PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA. Doktori iskola vezető: Dr. Gáborjányi Richard

Átírás

1 PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Doktori iskola vezető: Dr. Gáborjányi Richard Témavezető: Dr. Nádasy Miklós C. Sc. Konzulens: Dr. Szőcs Gábor C. Sc. A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) csalogató viselkedésének megfigyelése, szexferomonjának kivonása és szintetikus csalogatóanyag kifejlesztése a gyakorlati előrejelzés számára Készítette: Molnár Béla Péter Keszthely 2011

2 A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) csalogató viselkedésének megfigyelése, szexferomonjának kivonása és szintetikus csalogatóanyag kifejlesztése a gyakorlati előrejelzés számára című értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Molnár Béla Péter Készült a Pannon Egyetem Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok Doktori Iskolájának keretében Témavezető: Dr. habil. Nádasy Miklós C.Sc Elfogadásra javaslom (igen / nem).. Dr. Nádasy Miklós A jelölt a doktori szigorlaton.... % -ot ért el, Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: igen /nem aláírás Bíráló neve:... igen /nem aláírás Bíráló neve: igen /nem aláírás A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...% - ot ért el. Keszthely,. A Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése... Az EDT elnöke 2

3 Dr. Nádasy Miklós emlékére 3

4 A lepényfa-gubacsszúnyog hímje (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) Benedicty Zsuzsa rajza 4

5 TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK...5 KIVONATOK...7 MAGYAR NYELVŰ KIVONAT...7 SUMMARY (ANGOL NYELVŰ KIVONAT)...10 ZUSAMMENFASSUNG (NÉMET NYELVŰ KIVONAT) BEVEZETÉS CÉLKITŰZÉSEK IRODALMI ÁTTEKINTÉS A GUBACSSZÚNYOGOK, MINT KÁRTEVŐK A LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG A lepényfa-gubacsszúnyog elterjedése, általános leírása A lepényfa, mint tápnövény A lepényfa-gubacsszúnyog kártétele A lepényfa-gubacsszúnyog előrejelzése, védekezési lehetőségek, természetes ellenségek A ROVAROK KÉMIAI KOMMUNIKÁCIÓJA KÉMIAI KOMMUNIKÁCIÓ A GUBACSSZÚNYOGOKNÁL Tápnövény keresés növényi illatanyagok segítségével A gubacsszúnyogok szexferomonja A szexferomon termelés helye Csalogató viselkedés és annak napszaki ritmusa gubacsszúnyogoknál Szexferomon kémiai szerkezete a gubacsszúnyogok családjában A SZEXFEROMON ÉRZÉKELÉS PERIFÉRIKUS SZERVE: A CSÁP A rovar csáp felépítése és működése A gubacsszúnyogok csápmorfológiája ELEKTROANTENNOGRÁFIA (EAG) BIOSZENZOROS (CSÁPDETEKTOROS) GÁZKROMATOGRÁFIA ELVI HÁTTERE (GC-EAD) INGERÜLET ELVEZETÉS EGYEDI ÉRZÉKSZŐRRŐL (SINGLE SENSILLUM RECORDING, SSR) ELVI HÁTTERE ANYAG ÉS MÓDSZEREK KÍSÉRLETI ROVAROK KINEVELÉSE LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG CSALOGATÓ VISELKEDÉSE ÉS ANNAK NAPSZAKI RITMUSA SZEXFEROMON ÖSSZEGYŰJTÉSE LÉGTÉRBŐL TÖRTÉNŐ VISSZAFOGÁS MÓDSZERÉVEL Closed loop stripping apparatus (CLSA) Az összegyűjtött szexferomon leoldása az aktív szén szűrőről STIMULUSOK ELKÉSZÍTÉSE ELEKTROANTENNOGRÁFIA (EAG) BIOSZENZOROS (CSÁPDETEKTOROS) GÁZKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATOK (GC-EAD) KÉTVÁLASZTÁSOS VISELKEDÉSI KÍSÉRLETEK Y-OLFAKTOMÉTERREL PÁSZTÁZÓ ELEKTRONMIKROSZKÓP (SEM) INGERÜLET ELVEZETÉS EGYEDI SZAGLÓSZŐRRŐL (SSR) VIZSGÁLATOK SZEXFEROMON-CSAPDÁZÁS SZINTETIKUS FEROMONNAL EREDMÉNYEK CSALOGATÓ VISELKEDÉS ÉS ANNAK NAPSZAKI RITMUSA ELEKTROANTENNOGRÁFIA (EAG) BIOSZENZOROS (CSÁPDETEKTOROS) GÁZKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATOK (GC-EAD) KÉMIAI SZERKEZET-MEGHATÁROZÁS (GC-MS) A FEROMON MOLEKULA SZINTETIKUS ENANTIOMERJEI A FEROMON MOLEKULA SZINTETIKUS ENANTIOMEREINEK BIOLÓGIAI AKTIVITÁS VIZSGÁLATA CSÁPDETEKTORRAL (EAG)

6 5.7. SZABADFÖLDI CSAPDÁZÁS A SZTEREOSZELEKTÍVEN ELŐÁLLÍTOTT SZEXFEROMONNAL, ANTIPÓDJÁVAL ÉS A RACÉM KEVERÉKKEL AZ Y-OLFAKTOMÉTERES VIZSGÁLATOK ELEKTRONMIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOK INGERÜLETELVEZETÉS EGYEDI ÉRZÉKSZŐRRŐL (SINGLE SENSILLUM RECORDING - SSR) VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI A LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG ÚJ EURÓPAI ELTERJEDÉSI TERÜLETE TERMÉSZETES ELLENSÉGEK MEGVITATÁS A LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG CSALOGATÓ VISELKEDÉSÉVEL KAPCSOLATOS VIZSGÁLATOK A LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG SZEXFEROMONJÁNAK MEGHATÁROZÁSA ÉS ANNAK SZERKEZETE A SZEXFEROMON ENANTIOMER ÉS ANTIPÓDJA LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG SZEXFEROMON MEGHATÁROZÁSÁNAK GYAKORLATI FELHASZNÁLÁSA CSÁPMORFOLÓGIA ÉS A KEMOSZENZILLUMOK EGYEDI INGERÜLETELVEZETÉSE (SSR) TERMÉSZETES ELLENSÉGEK ÖSSZEFOGLALÁS A LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG SZEXFEROMON MEGHATÁROZÁSA ÉS A SZINTETIKUS FEROMONNAL KAPCSOLATOS VIZSGÁLATOK CSÁPMORFOLÓGIA ÉS INGERÜLETELVEZETÉS EGYEDI ÉRZÉKSZŐRRŐL VIZSGÁLATOK (SSR) A LEPÉNYFA-GUBACSSZÚNYOG ÚJ EURÓPAI ELŐFORDULÁSA ÉS EGY ÚJ TERMÉSZETES ELLENSÉGE ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOM RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

7 KIVONATOK Magyar nyelvű kivonat A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) csalogató viselkedésének megfigyelése, szexferomonjának kivonása és szintetikus csalogatóanyag kifejlesztése a gyakorlati előrejelzés számára A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) (Diptera: Cecidomyiidae) köszönhetően tápnövénye a tövises lepényfa (Gleditsia triacanthos Linné) terjedésének, jelentős kártevővé vált Európa szerte, így hazánkban is. A lepényfagubacsszúnyog elleni növényvédelem sikere az időzítésen múlik, hiszen a gubacsszúnyogokra általánosan jellemző a szinkronizált és rövid rajzás. Az ehhez szükséges előrejelzés eszköze a feromoncsapda lenne, azonban a faj kémiai kommunikációjáról korábban nem volt irodalmi adat, a faj szexferomonja eddig ismeretlen volt. Vizsgálataim célja a lepényfa-gubacsszúnyog csalogató viselkedése, annak napszaki ritmusának megfigyelése, a szexferomon izolálása és azonosítása volt. Végső célként gyakorlati növényvédelmi előrejelzéshez alkalmas feromoncsapda kifejlesztését tűztem ki. Vizsgálataim során begyűjtöttem a lepényfa-gubacsszúnyog által károsított lombot, abból kineveltem az imágókat, majd megfigyeltem a nőstények csalogató magatartását és annak napszaki ritmusát. A frissen kelt nőstények által zárt rendszerben (ún. closed loop stripping apparatus, CLSA) kibocsátott szexferomont aktív szén adszorbenssel gyűjtöttem össze (a legnagyobb kivonat esetében 1800 nőstényből). A kivonatok biológiai aktivitását csápdetektorral (EAG), hím lepényfa-gubacsszúnyogok csápjain vizsgáltam, majd bioszenzoros gázkromatográffal (GC-EAD) határoztam meg a feromon retenciós idejét. A szexferomon szerkezetének meghatározását (GC-MS) és szintetikus előállítását nemzetközi együttműködés keretében, Prof. David R. Hall végezte (Natural Resources Institute, University of Greenwich, Chatham Maritime, Nagy-Britannia). A szintetikus szexferomon enantiomerek biológiai aktivitását csápdetektorral (EAG), szabadföldi csapdázással (MTA NKI), valamint Y-olfaktométeres kétválasztásos tesztekkel (SLU, Alnarp, Svédország) vizsgáltam. A feromonális érzékelés megismeréséhez először pásztázó elektronmikroszkópos csápmorfológiai felvételeket készítettem. A csáp morfológiájának ismeretében ún. single 7

8 sensillum recording (SSR) azaz ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről módszerrel sensillum trichodeum és sensillum circumfilum érzékszőrökön végeztem kísérleteket (SLU, Alnarp, Svédország). Megállapítottam, hogy a nőstények a reggeli, délelőtti órákban (8-12 óráig) csalogatják fajuk hímjeit. A feromonkivonatok a hím ivarú egyedek csápján szignifikánsan nagyobb EAG választ (0,250 mv ± 0,016 mv) váltottak ki, mint az oldószeres kontroll (0,043 mv ± 0,004 mv). Az egyetlen EAG választ kiváltó anyag, a feltételezett szexferomon retenciós ideje a bioszenzoros gázkromatográfia (GC-EAD) alapján RT: 14,84 min volt (J&W Scientific, DB- WAX 30 m x 0.32 mm x 0,25 µm). Szintetikus standard sor segítségével a megállapított retenciós indexe RI: A tömegspektroszkópiás szerkezetmeghatározás és a királis kromatográfiás elválasztás alapján a feltételezett szexferomon az optikailag aktív (Z)-2- acetoxi-8-heptadecén (Z8-17:2Ac), (R)-enantiomerje. Az enantiomerek csápdetektoros vizsgálata során az (R)-enantiomer és a racém keverék szignifikánsan nagyobb csápválaszt váltottak ki, mint az (S)-enantiomer. A pásztázó elektronmikroszkópos csápmorfológia ismeretében elvégzett ingerületelvezetés egyedi szaglószőrről vizsgálatok (SSR) rámutattak, hogy a sensillum trichodeum hordozza az (R)-enantiomer receptorokat. Az (S)-enantiomer tüzelés mintázata (spike) azonban nem mutatott szignifikáns különbséget az oldószerhez képest. A szabadföldi csapdázások során mind az (R)-enantiomer, mind a racém keverék szignifikánsan több hím lepényfa-gubacsszúnyogot vonzott (egyenként 223,0 ± 44,2 db és 81,0 ± 17,4 db), mint az (S)-enantiomer (2,4 ± 0,9 db) és a kontroll (0,7 ± 0,5 db). További csapdázásos kísérletek azt mutatták, hogy az (R)-enantiomer vonzóképessége tovább növelhető, amennyiben kis mennyiségben hozzáadtuk az (S)-enantiomert. Az Y- olfaktométeres laboratóriumi vizsgálatok is ezt az eredményt támasztották alá. Megállapítottam, hogy a gyakorlati növényvédelmi előrejelzés szempontjából a racém keverék megfelelő és megbízható csalétke a lepényfa-gubacsszúnyog feromcsapdájának. A 2010-es évben így a lepényfa-gubacsszúnyog feromoncsapda bekerült a Csalomon csapdacsaládba és kereskedelmi forgalomban is kapható. Az újonnan fejlesztett feromoncsapda első gyakorlati felhasználásával elsőként találtam meg a lepényfagubacsszúnyogot Dél-Svédországban (Alnarp, Skåne). Szintén Svédországban találtam meg az Pinalithus cervinus (syn. Orthops cervinus) (Herrich-Schaeffer) fitofág poloskafajt, amely 8

