Morfinszármazékok részecske-specifikus jellemzése analitikai és egyensúlyi módszerekkel

Átírás

1 Morfinszármazékok részecske-specifikus jellemzése analitikai és egyensúlyi módszerekkel Doktori értekezés Kovács Zsuzsanna Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Hivatalos bírálók: Dr. Noszál Béla, D.Sc. Dr. Idei Miklós, D.Sc. Dr. Ludányi Krisztina, Ph.D Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Klebovich Imre, D.Sc. Dr. Perjési Pál, C.Sc. Dr. Idei Miklós, D.Sc. Budapest 2006.

2 TARTALMJEGYZÉK ÖSSZEFGLALÓ... 4 SUMMARY BEVEZETÉS IRDALMI ÁTTEKINTÉS Makroszkopikus protonálódási egyensúlyok A makroszkopikus protonálódási állandók meghatározási lehetőségei Potenciometria Ultraibolya-látható spektrofotometriás (UV-pH) titrálás NMR-pH titrálás Kapilláris elektroforézis és CZE-pH titrálás A CE elmélete CZE-pH titrálás Mikroszkopikus protonálódási egyensúlyok A mikroszkopikus protonálódási állandók meghatározási lehetőségei Modellvegyületek bázicitásának felhasználása (deduktív módszer) Mikroállandók meghatározása spektroszkópiás módszerekkel A vizsgált molekulák ismertetése Morfin Szerkezet, fizikai-kémiai tulajdonságok Farmakodinámia, farmakokinetika Morfin 6-glukuronid Kodein Folkodin

3 3. CÉLKITŰZÉSEK KÍSÉRLETI RÉSZ Felhasznált vegyszerek, vizsgált anyagok Vizsgálati módszerek Makroállandók meghatározása ph-potenciometriás titrálással Makro- és mikroállandók meghatározása UV-pH titrálással H NMR-pH titrálások Kapilláris elektroforézis vizsgálatok EREDMÉNYEK, KÖVETKEZTETÉSEK Morfin vázas vegyületek sav-bázis tulajdonságainak vizsgálata Morfin Morfin-6-glukuronid Folkodin és metabolitjai A vizsgált vegyületek eletroforetikus mozgékonyságának tanulmányozása ÖSSZEFGLALÁS RÖVIDÉTÉSEK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRDALMJEGYZÉK KÖZLEMÉNYEK

4 ÖSSZEFGLALÓ A protonálódási állandók ismerete elengedhetetlen a gyógyszermolekulák farmakokinetikai paramétereinek becsléséhez, illetve elválasztástechnikai módszerek kidolgozásához. Doktori munkám során a kábító fájdalomcsillapítók hatástani csoportjába tartozó természetes vegyületnek, a morfinnak, és legfontosabb aktív metabolitjának protonálódási állandóinak meghatározását végeztem el makroszkopikus és mikroszkopikus szinten. Megállapítottam, hogy morfin esetén a protonálódás a töltésmentes részecskén keresztül valósul meg elsősorban, és így bármely szöveti ph-n ezen protonáltsági izomer előfordulása dominál, megkönnyítve a morfin bejutását a központi idegrendszerbe. Elsőként vizsgáltam a morfin aktív metabolitjának, a morfin- 6-glukoronidnak protonálódási mikroegyensúlyait, mely meghatározások eredményeként megállapítható volt, hogy a metabolit major protonálódási útvonala megegyezik a morfinnál leírtakkal, ami jól magyarázható a közös szerkezettel. Meghatároztam továbbá két köhögéscsillapító hatású félszintetikus morfin származék, a kodein és a folkodin sav-bázis tulajdonságait. A kodein egy báziscentrummal rendelkezik, így a protonálódási folyamat egyértelműen jellemezhető a (makro)állandóval, az általam meghatározott protonálódási állandó jó egyezést mutatott az irodalomban talált értékekkel. Megmértem a folkodin protonálódási makroés mikroegyensúlyait leíró állandókat. A mikroállandók meghatározásához új N-metil származékokat állítottam elő. Vizsgáltam valamennyi gyógyszervegyület, és azok származékainak elektroforetikus mozgékonyságát eltérő ph-jú háttér elektrolitok alkalmazása mellett. Megállapítottam, hogy a vizsgált ph tartományban a molekulák effektív mozgékonyságának változásában a töltésváltozás mellett, a különböző protonáltsági állapotú vegyületek eltérő szolvatációs képességének is meghatározó szerep jut. Kovács Z., Hosztafi S., Noszál B. Site-specific acid-base properties of pholcodine and related compounds. Anal. Bioanal. Chem :

5 SUMMARY Knowledge of the protonation constants is essential for the prediction of pharmacokinetics parameters and the development of separation methods. I have determined the macroscopic and microscopic protonation constants of major analgetic morphine, and its most important metabolite. I have observed that for morphine the major protonation pathway includes in noncharged species, so at any physiological ph this protonation isomer is the dominant one contributing to the entrance of morphine to the central nerves system. The protonation microequilibria of morphine-6-glucuronide, the active metabolite, were characterized and major protonation pathway was proved to be identical to that of morphine The acid-base properties of two semi-synthetic morphine derivatives, codeine and pholcodine, were characterized. Codeine has only one basic site so its protonation process can be described by a macroconstant that showed good agreement with literature data. I determined protonation of macro- and microconstants of pholcodine, also utilizing newly-synthetized N-methyl derivatives. The electrophoretic behavior of these compounds was investigated by using background electrolytes with different ph. I have observed that in this ph range the change in the effective mobility of these compounds is influenced not only by their charge, but also by their different solvation properties. Kovács Z., Hosztafi S., Noszál B. Site-specific acid-base properties of pholcodine and related compounds. Anal. Bioanal. Chem :

6 1. BEVEZETÉS A gyógyszerhatás kialakulásának számos feltétele van: a hatóanyagnak fel kell szabadulnia az adott gyógyszerformából, oldódnia kell különböző testnedvekben, át kell hatolnia membránokon, igen sok esetben kötődnie kell membránfehérjékhez, ellen kell állnia enzimatikus támadásoknak, vagy éppen át kell alakulnia enzimatikus reakcióban, kötődnie kell a célmolekulához, végül ki kell ürülnie a szervezetből. A bio- és gyógyszermolekulák jelentős hányada savas és/vagy bázikus csoporttal/csoportokkal rendelkezik, és a szervezet különböző kémhatású kompartmentjeiben eltérő protonáltsági állapotban fordul elő. A fent említett folyamatok mindegyike függ a kérdéses vegyület ionizációs állapotától. A sav-bázis tulajdonságot jellemző protonálódási állandók ismeretében kiszámítható, hogy az adott kémhatású biológiai közegben a molekula milyen mértékben ionizált. Ennek ismeretében becsülhető például a felszívódás valószínűsége a gyomor-bélrendszerből, vagy a penetráció a vér-agy gáton központi idegrendszerben ható gyógyszer esetében. Ma a gyógyszerjelölt molekuláknak kb. egyharmadát selejtezik ki a kedvezőtlen farmakokinetikai tulajdonságok miatt. Ezért a gyógyszerkutatás fontos új törekvése, hogy minél korábbi fázisban ellenőrizzék azokat a fizikai-kémiai tulajdonságokat (oldhatóság, permeabilitás, pk a, lipofilitás, stabilitás) melyek meghatározzák a farmakokinetikai viselkedés LADMET paramétereit. Mivel napjaink felfedező gyógyszerkutatásában nagy molekulakönyvtárak vizsgálatát kell megoldani, előtérbe kerültek a nagy áteresztő képességű (HTS) analitikai módszerek, illetve különböző programok, melyek a molekulaszerkezetből jósolnak meg közelítő fizikai-kémiai paramétereket [1-3]. A protonálódási állandók ismerete a gyógyszervegyületek analitikájában is nélkülözhetetlen. A sav-bázis titrálásokon alapuló tartalmi meghatározásokon túl, a rokon vegyületek vizsgálata során alkalmazott elválasztástechnikai módszerek (fordított fázisú folyadékkromatográfia, kapilláris elektroforézis) kifejlesztéséhez is szükséges ez a fizikai-kémiai paraméter. 6

7 2. IRDALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 Makroszkopikus protonálódási egyensúlyok Az egyetlen protonálható, illetve deprotonálható csoporttal rendelkező vegyületek esetén a sav-bázis tulajdonságok egyértelműen jellemezhetők a protonálódási (makro)állandóval (logaritmusa: log K), illetve a disszociációs állandóval (negatív logaritmusa: pk a ). Ilyen molekulák esetén e két állandó számértékileg megegyezik. Ha a hatóanyag többcsoportos, akkor a protonálódási folyamatok a lépcsőzetes makroállandók mellett (2.1), a kumulatív állandókkal (2.2) is leírhatók. H i-1 L zi-1 H H i L zi z i [H il ] K i = z i [H L ][H i 1 ] 2.1 L z ih H i L zi z i [H il ] β i = z i [L ][H ] i = K i 2.2 j= 1 A fenti egyenletekben L z jelöli a molekula legbázikusabb, z töltésű formáját, mely n számú funkciós csoportjára tud protont felvenni. A 2.1 egyenlet általánosságban írja le az i. asszociációs lépést és az egyensúlyra vonatkozó állandót. Számos könyv, tankönyv fejezet található, mely táblázatos formában gyűjti össze a korábban publikált protonálódási makroállandókat [4-9]. 2.2 A makroszkopikus protonálódási állandók meghatározási lehetőségei Makroállandók meghatározására számos módszer alkalmas, melyek során a mért (detektált) fizikai-kémiai mennyiség ph-függő változása egyértelmű összefüggésbe hozható a vizsgált vegyület protonfelvételével, illetve protonleadásával. 7

