikulusok hiánya Makrofágos infiltrácio Makrofágos infiltráció hiánya Makrofágok jelenléte kis számban Közepes számú makrofág infiltráció Nagymértékű makrofág infiltráció Infektív granulóma jelenléte Granulóma hiánya Granulóma hiánya Granulóma hiánya Granulóma gyakori jelenléte Gigantikus sejtek jelenléte Óriássejtek hiánya Óriássejtek hiánya Óriássejtek kisszámú jelenléte Óriássejtek nagyszámú jelenléte A limfatikus szövet arhitektúrájának változása A szövet arhitektúrája változatlan A szövet arhitektúrája változatlan A szövet arhitektúrája továbbra is megőrzött A szövet arhitektúra megváltozott, hianyzik a sztróma (Chiannini ini és s mtsai., 2003)

32 A szövetek immunohisztokémiai miai kivizsgálása sa (LSAB2) PCV2 Cap antigén n detekció,, disztribúci ció és mennyiség g meghatároz rozása A szövetek in situ hibridizáci ciós kivizsgálása sa (ISH CP és s ISH RFP) PCV2 DNS detekció,, disztribúci ció,, mennyiség meghatároz rozása, vírusreplikv rusreplikáció bizonyítása. (Chiannini és s mtsai., 2003) 2

33 Negatív kontróla Pozitív v kontróla A pozitív v szignál l kvantifikáci ciója IHC és s ISH ( -, +, + +, )

34 . EREDMÉNYEK ÉS S MEGBESZÉLÉS 8,75%

35 100,00%

36 81,67% 70,00%

37

38 41,66% 16,17%

39 86,67% 100,00%

40

41 0 68,33%

42

43

44

45

46

47 31,67% 60,00%

48

49 Kvalitatív v PCR Magyarország (Cságola mts, 2oo6) Szlovénia (Toplak mts, 2oo4) Szerbia (Becskei mts, 2o1o) Németország (Reiner mts, 2o1o) 2o, 5o% 25,oo% 26,67% 63,1o% 100,00% 26,67%

50 Szövettani elváltoz ltozások és s a PCV2 immunodestruktív v hatása

51

52 Ln. med., HE

53 78,33% 13,33%

54 Tonsila, v.d., HE

55 Payer plakk, v.d. HE

56 Ln.mediastinalis, HE

57 A limfatikus szövetk vetkárosodás s mértm rtékének kimutatása házisertés s : vaddisznó Szövet Szővetkárosodás mértéke BL I II III Nyirokcsomók 11,67 a 10,00 53,33 b 25,00 c Peyer plakk 20,00 a 11,67 50,00 b 18,33 c Illeocökális valvula 25,00 a 18,33 48,33 b 8,33 Mandula 18,33 a 11,67 51,67 b 18,33 c Lép 50,00 a 5,00 35,00 b 10,00 A Nyirokcsomók 65,00 a 21,67 10,00 b 3,33 c Házisertás Vaddisznó Peyer plakk 75,00 a 16,67 6,67 b 1,67 c Illeocökális valvula 78,33 a 11,67 8,33 b 1,67 Mandula 78,33 a 13,33 6,67 b 1,67 c Lép 90,00 a 6,67 1,67 b 1,67 A Legenda: a, b, c = p<0,01; A = p<0,05

58 Limfni čvorovi p<0,01 Pajerove ploče p<0, Ileocekalna valvula p<0,01 Tonzile p<0,01 Slezina Nyirok Payer Illeocök. Mandula LépL csomó plakk valvula p<0, p<0,01 Divlje svinje Vaddisznó Házi sertés Diagram 1. A limfatikus szövet ++ és s +++ erőss sségű limfocitás s depléci ciója (%)

59 Tüdő,100x, HE

60 Tüdő, HE

61 68,33%

62

63 78,33% 51,67% Máj, HE

64 46,67% 51,67% Vese, HE

65 Immunohisztokémiai miai és in situ hibridizáci ciós s kivizsgálás eredményei PCV2 Cap prot PCV2 DNS szövettani metszet

66 Ln.ingvinalis sup., IHC

67 73,33% 5,00% Ln.ingvinalis sup., IHC

68 Tonsila v.d., IHC

69 Payer plakk, v.d., IHC

70 Szövet Ekszpresszió intenzitás % IHC Σ pozitiv PCR Σ pozitiv Házi Sertés Mandulák 30,00 a 15,00 36,67 b 18,33 c 70,00 d ni Payer plakk 16,67 a 10,00 50,00 b 23,33 c 83,33 d ni Illeocökális valvula 23,33 a 13,33 46,67 b 16,67 c 76,67 d ni Lép 25,00 a 11,67 48,33 b 15,00 c 75,00 d 100,00 e Nyirokcsomók 15,00 a 11,67 51,67 b 21,67 c 85,00 d * 100,00 e Mandulák 88,33 a 10,00 1,67 b 0,00 c 11,67 d ni Vad disznó Payer plakk 86,67 a 8,33 3,33 b 1,67 c 13,33 d ni Illeocökális valvula 86,67 a 8,33 3,33 b 1,67 c 13,33 d ni Lép 91,67 a 66,67 1,67 b 0,00 c 8,33 d 26,67 e Nyirokcsomók 81,67 a 13,33 3,33 b 1,67 c 18,33 d * 26,67 e Legenda: a, b, c, d, e = p<0,01; * = ingv.sup. ny.cs.; ni = kivizsgálatlan