9 természetes ellenségként a lepényfa-gubacsszúnyog gubacsok szívogatásával közvetve képes volt nagy mértékben csökkenteni a következő rajzás egyedsűrűségét. 9

10 Summary (Angol nyelvű kivonat) Observation on calling behaviour and isolation of female-produced sex pheromone of the honey locust gall midge (Dasineura gleditchiae Osten Sacken), and development of a synthetic trap bait for practical monitoring Following its accidental introduction, the honey locust gall midge (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) (Diptera: Cecidomyiidae) has become an important urban pest of the honey locust tree (Gleditsia triacanthos Linné) across most parts of Europe, including Hungary. The development of an efficient strategy of protecting these popular ornamental trees should be based on sensitive detection of the narrowly synchronized, short flight period of the midges, for which purpose pheromone traps could be ideal. However, no such traps exsisted, as even the chemical composition of the sex pheromone of this pest was unknown. The objectives of my studies were to observe the calling behavior of the honey locust gall midge with the final aim of isolating and, if possible, identifying its sex pheromone. If successfully completed, this would allow to develop a pheromone trap which could be used in practical monitoring. Methods included collecting galls (Budapest) and rearing adults, visual observation of calling behavior, extraction of pheromones from females (largest extract was prepared from 1800 freshly emerged, unmated females). The airborne sex pheromone, emitted by females, was collected in the laboratory in a closed loop stripping apparatus (CLSA), using charcoal filter. The biological activity of the extract was verified by electorantennography (EAG), and the retention time of the proposed sex pheromone was defined by using gas chromatography linked to electroantennographic detector (GC-EAD). Direct chemical structure elucidation by gas chromatography linked mass spectroscopy (GC-MS) and synthesis was completed within the a frame of international interdisciplinary cooperation, by Prof. David R. Hall (Natural Resources Institute, University of Greenwich, Chatham Maritime, UK). Electrophysiological, as well as behavioral activity of synthetics was completed on midges of a Hungarian population, by EAG and by field trapping trial (Budapest). At the same time, Y-tube laboratory choice tests were also conducted (SLU, Alnarp, Sweden). In order to have a deeper insight of the pheromone perception, morphological studies of the antennae by scanning electronmicroscope, as well as single sensillum recordings (SSR) from sensilla trichodea and 10

11 sensilla circumfila responsible for pheromone perception were also performed (SLU, Alnarp, Sweden). Results showed that females call the conspecific males in the morning (08-12 hours). Extracts elicited strong electrophysiological activity (0.250 mv ± mv versus mv ± mv of the solvent control). There was one strong antennal response at a retention time RT min in GC-EAD, corresponding to a small peak in the FID trace. Comparing to a series of synthetic standards, the retention index of the peak with antennal activity was calculated as RI Structure elucidation (GC-MS) revealed a chiral compound: (Z)-2- acetoxy-8-heptadecene (Z8-17:2Ac), with a match of the (R)-enantiomer on chiral column. Comparing of the synthetic enantiomers, as well as of the racemate in various dose levels, the (R)-enantiomer and the racemate were significantly superior to the (S)-enantiomer in EAG tests. The morphology of the antennae was visualizied by scannig electronmicroscope. In the case of sensillum trichodeum it was proven that the receptors of the (R)-enantiomer were located there. There were no significant differences between the spike pattern generated by the (S)-enantiomer and the hexane-control. Field tests revealed that both the (R)-enantiomer and the racemate attracted male midges in significant numbers (223.0 ± 44.2; 81.0 ± 17.4, respectively), while the (S)- enantiomer was virtually inactive (2.4 ± 0.9; unbaited 0.7 ± 0.5). However, further trapping tests showed that the attractiveness of the (R)-enantiomer can slightly be enhanced by adding small amounts of the (S)-enantiomer. The same trend was corroborated by Y-tube olfactometer laboratory bioassays. As a practical conclusion, traps baited with a racemate sample constitute a powerful tool for monitoring the flight of the honey locust gall midge. In 2010 the honey locust gall midge pheromone traps were included as a new associate in the Csalomon (Plant Protection Insitute, HAS, Budapest, Hungary) trap family. With these traps, the first record of the honey locust gall midge from Sweden was documented, by captures obtained in Alnarp, in the course of my survey in Skåne, Southern-Sweden. Moreover, I detected in Alnarp by visual observation even a natural enemy of the pest: a mirid bug, Pinalithus cervinus (Herrich-Schaeffer). 11

12 Zusammenfassung (Német nyelvű kivonat) Zusammenfassung Beobachtung des Anlockungsverhaltens der Gleditschienblatt-Gallmücke (Dasineura gleditchiae Osten Sacken), Isolierung des Sexpheromons und Entwicklung des synthetischen Lockstoffmaterials für die praktische Monitoring Wegen der Verbreitung des Gleditschienblattes (Gleditsia triacanthos, L.), der die Naehrpflanze der Gleditschienblatt-Gallmücke (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) ist, bedeutet diese Gallmücke ein wichtiger Schaedling überall in Europa, sogar in Ungarn. Der Erfolg der Pflanzenschutzstrategie gegen Gleditschienblatt-Gallmücke haengt von der Tempierung, da das syncrhonisierte und kurze Geschwaerm dieser Gallmücke allgemein typisch ist. Das dazu notwendige Mittel der Monitoring waere die Feromonfalle. Jedoch existierte früher über die chemische Kommunikation dieser Art keine Literatur, der Sexpheromon dieser Art war bis jetzt unbekannt. Das Ziel meiner Forschungen war die Beobachtung des Anlockungsverhaltens der Gleditschienblatt-Gallmücke, die Beobachtung deren Tagesrhytmus, die Isolierung des Sexpheromons und dessen Identifizierung. Meine Primaerzielsetzung war die Entwicklung solcher Pheromonfalle, die zu dem praktischen Pflanzenschutz-Monitoring geeigneit ist. Im Laufe meiner Untersuchungen habe ich das von Gleditschienblatt-Gallmücke beschaedigte Laub gesammelt, davon habe ich die Erwachsenen gezüchtet, ich habe das Anlockungsverhalten der Weibchen und deren Tagesrhytmus beobachtet. Den von den frisch geschlüpften Weibchen ausgelassenen Sexpheromon habe ich im geschlossenen System (sog. Closed Loop Stripping Apparatus, CLSA) mit Aktiv-Kohlabsorbent gesammelt (Meistextrakt 1800 Weibchen). Die biologische Aktivitaet der Extrakte an Maennchen-Gleditschienblatt- Gallmücke-Antenne habe ich mit Antenne-Detektor (EAG) untersucht, dann habe ich die Retentionszeit des Pheromons mit Biosensor-Gaschromatograph (GC-EAD) bestimmt. Die Struktur-Determinierung (GC-MS) des Sexpheromons und dessen synthetische Herstellung hat Herr Prof. David R. Hall (Natural Resources Institute, University of Greenwich, Chatham Maritime, Gross-Britannien) im Rahmen internationaler Zusammenarbeit durchgeführt. Die Attraktivitaet der synthetischen Sexpheromon-Enantiomeren habe ich mit Antenne-Detektor 12

13 (EAG) und Freilandtest (MTA NKI Ungarische Wissenschaften-Akademie Pflanzenschutz- Institut, Budapest), bzw. mit Y-Olfaktometer Doppelwaehlsystem (SLU, Alnarp, Schweden) untersucht. Im Interesse der Erkennung der pheromonalischen Reaktion habe ich zuerst Scanning elektromikroskopische Antenne-Morfologie-Recording gefertigt, dann habe ich mit der Methode Reizungsabführung auf Einzelsinneshaar (SSR) auf sensillum trichodeum und sensillum circumfillum Sensor-Untersuchungen (SLU, Alnarp Schweden) durchgeführt. Ich habe festgestellt, dass die Weibchen in den Vormittagsstunden (8-12 h) die Maennchen anlocken. Die Pheromonextrakte auf der Maennchen-Antenne haben signifikanterweise grössere Antwort (0,250 mv ± 0,016 mv) gegeben, als die Lösemittel- Kontrolle (0,043 mv ± 0,004 mv). Das einzige Antenne-Antwort gebende Material, die praesumierte Sexpheromon-Retentionszeit wurde auf Grund der Gaschromatographie (GC- EAD) entdeckt und, seine Retenzionzeit als RT: 14,84 Min festgestellt. Mit Hilfe der synthetischen Standardserie war der festgestellte Retentionsindex: Auf Grund der massenspektroskopischen Strukturdeterminierung und der Chiral-chromatographische Separierung ist der praesumierte Sexpheromon der optisch aktive (Z)-2-acetoxi-8-heptadeken (Z8-17:2Ac) der (R)-Enantiomer. Bei der Antenne-Detektorprüfung der Enantiomeren haben die (R)-Enantiomer und Racem-Mischung signifikanterweise grössere Antenne-Antwort ausgelöst, als der (S)-Enantiomer. Die mit Hilfe der Scanning elektronmikroskopischen Antenne-Morphologie durchgeführten Untersuchungen mit der Methode Reizungsabführung auf Einzelsensor (SSR) haben darauf hingewiesen, dass die sensillum trichodeum die (R)-Enantiomer Rezeptore traegt. Jedoch hat die (S)-Enantiomer Bockenmodellierung (spike) keinen signifikanten Unterschied im Vergleich zum Lösemittel gezeigt. Im Laufe der Freilandteste haben obwohl der (R)-Enantioner als auch Racem- Mischung signifikanterweise mehr Maennchen Gleditschienblatt-Gallmücke gereizt (je eins 223,0 ± 44,2 und 81,0 ± 17,4) als der (S)-Enantiomer (2,4 ± 0,9) und die Kontrolle (0,7 ± 0,5). Weitere Fallenversuche haben gezeigt, dass die Anlocksfaehigkeit der reine (R)-Enantiomer noch erhöht werden kann, falls wir die (S)-Enantiomer in kleinen Mengen dazu geben. Dieses Ergebnis wurde auch mit Y-Olfaktometer-Labortesten unterstütz. Ich habe festgestellt, dass Racem-Mischung mit Rücksicht auf praktische Pflanzenschutz-Monitoring ein geeigneter und sicherer Köder der Pheromonfalle der Gleditschienblatt-Gallmücke ist. Dieserweise ist die Gleditschienblatt-Gallmücke 13

14 Pheromonfalle in die Csalomon (Pflanzenschutzinstitut, Budapest) Fallenfamilie im Jahre 2010 eingeführt worden, und ist auch erhaeltlich. Ich war der Erste, der den Gleditscheinblatt-Gallmücke in Süd-Schweden (Alnarp, Schweden) mit der ersten praktischen Verwendung der neu-entwickelten Pheromonfalle gefunden hat. Auch in Schweden habe ich der Pinalithus cervinus (Herrich-Schaeffer) Pflanzenfressende Wanzespecie gefunden, die als Naturfeind mit dem Aussaugen der Gleditschienblatt-Gallen indirekterweise faehig war, die Anzahl der Mücken des naechsten Geschwaerms bedeutend zu reduzieren. 14