8 2.2.1 Potenciometria A protonálódási makroállandók meghatározásának legelterjedtebb módszere a potenciometriás titrálás. A pontos kivitelezést (eszközök, kombinált üvegelektród használata, kalibráció, oldatkészítések, számítások, hibaforrások és azok kiküszöbölése) Albert és Serjeant részletesen tárgyalja [10a]. A ph-metria során, a meghatározandó anyag oldatához, folytonos keverés mellett pontosan ismert térfogatú erős savat (pl. sósavat) vagy erős bázist (pl. kálium-hidroxidot vagy nátrium-hidroxidot) adagolnak, mialatt az oldat változó ph-ját folyamatosan regisztrálják kombinált üvegelektróddal. A kombinált üvegelektród mérési tartománya ph = 2-12 között helyezkedik el, ebből az intervallumból kilépve jelentősen megnő a mérés hibája. A meghatározandó vegyületet meglehetősen nagy koncentrációban kell oldani, 0,5 mm, vagy ezt meghaladó töménységű oldatot kell készíteni. Nem lehet pontos állandót mérni, ha a meghatározandó állandó pk a értéke kisebb, mint a titrálás során alkalmazott koncentráció negatív logaritmusa, pl. 0,01 M-os oldatból nem lehet meghatározni pk a <2 értékű állandót [10a]. Ha a molekula nem oldódik elég magas koncentrációban a vizes oldatban, vízzel elegyedő szerves oldószereket (koszolvenst) alkalmaznak az oldhatóság növelésére. Ilyen esetekben több, eltérő összetételű víz/szerves oldószer elegyben határozzák meg a látszólagos protonálódási állandót (log s K; s: solvent), amiből extrapolációval kapható a vizes közegre jellemző állandó [11]. Ha az anyag oldhatósága lehetővé teszi, metanolt használnak szerves oldószerként, mert a metanol rendelkezik a vízhez leginkább hasonló szolvatációs tulajdonságokkal. A mérés pontosságának növelése, valamint az állandók meghatározásánál a fiziológiáshoz közeli körülmények (I=0,15 M) biztosítása érdekében vízben jól oldódó, inert sókat (nátrium-klorid, káliumklorid) alkalmaznak az ionerősség beállítására. A titrálásokat termosztált körülmények közt végzik (általában 25 C-on), mivel a protonálódási állandó változik a hőmérséklettel. A ph változást ábrázolva a mérőoldat fogyásának függvényében kapjuk a titrálási görbét. Amennyiben csak egy protonálható csoportot tartalmazott a vizsgált vegyület, vagy több állandó estén, ha azok elég jól elkülönülnek egymástól a ph skálán, a fenti görbéből könnyen számítható(k) a kívánt makroállandó(k). Ha azonban a molekula protonálódási állandói közel esnek egymáshoz, átlapolnak, a titrálási görbéből nem lehet a fenti módon egyszerűen kiszámolni a meghatározni kívánt konstansokat [3]. 8

9 Ilyen esetekben a különbségi titrálást részesítik előnyben. A meghatározás folyamán két titrálást végeznek: az elsőben adott mennyiségű erős savat titrálnak erős lúg mérőoldattal (1. ábra, üres háromszögekkel jelölt görbe), majd a következő titráláskor az első titrálással azonos mennyiségű erős savhoz hozzáadják a meghatározandó anyagot, és ezt az oldatot titrálják a lúg mérőoldattal (1. ábra, teli háromszögekkel jelölt görbe). A protonálódási állandókat a két görbe különbségéből lehet kiszámítani ph VNaH (ml) 1. ábra Morfin különbségi titrálásos görbéje [12] ( : üres titrálás, : erős sav a vizsgált anyag titrálása) Hasznos lehet a titrálási adatok átalakítása Bjerrum függvénnyé [13], amely során a ph függvényében ábrázolják a molekula által kötött protonok számát. A Bjerrum görbe (2. ábra) felállításához tudni kell a titrálás során hozzáadott sav, illetve lúg mennyiséget (totál hidrogén ion koncentráció), valamint hogy a vizsgálandó vegyületnek hány protonálható csoportja van. A titrálás során a ph mérésével tudják követni a szabad hidrogénion-koncentráció változását. A totál és szabad hidrogénion koncentráció különbsége adja a kötött protonok koncentrációját, melyet elosztva a minta koncentrációjával megkapják az átlagosan kötött protonok számát egy ligandumra vonatkoztatva. A Bjerrum függvényről leolvashatók azok a ph értékek, melyekhez "feles" nh átlag érték tartozik, azaz valamennyi közelítő pk a (illetve log K) érték. 9

10 2 1,5 n 1 0, ph 2. ábra Kétcsoportos molekula Bjerrum függvénye A protonálódási állandók ph-potenciometriás meghatározásnak természetesen hátrányai is vannak: a titráláshoz magas ligandum koncentráció szükséges (kb. 0,5 mm), azaz egy titrálás anyagigénye néhány mg is lehet, mely meghaladhatja a rendelkezésre álló mennyiséget. A vegyületnek a teljes, vizsgált ph tartományban oldatban kell maradnia, tehát megfelelő oldhatósággal kell rendelkeznie vízben, illetve víz/szerves oldószerelegyekben. Különbségi titrálással a ph = 2-12 tartományban lehet megbízhatóan log K értékeket meghatározni, így a szélsőséges ph tartományba eső állandók meghatározására célravezetőbb valamilyen spektroszkópiás módszert választani. A potenciometriás titrálást követően a görbe kiértékelésénél nem lehet figyelembe venni, ha a vizsgált anyag esetleges szennyezőt tartalmazott, azaz a módszer csak tiszta és nemillékony hatóanyagok meghatározására alkalmas. Ilyen vegyületek esetében megbízhatóbb állandók kaphatók NMR-pH, illetve CZE-pH titrálással Ultraibolya-látható spektrofotometriás (UV-pH) titrálás Annak ellenére, hogy az UV-pH titrálás (a nem automatizált) időigényesebb, az előző fejezetben tárgyalt ph-metriás meghatározásnál, mégis széles körben elterjedt. Főként olyan molekulák esetén használatos, melyek oldhatósága, vagy szélső tartományba eső pk a értéke nem teszi lehetővé, illetve megnehezíti a ph-potenciometria alkalmazását. A spektrofotometriás meghatározás feltétele, hogy a moláris abszorpciós koefficienstől függően, tipikusan legalább 1 μm koncetrációban oldódjon a meghatározandó anyag, valamint a molekula a sav-bázis tulajdonságot hordozó funkciós 10

11 csoporthoz minél közelebb tartalmazzon kromofór csoportot, így a spektruma ph-függő változást mutasson. A mérés során azonos ionerősségű és a vizsgált anyagra nézve azonos töménységű, de különböző ph-jú oldatokat kell készíteni, és ezek spektrumát kell regisztrálni [10b]. A spektrumok felvétele után célszerű azt a hullámhosszt kiválasztani, ahol a vizsgált anyag fényelnyelése legérzékenyebb a ph változásra. A makroállandó az alábbi összefüggés alapján nemlineáris paraméterillesztéssel kapható meg: AL AHLK[H ] A ph = AL xl AHL xhl = K[H ] ahol az A ph az adott ph-n mért abszorbancia érték, A L és A HL a protonálatlan, illetve a protonált részecske egyedi fényelnyelése, x L és x HL a két különböző részecske móltörtje. Ha A L és A HL leolvasható a szélső ph értékeken regisztrált spektrumokról, a K állandó általában kellő biztonsággal meghatározható. Napjainkban már olyan automatizált műszerek állnak rendelkezésünkre, hogy a mérések kivitelezése és az eredmények kiértékelése jóval könnyebb, valamint használatukkal rövid idő alatt pontos állandók kaphatók. A Sirius cég 2003-ban egy új, nagy áteresztő képességű műszert fejlesztett ki, mely 4 perc alatt képes meghatározni egy vegyület protonálódási állandóját [14]. A spektrális gradiens analízis (SGA) során gyenge savak és gyenge bázisok keverésével lineáris ph gradienst alakítanak ki, és a vizsgálandó mintát ebbe az áramló pufferbe injektálják, ami elhalad a diódasoros detektor előtt. A konstansok számítása több hullámhosszon detektált, a ph függvényében változó abszorbanciákból történik NMR-pH titrálás Az fejezetben tárgyalt UV-pH titrálás nem jelent jó megoldást, ha a vizsgált anyag szennyezőt tartalmaz, mivel a mérés során összabszorbanciákat mérünk. Ilyen esetben is általában jól használható az NMR-pH titrálás mindaddig, amíg a ph függvényében változó NMR spektrumon külön-külön követhetők, a vizsgált anyag jelei, valamint az esetleges szennyezők, bomlástermékek jelei. Az NMR-aktív mag kémiai eltolódása ppm-ben az alábbi egyenlettel irható le: ν ν ref 6 σ ref σ δ = 10 = σ ref σ 2.4 ν 1 σ 0 ref 11