71 p<0, p<0, p<0, p<0, p<0, Limfni Nyirok Payer Pajerove Ileocekalna Illeocök. Mandula Lép Tonzile Slezina L čvorovi csomó ploče plakk valvula Vaddisznó Divlje svinje Házi sertés p<0,01 Diagram 2. A limfatikus szövet ++ és s +++ erőss sségű PCV2 Cap antigén ekspressziója (%)

72 Tüdő, IHC

73 Tüdő, h.s., IHC

74 75,00% 6,67% Ln.mesent., CP ISH

75 Tonzila, v.d., CP ISH

76 Tüdő, h.s., CP ISH

77 A PCV2 genóm m ekszpressziója (%) Tkivo CP ISH RFP ISH PCR Σ Pozit. - + Σ Pozit. Tonzile 26,67 a 15,00 36,67 b 21,67 c 73,33 d 66,67 e 33,33 f ni Pajerove pl. 15,00 a 10,00 50,00 b 25,00 c 85,00 d 60,00 e 40,00 f ni Házi sertés Ileocek.valv. 21,67 a 13,33 46,67 b 18,33 c 78,33 d 61,67 e 38,33 f ni Slezina 21,67 a 13,33 48,33 b 16,67 c 78,33 d 66,67 e 33,33 f 100,00 g Limfni čv. 13,33 a 16,67 51,67 *b 23,33 c 86,67 d 53,33 e 46,67 f * 100,00 g Tonzile 88,33 a 10,00 1,67 b 0,00 c 11,67 d 98,33 e 1,67 f ni Pajerove pl. 85,00 a 8,33 5,00 b 1,67 c 15,00 d 96,67 e 3,33 f ni Vaddisznó Ileocek.valv. 85,00 a 8,33 5,00 b 1,67 c 15,00 d 96,67 e 3,33 f ni Slezina 91,67 a 5,00 3,33 b 0,00 c 8,33 d 98,33 e 1,67 f 26,67 g Limfni čv. 80,00 a 13,33 5,00 b 1,67 c 20,00 d 93,33 e 6,67 f * 26,67 g Legenda: istim slovima a, b, c, d, e = p<0,01; * = ingv. sup.l.čvor; ni = nije ispitano

78 , p<0,01 p<0,01 p<0,01 p<0,01 p<0,01 Házi sertés ,67 6,67 6,67 1,67 3,33 0 Limfni Nyirok Pajerove Payer Ileocekalna Illeocök. Tonzile Mandula Slezina LépL čvorovi ploče valvula Csomó plakk valvula p<0,01 Vaddisznó Divlje svinje Diagram 3. A limfatikus szövet ++ és s +++ erőss sségű CP ISH szignálja (%)

79 kórszövettan PCR Histopatološki IHC CP ISH p<0, Vaddisznó Divlje svinje Házi sertés Domaće svinje Diagram 4. PMWS diagnózis a PCV2-vel fertőzött tt sertésekn seknél. % Küloböző diagnosztikai módszerek m komparatív v eredményei. (II és s III intenzitású kórszövettani elváltoz ltozások, ++ és +++ intenzitású ICH és s CP ISH szig.)

80 PCV2-vel fertőzött tt malacok bakteriális fertőzései PCV2 + 1 fajta baktérium 15% PCV2 + 2 fajta baktérium 46.25% PCV2 + 3 fajta baktérium 32.50% PCV2 + 4 fajta baktérium 5% PCV2 + 5 fajta baktérium 1.25%

81 ...KÖVETKEZTET VETKEZTETÉS... + A PCR analízis eredményei megerősített tették k a PCV2 fertőzést minden kivizsgált sertéstelepen, stelepen, valamint mindkét t vaddisznó állományban (100,00% h.s., 26,67%v.d., p<0.01) + A kórbonctani, k kórszk rszövettani, immunihisztokémiai miai és s in situ hibridizaciós s eredmények arra utalnak, hogy a kivizsgált házisertések sek 75,00% PMWS-ben szenved, míg m g a vaddisznókn knál l a kórkk rkép a kivizsgált egyedek 6,67%-ban lett alátámasztva masztva.

82 + Patognomikus kórbonctani k elváloz lozás s nem találhat lható a PMWS-ben szenvedő egyedeknél. + + A leggyakoribb kórszk rszövettani lelet a limfatikus szövetben jelenlevő közepes és s intenzív v mértm rtékű limfocita depléci ció. A limfocita depléci ció a főf oka az immunoszupresszív állapotnak. + Nagy mennyiségű PCV2 Cap antigén és s DNS van jelen a limfatikus szövetek sejtjeiben, elsősorban sorban a makrofágokban, dendritikus sejtekben, APC sejtekben, alveoláris makrofágokban gokban.

83 + A PCV2 Cap antigén és s DNS jelenléte bizonyított a mandulákban, lépben, l Payer plakkokban, nyirokcsomókban, kban, illeocökális lis valvulákban, tüdőben, t májban, vesékben és s szívben vben. Lebnagyobb mennyiségben viszont a limfatikus szövetekben találhat lható + A PCV2 tropizmusa bebizonyosult a limfociták, makrofágok, alveoláris epitel, bronhiális epitel,vesetubulus epitel, epecsatorna epitel sejtjei iránt, valamint a hepatociták és s enterociták k iránt is.

84 Csapatmunka :)

85

86

87

88