15 1. BEVEZETÉS A Földünkön napjainkig léteznek faunisztikailag és florisztikailag fel nem térképezett területek, de meglepő módon felderített területekről is írnak le új fajokat nap mint nap. Különösen igaz ez a rovarok világára. Az általam vizsgált gubacsszúnyogok márcsak a méretüknél fogva is, viszonylag későn kerültek a figyelem előterébe. Jól példázza ezt a ben, Brazíliában a tengerpartokon élő Eugenia (Myrtaceae) növényeken talált két, tudományra nézve új gubacsszúnyog faj, egyik nemzetségre is újdonság volt (Maia és mtsai., 2005). Egy 2006-ban megjelent cikk szerint, az Alpokban, a gleccserek előterületein élő, terjedő gyömbérgyökéren (Geum reptans Linné) 2400 méteren fedeztek fel új fitofág gubacsszúnyog fajt (Geomyia alpina Skuhravá) (Skuhravá és mtsai., 2006a). Az ember közvetlen környezete is rejthet meglepetéseket, mint azt egy 2008-ban, Dél- Floridában megtalált, a tudomány számára addig ismeretlen ragadozó gubacsszúnyog faj (Tingidoletes praelonga Gagné) bizonyítja. Ezt a nemzetségre új fajt, avokádóültetvényekben találták meg a kutatók, és lárvái az avokádó csipkés poloska (Pseudacysta perseae Heidemann) nimfáit, sőt imágóit fogyasztják. Az avokádó legjelentősebb kártevőjének visszaszorítása így természetes ellensége felhasználásával válhat lehetővé (Gagné és mtsai., 2008). A gubacsszúnyogok taxonómiailag a kétszárnyúak rendjébe (Diptera), a fonalascsápúak (Nematocera) alrendjébe és a gubacsszúnyogok családjába (Cecidomyiidae) tartoznak. A család több mint 5000 fajt számlál világszerte (Gagné, 1989). Sok mezőgazdaságilag is fontos kártevő kerül ki a családból, csak néhány példát említve: például a búza négy gubacsszúnyog kártevője: a citromsárga búza-gubacsszúnyog (Contarinia tritici Kirby), a narancssárga búza-gubacsszúnyog (Sitodiplosis mosellana Géhin), a nyerges búzagubacsszúnyog (Haplodiplosis marginata von Roser), és a hesszeni légy (Mayetiola destructor Say), továbbá például az afrikai rizs-gubacsszúnyog (Orseolia oryzivora Harris Gagné) és az ázsiai rizs-gubacsszúnyog (Orseolia oryzae Wood Mason), a repcebecőgubacsszúnyog (Dasineura brassicae Winn), a borsó-gubacsszúnyog (Contarinia pisi Winn), a káposzta-gubacsszúnyog (Contarinia nasturtii Kieffer), vagy az alma-gubacsszúnyog (Dasineura mali Kieffer). Az erdészeti kultúrákban hazánkban is egyre nagyobb károkat okoz 15

16 az ipari faalapanyagként jelentős fehér akácon, az Észak-Amerikából behurcolt akácgubacsszúnyog (Obolodiplosis robiniae Haldeman) (Csóka, 2006). A fitofág gubacsszúnyogok nagy többsége monofág, de találunk a családban oligofág fajokat is (Harris és mtsai., 1999), mint például a citrom-gubacsszúnyog (Prodiplosis longifilia Gagné) (Peña és mtsai., 1987). A fitofág fajok mellett találunk olyan fajokat, amelyek lárvái ragadozó életmódot folytatnak például a már kereskedelmi forgalomban is kapható, biológiai növényvédelemben használatos levéltetű fogyasztó gubacsszúnyog (Aphidoletes aphidimyza Rondani) (van Lenteren és Woets, 1988). A gubacsszúnyogok családjának számos faja viszont micellofág vagy szaprofág életmódot folytat és nincsen növényvédelmi jelentősége. Visszatérve a fitofág fajokra, a borsó-gubacsszúnyognál (Contarinia pisi) figyelték meg, annak ellenére, hogy monofág faj és csak a borsó (Pisum sativum Linné) a tápnövénye (Geissler, 1966), hogy a lárvái képesek túlélni és kifejlődni két lednek (Lathyrus spp.) fajon is (Vallotton, 1969). A gubacsszúnyogokra általánosan jellemző a kis testméret például a már említett borsó-gubacsszúnyog kifejlett imágói, mindössze 2 mm-esek. A nemek között megfigyelhető méretbeli különbség, a nőstények valamivel nagyobbak, mint azt a lepényfa-gubacsszúnyagnál is megfigyeltem. A kifejlett hímek 1,5-1,8 mm-esek, a nőstények 1,8-2,0 mm-esek (Ripka, 1996). A kis testméret rövid élettartammal párosul, ami általában 1-2 nap (Gagné, 1989) ez alól a nem párosodott nőstények lehetnek kivételek, amelyek akár 3-4 napig is élnek (Harris és Rose, 1991), így az egyedeknek nagyfokú szinkronizáltságra van szükségük a rajzásban és a szaporodásban, a tápnövény megfelelő fenológiai állapotához igazodva (Gagné, 1994). Solinas és Isidoro (1991) vizsgálatai alapján, melyeket cirok-gubacsszúnyoggal (Contarinia sorghicola Coq.) végeztek, a nőstények átlagosan 4,7 ± 0,3 napig, a faj hímjei 3,5 ± 0,4 napig éltek. A rizs-gubacsszúnyog imágókkal végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a nőstények óráig, míg a hímek csak óráig élnek (Rajamani és mtsai., 2004). Általában ennél rövidebb az imágók élettartama, átlagosan 1-2 nap, szélsőséges esetben csak 1-2 óra (Harris, 1979). Az első megfigyelések a gubacsszúnyogok kémiai kommunikációjára vonatkozóan Cartwright (1922) nevéhez fűződnek. Megfigyelései szerint a hesseni légy (Mayetiola destructor) nőstények képesek több méterről is magukhoz csalogatni a hímeket, ezt megerősítendő frissen kelt nőstényeket helyezett kis ketrecekbe, melyek egy részét kívülről 16

17 ragasztó anyaggal vont be. A négynapos kísérletben átlagosan 145 hesszeni légy hímet fogott csapdánként. Második kísérletében a frissen kelt, nem párosodott nőstényekkel csalétkezett ketrecektől távolodva ragacsos felületeket helyezett el 0,3 métertől egészen 4 méterig és megfigyelte a fogott hímek számának növekedését a nőstény felé haladva (Cartwright, 1922). Ezek a vizsgálatok megalapozták a faj későbbi szexferomon meghatározását, amely első volt a gubacsszúnyogok családjában. Ezen első, a szexferomon jelenlétét demonstráló vizsgálat óta sem haladta meg a sikeres feromon meghatározások száma a gubacsszúnyogok családjában a huszat, erről bővebben a fejezetben lesz szó (lásd 1. táblázat). A gubacsszúnyogok feromontermelő mirigyének pontos helyét és felépítését szintén sokáig homály fedte. Az 1900-as években kezdtek el foglalkozni a kutatók behatóbban a feltételezett feromonmirigy szöveti felépítésével és elhelyezkedésével, amit nehezített a gubacsszúnyogok apró testmérete. Nagy áttörést az elektronmikroszkóp megalkotása, fejlődése jelentette, ami behatóbb vizsgálatokat tett lehetővé. 17

18 2. CÉLKITŰZÉSEK A hazánkba szaporítóanyaggal behurcolt lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae Osten Sacken), monofág kártevő, kizárólag a tövises lepényfán (Gleditsia triacanthos L.) és annak városi környezetben egyre szélesebb körben ültetett díszváltozatain (pl. Sunburst, Shademaster, Skyline, Rubylace) károsít. Tömeges rajzásakor esztétikai értékcsökkenést szélsőséges esetben hajtáselhalást okoz a hajtások részleges defóliálásával park és útsorfákon. A növényvédelmi permetezések közterületeken, nem tartoznak a könnyen kivitelezhető kezelések közé, gondoljunk csak a közparkokra, a nagyméretű kezelendő fákra, illetve a közterületeken engedélyezett növényvédő szerek szigorodó szabályozására. A lepényfa-gubacsszúnyog behurcolt kártevő, melynek előrejelzése a szexferomon ismerete nélkül nem megoldott és csak a folyamatos megfigyelés adhatna információt a permetezések pontos időzítéshez. A pontosan időzített növényvédelmi kezelés, az imágók rövid rajzási ideje és a védetten fejlődő lárvák miatt a védekezés egyetlen lehetősége. Célul ezért, ezen faj feromon meghatározását tűztem ki, a következő lépések sorzatán át: - a párosodás napi ritmusának megfigyelése, - az imágók párosodási viselkedésének megfigyelése, - csalogató nőstények által kibocsátott feromon légtérből történő visszagyűjtése, - a feromon kivonatok biológiai aktivitásának vizsgálata csápdekterorral (EAG), - a feromon retenciós idejének (RT) és idexének (RI) meghatározása bioszenzoros gázkromatográffal (GC-EAD). Sikeres kivonatkészítés esetén a feromon tömegspektroszkópiás szerkezetmeghatározását (GC-MS) és szintetikus előállítását külföldi kémiai laborral történő együttműködéssel terveztem megoldani. Ezt követően a szintetikus feromon további vizsgálatai: - a szintetikus szexferomon komponens/ek csápdetektoros vizsgálata (EAG), - szabadföldi feromoncsapdázás a szintetikus szexferomon komponensekkel, - ha többkomponensű a szexferomon keverék, az optimális arány megtalálása, - feromoncsapdás rajzásmegfigyelések, nemzedékszám megállapítása hazánkban, - viselkedési vizsgálatok Y-olfaktométerrel, - perifériás érzékelés vizsgálata ún. single sensillum recording (SSR) a későbbiekben ingerület elvezetés egyedi érzékszőrről vizsgálatokkal. Ezen vizsgálatok végső célja egy, a 18

19 kereskedelmi forgalomban is kapható csapdatípus kifejlesztése volt a lepényfa-gubacsszúnyog előrejelzésére. 19

20 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1. A gubacsszúnyogok, mint kártevők A fitofág gubacsszúnyogok észrevétlenül ugyan, de jelen vannak közvetlen környezetünkben a termesztett dísz-, zöldség-, gyümölcs-, és szántóföldi növényeiken. Kártételüket tekintve megkülönböztethetünk vegetatív, illetve generatív részeket károsító fajokat. A vegetatív részeken károsító fajok lárvái a levéllemezen okoznak elváltozásokat szívogatásukkal. Ennek eredménye lehet az ún. leaf margin roll galls, amelynek során a levélszél besodródik, kissé megvastagodik és alakít ki gubacsot. Ez a típusú kártétel jellemző az alma-gubacsszúnyogra (Dasineura mali) (Cross és mtsai., 2009), az akác-gubacsszúnyogra (Obolodiplosis robiniae) (Csóka, 2006), a körtelevél-gubacsszúnyogra (Dasineura pyri Bouché) (Ambrus, 1994), az ibolya-gubacsszúnyogra (Dasineura affinis Kieffer) (Ambrus, 1994). Szívogatás hatására létrejöhet ún. pod-like galls típusú levélgubacs is, mely egy felfújt, megduzzadt jellegű gubacs, jellemző kártétele a lepényfa-gubacsszúnyognak (Thompson és mtsai., 1998). Az ázsiai rizs-gubacsszúnyog (Orseolia oryzae) lárvák kártételt a bokrosodó rizstőben okoznak ún. hollow cavity illetve tubular galls típusú gubacsok képzésével, mely tulajdonképpen a hajtások kiodvasítását jelenti (Rajamani és mtsai., 2004). A krizantémumgubacsszúnyog (Rhopalomyia longicauda Sato) kikelő lárvái képesek a száron, leveleken és akár a virágzatban is az ún. cone-shaped galls típusú elváltozásokat okozni (Sato és mtsai., 2009). A feketeribiszke-gubacsszúnyog (Dasineura tetensi Rübs.) kikelő lárvái a még ki sem bomlott levelek közé húzódnak és szívogatásuk nyomán a levelek és a hajtáscsúcs csavarodik, torzul (Hellqvist, 2001). Más bogyós gyümölcsökön, a fekete- és a vörös áfonyán élő áfonyagubacsszúnyog (Dasineura oxycoccana Johnson) mind a virág- mind pedig a hajtásrügyeket károsítja és boszorkányseprűsödést okoz (Lyrene és Payne, 1992). A káposzta-gubacsszúnyog (Contarinia nasturtii) kártétele nyomán is torzulnak a szívlevelek, a káposzta nem fejesedik. A lárvák a virágbimbók helyén is indukálják a gubacsképződést (Hillbur és mtsai., 2005). Ismerünk levélen aknaszerű kártételt is, mint például a puszpáng-gubacsszúnyog (Monarthropalpus flavus Schank) esetében, amelynek angol neve is az aknaszerű kártételre utal: boxwood leafminer (Brewer és mtsai., 1984). A fenyőtű-gubacsszúnyog (Thecodiplosis japonensis Uchida Inouye) lárvái Pinus fenyőfajok tűleveleiben élnek, táplálkoznak (Soné és 20