12 ahol ν a megfigyelt mag, ν ref egy referenciaanyag magjának rezonancia frekvenciája [Hz], σ és σ ref ugyanezek árnyékolási tényezője, ν 0 a spektrométer alalpfrekvenciája [MHz]. A protonálódás hatására a funkciós csoport körül csökken az elektronsűrűség, ezért a közeli NMR magok diamágneses árnyékolása, így kémiai eltolódása is megváltozik. Mivel a molekulák protonálódása, illetve deprotonálódása pillanatszerűen megy végbe, az NMR időskáláján láthatatlan marad a folyamat, így egy közös rezonanciajel figyelhető meg a részecskék egyedi δ L, δ és δ 2 kémiai eltolódásainak móltörtekkel súlyozott átlagánál: ph L L HL HL δl δ K1[H ] δ 2 K HL H L 1K x 2 = H2 L H2L 2 1 K1[H ] K1K 2[H ] [H ] δ = δ x δ x δ 2.5 Ha a molekula n számú protonálható csoportot tartalmaz, akkor a 2.5 egyenlet bővített formája írható fel: 1 δ 2.6 n n i ph = δl xl δhl xhl... δh L xh L = δh L xh L = δh L βh L[H ] n n i i i i i= 0 αh i= 0 ahol 2 n H = 1 β1[h ] β2[h ]... βn[h ] α 2.7 Ha a protonálódási folyamatok átlapolnak, a követett magokra jellemző NMRpH titrálási görbéket egyszerre érdemes kiértékelni többváltozós nemlineáris paraméterillesztéssel. Egyenként illesztve ugyanis, mivel a protonálódás helyétől különböző távolságban lévő magok eltérő érzékenységgel érzik az egyik vagy másik csoport protonáltsági fokát, csak kevésbé pontos állandók számíthatók. A titrálás során, hasonlóan az UV-pH titráláshoz, azonos ionerősségű és ligandum koncentrációjú, de eltérő ph-jú oldatok NMR spektrumát regisztrálják. A ph beállítása és pontos ismerete kulcsfontosságú kérdés a mérés folyamán. A különböző ph-jú minták elkészíthetők savas és bázikus törzsoldatok elegyítésével kombinált üvegelektród mellett. Ilyenkor a ph pontosan leolvasható, de nagyobb térfogatokra van szükség, így a titrálás anyagigénye megnő. Kevésbé munka- és anyagigényes Hägele és mtsai. által kifejlesztett kapcsolt technika, ahol egy automata potenciometrás titrátort átfolyó cellás NMR próbafejjel kötöttek össze, a titráló oldat adagolását és a spektrumok felvételét is automatizálva [15]. Az anyagtakarékos "egycsöves" technika során a titráló oldat kis térfogatú részleteit adagolják az NMR csőbe és a ph-t HL H 2 L 2 12

13 mikroelektróddal mérik kevertetés nélkül, meglehetősen pontatlanul. Az elektróddal történő ph mérés pontatlanságának kiküszöbölésére az egycsöves titrálás alatt célszerű a ph-t in situ indikátormolekulával meghatározni. A ph az indikátor mért kémiai eltolódásából a 2.8 egyenlet alapján számítható: mért Ind δ δ ph = log Kind log 2.8 δ δ Ind HInd mért Ind ha a δ Ind és δ HInd indikátormolekula határeltolódások, illetve a log K ind értéke független kísérletekből pontosan ismert. Szakács és mtsai. 5 indikátorból álló sorozatot állított össze a ph = 0-12 tartomány lefedésére [16]. A titrálás során a pontos ph mérésén kívül nélkülözhetetlen egy olyan referencia anyag (δ=0 ppm), melynek protonáltsági állapota, ennél fogva kémiai eltolódása sem változik a vizsgált ph tartományban. A fenti kitételt figyelembe véve a legmegfelelőbb referenciaanyagnak a 3-trimetil-1-propánszulfonsav (DSS) bizonyult Kapilláris elektroforézis és CZE-pH titrálás Az elektroforézis során az ionos részecskék a töltésük és méretük (tömegük) függvényében különböző sebességgel eltérő irányba vándorolnak az elektromos tér hatására. A jelenséget, mint elválasztástechnikát 1937-ben Tiselius mutatta be. A módszer igen gyors fejlődése a 80-as évek elején kezdődött, mikor Jorgenson és Lukács elsőként mutatta be a kapilláris zóna elektroforézis alkalmazásának gyakorlati lehetőségeit [17]. A kapilláris elektroforézisnél (CE) az elektroforézis egy vékony, általában μm belső átmérőjű, pufferoldattal (háttér elektrolit) töltött kapillárisban történik. A kapilláris nagy elektromos ellenállásánál fogva rendkívül nagy térerő ( V/cm) alkalmazását teszi lehetővé kismértékű hőfejlődés mellett, továbbá a fejlődött Joule-hő a nagy felület/térfogat aránya miatt jól elvezethető. A nagy feszültség (30 kv) alkalmazása megfelelő felbontás mellett rövid analízis időt biztosít. A kényszeráramlásos folyadékkromatográfiát jellemző lamináris profilú áramlással szemben, az elektroforézis során a folyadék mozgása a kapillárisban az elektroozmotikus áramlásnak (ld. később) köszönhetően dugószerű, mely nagy elméleti tányérszámot (hatékonyságot) garantál az analízis során. A CE mintaigénye rendkívül alacsony (néhány nl) és a módszer egyszerűségéből adódóan könnyen automatizálható óta több gyártó cég van a piacon, és évről évre nő a módszerrel kapcsolatos 13

14 publikációk, könyvek [18-20] és konferenciák száma. A módszer igen nagy előnye, hogy a lehetséges alkalmazások köre rendkívül széles. Míg kezdetben csak biológiai makromolekulák vizsgálatára használták, ma már használják szervetlen ionok, kis szerves molekulák, vitaminok, királis vegyületek, fehérjék, szénhidrátok, oligo- és polinukleotidok, egész sejtek, vírusok elválasztására. A CE sokrétűsége abban rejlik, hogy többféle elválasztási mód (CZE, MEKC, CGE, CIEF, CITP) egyazon készülékben megvalósítható A CE elmélete A módszer alapja, hogy elektromos térben a minta komponensei különböző sebességgel haladnak. Egy ion sebessége az alábbiak szerint adható meg: v = μ E 2.9 ahol v a vizsgált ion sebessége, μ a molekula elektroforetikus mobilitása az adott közegben az alkalmazott térerő (E) mellett. Egy részecske mozgékonyságát a részecskére ható elektromos erő (F e ) és a közeg által kifejtett súrlódási erő (F s ) határozza meg, melyek a következő két egyenlettel írhatók le: F e = q E 2.10 F s = -6 π η r v 2.11 ahol q az ion töltése, η az oldat viszkozitása, r az ion sugara. Az elválasztás során e két erő egymással egyenlő, irányuk ellentétes, így felírható: q E = 6 π η r v 2.12 A 2.12 egyenletből az ion sebességét kifejezve, s azt behelyettesítve a 2.10 egyenletbe kapjuk a 2.13 összefüggést, mely a mobilitást fizikai állandókkal írja le. q μ = πηr Az utóbbi kifejezésből könnyedén kiolvasható, hogy a kis méretű, többszörös töltésű részecskék rendelkeznek a legnagyobb mobilitással, míg a nagyobb méretű, de kis töltésű ionok mozgékonysága csekély (3. ábra) Kezeletlen kapillárisban az elektroforézis kísérő jelensége a háttér elektrolit transzportja az elválasztás során, melyet elektroozmotikus áramlásnak (EF) nevezünk. A jelenség oka, hogy a szilika kapillárisfal belső felszínén lévő ionizált szilanol csoportok mentén elektromos kettősréteg alakul ki. A fal negatív töltését pozitív töltésű, 14

15 hidratált kationok veszik körül, s az elektromos tér hatására ezek a katód felé vándorolnak, magukkal sodorva a környező minta és puffer komponenseit, valamint oldószer molekuláit. Az EF mértéke a következő egyenlettel fejezhető ki: v εζ = E μefe 2.14 η' EF = ahol ε a közeg dielektromos állandója, η' az elektromos kettősréteg viszkozitása, mely közelítőleg azonos az elválasztás során használt puffer viszkozitásával, ζ a kapillárisfal zéta potenciálja. Az EF mértéke a megfelelő elválasztás érdekében jól szabályozható. Az EF másik fontos előnye a dugószerű áramlás mellett, hogy a pozitív és a negatív töltéssel bíró részecskék egyszerre analizálhatók. Normál polaritás (kapilláris fala nem módosított) alkalmazása során az injektálás az anód oldalán történik és a minta komponensei a detektor előtt elhaladva, a katód irányába vándorolnak. A katód felé nemcsak a kationok vándorolnak, hanem anionok is, mivel az EF akár egy nagyságrenddel is nagyobb lehet az anionok effektív mobilitásánál. A töltés nélküli részecskék az elektroozmotikus áramlással vándorolnak, egymástól nem válaszhatók el (3. ábra). 3. ábra Különböző töltésű és méretű részecskék vándorlása az elektroozmootikus áramlással CZE-pH titrálás A kapilláris elektroforézis mindamellett, hogy egy nagyhatékonyságú elválasztástechnikai módszer, alkalmas különböző fizikai-kémiai paraméterek meghatározására, mint pl. pk a, izoelektomos pont, diffúziós koefficiens, log P stb. [20]. Mivel doktori munkám során ezen paraméterek közül a vizsgált vegyületeknek csak a 15