21 Takeda, 1983), ezzel lombszáradást okozva. A levélen kívül a lárvák okozhatnak kárt a hajtásokban is, azok tápanyagszállító részeit károsítva. A búza gubacsszúnyogai közül a nyerges-gubacsszúnyog (Haplodiplosis marginata) és a hesszeni légy (Mayetiola destructor) a hajtásban táplálkozik, és okoz gyenge növekedésű töveket (Ambrus, 1994). A zabon is találunk egy rokon fajt, a zab-gubacsszúnyogot (Mayetiola avenae Marchal), amely szintén a növény tövénél okoz hagymaszerű gubacsokat (Ambrus, 1994). A málnavesszőgubacsszúnyog (Resseliella theobaldi Barnes) lárvái a málna vesszőinek háncsrészét roncsolják, a kéreg pedig felreped, a vessző elhal (Labanowska és Cross, 2008), a málnagubacsszúnyog (Lasioptera rubi Schrank) kártétele nyomán ezzel szemben a vessző 1-3 cm hosszan, gömbölydeden megvastagodik, felreped, így csökkentve a tő termőképességét (Ambrus, 1994). A nád-gubacsszúnyog (Lasioptera hungarica Möhn) lárvái a nád ízközeiben akár háromszázan is kifejlődhetnek (Tewksbury és mtsai., 2002) és gomba kórokozóval fertőzik meg a szárat, amellyel szimbiózisban élnek. Ezekhez hasonlóan a fás részeket kedveli a szemzésrontó-gubacsszúnyog (Resseliella oculiperda Rübsaamen), amely oltványiskolákban okoz károkat: dísz- és gyümölcstermő növények szemzéseibe helyezik el tojásaikat, akár darabot is szemzésenként. A fejlődő lárvák a képződő kalluszszövetet szívogatják, ezzel okozzák a szempajzsok elszáradását (van Tol és mtsai., 2007). A generatív növényrészeken is változatos, sokszínű kártételekkel találkozhatunk. A fejlődő lárvák az intenzív anyagcserével rendelkező, növekedő magvakat vagy a termések egyes részeit szívogatják. A bimbókban fejlődve okoznak kárt például a sásliliom- (Contarinia quinquenotata Löw) (Halstead, 1995) és a lucerna bimbó-gubacsszúnyog (Contarinia medicaginis Kieffer) (Ambrus, 1994) lárvái. A táplálkozásuk nyomán a bimbók hólyagosan felfúvódhatnak, bennük a virágrészek torzulnak a bimbó ki sem nyílik, elszárad (Halstead, 1995). A duglászfenyő-gubacsszúnyog (Contarinia oregonensis Foote) lárvái a tobozok belsejében, a pikkelylevelekben okoznak gubacsokat (Hedlin, 1961). A vörös cédrus tobozgubacsszúnyog (Mayetiola thujae Hedlin) lárvái szintén a fejlődő tobozban védetten szívogatják a magokat, melynek következtében a magok csíraképtelenné válnak (Hedlin, 1959). A borsó-gubacsszúnyog (Contarinia pisi) károsíthatja a borsó növény bimbóit, a hajtáscsúcsait, amelyeken gubacsokat okoz, a hüvelyen kívülről nem látható a kártétel. Belül azonban akár 100 lárva is fejlődhet, lerontva ezzel a piaci értékét (Ambrus, 1994). A repcebecő-gubacsszúnyog (Dasineura brassicae) lárvái nagy számban fejlődnek a repce zöld becőiben, annak belső falát hámozgatva, mely korai maghullást okoz (Ahman, 1985). A 21

22 lucerna magjait, a lucerna csigát teszi értéktelenné a lucernahüvely-gubacsszúnyog (Asphondylia miki Wachtl) (Manninger, 1966). A búza kalászban a fejlődő szemeken károsítanak a narancssárga búza- (Sitodiplosis mosellana Géhin) és a citromsárga búzagubacsszúnyog (Contarinia tritici) lárvái. A cirok növényen a cirok-gubacsszúnyog (Contarinia sorghicola) nyűvei a bugában a magkezdeményeken szívogatnak és felélik a magot (Wani és mtsai., 1979; Harris, 1976). A fenti, a teljesség igénye nélküli felsorolásból kitűnik, hogy a gubacsszúnyogok számtalan kultúrában jelen vannak, és jelentős károkat képesek okozni. Kártételük jelentőségét növeli, hogy gyakran táplálkoznak generatív részeken termésveszteséget okozva, illetve a rövid rajzástartamuk és a lárvák rejtett, védett életmódja nehezíti az eredményes növényvédelmi kezeléseket A lepényfa-gubacsszúnyog A lepényfa-gubacsszúnyog elterjedése, általános leírása A lepényfa-gubacsszúnyog (Dasineura gleditchiae) Észak-Amerikában őshonos gubacsszúnyog faj (Diptera, Cecidomiiydae), amely a szintén ott őshonos tövises lepényfán (Gleditsia triacanthos) károsít (Thompson és mtsai., 1998). A Dasineura genus, figyelembe véve a fajok számát (288 faj) a legnagyobb palearktikus gubacsszúnyog nemzetség (Skuhravá, 1986). A lepényfa-gubacsszúnyogot feltehetően szaporítóanyaggal hurcolták be Európába (Skuhravá, 1986), erre utal első európai észlelése is. Először ugyanis 1980-ban Hollandiában (Nijveldt, 1980), a dísznövénytermesztés európai fellegvárában mutatták ki. Innen terjedt szét Európa további országaiba. Az Európai és Mediterráneumi Növényvédelmi Szervezet (EPPO) 2008-ban Párizsban tartott konferenciája összefoglalta a kártevő addig ismert európai elterjedését (1. ábra): Hollandiában már megtalálták (Nijveldt, 1980) Olaszország (Bolchi és Volonte, 1985) Nagy-Britannia (Halstead, 1992) Svájc, Valais kantonban (Fischer és Pivot, 1992) Magyarország, Budapest (Ripka, 1996) Szerbia (Simova-Tossic és Skuhravá, 1995) Lengyelország (Labanowski és Soika, 1997) Szlovákia, Nyitra közelében (Hrubík, 2007) Görögország, Thessaloniki közelében (Dini-Papanastasi és Skarmoutsos, 2001) Spanyolország, Madrid (del Estal és mtsai., 1998) 22

23 Luxemburg (Lambinon és mtsai., 2001) Németország, Drezda Csehország (Sefrová és Lastuvka, 2005) Ausztria, Burgenland (Steyrer és mtsai., 2002) Franciaország (Larousse, 2005) Törökország, Ankara, ez a faj első ázsiai említése (Bayram és mtsai., 2005) Dánia (Skuhravá és mtsai., 2006b) A kártevőt sikerült megtalálnom Svédországban is 2008-ban Malmö és környékén Skåne tartományban (Molnár és mtsai., 2009) (1. ábra). A lepényfa-gubacsszúnyog hazai gyors elterjedéséhez nagymértékben hozzájárult tápnövényének jó várostűrő tulajdonsága amely széles körben kedveltté tette útsorfásításra, parkokban szoliterként, sőt házi díszkertekben is egyre gyakrabban ültetik dekoratív lombszínű fajtáit. 1. ábra. A lepényfa-gubacsszúnyog eddig ismert előfordulása Európában (EPPO Reporting Service 2008 alapján), kiegészítve saját svédországi megfigyelésemmel. A fajnak hazai megfigyelések szerint évente több, átfedő (Ripka, 1996), saját megfigyeléseim szerint 3-4 nemzedéke van. A kártevő báb alakban telel a talajban, a károsított fa lombkoronája alatt, a talaj felső 3-5 cm-es rétegében. Tavasszal az imágók kelése egybeesik 23

24 a tápnövényének lombfakadásával. Először a hím gubacsszúnyogok jönnek elő (Thompson és mtsai., 1998) megelőzve pár órával a nőstényeket (proterandria). A lepényfa-gubacsszúnyog imágók hasonlóan a többi gubacsszúnyog fajhoz igen rövid életűek, így a rajzásuk precízen szinkronizált. Az előjövő nőstények felrepülnek kedvelt tojásrakó helyükre, a fiatal, még ki nem bomlott friss hajtáscsúcsokra, és itt veszik fel a csalogató testtartást, csalogatnak, azaz bocsátják ki a szexferomonjukat, majd párosodnak az érkező hímekkel. A nőstények feltehetően csak egyszer párosodnak életük során. Röviddel a párosodás után a nőstények lerakják tojásaikat a hajtások csúcsi részére a kibomló levelek felületére egyesével vagy csoportosan (lásd 1. melléklet). A tojások hosszúkásak, narancssárga opálos színűek. A lárvák kelése, ideális körülmények között 2 nap múlva kezdődik, a kikelő lárvák azonnal táplálkozni kezdenek és nyálukkal indukálják a gubacsok képződését a levéllemezből. A későbbiekben a lárvák az összetett levél levélkéiből, a főér mentén összehajolt gubacsokban, védetten fejlődnek. Egyegy gubacsban általában 3-5 lárva fejlődik, de előfordul 8-10 darab is (saját megfigyelés). Három lárvastádium után bábozódnak. A lárvák feje gyengén szklerotizált, a hasi oldalon található a szájnyílás, amelyből a mell-lapocska (spatula) ölthető ki (Ripka, 1996). A test anális végén négy pár rövid sertét viselő papilla található. Az első stádiumú lárvák hosszúkásak (kb. 0,5 mm hosszúak) fehér színűek és finoman szelvényezettek. A második stádiumú lárvák hát-hasi irányban lapítottak, hengeresek, színük fehértől narancssárgáig változik, a fejen apró, visszahúzható csápok vannak. A harmadik stádiumban méretbeli gyarapodás figyelhető meg így végül a bábozódás előtt a lárvák elérik a 2,5 mm-es hosszúságot. A tenyészidő folyamán a lárvák a gubacsokban bábozódnak, az áttelő nemzedék lárvái a gubacsokból a földre vetik magukat és a talajban bábozódnak. A bábok 2,5 mm-esek, hosszúkásak, szarvszerűek. Színük kezdetben fehéres, majd fokozatosan besötétednek egészen a vöröses barnáig. A bábállapot 4-6 napig tart. Imágóvá vedlés előtt közvetlenül, a bábok a gubacsban az összehajolt levéllemez nyílásához helyezkednek, részben kifurakodnak rajta. Az imágók előjövetele után a gubacs nyílásánál megfigyelhetők az üres bábingek. Az imágók körülbelül 2-3 mm nagyságúak, megfigyelések szerint nem táplálkoznak. Az imágók élettartama mindössze 1-2 nap, csak a nem párosodott nőstények élnek valamivel tovább, akár 3-4 napig. Nyáron a nemzedékek akár napra is követhetik egymást. Az imágókon ivari dimorfizmust figyelhetünk meg, a hímek potrohszelvényei szürkék, míg a 24

25 nőstényeké vöröses. Csápjuk morfológiája is ivaronként különbözik, erről bővebben lesz szó a A gubacsszúnyogok csápmorfológiája című fejezetben A lepényfa, mint tápnövény A lepényfa-gubacsszúnyog monofág faj, egyetlen tápnövénye az észak-amerikai tövises lepényfa (Gleditsia triacanthos). Ripka (1996) vizsgálta hazánkban gyűjteményes kertekben megtalálható lepényfa fajok fogékonyságát. A Kínából származó G. capica Desf. és az Irán környékéről származó G. ferox Lour. esetében nem talált kártételt. A Gleditsia genusz számtalan faja ismert szerte a világon (G. aquatica Marsh., G. japonica Miq., G. australis Forbes and Hemsley, G. microphylla Isely, G. macracantha Desf.), melyek fogékonyságáról nincsen irodalmi adat. A lepényfának a gubacsszúnyogon kívül kevés jelentős kártevője, kórokozója ismeretes. További kedvező tulajdonságai, úgymint jó törzsnevelő képessége, város-, szárazságtűrése, szennyezett talajokkal szembeni toleranciája és bizonyos szintű sótoleranciája, kedvelt park- és útsorfává tették. A lepényfa alapfaja, mint azt a tudományos neve is mutatja, tövisekkel rendelkezik, triacanthos = hármas töviseket jelent. Ezek az akár cm hosszú hármasan elágazó tövisek megjelennek nemcsak az ágakon, hanem a törzsön is. Ez a tulajdonsága nem kívánatos városi környezetben, hiszen komoly veszélyforrás lehet. Természetes szelekció során emeltek ki tövisnélküli egyedeket, amelyek aztán további vegetatív szaporítással megőrizték e tulajdonságukat. Ez a változat, a G. triacanthos Inermis, számos további fajta alapját képezte. Napjainkban az egyik legkedveltebb tövis nélküli fajta az aranysárga lombozatú, kis méretű laza koronát képező Sunburst fajta. Ez a fajta nem képez termést, így nem szemetel, amely szintén kedvező tulajdonság városi környezetben. Jó tulajdonságai mellett azonban meg kell említeni, hogy a gubacsszúnyog kártételére az alapfajnál fogékonyabb A lepényfa-gubacsszúnyog kártétele A lepényfa-gubacsszúnyog lárvái okozzák a kártételt szívogatásukkal, a lepényfa fiatal, még ki nem bomlott lombozatán. A fiatal kikelő lárvák hullámzó mozgással felkeresik a számukra ideális fiatal leveleket és megkezdik a táplálkozást. A szívogatás következménye, hogy a levél szövete a nyálban található növényi hormon analógok hatására rendellenesen növekedni kezd és a főér mentén a levéllemezek a színük felé összeborulnak létrehozva a 25

26 gömb alakú levélkegubacsokat (ún. pod like galls). A kialakult gubacsban a lárvák védetten fejlődnek tovább. Átlagosan 3-5 darab lárva fejlődik gubacsonként. A kialakult gubacsok kezdetben zöldek, majd idővel megvörösödnek, antociánosodnak. Ez az elszíneződés főleg a sárga lombú fajtákon (G. triacanthos Sunburst ) meglehetősen dekoratív színkombinációkat képes létrehozni. A lárvák kifejlődése után az imágók a levéllemez összehajlása mentén kifurakodott bábokból repülnek ki. A kirepülés után az üres bábingek megtalálhatók a gubacsok szélein. Később a kiürült gubacsok elszáradnak majd lehullanak. A levélnyelek még egy ideig tartják magukat ilyenkor, később azonban azok is elszáradnak és lehullanak, felkopaszítva ezzel a fiatal hajtásvégeket (Thompson és mtsai., 1998). Nyáron az egymást követő nemzedékek képesek megakadályozni a hajtások újralombosodását. Nyár végére a fák károsított hajtásai már messziről felismerhetőek, hiszen a kora tavaszi leveleket leszámítva csúcsukig felkopaszodhatnak, lerontva ezzel a fák esztétikai értékét és árnyékadó tulajdonságát A lepényfa-gubacsszúnyog előrejelzése, védekezési lehetőségek, természetes ellenségek Áttelelt bábokból az imágók tavaszi előjövetelét próbálták megfigyelni Parella és Thompson (1998) a tápnövény lombkoronája alá, a földre helyezett hengeres csapdákkal. Továbbá használtak a fák lombkoronájába kihelyezett, csalétek nélküli ragacsos csapdákat is, melyekbe rajzáskor a nagy számok törvénye alapján, véletlenül beleragadt imágókat figyelték. Rosetta és munkatársai (1998) véleménye szerint, az áttelelő nemzedék megfigyelése alapvetően fontos, ezért ők a lerakott tojásokat keresték napi rendszerességgel, kézi nagyítóval. A terepi vizsgálatok alapján időzítették a növényvédő szeres kezeléseket. Oregonban, közterületeken számtalan inszekticid engedélyezett a kártevő elleni védekezésben, például piretroidok, karbamátok, organofoszfátok (Rosetta és mtsai., 1998). A vizuális rajzásmegfigyelés mellett lehetőség van kalkulációra a várható rajzáskezdetet illetve az egyes fejlődési alakok megjelenésének várható időpontját illetően. A rovar fejlődéséhez szükséges hőösszeg számítása, az ún. growing degree-day (GDD) jól alkalmazható számos fás növény kártevőjénél (Shetlar és Herms, 1999). A lepényfagubacsszúnyognál irodalomból ugyan még nem ismert ennek a módszernek az alkalmazása, de egy másik gubacsszúnyog faj a puszpáng-gubacsszúnyog esetében a rajzás 26

27 előrejelzésében, jól használhatónak bizonyult a hőösszeg számítás módszere (d Eustachio és Raupp, 2001). Ehhez csak a napi minimum és maximum hőmérsékleti értéket kell mérnünk, melyek átlagából levonva az ún. biológiai nullpont hőmérsékletét, amit egyezményesen 10 Cban (50 F) állapítottak meg. Így megkapjuk a napi hasznos hőmennyiséget, mely a fejlődésben szerepet játszik. Vizsgálataikkal megállapították a puszpáng-gubacsszúnyog egyes fejlődési stádiumaihoz szükséges akkumulált, hasznos hőösszeget, például az első bábok 46 F-nél, az első imágók 352 F-nél jelentek meg. Ezek ismeretében már jól meghatározható a rajzás várható időpontja (d Eustachio és Raupp, 2001). A természetes ellenségek között a parazitoid Hymenoptera fajokat kell megemlíteni, legnagyobb számban a Pteromalidae családból (Parella és Thompson, 1998). Del Estal és munkatársai (1998) említenek egy általuk kinevelt és meghatározott parazitoid fajt a fent említett családból, nevezetesen a Mesopolobus mediterraneus Mayr (Hymenoptera, Pteromalidae) fürkészdarazsat. Bene és Landi (1993) beszámolt az Eupelmus urozonus Dalman, (Hymenoptera, Eupelmidae) parazitoid fürkészről, amit olaszországi vizsgálatik során D. gleditchiae bábokból határoztak meg. Ez a parazitoid faj fontos természetes ellensége nemcsak számos gubacsszúnyog fajnak, de olyan kártevőknek is mint a szelídgesztenye gubacsdarázs (Dryocosmus kuriphilus Yasumatsu) (Guo és mtsai., 1997). Mint ismeretes, léteznek ragadozó életmódú gubacsszúnyog fajok, amelyek esetenként fitofág gubacsszúnyogok lárváival táplálkoznak. Erre jó példa a Barnes (1944) által, málnavesszőgubacsszúnyoggal fertőzött málnavesszőkről kinevelt, Lestodiplosis nemzetségbe tartozó ragadozó gubacsszúnyog. Ezen kívül sok pókfaj, bogár, ragadozó poloska és a kis testű madarak is előszeretettel táplálkoznak a lárvákkal. Saját, svédországi megfigyeléseim is alátámasztják a kisebb énekes madarak például széncinegék, verebek lárvagyérítő tevékenységét. A gubacsgyűjtések alkalmával helyenként teljesen kicsipkedték a gubacsok falát és eltávolították a lárvákat, mérsékelve ezzel a következő rajzás egyedsűrűségét A rovarok kémiai kommunikációja A rovarvilágban a kémiai ingerekkel történő kommunikációnak óriási szerepe van az egyéb kommunikációs csatornák (vizuális, akusztikus) mellett. Ez az információcsere egyaránt 27

28 megtalálható mind a szárazföldön, mint a vízben élő növényi és állati szervezeteknél (Birch, 1974). A kémiai kommunikációban résztvevő anyagok szerepet játszanak az egyes egyedek életében illetve a populációk szintjén is. A kémiai kommunikációval szemben az akusztikus és a vizuális kommunikációs csatornák már alaposabban ismertek és régóta vizsgálat tárgyát képezik. A kémiai érzékszervekkel történő kommunikáció talán a részt vevő anyagok szerkezeti sokszínűsége, a receptorok felépítése, működése, a mögöttes biokémiai folyamatok összetettsége miatt, csupán az elmúlt évtizedek kutatómunkáinak eredményei nyomán váltak ismertté, és még a mai napig sok a megválaszolatlan kérdés e területen. A kémiai kommunikációban részt vevő anyagokat célszerű szétválasztani kizárólag a kémiai kommunikációban szerepet játszó anyagokra, az ún. szemiokemikáliákra vagy infokemikáliákra (Law és Regnier, 1971) és a viselkedést szabályzó anyagokra (Shorey, 1977). A szemiokemikáliákhoz tartoznak a fajok közötti kommunikációt szolgáló ún. allelokemikáliák (Whittaker és Feeny, 1971) (2.ábra), és a fajon belüli információcserét szolgáló feromonok (Karlson és Lüscher, 1959). 2. ábra. A kémiai kommunikációban részt vevő anyagok csoportosítása A feromonok a fajon belüli kommunikációért felelős vegyületek, amelyek érzékelése esetén a faj másik egyede fajra jellemző mozgással válaszol. Az elnevezést először Karlson és Lüscher (1959) használta. Definíciójuk szerint: A feromonok olyan anyagok, amelyeket az illető állatfaj egyik egyede bocsát ki és a faj másik, felfogó egyedéből valamilyen specifikus választ vált ki. A kiváltott válaszreakció típusa szerint a feromonokat tovább osztályozhatjuk, 28