16 pk a értékeit vizsgáltam, a továbbiakban csak az ezzel kapcsolatos irodalmakat tekintem át. Ha egy molekula protonálódik (illetve deprotonálódik) megváltozik az átlagos töltése, aminek egyenes következménye, hogy elektroforetikus mobilitása is megváltozik. Adott ph-n egy vegyület mozgékonysága az eltérő töltéssel bíró részecskék móltörtekkel súlyozott egyedi mobilitásaiból tevődik össze. Az alábbi egyenlet a fenti összefüggést adja meg egy kétértékű bázis esetére: μ ph μb μ K BH 1[ H ] μ 2 K BH x 2 = BH2 BH2 1 K1[H ] K1K 2[H K 2[H ] = μ BxB μ x μ 2.15 BH BH 2 ] Azonos ionerősségű, de változó ph-jú háttér elektrolitokban elvégezve az elektroforézist, majd a 2.16 egyenlet alapján számított effektív mobilitásokat ábrázolva a ph függvényében jutunk a CZE-pH titrálási görbéhez. A görbe pontjaira illesztve a 2.15 egyenletet a protonálódási állandók kiszámíthatók. μ ph ll 1 1 = U tm t EF 2.16 ahol l az effektív úthossz (injektálástól a detektor ablakig), L a kapilláris teljes hossza, U az elválasztás során alkalmazott feszültség, t m a minta, t EF az EF marker vándorlási ideje as években több kutatócsoport is alkalmazta a papírelektroforézist pk a meghatározására [21-22]. A módszer ugyan kis anyagmennyiséget és alacsony minta koncentrációt igényelt, valamint a szennyezések nem zavarták a meghatározást nem terjedt el széles körben, mivel az analízis idő hosszú volt, a rendszer termosztálást sem lehetett jól megoldani, így az eredmények nem voltak reprodukálhatók, valamint a méréseket nem lehetett automatizálni. A kapilláris zóna elektroforézis technika alkalmazását protonálódási állandó meghatározására 1991-ben Beckers és mtsai. mutatták be [23]. Felállították a számításhoz szükséges alapegyenleteket, valamint vizsgálták az effektív mobilitások meghatározásának reprodukálhatóságát számos gyógyszervegyület esetében, meghatározták néhány egyértékű sav protonálódási állandóját. Tanulmányozták melyik a legmegfelelőbb neutrális marker anyag az EF precíz indikálására, mivel ha az EF pontatlan, a számított, effektív mobilitás értékek, és így a pk a érték is azok lesznek. Jianyi Cai és kutatócsoportja két gyenge bázis és egy amfoter vegyület disszociációs állandóit határozta meg [24]. A pk a meghatározását 16 2

17 leginkább befolyásoló tényezőket Gluck és mtsai. vizsgálták a legmélyrehatóbban [25-28]. Kulcskérdés a titrálás során a megfelelő puffer és annak koncentrácójának megválasztása, ugyanis az oldat viszkozitása, a hidratált ion mérete, és ebből kifolyólag a töltéssel bíró részecske mobilitása is függ a pufferoldat összetételétől. Így a titrálási görbén kiugró pontokat okozhat, ha a vegyület effektív mozgékonyságának változása a ph függvényében nem csak a töltés módosulásának köszönhető. A probléma kiküszöbölésére a mintával együtt injektáltak olyan ionos vegyületeket, melyek töltése a vizsgált ph tartományban állandó, így az effektív mobilitásuknak is állandónak kell lennie, amennyiben változik, azt korrekcióba lehet venni a vizsgált vegyület esetében [25, 27]. Bevezették a kapillárisban történő in situ ph mérést egy ismert pk a -jú vegyület együtt injektálásával, mellyel a ph detektálás a kapillárison belül valósul meg az analízissel egy időben, kiküszöbölve az esetleg C 2 adszorpció és elektrolízis okozta ph változásokat. Összehasonlították a lineáris, illetve nem lineáris regresszióval történő kiértékelést [27], valamint tanulmányozták az átfedő protonálódási állandók meghatározásának nehézségeit [28]. A fenti szerzők munkásságát követően egyre több vegyület protonálódási állandójának meghatározását végezték el CZE-pH titrálás alkalmazásával. Eltérő oldhatósággal rendelkező vegyületek állandóit vízben [29-34], víz/szerves oldószerelegyekben [35-38], illetve nemvizes közegben [39-41] határozták meg. A módszer fejlődését és a legfontosabb meghatározásokat Poole foglalta össze 2004-ben [42]. Ishihama és csoportja levezette az n számú protonálható csoporttal bíró vegyületek esetén illesztendő függvényt, valamint az angiotenzin és számos analógjának sav-bázis tulajdonságait határozta meg CZE-val [43]. Ha a vegyületnek nincs UV elnyelése még az alacsonyabb hullámhossz tartományban sem, megoldásként választható az indirekt UV detektálás, amikor a háttér elektrolit valamelyik komponense UV aktív [44]. CZE-pH titrálás egyre szélesebb körben történő elterjedésével megjelentek korlátjai is. Legfőképpen, hogy alacsony pk a értékek meghatározásához alacsony ph tartományban kell dolgozni, ami viszont az EF csökkenését eredményezi. Így az analízis idő jelentősen megnyúlhat, sőt előfordulhat, hogy bizonyos negatív töltéssel rendelkező részecskék nem jutnak el a detektorhoz, mivel a csökkenő EF nem fogja a katód irányába sodorni őket. A probléma kiküszöbölésére több megoldás is született. A savas karakterű, dialkilfoszforsavak meghatározása [44] során polibrént (kationos 17

18 tenzidet) tettek CMC alatti koncentrációban az alacsony ph-jú pufferoldatba. A tenzid a negatív töltésű falhoz adszorbeálódva megváltoztatta annak töltését, és ezáltal megfordult az EF iránya (katód anód). Ha fordított polaritást kapcsolunk az elektródokra (injektálás a katód, detektálás az anód oldalán) az eddig ellentétes irányba mozgó anionok is detektálhatóvá válnak [28,44]. A módszer azonban nem bizonyult kellően robosztusnak ahhoz, hogy a legkülönbözőbb savas illetve bázikus karakterű anyagok pk a mérését automatizálni lehessen. Megoldást az alacsony ph-jú analízisek automatizálására a nyomással segített (PACE), illetve vákuummal segített többszörös (VAMCE) kapilláris elektroforézis rendszerek kifejlesztése jelentett. Elsőként Janowsky és Friebe alkalmazott kis külső nyomást (50 mbar) alacsony pk a -jú 99m Tc radiofarmakonok méréseihez [45]. Jia és mtsai. tanulmányozták a külső nyomás hatását a mobilitás, illetve a pk a értékek meghatározására, valamint közepes áteresztő képességű, validált protonálódási állandó meghatározási módszert dolgoztak ki [46]. Miller nyomással segített kapilláris elektroforetikus módszert használt fel, hogy szemiempirikus összefüggést állítson fel gyógyszermolekulák effektív mobilitása, töltése és molekulatömege között [47]. Kísérleteik során megállapították, hogy különböző ionos karakterrel rendelkező részecskék mobilitása és molekulatömege között eltérő összefüggés írható fel. Gyorsan bomló vegyületek meghatározására kiváltképpen alkalmas módszer a "short-end" injektálás [48-49], melynek során a mintát a kapilláris kimeneti végén jutatják be, ezzel jelentősen lerövidítve az úthosszt a detektorig, valamint az analízis időt. A CZE-pH titrálást igazán nagyhatékonyságúvá a cepr 9600 TM többszörös kapilláris rendszer (CombiSep) kifejlesztése tette, amely 8 különböző anyag, 12 különböző ph-n egyszerre történő analízisét teszi lehetővé [50-51]. A kapilláris elektroforézissel történő pk a meghatározás előnyei. A legfontosabb előnye, hogy nagyhatékonyságú elválasztástechnika révén a meghatározás nem igényel tiszta mintát. Nem szükséges tudni a pontos mintakoncentrációt az állandó kiszámításához, mivel csak a ph és mobilitás értékek használandók fel a kiértékeléshez. Kevés a mintaigénye, pl. a minimális mintakoncentráció a benzoesav esetében 2 μm [25]. Vízben kismértékben oldódó vegyületek is könnyedén meghatározhatók víz/szerves oldószerelegyekben, illetve nemvizes közegben [35-41]. CZE-pH és NMRpH titrálást összehasonlítva az eddigi előnyök mindkét módszernél fennállnak, de 18