29 a gyors viselkedési választ kiváltó ún. releaser vagy kiváltó, illetve a lassú fiziológiás hatást eredményező, ún. primer vagy áthangoló feromonokra (Wilson, 1963). Az 2. ábrán látható kiváltó feromonok közül a továbbiakban csak az ivari, azaz szexferomonokkal foglalkozom. A rovarok szexferomonjai illékony vegyületek, a levegőben terjednek, így természetesen terjedésüket a légmozgások erősen befolyásolják. Hatásukat meglehetősen kis (piko- illetve nanogrammnyi) mennyiségben is képesek kifejteni, gyakran nagyobb távolságból is. A hatás kiváltásáért olykor egy vegyület felelős, más esetekben több komponens megfelelő arányú, együttes jelenléte szükséges. Több komponens esetén, a komponensek külön-külön nem elégségesek a hatás kiváltásáért az összes komponens felelős, és a komponensek együttesét nevezzük feromonnak (Shorey, 1977). Mind a feromontermelő ivar feromontermelésének, mind a kibocsátott feromon felfogásának, érzékelésének az ellentétes ivar esetében is napszaki ritmusa van, mely hormonális szabályozás alatt áll (Raina és Menn, 1987). A szigorú szabályozásnak köszönhetően ezek a folyamatok csak bizonyos meghatározott napszakban zajlanak, amely a faj számára több előnyt is nyújt. Ennek révén csökkenthető a feromontermelő-, és kibocsátó, valamint a feromon érzékelő-, kereső magatartás energiaigénye, továbbá csökkenthető a predátorokkal történő találkozás esélye. A hasonló feromon vegyületeket használó fajok esetén, a napi ritmus lehetőséget kínál a reproduktív izolációra (Haynes és Birch, 1984, 1986), mindezen tényezők együttesen segítik a fajon belüli kémiai kommunikáció hatékonyságát Kémiai kommunikáció a gubacsszúnyogoknál Tápnövény keresés növényi illatanyagok segítségével A gubacsszúnyogokra általánosan jellemző az efemer, rövid élettartam. Fajtól függően egy-öt nap alatt a hímeknek fel kell kutatniuk fajuk nőstényeit, megtermékenyíteni azokat, majd a nőstényeknek tojásrakásra alkalmas tápnövényt kell keresniük és lerakni tojásaikat (Kanno és Harris, 2000; Birkett és mtsai., 2004, Harris és Foster, 1999), ez által gondoskodva az utódaikról. Ezek a tevékenységek a gubacsszúnyogoknál tehát viharos gyorsasággal zajlanak. Az áttelelő bábból előjövő imágóknak fel kell keresniük a tápnövényüket. Belátható, hogy ezeknél a parányoknál is elengedhetetlenül fontos szerepet játszik a kémiai kommunikáció, legyen az a hímek párkereső magatartása vagy a nőstények tápnövény kereső 29

30 viselkedése (Foster és Harris, 1997). A gubacsszúnyogok családjából napjainkig kevés irodalom ismeretes a tápnövény és gubacsszúnyog kártevője viszonyairól. A fajok többsége egyetlen tápnövényre specializálódott vagy szűk tápnövénykörrel rendelkezik, ami arra utal, hogy igen fejlett a gubacsszúnyog nőstények tápnövény kereső magatartása, melyben növényi illatanyagok segítik őket (Crook és Mordue, 1999). Például a repcebecő-gubacsszúnyog a keresztesvirágúak (Brassicaceae) családjának becőterméseire specializálódott (Petterson, 1976; Murchie és mtsai., 1997). Szintetikus növényi illatanyagok közül a fenil- és az allil-izotiocianát bizonyult attraktánsnak a repcebecő-gubacsszúnyog nőstényeire (Murchie és mtsai., 1997; Lerin, 1984). Az almalevél-gubacsszúnyognál szélcsatornás vizsgálatokkal kimutatták, hogy a nőstény képes különbséget tenni az alma és a körte levele között. A nőstény széllel szemben repülve az almalevelet választotta és arra szállt le (Galanihe és Harris, 1997). Anfora és munkatársai (2005a, 2005b) figyelték meg elektroantennográfiás vizsgálataikban, hogy az almalevél-gubacsszúnyog nőstényének preparált csápja válaszolt fiatal almalevélből meghatározott illatanyagokra, mint a (Z)-3- hexen-1-ol és a hexanol. Hasonlóképpen a narancssárga búza-gubacsszúnyog nőstényeire is vonzó hatással volt a tápnövénye kalászából készült kivonat és annak számos meghatározott szintetikus illatagyag komponense (Birkett és mtsai., 2004). A meghatározott komponensek között szerepelt az acetofenon, (Z)-3-hexenyl-acetát, 3-carene, 2-tridecanone, 2-ethyl-1- hexanol és az 1-octen-3-ol. A málnavessző-gubacsszúnyog esetében a nőstények számára attraktívnak bizonyult a sebzett málnavesszőből készített kivonat. A párosodott nőstények csápján nagyobb csápválaszt váltott ki a friss málna hajtásokból készített kivonat, szemben az öreg málnavesszők kivonatával (Gordon és Williamson, 1991). A gázkromatográfiás elemzés tíz, a fiatal málnavessző által termelt illatanyag komponenst mutatott ki, melyek közül háromra a 6-methyl-5-hepten-2-ol, myrtenal és myrtenolra a párosodott nőstény csápja elektroantennográfiásan válaszolt is. A feketeribiszke-gubacsszúnyognál (Crook, 1998) és a hesszeni légynél (Harris és Rose, 1989) jegyezték föl, hogy a nőstények csápjukat mozgatva keresgélnek a tápnövény felületén tojásrakás előtt. A feketeribiszke-gubacsszúnyog nőstényei, a rezisztens és fogékony feketeribiszke fajták között, azonban mégsem az illatanyag-mintázat eltérése alapján választanak, hanem vélhetően tapintási ingerek alapján (Crook és mtsai., 2001). 30

31 A gubacsszúnyogok szexferomonja A kétszárnyúak (Diptera) rendjében a hímek távhatású szexferomonra történő orientációját mind az alacsonyabb rendű legyeknél, mind a fejlettebb legyeknél már az as években bizonyították Blomquist és munkatársai (1987). Az Y-olfaktométeres vizsgálatokban megfigyelték, hogy a hímek a légárammal szembe repülve (ún. upwind flight) a behelyezett nőstényhez repülnek (Kostelc és mtsai., 1980; Alberts és mtsai., 1981; Williams és Martin, 1986). A Cyclorrhapha alrendben figyelték meg, hogy a nőstények által kibocsátott feromon ún. rövid távú feromon (Shorey és Bartell, 1970), mely a hímek párosodási magatartására hat (Carlson és mtsai., 1984), illetve növeli a kopulációs aktivitást (Mackley és Broce, 1981). A levegőben lévő, illékony anyagok érzékelése a gubacsszúnyog fajok számára is alapvetően fontos, mind az intraspecifikus kommunikációban (McKay és Hatchett, 1984; Williams és Martin, 1986; Gries és mtsai., 2000), mind pedig az előzőekben már vázolt megfelelő tojásrakási hely megtalálásában (Kanno és Harris, 2000; Birkett és mtsai., 2004). A gubacsszúnyogok családjában (Cecidomyiidae) az első megfigyelések a szemiokemikáliák használatára Cartwright (1922) nevéhez fűződnek. A hesszeni légynél végzett első megfigyelései alapján, miszerint a nőstény képes több méter távolságból magához csalogatni a hímeket, kísérleteket állított be. Frissen kikelt nőstényeket helyezett kis ketrecekbe, amelyek kívülről ragacsos felületűek voltak. Ezt követően négy napig figyelte a ragacsba ragadt hímek számát. Átlagosan 145 darabot fogott ketrecenként. Második kísérletében a frissen kikelt és ketrecbe helyezett nőstényektől távolodva ragacslapokat állított fel 0,3 métertől egészen 4 méter távolságra. A pár napos kísérlettel megfigyelte a hímek emelkedő számát a nőstényes csapda felé haladva (Cartwright, 1922). A repcebecőgubacsszúnyognál végzett korai megfigyelések alapján Sylvén (1970), később Petterson (1976) arra következtetett, hogy szemiokemikáliák használatával megoldható lehet a védekezés e faj ellen. Csak később Williams és Martin (1986) fogalmazta meg, hogy a faj termelhet szexferomont és feltehetőleg a nőstény tojócsővénél lévő mirigyben. Garthwaite és munkatársai (1986) több gubacsszúnyog fajnál is, köztük a feketeribiszke-gubacsszúnyognál (D. tetensi) megfigyelték, hogy a hímek reagálnak a nőstények csalogató ún. calling magatartására, ami a feromonkibocsátást jelzi. 31

32 A duglászfenyő toboz-gubacsszúnyognál Miller és Borden (1984) tudtak kimutatni ún. tápnövény-jelölő feromont. Az 1990-es évek végéig a gubacsszúnyogok között csak a hesszeni légy (Foster és mtsai., 1991) és a borsó-gubacsszúnyog (Hillbur és mtsai., 1999) szexferomon komponenseit sikerült azonosítani a család fajgazdagsága ellenére (1. táblázat). 32

33 1. táblázat. Összefoglaló táblázat a gubacsszúnyogok családjában napjainkig elvégzett kémiai kommunikációs vizsgálatokról és szexferomon meghatározásokról Gubacsszúnyog faj Szűz nőstényes Laboratóriumi Feromon csapdázás vizsgálatok meghatározás McKay és Hatchett Foster és mtsai. Hesszeni légy (1984), (1991), Cartwright (1922) Mayetiola destructor Say Harris és Foster Andersson és mtsai. (1991) (2009) Feketeribizli-gubacsszúnyog Garthwaite és mtsai. Hall és mtsai. (2009) Hall és mtsai. (2009) Dasineura tetensi Rübs. Alma-gubacsszúnyog Dasineura mali Kieffer Duglászfenyő tobozgubacsszúnyog Contarinia oregonensis Foote Borsó-gubacsszúnyog Contarinia pisi Winn Cirok-gubacsszúnyog Contarinia sorghicola Coq. Narancssárga búzagubacsszúnyog Sitodiplosis mosellana Géhin Krizantémum-gubacsszúnyog Rhopalomyia longicauda Sato Ragadozó gubacsszúnyog Aphidoletes aphidimyza Rondani Káposzta-gubacsszúnyog Contarinia nasturtii Kieffer Körtelevél-gubacsszúnyog Dasineura pyri Bouché Vörös cédrus tobozgubacsszúnyog Mayetiola thujae Hedlin Ázsiai rizs-gubacsszúnyog Orseolia oryzae Wood Repcebecő-gubacsszúnyog Dasineura brassicae Winn Fenyő-gubacsszúnyog Thecodiplosis japonensis Uchida et Inouye Puszpáng-gubacsszúnyog Monarthropalpus flavus Schr Málnavessző-gubacsszúnyog Resseliella theobaldi Barnes (1986) Harris és mtsai. (1996) Miller és Borden (1984) Wall és mtsai. (1985) Sharma és mtsai. (1992); Sharma és Vidyashagar (1992) Pivnick és Labbé (1992), Gries és mtsai. (2000) Harris és mtsai. (1996) Miller és Borden (1984) Hillbur és Löftqvist (1996) - Pivnick (1993) Suckling és mtsai. (2007) Gries és mtsai. (2002) Hillbur és mtsai. (1999) Riolo és mtsai. (2006) Gries és mtsai. (2000) - - Liu és mtsai. (2009) - Van Lenteren és mtsai. (2002) - Hillbur (2004) Choi és mtsai. (2004) Hillbur és mtsai. (2005) Amarawardana és mtsai. (2006) Gries és mtsai. (2005) Sain és Kalode (1985) - - Williams és Walton (1990) Williams és Martin (1986) Lee és mtsai. (1997) Soné (1985) - Vétek és mtsai. (2010) Saját, nem publikált eredmények - - Hall és mtsai. (2009)