19 közülük nagy áteresztő képességű technika csak a kapilláris elektroforézis módszerből fejleszthető ki. 2.3 Mikroszkopikus protonálódási egyensúlyok Az eddigi fejezetekben tárgyalt állandók többcsoportos molekulák esetében, kiváltképpen mikor az állandók értékei közel esnek egymáshoz, nem adnak teljes képet a protonálódás folyamatáról. A makroállandók a molekula egészét jellemzik, az egyedi funkciós csoportok sav-bázis karakteréről nem adnak információt. Ugyanakkor a makroállandók ismerete nélkülözhetetlen a különböző töltéssel bíró részecskék phfüggő koncentrációjának, a vegyületek izoelektomos pontjának, valamint különböző ph-n a molekulák töltésének kiszámításában. a., - k N H N H CH 3 k N - H k z H N CH 3 H H N H CH 3 k N k H N CH 3 b., M - K K 1 2 HM H 2 M 4. ábra a, A morfin mikroszkopikus protonálódási egyensúlyi folyamatai b, A morfin makroszkopikus protonálódási egyensúlyi folyamatai Többcsoportos molekulák egyes funkciós csoportjainak sav-bázis tulajdonságai csoportállandókkal, mikroállandókkal vagy szubmikroállandókkal jellemezhetők [52]. Az egyensúlyi állandókban hordozott szerkezeti információ a fenti sorrendben egyre részletesebb. A csoportállandók az egyes funkciós csoportok bázicitását tükrözik, de a molekula többi részének protonáltsági állapotát figyelmen kívül hagyják és csak speciális esetekben használhatók [53, 54]. A mikroállandó, melyet elsőként Bjerrum 19

20 vezetett be [55], az egyes csoportok bázicitását jellemzi a molekula összes többi csoportjának bizonyos, meghatározott protonáltsági állapotában. A szubmikroállandókban a fentieken kívül még a konformációs állapot is benne foglaltatik [56-60]. A 4.a és 4.b ábra a morfin protonálódási makro- és mikroegyensúlyait mutatja be. Az ábrán látható a mikroszkopikus és a makroszkopikus folyamatokat leíró 4 mikroállandó ( k N N, k, k, k N ), illetve 2 lépcsőzetes makroállandó (K 1, K 2 ). A mikroállandók felső indexe az adott folyamatban protonálódó funkciós csoportot jelöli, az esetleges alsó indexe a már előzetesen protonált csoportot. A makro- és mikroállandók közötti kapcsolat kétcsoportos molekula esetén a következő összefüggésekkel írható le [55]. N 1 K1 = k k β = 2.17 N N 2 K1K 2 = k k k k N β = = K = 2.19 k k N N Egy csoport protonálódása nagy valószínűséggel lecsökkenti a másik csoport bázicitását. Ez a bázicitás-módosító hatás a kölcsönhatási tényező számértékével jellemezhető. Pl. a 4. ábrán bemutatott esetben: pe N N N = log k log k N = log k log k ábráról leolvasható, hogy a HM makrorészecske kétféle protonáltsági izomer (mikrorészecske) formájában fordulhat elő, aszerint, hogy elsőként melyik funkciós csoport protonálódik. A protonáltsági izomerek mindig együtt fordulnak elő az oldatban, de mivel a protonálódási folyamatok pillanatszerűen gyorsak, így a részecskék egymásba történő átalakulása az elválasztástechnikák számára láthatatlan. Meghatározásukat az is nehezíti, hogy koncentráció arányuk a ph-tól független. A k z tautomerizációs mikroállandó meghatározására az irodalomban UV spektrofotometriát használnak. Minél több sav-bázis karakterű csoporttal rendelkezik a gyógyszervegyület, a protonálódását leíró mikroegyensúlyi sémája annál bonyolultabb. Pl. egy háromcsoportos molekula protonálódási sémája már 8 mikrorészecskét és 12 20

21 mikroállandót tartalmaz, míg egy négycsoportos molekula esetén 16 részecske és 32 mikroállandó építi fel a mikroegyensúlyi sémát. Mivel a biomolekulák specifikus kölcsönhatásai a megfelelő finomszerkezetű (protonáltsági állapotú és konformációjú) mikroformák révén valósulnak meg és a specifikus biokémiai reakcióban nem mindig a domináns mikrorészecske a reaktív, szükséges valamennyi mikrorészecske koncentrációjának kiszámítása, ami valamennyi mikroállandó ismeretét igényli [61]. 2.4 A mikroszkopikus protonálódási állandók meghatározási lehetőségei A 2.2-es fejezetben ismertetett makroállandók meghatározásán túl szükség van mikroállandó(k) ismeretére is, hogy a makro- és mikroállandók közötti összefüggéseket felhasználva valamennyi mikroállandó számítható legyen. Így pl. a 4. ábrán bemutatott morfin mikrospeciációs séma teljes leírásához szükség van a két makroállandóra, és egy független mérésből meghatározott mikroállandóra. Amennyiben a mikroállandó meghatározása nehézségekbe ütközik, rokon szerkezetű vegyületek (pl. kétcsoportos molekula egycsoportos származéka) bázicitás adatait használják fel a protonálódási mikroegyensúlyok leírásához (deduktív módszer) Modellvegyületek bázicitásának felhasználása (deduktív módszer) A módszer során a meghatározandó molekulához szerkezetileg közel azonos, de kevesebb számú protonálható csoporttal rendelkező vegyület protonálódási makroállandó(i)t építjük be a mikrosepciációs sémába, adott mikroállandó(k) helyére. Az első ilyen jellegű meghatározást Ebert végezte [62], aki a glicin metilészterének aminocsoportjára mért makroállandóval jellemezte a glicin minor protonálsági izomerjének (H 2 N-CH 2 -CH) amino-bázicitását. A meghatározás során feltételezte, hogy az észter- és a karboxilcsoport hatása az aminocsoport bázicitására azonos. Az aszparagin és az aszpartát rota-mikrospeciációjának felderítése során karboxilcsoport helyettesítésére karboxamidot használtak [59]. Ugyancsak karboxilcsoport észteresítésével vizsgálták különböző vinpocetin származékok protonálódási mikroegyensúlyait [63]. Pandit a piperazinnak és egy biszubsztituált származékának makroállandóiból a szimmetriaviszonyokat kihasználva, kiszámította a vegyületek 21

22 mikroállandóit, melyeket egy monoszubsztituált származék mikroállandóinak kiszámításához használt fel [64]. A deduktív meghatározások másik módja, mikor egy kisebb modellmolekula két csoportjának meghatározott kölcsönhatási tényezőjét egy nagyobb molekula kölcsönhatási tényezőjeként használják fel a mikroállandók kiszámításához [65,66]. Az arginin mikroegyensúlyi folyamatait a fenti két módszer ötvözésével sikerült leírni [67]. A széles körben elterjedő spektrofotometriás meghatározások a deduktív módszereket egyre inkább háttérbe szorították, de bizonyos esetekben még ma is ez a legprecízebb meghatározási lehetősége a mikroállandóknak: (i) amikor a bázicitás értékek nagymértékben különböznek, a minor mikrorészecske hozzájárulása bármely analitikai jelhez csekély, így a mikroállandó meghatározása spektroszkópiásan nagy hibával terhelt, (ii) ha a protonálódási útvonalak egyike sem mérhető szelektíven spektroszkópiai módszerekkel Mikroállandók meghatározása spektroszkópiás módszerekkel Kombinált ph-spekrtofotometriát lehet alkalmazni mikroállandók meghatározására olyan esetekben, ahol a kémiai szerkezetből adódóan a spektrumváltozás szeletíven csak az egyik funkciós csoport protonálódásához rendelhető. Így lehet a példaként bemutatott morfin mikroállandóit meghatározni [68-70], illetve hasonlóképpen lehet megmérni, illetve kiszámítani széles hatásspektrumú fluorokinolonok mikroegyensúlyi állandóit [71]. A meghatározások során, a vegyületek makroállandóit előzetesen ph-metriával megmérték, majd spektrofotometriásan meghatároztak egy mikroállandót. A mikroállandó a mérési adatpontokból az alábbi összefüggések szerint számítható: f (ph) AL - ApH = 2.21 A A L H2L 2 2 ( ph ) (1 K1[H ] K1K 2[H ] ) K1K 2[H ] f k = H ahol f (ph) a vizsgált csoport protonáltsági móltörtje, A L és 2.22 A H 2 L a teljesen protonálatlan, illetve protonált forma abszorbancia értékei, A ph adott ph-jú oldat abszorbancája, K 1 és 22

23 K 2 a ph-metriás titrálás eredményéből származatott makroállandók, k a titrálás során meghatározható mikroállandó. A két makroállandó és egy mikroállandó ismeretében, felhasználva a makro- és mikroállandók közötti összefüggéseket ( ) a maradék három mikroállandó kiszámítható. Az eddigiekben leírt módszer nem alkalmas olyan vegyületek mikroállandóinak meghatározására, ahol mindkét csoport protonálódása jelentősen befolyásolja a spektrumot. Ilyen esetekben a k z tautomerizációs állandó meghatározása nyújthat megoldást [70, 72-75], amennyiben más pontosabb módszer (deduktív módszer) nem áll rendelkezésünkre. A módszer során a vizsgált vegyületet különböző arányú puffer (phja a vizsgált vegyület izoelektromos pontja) és szerves oldószer elegyekben oldják, majd regisztrálják az így kapott oldatok UV spektrumát. A szerves oldószerben felvett spektrumot a semleges, töltésmentes részecske, míg a vizes oldatban regisztrálhatót az ikerionos forma spektrumaként azonosítják. A spektroszkópiás adatokból az alábbiak szerint lehet kiszámítani k z értékeket a különböző arányú puffer/szerves oldószerelegyek esetében: k z = A A % HL A A ± 00 HL % ahol, k z a tautomerizációs állandó az adott oldószerelegyben, A % az adott %-os összetételű oldószerelegyben mért abszorbancia, A 00 a tiszta szerves oldószerben mért HL abszorbancia, A ± a vizes pufferoldatban mért abszorbancia. HL A 2.23 egyenlet érvényessége csak következő feltételezések mellett teljesül: (i) ha a H 2 L és a L - mikroforma spektrális hozzájárulása elhanyagolható, átlapoló makroállandók esetében ez a feltétel nem valósul meg, (ii) ha a töltésmentes, illetve az ikerionos részecske előfordulása a tiszta szerves oldószerben, illetve a pufferoldatban kizárólagos, (iii) a protonáltsági izomerek moláris abszorpciós koefficense a vizsgált hullámhosszon nagymértékben különbözik. A felsorolt feltételek az esetek többségében nem teljesülnek, ezt igyekeznek kompenzálni egyszerre több hullámhosszon történő spektroszkópiás méréssel (WApH) [74-75]

24 Néhány funkciós csoport sav-bázis tulajdonságának jellemzésére a ph-függő infravörös vagy Raman spektroszkópia is felhasználható [52], de az 1 H-NMR alkalmazhatósága sokkal gyakoribb, mivel minden szerves vegyület tartalmaz 1 H-t. Ha a vizsgált vegyület két protonálható csoportja 4-5 kovalens kötés távolságra helyezkedik el, akkor a csoportok szomszédságában elhelyezkedő szén kötésű protonok jelének kémiai eltolódását a ph függvényében követve az egyes csoportok protonálódási folyamatai szelektíven nyomon kísérhetők. A feltevés kiváltképpen igaz a polipeptidek és proteinek vizsgálatánál. Az egyes csoportokra jellemző protonáltsági móltörtek a kémiai eltolódásokat felhasználva, az UV-pH titrálás során leírt egyenlettel (2.21) analóg kiszámíthatók [76]. A hisztidin, hisztamin és néhány rokon vegyületének mikroegyensúlyi folyamatait nem lehetett kombinált ph-metria - NMR módszerrel felderíteni. A minor protonáltsági izomer (az imidazol gyűrűn protonált) koncentrációja olyan csekély, hogy nem nyújt elegendő analitikai jelet a mikroállandók meghatározására, ugyanakkor az ilyen esetekben használt deduktív módszer sem jelentett megoldást. A mikroállandókat indirekt módon, az imidazol gyűrű 2-es szénatomján lévő hidrogén deutériumra (D 2 oldatban) történő cseréjének kinetikai állandójából számították [77]. lyan esetekben mikor a protonálható csoportok 4 kovalens kötésnél közelebb vannak egymáshoz, a közelükben lévő NMR magok mindegyike érzi valamennyi báziscentrum protonálódását. Ilyen esetekben a Sudmeier-Reilley megközelítés eredményezi a legmegbízhatóbb protonálódási mikroállandókat [78], miszerint az egyes csoportok protonálódása során fellépő kémiai eltolódás változások összeadódnak az alábbi összefüggés szerint (pl. egy kétcsoportos vegyület esetén): Δδ (ph) = f C f C 2.24 A A B B ahol f A és f B az A és B csoport protonáltsági móltörtje, C A és C B az A és B csoport teljes protonálódása során ppm-ben mért kémiai eltolódás változás. A C koefficiensek összegzéseként megkapjuk a kétcsoportos molekula maximális kémiai eltolódás változását a megfigyelt spin esetében (f A =f B =1): max Δδ = C C 2.25 A B A 2.24 egyenletben szereplő protonáltsági móltörteket mikroállandókkal kifejezve a 2.26 egyenlethez jutunk: 24

25 Δδ ph A A B A B A 2 k [H ] k k [H ] k [H ] k k [H ] = C A B A 2 A C A B A 2 B ( k k )[H ] k k [H ] 1 ( k k )[H ] k k [H ] A 2.24 egyenletben f és C korrelált paraméterek, így egyidejű számításuk nem megoldható a mért NMR-pH adatsorokból [79]. Tehát vagy a protonáltsági móltörtek, és belőlük a mikroállandók határozhatók meg, ha az egyenletbe szerkezetileg rokon, de kevesebb protonálható csoportot tartalmazó vegyületek C értékeit importáljuk [78], illetve ha ismerjük más független mérésből (pl. UV-pH titrálásból) a ph-függő protonáltsági móltörtet, a C együtthatók lineáris regresszióval kiszámíthatók az NMR titrálási görbékből [80]. Bio- és gyógyszermolekulák NMR-val történő mikroszkopikus sav-bázis paramétereinek meghatározását egy 2004-ben írt összefoglaló közlemény tartalmazza [79]. B A B A 2 B A 2.5 A vizsgált molekulák ismertetése Morfin Szerkezet, fizikai-kémiai tulajdonságok. A már ősidők óta analgetikumként alkalmazott ópiumot a mák növény, Papaver somniferum tejnedvéből állítják elő, melynek számos alkaloidja közül a morfin (5. ábra) a legfontosabb. A morfint annak ellenére, hogy számos kábító fájdalomcsillapító látott napvilágot az utóbbi évtizedek intenzív kutatásának eredményeként, napjainkban is széles körben használják, elsősorban krónikus fájdalmak csillapítására. H * * * 14 H * * 5.ábra A morfin szerkezete és számozása N CH 3 17 A morfint, mint elsőként izolált alkaloidot, Sertürnernek sikerült kivonnia az ópiumból 1806-ban, de szerkezetét csak jóval később, 1923-ban írták le Robinson és 25

26 mtsai. Gates és Tschudi a morfin totálszintézisét 1952-ben mutatta be, de mivel ipari előállítása nem gazdaságos, ezért még ma is ópiumból, illetve Kabay János eljárása után száraz mákgubóból illetve mákszalmából történő kivonással állítják elő. A morfin 5 kondenzált gyűrűből felépülő, meglehetősen rigid szerkezetű morfinánnvázas alkaloid. A molekula 5 királis szénatomot tartalmaz (* jelölve), csak a természetben található balra forgató sztereoizomer hatásos. A morfin vízben és szerves oldószerekben való oldhatóságát, valamint az oldhatóság ph-függését Roy és Flynn vizsgálta [81-82]. A ph-függő vizsgálatok ph = 5,67-8,61 tartományban történtek, az oldhatóság több mint 3 nagyságrenddel csökkent a gyengén lúgos tartományban, ami jól magyarázható a tercier N atom protonáltsági állapotának csökkenésével. Ugyanakkor a szerzők vizsgálataik során helytelenül, csak egy protonálható csoporttal rendelkező vegyületként kezelték a morfint, és nem vizsgálták az oldhatóságot ph = 9-et meghaladó közegben. A morfin legbázikusabb formája két protonálható csoporttal rendelkezik (4. ábra), egy fenolát- és egy tercier aminocsoporttal. A morfin sav-bázis tulajdonságait számos kutatócsoport vizsgálta makro- és mikroszkopikus szinten egyaránt [68,69,70, 83-87]. Az 1. táblázat tartalmazza az irodalomban található morfin protonálódási makroállandókat, melyeket ph-potenciometrásan határoztak meg a táblázatban feltüntetett körülmények között. 1. táblázat Irodalmi protonálódási makroállandók a morfinra vonatkozóan pk 1 pk 2 hőmérséklet ( C) ionerősség ref. 8,29 9, , ,02 9, ,93 9, ,05 9, , ,16 9, , ,18 9, , ,18 9, , ,37 9, ,