34 A 2000-es években már több kutatócsoport is foglakozott a család fajaival. Élénk kutatás tárgyát képezte például a biológiai védekezésben felhasználható ragadozó, levéltetűfogyasztó gubacsszúnyog (A. aphidimyza), melynek párzási viselkedéséről és feltételezett feromonmirigyéről van Lenteren és munkatársai (2002) cikkében olvashatunk. Ennél a fajnál sikerült először bizonyítani a zoofág gubacsszúnyogok esetében a szexferomon meglétét majd sikerült a szerkezet-meghatározás és a szintézis is (Choi és mtsai., 2004). A faj további érdekességekkel is bír. A párzáshoz egy meglehetősen veszélyes környezetet választanak, ugyanis a nőstények pókhálókra szállva csalogatják magukhoz a hímeket, itt történik a párosodás is. A szúnyogok maguk annyira könnyűek és légiesen mozognak, hogy a pók nem szerez tudomást róluk, ellentétben az esetlegesen a szúnyogokra támadó ragadozókról. Maga a párosodás is meglehetősen különös, hiszen a nőstény és a hím szemtől-szembe (ún. face to face position) helyezkednek el, majd a hím csipeszszerű fogó párzókészülékével magához ragadja a nőstényt és úgy kopulálnak A szexferomon termelés helye A szexferomon termelés pontos helye és szöveti felépítése a gubacsszúnyogoknál csak az 1990-es évek vége óta ismeretes. Sok korábbi vizsgálat foglalkozott a feltételezett feromonmirigy helyzetével és szöveti felépítésével. A feromontermelés és kibocsátás helyéről gubacsszúnyogoknál elsőként Solinas és Isidoro (1991), majd Isidoro és munkatársai (1992) írnak három fajnál (D. brassicae, M. destructor, C. sorghicola) vizsgálva. A feromontermelésért és tárolásért felelős mirigy Harris és Foster (1999) szerint a potroh utolsó szelvényeiben található számos fajnál. Van Lenteren és munkatársai 2002-ben megjelent cikkében behatóan foglalkozik a ragadozó, levéltetű fogyasztó gubacsszúnyog (A. aphidimyza) feltételezett feromonmirigyével. A feromonmirigy a potroh utolsó három (8., 9., 10.) szelvényéből alakuló, teleszkópos tojócsőben található. A potroh 8. szelvénye hengeres alakú és átmérője kisebb, mint a 7. szelvényé. A 9. szelvény ugyanolyan hosszú, mint a 8. szelvény, amelybe ki és be tud csúszni a tojócső kitolása illetve behúzásakor (van Lenteren és mtsai., 2002). A 8. és 9. szelvényt összekötő interszegmentális membrán, az összekötött szelvényekkel megegyező hosszúságú (3. ábra). A membránban a mirigy terület egyrétegű, változatos alakú epidermális sejtekből áll és gyűrű alakban helyezkedik el, de a hasi oldalon 34

35 kifejezettebben. Az interszegmentális membrán sejthártyája összekapcsolódik az epidermális eredetű miriggyel, de nem található egyértelmű porózusság, mely segítene a külvilágba juttatni a termelt feromont. A szekréciós sejtek Solinas és Isidoro (1991) véleménye szerint is a 8-adik és 9-edik szelvény interszegmentális membránjának epidermiszében foglalnak helyet a cirokgubacsszúnyognál. Megerősítik ezt a megfigyelést Isidoro és munkatársai (1992) vizsgálatai a repcebecő-gubacsszúnyog esetében is. Vizsgálatai szerint a frissen kelt nőstényekben az egyrétegű epitéliális sejtek, hengeres-szögletes változatos alakúak és jól fejlett a sejtmagjuk, melyet körülvesz a fejlett durva felszínű endoplazmatikus retikulum, a citoplazmájukban megtalálhatóak még a kiterjedt sima felszínű endoplazmatikus retikulum, a jól fejlett mitokondrium és számtalan elektrodenz szekréciós vezikulum. A vizsgált sejtek ultrastrukturális szerkezete tipikus feromontermelő mirigyre utal, melyek csak a szűz nőstény egyedekben hipertrófikusak, és párzás után elsorvadnak (Solinas és Isidoro, 1991). Hasonló ultrastrukturális szerkezetű a lepkék (Lepidoptera) rendjében a feromontermelő mirigy, amely Percy és Weatherstone (1974) szerint egyértelműen karakterizálja a sejtek szekréciós tevékenységét. Az egynapos, de még nem párosodott nőstény gubacsszúnyog és egy frissen kikelt nőstény esetében a mirigysejtek ultrastrukturális szerkezete között nincsen különbség. Ellenben az egynapos és már párosodott nősténynél megvizsgálva az 8-9. szelvény interszegmentális membránját, benne a feromonmirigy már elsorvadt (Isidoro és mtsai., 1992) (4. ábra). Noirot és Quennedey (1991) besorolása szerint ezek az epitéliális mirigysejtek az ún. 1. típusba tartoznak, melyekre jellemző, hogy nem differenciálódtak működési egységgé, és a szekrétumok a sejthártyán át kerülnek a külvilágba, melyben a pórus csatornák és a velük összefüggésben álló epikutikuláris filamentek segítenek. 35

36 3. ábra. Repcebecő-gubacsszúnyog (Dasineura brassicae Winn): 1. nőstény egész potroha a részben kitolt tojócsővel (OV), jól látható a 8. és 9. potrohszelvény; 2. a teljesen kitolt tojócső alapi része, hasi nézetben, látható az interszegmentális membrán (IM) ahol a feromonmirigyekhelyezkednek el; 3. a teljesen kitolt tojócső oldalsó nézetben az interszegmentális membránnal; 4. a kitolt tojócső elektronmikroszkópiás felvétele a 8-9. potrohszelvénnyel és az interszegmentális hártya (Isidro és mtsai., 1992 nyomán) 36

37 4. ábra Frissen kikelt nőstény repcebecőgubacsszúnyog részben kitolt tojócsővének keresztmetszete a 8. szelvénynél (Isidoro és mtsai., 1992 nyomán) PG feromon mirigy 8 és 9 8. és 9. szelvény ON tojócső idegek MU potroh izmok VA - vagina IM interszegmentális membrán A mirigy epitélium vastagsága eltérő az eddig vizsgált gubacsszúnyogok esetében, úgy tűnik, hogy ez összefüggésben van a tojócső alakjával és méretével. A megnyúlt, hosszúkás tojócsövű cirok- és repcebecő-gubacsszúnyog esetében a mirigy epitélium réteg nagyon vékony, míg a relatív rövid tojócsövű hesszeni légynél jóval vastagabb (van Lenteren és mtsai., 2002) Csalogató viselkedés és annak napszaki ritmusa gubacsszúnyogoknál A nőstény gubacsszúnyogoknál a csalogató viselkedést (ún. calling behaviour) számos fajnál megfigyelték, vizsgálták már. A repcebecő-gubacsszúnyognál Isidoro és munkatársai (1992) figyelték meg, hogy a szűz nőstény csalogatás közben sétál vagy egy helyben áll és jól láthatóan kitolja a tojócsővét, mely a feromon kibocsátást jelzi. A meg nem termékenyített nőstények életük végéig képesek csalogatni, kibocsátani a szexferomont - ha nem történik párosodás. Ha a párosodás megtörtént, a nőstény teljesen visszahúzza a tojócsövét és a továbbiakban többet már nem csalogat, hiszen csak egyszer párosodnak életük során. A párosodás 5-20 másodpercig tartott a már említett potroh a potrohhoz pozícióban (ún. tail to tail). A kitolt tojócső és a feromonkibocsátás kapcsolatát Williams és Martin (1986) vizsgálta 37

38 korábban ennél a fajnál. Ők a kitolt tojócsővet izolálták és extrahálták hexánnal, ami szélcsatornás biotesztekben szűrőpapír diszpenzeren aktívnak bizonyult és csalogatta a hímeket, ellentétben a levágott tojócsövű nőstényekből készült extraktummal. A feromon kibocsátása és a csalogató magatartás, azaz a tojócső extenziója tehát összefüggenek egymással. Ez a megfeszített testhelyzet, izomkontrakció lehetővé teszi a teleszkópszerű tojócső kitolását, így a nyugalmi állapotban, visszahúzott helyzetben lévő szelvények között felgyűrődőtt feromonmirigy, kitolva a kutikulán át érintkezésbe kerülhet a levegővel, ami segíti a feromon elpárolgását a szabadba. Hasonló eredményt publikáltak ezt megelőzően a duglászfenyő toboz-gubacsszúnyognál Miller és Borden (1984). Kísérleteik során bizonyították, hogy a nőstény tojócsőből készült kivonatok bioteszetekben nagymértékben csalogatták a fajtárs hímeket. Az alma-gubacsszúnyog frissen kelt nőstényei is a fitofág gubacsszúnyogokra jellemző (Gagné, 1989, 1994) csalogató magatartást mutatják: a nőstények a bábból való előjövetel után kb. 15 percig még nem csalogatnak, csak egy helyben várakoznak. Majd ezután sétálnak és teljesen vagy részben kitolják a tojócsővüket, ha egy hím megközelíti őket, megállnak majd hamarosan kopulálnak is vele (Harris és Foster, 1999). A kopuláció a hesseni légynél és más, vizsgált gubacsszúnyog fajoknál például a levéltetűfogyasztó gubacsszúnyognál (van Lenteren és mtsai., 2002), repcebecő-gubacsszúnyognál is általában másodpercig tart, de például a narancssárga búza-gubacsszúnyog esetében eltarthat akár 4 percig is (Harris és Foster, 1999). A gubacsszúnyogoknál általánosan megfigyelt, hogy a hímek röviddel a nőstények előtt kezdenek kikelni a bábokból (proterandria) (Gagné, 1989). A cirok-gubacsszúnyognál figyelték meg, hogy az imágók kelése röviddel napkelte után (7 órától) kezdődik. Tömegesen 8:45 és 9:30 között jelentek meg mind a hímek, mind a nőstények (Summers, 1975). Délután 14:30 után már nem figyeltek meg imágókelést. A hímeknél a keléshez szükséges hőküszöbérték C, a nőstényeknél ez magasabb, C. Ez a hőküszöb különbség felelős a hímek nőstényelőző (proterandria) keléséért a cirok-gubacsszúnyognál. A hesseni légynél egészen másképpen alakul a napszakosság. A legtöbb hím késő éjjel jelenik meg, a tömeges nősténykelés előtt (Bergh és mtsai., 1990). A hímek kisebb számban, de megjelennek napkelte után is, a nőstények tömeges kelésekor. Heath és munkatársai (2005) valamint Suckling és munkatársai (2007) Kanadában almalevél-gubacsszúnyognál végzett megfigyelései szerint a hímek kevéssel a nőstények előtt jelennek meg. Legnagyobb számban mind a hímek, mind a nőstények reggel 8 és délután 13 óra között jelentek meg. Egy esti (8 38

39 óra körüli) kisebb imágókelési csúcsot is megfigyeltek. Ez részben ellentmond Harris és Foster (1999) eredményeinek, akik új-zélandi megfigyeléseik során déli 12 óra után, nem tapasztaltak imágókelést alma-gubacsszúnyognál. Az ázsiai rizs-gubacsszúnyog hímjei is megelőzik kelésükkel a fajtárs nőstényeket. Megfigyelések szerint óra között a hímek, míg valamivel később óra között a nőstények kelnek tömegesen és azonnal párosodnak (Rajamani, 2004). A faj trópusi elterjedési területe és a folyamatos rizstermesztés lehetővé teszi, hogy a rizs-gubacsszúnyog egész évben kifejlődhessen. Az imágók élettartamát Sain (1988) kutatta Indiában, szabadföldi és laboratóriumi tenyésztéses vizsgálatokkal. Szerinte a téli hónapok során a hőmérséklettől függően lelassul a fejlődés, és a nyári napról napra nő a teljes fejlődési idő és természetesen vele együtt az imágók élettartama is megnő. A puszpáng-gubacsszúnyog (M. flavus) rajzásának napi ritmusát illetően az irodalomban ellentétes megfigyeléseket találunk. Napnyugtakor tömegesen megjelenő imágókról számol be Balás és Sáringer (1982) és Martinovich (1975). Saját megfigyeléseim szerint ez a faj, ezzel ellentétben, napkeltekor rajzik tömegesen. Szabadföldi és laboratóriumi rajzásmegfigyeléseim szerint a hímek már hajnali fél 5-5 órakor tömegesen repkednek a puszpánghajtások körül. A nőstények valamivel később kezdenek el tömegesen kikelni, de még a korai órákban (6-7 óra körül). A kikelt nőstények kezdetben egy helyben várakoznak, ekkor még nem csalogatnak. Később aztán kimerészkednek a levelekre és ott kezdik meg a csalogatást és párosodnak a hímekkel (saját, nem publikált megfigyelések). Ezen megfigyeléseimmel jól egybevágnak Vétek és munkatársai (2010) szabadföldi szűz nőstényes rajzásmegfigyelései. Csapdázásaikat csak reggel fél 7-kor kezdték ugyan, de ettől az időponttól növekvő egyedszámú csapdafogásokat tapasztaltak, legnagyobb egyedszámban 8 és 10 óra között Szexferomon kémiai szerkezete a gubacsszúnyogok családjában A gubacsszúnyogok családjában napjainkig meghatározott szexferomon vegyületek nagyfokú konzervatízmust mutatnak. Az alapváz elágazás nélküli, telített vagy telítetlen páratlan számú 11, 13 vagy 17 szénatomból áll (2. táblázat). A páratlan számú szénatomból felépülő szénváz jellemzően egy oxigén tartalmú funkciós csoportot hordoz a második szénatomon. Amarawardana (2009) összesítése alapján általánosan elmondható bár természetesen vannak kivételek hogy az eddig azonosított gubacsszúnyog feromon 39