27 A két makroállandó közelsége miatt, helytelenül csak egy makroállandót megadó közlemények értékei a táblázatban nem szerepelnek. A potenciometriás méréseket spekrofotometriás meghatározásokkal kiegészítve a protonálódási folyamatokat mikroszkopikus szinten is vizsgálták [68-70]. Az így meghatározott állandókat 2. táblázat foglalja össze. Schill és munkacsoportja által mért spektrofotometriás mérési adatpontokat [68] Niebergall és mtsai. lineáris és nemlineáris paraméterillesztéssel ismételten feldolgozták [69], az így kapott eredményeik meglehetősen jó egyezést mutattak az először kiszámolt állandókkal. Az egyes meghatározások végeredményeit összehasonlítva feltűnik, hogy a protonálódási mikroegyensúlyokat jellemező mikroállandók értékei ellentmodásosak. Nevezetesen, az egyes meghatározások során hol a töltésmentes (transzport forma) mikrorészecskén [68, 85 (37 C)], hol pedig az ikerionos (receptoriális forma) mikrorészecskén [70, 85 (25 C)] átvezető protonálódási útvonal a domináns. Ugyanakkor a kölcsönhatási tényező közel azonosnak adódott a különböző körülmények közt végrehajtott meghatározások folyamán (0,5 0,59, 0,58, 0,68). A különbségek feltételezhetően az eltérő vizsgálati körülményekből adódnak (ionerősség, hőmérséklet). 2. táblázat Irodalmi protonálódási mikroállandók a morfinra vonatkozóan (a mikroállandók jelölését ld. a 3. ábrán) k N k k N N k pk 1 pk 2 hőmérséklet ( C) ionerősség ref. 8,95 9,37 8,87 8,45 8,31 9, , ,29 9,18 8,59 8,70 8,34 9, , ,24 8,95 8,37 8,66 8,19 9, , ,12 9,26 8,58 8,44 8,21 9, ,10 85 A farmakokinetikai paraméterek becséléséhez a sav-bázis tulajdonságok ismerete mellett elengedhetetlen a vegyületek lipofilitását jellemző, megoszlási hányados meghatározása is. A fenti kutató csoportok meghatározták a morfin látszólagos megoszlási hányadosának ph-függését. A fiziológiás ph-n az alábbi 27

28 értékeket mérték: log D ph=7,4 = 1,17 (37 C-on) illetve 1,42 (20 C-on) [83,84]; log D ph=7,4 = -0,07 (25 C, I=0,15 M) [87]. Az amfoter tulajdonságú vegyületek, így a morfin látszólagos megoszlási hányadosának ph-függése, jellegzetes maximumot leíró görbe. A morfin esetében a maximum ph 8,7-nél van [87], a vegyület izoelektromos pontjánál, mikor is legnagyobb %-ban van jelen a vizes oldatban a semleges, illetve az ikerionos mikroforma Farmakodinámia, farmakokinetika. Farmakodinámia. A morfin és más kábító fájdalomcsillapító hatású vegyületek a szervezetben opioid receptorokhoz kötődnek. A 70-es évek elejétől kezdve intenzív kutatás folyik, melynek eredményeként már több receptor típust különbözetnek meg (μ, κ, δ). Néhányan a σ, ε receptor létezéséről is beszámoltak. A σ-ról ma már tudjuk, hogy nem opioid, a naloxon nem kötődik hozzá, ellentétben a haloperidollal, ami viszont dopamin receptor antagonista. A ε receptor szerepe még tisztázatlan, a többi opiát receptorral ellentétben még nem sikerült klónozni, és még nem találták meg a szelektív agonista és antagonista vegyületét. Valamennyi opioid receptorról kimutatták, hogy G fehérje kapcsolt receptorok családjába tartozik [89]. A receptorok kutatásával párhuzamosan zajlott az endogén opiátok felfedezése. Az endogén opiátok eltérő aminosav szekvenciával rendelkező, különböző hosszúságú peptidek. Az endogén opiátok szelektivitása különbözik az egyes opiát receptorokhoz. Az endomorfin 1 és 2 peptidnek nagyfokú a szelektivitása a μ receptorokhoz, míg a Leu-enkefalinnak a δ receptorhoz, és a dinorfinnak a κ receptorhoz. Annak ellenére, hogy az endogén opiátok aminosav szekvenciája kissé különbözik, valamint az őket alkotó aminosavak száma sem egyforma, egy valami közös bennük: mindegyiknek tirozin az N terminális aminosava. A 6. ábra jól szemlélteti hogyan hozható fedésbe a morfin a tirozinnal, és magyarázatot ad arra, hogy miként lehet a morfin agonista egy olyan receptoron, amelynek endogén ligandjai oligopeptidek. 28

29 H NNH CH 3 2 NH H R 6. ábra A morfin és az endogén opiátok közös szerkezeti vonása A különböző receptor típusok más és más farmakológiai hatást közvetítenek, pl. a fájdalomcsillapításban kiemelt szerepe a μ receptornak van. Így különböző endogén ligandumoknak és gyógyszereknek az eltérő receptor affinitásukon keresztül különböző hatásspektrumuk van. Az opiát receptorok felfedezéséről számos összefoglaló közlemény született, mely részletesen tárgyalja a szervezetbeni eloszlásukat, szerkezetüket, kémiájukat, fájdalomcsillapításban történő szerepüket [90-92]. Farmakokinetika. A morfin majdnem teljesen felszívódik a gyomorbéltraktusból (elsősorban a vékonybélből szívódik fel), ugyanakkor a máj "first pass" metabolizmusának köszönhetően a biológiai hasznosíthatósága szájon át történő alkalmazás esetén alacsony. A biotranszformáció során legnagyobb mértékben a morfin glukuronsavval konjugálódik a 3 és/vagy a 6 hidroxil csoporton keresztül, illetve szulfát észter, normorfin és annak glukuronidjai, valamint kodein keletkezik belőle. A poláros metabolitok és kis mennyiségű metabolizálatlan morfin elsősorban a vizelettel ürül. A morfin farmakokinetikáját, metabolitjait és azok farmakológiai hatását több munkacsoport is összefoglalta [93-95] Morfin 6-glukuronid H H H H CH 3 H 7. ábra A morfin-6-glukuronid szerkezete N 29

30 A morfin egyik igen fontos metabolitja a szekunder alkoholos hidroxilcsoport glukuronsavval képzett konjugációs terméke (7.ábra). A vegyület fontosságát az adja, hogy aktív metabolitként van jelen a szervezetben. Annak ellenére, hogy a glukuronsavval történő konjugáció jelentősen megnöveli hidrofil jellegét, mégis bejut a központi idegrendszerbe és kifejti analgetikus hatását. Mivel a vér-agy gáton történő átjutás csak megfelelően lipofil (log P 2) karakterű vegyületek számára biztosított, felmerül a kérdés, hogy a morfin-6-glukuronid miként juthat vissza az idegrendszerbe. A váratlan viselkedés tisztázása érdekében több munkacsoport is tanulmányozta a molekulának sav-bázis tulajdonságát és megoszlási hányadosát. Az irodalomban található protonálódási makroállandói 25 C-on, 0,15 M ionerősség mellett, potenciometriás meghatározást alkalmazva: pk 1 = 2,77; pk 2 = 8,22, pk 3 = 9,42 [87]. Az igen alacsony pk 1 érték biztosítja, hogy a szervezet ph-ján a morfinhoz képest plusz egy negatív töltést tartalmazó makroforma dominál, ami meglehetősen megkönnyíti a vizelettel történő kiválasztást a vízoldhatóság megnövekedése révén. A morfin-glukuronidok megoszlási hányadosát direkt módon, kétfázisú potenciometriával [87] és indirekt módon, forditott fázisú folyadékkromatográfiával [96] is meghatározták. A vizsgálatok során a glukuronidok lipofilitása nem sokkal maradt el a morfinétól. Ugyanakkor a log P értékkel jól korreláló kromatográfiás paramétert, a kapacitás faktor logaritmus értékét fragmens módszerrel kiszámítva azt tapasztalták, hogy az értékek fiziológiás ph-n 2 és 2,5 egységgel kisebbek a kísérletesen meghatározott értéknél. Ellentétben a kísérletes meghatározásokkal, tehát a számítások során a metaboliztok kevésbé bizonyultak lipofilnek. Az ellentmondás feloldására kvantumkémiai számításokat végeztek el, melyek során bizonyítást nyert az a feltételezés, hogy a glukuronidok kétféle kitüntetett konformációs állapotban létezhetnek, egy nyújtott és egy összehajtott konformációban. Ez utóbbiban hidrogénhíd kötés tud kialakulni a morfin fennmaradó szabad hidroxilcsoportja és a glukuronsav karboxilátja között, amely megnöveli a konformer lipofilitását. A vizsgálatok alapján elmondható, hogy a morfin-glukuronidok képesek alkalmazkodni az eltérő polaritású közegekhez, és ez biztosítja számukra a megfelelő penetrációt az agyba [96-97]. 30

31 2.5.3 Kodein CH 3 H N CH 3 8. ábra A kodein szerkezete A morfin 3-metil-éter származéka (8. ábra), mely kis %-ban megtalálható a mák tejnedvében is. A kodein fájdalomcsillapító hatása 6-szor, de köhögéscsillapító és légzésdepresszív hatása csak 3-szor gyengébb a morfinnál. Hatásmódja nem egészen tisztázott; gyenge affinitással kötődik az opiátreceptorokhoz. Feltételezhető, hogy nem a sztereospecifikus μ vagy κ receptorok közvetítik a köhögéscsillapító hatását, a jobbra forgató, analgetikus hatással nem rendelkező származékok is jó köhögéscsillapítók [98]. A fenolos csoport éteresítése miatt a vegyület elveszíti amfoter jellegét, és egyértékű bázisként viselkedik. Protonálódási állandóját [68, 87, 99] és megoszlási hányadosát [87] néhány kutatócsoport már meghatározta különböző hőmérsékleten és ionerősség mellett. A kodein pk a értéke 8,22 (T = 25 C, I = 0,15 M), log D ph=7,4 értéke 0,22 (T = 25 C, I = 0,15 M). A kodein fiziológiás ph-n mintegy 2-szer jobban oldódik a szerves fázisban, mint a morfin, ami jól magyarázható a kodein semleges és a morfin semleges/ikerionos formájára jellemző a log P értékkel (log P morfin = 0,89; log P kodein = 1.19) [87] Folkodin N H N CH ábra A folkodin szerkezete és számozása 31

32 A folkodin (9. ábra), (3--morfolinoetilmorfin), egy félszintetikus morfin származék, melyet széles körben használnak köhögéscsillapítóként. Előnye a kodeinnel szemben, hogy nincs analgetikus hatása, és alkalmazása során nem alakul ki hozzászokás. A folkodin szintézisét 1950-ben közölték, és azóta számos farmakológiai és toxikológiai vizsgálatot végeztek el. A preklinikai és klinikai vizsgálatokat Findlay foglalta össze [100]. Az állatkísérletek során hatékonyabb köhögéscsillapítónak bizonyult a kodeinnél. A toxicitás vizsgálatok eredményeként bebizonyosodott, hogy a kodeinnel ellentétben nagyobb biztonsággal alkalmazható emberek esetén, annak ellenére, hogy állatkísérletekben légzés depresszív hatása kifejezettebb volt. Mindamellett, hogy a folkodint évek óta használják száraz köhögés csillapítására, metabolizmusa nem teljesen tisztázott. Maurer és Fritz GC/MS technikát alkalmazva számos metabolitot (norfolkodint, oxofolkodint, noroxofolkodint, hidroxifolkodint, dezmorfolino-hidroxifolkodint, nordezmorfolino-hidroxifolkodint, nyomokban morfint) azonosított vizeletből [101]. Jairaj és mtsai. vizsgálataik során a norfolkodint és a folkodin-n-oxidot azonosították metabolitként, és állításuk szerint ez utóbbi Mauer és Fritz által oxofolkodinként közölt metabolit [102]. Ellentétben az előző munkacsoportokkal, Johansen és munkacsoportja, ugyan csak kis %-ban, de a morfint és glukuronidját is megtalálta a metabolitok között [103,104]. A tisztázatlan metabolizmus ellenére ugyanakkor valamennyi farmakokinetikai vizsgálat abban egyetért, hogy a folkodin kiürülése sokkal hosszabb a szervezetből, mint a kodeiné [ ]. Mivel a folkodin szerkezete igen közel áll a morfinéhoz, az opiát immuntesztek során keresztreakciót ad. Így bűnügyi és toxikológiai vizsgálatokhoz a gyorstesztek mellett, nélkülözhetetlen olyan szelektív és érzékeny, lehetőleg gyors műszeres analitikai eljárások kidolgozása, melyek alkalmasak a folkodint, és annak metabolitjait biztosan kimutatni az emberi szövetmintákból [ ]. A folkodin fizikai-kémiai paramétereire az irodalomban nincsenek adatok, mindössze a sav-bázis tulajdonságát vizsgálták 37 C-on makroszkopikus szinten, a közleményben a közeg ionerősségét nem adták meg [110]. 32

33 3. CÉLKITŰZÉSEK Doktori munkám célja volt, hogy a krónikus fájdalom csökkentésére napjainkban is igen gyakran alkalmazott morfin sav-bázis tulajdonságát jellemző protonálódási makro- és mikroállandókat meghatározzam, és az irodalomban található ellentmondásokat tisztázzam. Annak érdekében, hogy kellőképpen alátámasztott eredményhez vezessenek meghatározásaink, a mikroállandókat spektroszkópiával kombinált potenciometria mellett deduktív módszerrel is meg kívántuk határozni. Célul tűztük ki a morfin aktív metabolitjának mikroszkopikus protonálódási folyamatainak meghatározását, melyet az irodalmi áttekintés szerint ezidáig csak makroszkopikus szinten vizsgáltak. További célunk volt, hogy a morfin és a kodein protonálódási egyensúlyait számszerűsítő makroállandókat összehasonlítsuk egy kevésbé tanulmányozott félszintetikus származék, a folkodin protonálódási állandóival, és ezzel magyarázatot adjunk meglehetősen eltérő farmakológiai viselkedésükre. Ezen felül célkitűzéseinkhez tartozott a folkodin és fő metabolitja, a norfolkodin mikrospeciációs sémájának meghatározása. Tanulmányozni akartuk az általunk meghatározott protonálódási állandóval rendelkező vegyületek elektroforetikus mobilitását különböző ph-jú háttér elektrolitokat felhasználva, hogy összehasonlíthassuk a vegyületek mozgékonyását az irodalomban leggyakrabban használt, fford szabály szerint számított értékekkel. 33

34 4. KÍSÉRLETI RÉSZ 4.1 Felhasznált vegyszerek, vizsgált anyagok A mérésekhez felhasznált valamennyi analitikai tisztaságú vegyszert (mérőoldatok komponenseit, inert sókat az ionerősség beállításához, kalibráló és a mérésekhez felhasznált puffersókat) a Sigma, Aldrich, Fluka és Reanal gyártóktól szereztük be. Az NMR spektroszkópiához referencia anyagként használt 3-trimetil-1- propánszulfonsav nátrium sóját (DSS) használtuk, melyet a Fluka cégtől vásároltunk. Az NMR mérések mintáinak elkészítéséhez 99,8 %-os izotóptisztaságú D 2 oldószert alkalmaztunk, melyet az Aldrich cégtől szereztünk be. Valamennyi esetben kétszer desztillált vizet használtunk. A vizsgált anyagok közül a Ph. Eur. 4. szerint minősített morfin-hidrokloridot és kodein-hidrokloridot az Alkalodia Gyógyszergyártól vásároltuk. Doktori munkám során az egyéb vizsgált morfin származékokat, metabolitokat Hosztafi Sándor állította elő az irodalomban megtalálható szintézis utak szerint [ ]. Morfin és kodein kvaterner sóinak előállítása. A morfin, illetve a kodein bázis metil-jodiddal képződő kvaterner sója régóta ismert vegyületek. Morfin vagy kodein bázist metanolban metiljodid felesleggel (kb. 10 ekv.) 40 C-on melegítve 8 óra reakció után a termék kristályosan kiválik, a hozam mindkét esetben közel kvantitatív. Kvaterner folkodin származékok előállítása. A folkodin vizes oldatának a kémhatását 0,1 M sósavval ph = 7,4-re állítottuk be. A ph állítása azért szükséges, hogy maximális koncentrációban legyenek jelen az oldatban az egyszer protonált izomerek, és így a metilezés során monokvaterner vegyületek nagy mennyiségben keletkezzenek. A vizes oldatot ezután bepároltuk, és a maradékot metanolban oldottuk, majd feleslegben metil-jodidot adtunk hozzá. Az elegyet 24 órán keresztül kevertettük 60 C-on, végül bepároltuk. Vékonyréteg kromatográfiás elválasztás során a szintézis termék, ahogyan vártuk is, nem bizonyult egységesnek. NMR vizsgálatokkal azonosítottuk az anyagokat, melyek a folkodin, a kétféle N-metilfolkodin izomer, és a bisz-n-metilfolkodin voltak. Azért, hogy a későbbiekben az NMR-pH titrálások 34

35 könnyebben követhetők legyenek, kidolgoztunk egy vékonyréteg kromatográfiás elválasztást, melynek eredményeként a szintézis 4 komponensét elválasztottuk. A módszerfejlesztés során számos normál és fordított fázisú rendszert kipróbáltunk, többkevesebb sikerrel. Az alábbiakban csak az optimalizált rendszer körülményeit adom meg: állófázisként bázikus aluminium-oxid 60 F254 (Typ E) réteget (Merck), mozgófázisként diklórmetán, 2-propanol, 25 %-os ammónia 35/45/20 arányú elegyét használtuk. Az anyagból 0,5 %-os oldatot készítettünk metanollal, majd 1200 μl-t vittünk fel a rétegre 18 cm-es sávban Camag (Muttenz, Svájc) Linomat IV felcseppentő segítségével. A kromatografálási idő kb. 3 óra volt, majd az elválasztást 254 nm-en UV lámpával ellenőriztük. A foltokat a rétegről lekapartuk, és a rétegen adszorbeálódott anyagot metanollal oldottuk le az aluminium-oxidról. A metanolos oldatokat bepároltuk és az anyagokat NMR spektroszkópiával azonosítottuk. Az R f értékek a következők voltak: bisz-n-metilfolkodin: 0,02; N-metilfolkodin (piperidin gyűrűn): 0,49, N- metilfolkodin (morfolin gyűrűn): 0,57, folkodin: 0,87 (ld. 10. ábra) A B C D 10. ábra A kvaternerezett folkodin származékok kromatogramja (A: a kiindulási folkodin kromatogramja; B-D különböző szerves oldószerekből kikristályosított termékek kromatogramjai; 1: folkodin, 2: N-metilfolkodin (morfolin); 3: N-metilfolkodin (piperidin); 4: bisz-n-metilfolkodin; kromatografálás körülményeit ld. szöveg) 35