40 molekuláknak van legalább egy királis központja, tehát tükörképi izomerekről, enantiomerekről beszélhetünk. Az egy királis központú feromon molekulával rendelkező fajoknál, az eddigi tapasztalatok alapján elmondható, hogy a feromon enantiomer mellett az antipod nem mutatott biológiai aktivitást. A racém elegy így, megfelelő vonzóképességgel bír a faj hímjeinek csalogatására. Ellentétben, ha a feromon két királis központtal rendelkezik az enantiomerek között legalább az egyik inhibitor hatással bír, így a racém elegy nem vonzza a faj hímjeit. Tizenegy szénatomszámú (undekán) vegyületeket azonosítottak például a káposztagubacsszúnyognál (C. naturtii): 2S9S- és 2S10S-diacetoxi-undekán (Hillbur és mtsai., 2005). Tizenhárom szénatomszámú vegyületek (tridekán) alkotják például a borsó-gubacsszúnyog (C. pisi) szexferomon komponenseit: 2S11S-, 2S12S-diacetoxi-tridekán és a 2-acetoxi-tridekán (Hillbur és mtsai., 1999). A vörös cédrus toboz-gubacsszúnyognál (M. thujae) azonosított feromon komponensek alapváza tizenhét szénatomszámú (heptadekán): 2S12S-, 2S13S-, 2S14S-diacetoxi-heptadekán (Gries és mtsai., 2005). A szexferomon jellemző funkciós csoportjai a gubacsszúnyogok családjában az acetoxi-csoport (CH 3 -C(=O)-O-), a keto-csoport (-C=O), a hidroxi-csoport (-OH), néhány fajnál megtalálható a butiroxi-csoport is, például az alma- (Suckling és mtsai., 2007) vagy a krizantémum-gubacsszúnyognál (Liu, 2009) (4.táblázat). A már említett borsó-gubacsszúnyog esetében a két acetoxi-csoportot tartalmazó diacetoxi-tridekánok mellett azonosítottak egy, egyetlen acetoxi-csoportot tartalmazó komponenst, a 2-acetoxitridekánt is (Hillbur, 2001). A biológiai védekezésben szerepet játszó ragadozó-gubacsszúnyog szexferomonjának főkomponense is két acetoxi-csoportot tartalmaz, a tizenhárom szénatomszámú láncon, ez a vegyület a (2R7S)-diacetoxitridekán (Choi és mtsai., 2004). A málnavessző-gubacsszúnyognál (R. theobaldi) tizenegy szénatomszám hosszú főkomponens egyaránt tartalmaz acetoxi- és keto-csoportot, ez a molekula az (S)-2-acetoxiundekanon (Hall és mtsai., 2009). Ennél a fajnál a kisebb ún. minor komponensként azonosított 2-undekanon keto-csoportot, a 2-acetoxiundekán acetoxi- csoportot, míg a 2- undekanol hidroxil-csoportot tartalmaz. 40

41 2. táblázat. Néhány telített szénláncú, acetoxi-csoportot tartalmazó gubacsszúnyog szexferomon és szerkezeti képletük Undekán (11 C-atom) Tridekán (13 C-atom) Heptadekán (17 C-atom) Contarinia nasturtii Contarinia pisi Mayetiola thujae 2S9S-diacetoxi-undekán 2S11S-diacetoxi-tridekán 2S12S-diacetoxi-heptadekán 2S10S-diacetoxi-undekán 2S12S-diacetoxi-tridekán 2S13S-diacetoxi-heptadekán 2-acetoxi-tridekán 2S14S-diacetoxi-heptadekán A feromonkomponensek a gubacsszúnyogok családjában lehetnek telített molekulák, de találunk telítetlen kettős kötéseket tartalmazó komponenseket is. A duglászfenyő tobozgubacsszúnyog (C. oregonensis) nőstények által kibocsátott komponens például két kettős kötést tartalmaz Z,Z konfigurációban a 4 és 7 szénatomnál (2S-Z4Z7-13Ac) (Gries és mtsai., 2002). Ez a molekula nagyfokú hasonlóságot mutat a hesseni légy 2009-ben meghatározott további feromon komponenseivel, nevezetesen a 2S-Z8E10-13Ac és a 2S-E8E10-13Ac-vel (Andersson és mtsai., 2009) (3. táblázat). 41

42 3. táblázat. Néhány telítetlen szénláncú, acetoxi-csoportot tartalmazó, tridecén gubacsszúnyog szexferomon vegyület és szerkezeti képlete. A hesszeni légynél (M. destructor) a teljesség miatt szerepel a telített 2S-acetoxi-tridekán is. Contarinia oregonensis Tridecén (13 C-atom) Mayetiola destructor 2S-Z4Z7-acetoxi-tridekén 2S-E8E10-acetoxi-tridekén 2S-E10-acetoxi-tridekén 2S-Z8E10-acetoxi-tridekén 2S-E10-tridekén-alkohol 2S-acetoxi-tridekán 4. táblázat. Telítetlen szénláncú, heptadecén gubacsszúnyog szexferomon vegyületek és szerkezeti képletük Heptadecén (17 C-atom) Rhopalomyia longicauda Dasineura mali 2S-2-butyroxi-Z8-heptadecén 13-acetoxi-Z8-17-2Kt 2S-Z8-heptadecén-2-ol 42

43 3.5. A szexferomon érzékelés periférikus szerve: a csáp A rovarvilágban a külső környezeti ingerek periférikus érzékelésének fő szerve a csáp, legyen az mechanikai vagy kémiai inger. A csápon található érzőszőrök beidegződésük révén képesek a környezeti ingereket a szenzillák alatti sejttestbe juttatni. A rovaroknál a szagló receptor egy bipoláris neuron, melynek denritjén ülnek a receptorok, míg az axonja a szaglóidegen át az azonos oldali szaglólebenybe fut be. A szaglólebenyben lévő glomerulusokba befutó ingerületek aztán projekciós neuronok segítségével jutnak el a gombatestbe illetve az oldalsó előagyba (lateral protocerebrum). A gubacsszúnyogok családjában a felsőbb agyi területek kutatása az érzékelésben napjainkban kezd fellendülni a feromonmeghatározások és az intracelluláris felvételezési technikák (intracellular recording) finomodása kapcsán A rovar csáp felépítése és működése A rovarvilágban az illatanyagok érzékelése (táplálék, tojásrakó hely, ivari illatok), a szaglás sokkal hangsúlyosabb szerepet tölt be, mint nálunk embereknél. A rovarok szaglószerve kifinomult, több nagyságrenddel érzékenyebb, mint az emlősöké. Fontos feladata a tápnövények illatának, ragadozóknál a prédaállat illatának vagy éppen a másik nem illatának érzékelése. A gubacsszúnyogok, mint a rovarok többsége, elsődlegesen a csápjukkal érzékelnek, mely funkcionálisan egyenértékű a gerincesek orrával (Keil, 1999). A szaglás nem csak a tápnövény felderítését, hanem a szaporodásnál az ellentétes ivar felkeresését vagy éppen a fajok közötti kommunikációt segíti, mint például a hangyáknál (Keil, 1999). Az illatanyagok túlnyomó részét tehát a rovarok a csápokon érzékelik, de receptorok előfordulhatnak máshol is a rovar testén. Például a legyeknél általános, hogy a csápok mellett az ajaktapogatók (maxillary palp) is részt vesznek a szaglásban (Bruyne és mtsai., 1999) vagy például kemoreceptorok találhatóak a fürkészdarazsaknál a tojócsöveken is a megfelelő petézőhely felderítésére (Odorfer, 1992). Annak ellenére, hogy a csáp morfológiailag mennyire sokszínű megjelenést mutat a rovarvilágban, az alapvető felépítése hasonló a legtöbb rovarnál, ha nem az összesnél. A rovarok csápja nem más, mint átalakult és specializálódott láb. A homeotikus antennopedia mutáns ecetmuslica (Drosophila melanogaster Meigen) például csápja helyén lábakat növeszt (Postlethwait és Schneiderman, 1971). 43

44 A csáp tehát a fejen található végtag eredetű, páros szaglószerv függelék, beidegzett speciális érzékszőrökkel, ún. szenzillákkal, melyek nemcsak a szaglóreceptorokat (kemoszenzillák), de a mechano-, higro-, termoreceptorokat is hordozzák. A kemoszenzillák falát pórusok törik át, melyek lehetővé teszik az illatanyag molekulák szenzillum limfába a szenzillum kutikulával borított belső terébe a folyadéktérbe jutását. Leydig és munkatársai már 1860-as években úgy vélekedtek bár mikroszkópiásan még nem tudták bizonyítani hogy a kutikulával borított rovar szaglóegységnek (szenzillum) permeábilisnak kell lennie az illatmolekulák számára (cit. Steinbrecht, 1999). Mintegy száz év elteltével sikerült a permeábilitást demonstrálni, különböző sejtfestési eljárások segítségével (Slifer, 1954). Az első kutató, aki már pórusokról beszél a rovarok szenzilláit illetően Glenn Richards volt 1952-ben (cit. Steinbrecht, 1999), azonban a szisztematikus elektronmikroszkópiás kutatások e területen Slifer nevéhez fűződnek 1957-től. Megfigyelte, hogy a szöcskék csápjának csúcsi flagellumán található rövid, tompa ún. basiconic peg típusú szenzillum felszíne 0,1-0,2 µm nagyságú pórusokkal van tele (Slifer és mtsai., 1959). Steinbrecht (1969) különböztette meg először a szenzillákat a pórusok milyensége és a szenzillák falszerkezete alapján. A pórusokból a szenzillum limfába (vízes hidrofil közeg) benyúlnak az ún. pórus tubulusok, melyek száma 3 és 20 között lehet, átmérőjük mindössze nm. A tubulusok a szenzillum limfában végeződnek hosszúktól függően közelebb-távolabb a szenzillumba benyúló dendrit membránjától, ahol a szagló receptorok ülnek. Ez a felépítés a szimpla falú, falán pórusos szenzillákra, az ún. single-walled wall-pore sensillum típusokra igaz (Hunger és Steinbrecht, 1997). A középső kambriumból ismerjük a legősibb ízeltlábú csápot a trilobiták köréből. Ezek sok szegmensből álló, hosszú, vékony, elágazás nélküli ostorszerű függelékek voltak. Fiatalabb geológiai rétegekből előkerültek más ízeltlábúak is, melyek már elágazó, csápágakkal rendelkeztek. Például az 5 cm hosszú négyszemű, arachnomorph ízeltlábú a Leanchoilia superlata testhosszának felét kitevő ostoros csáppal rendelkezett, melynek végén ujjszerű függelékek, elágazások voltak (Garcia-Bellido, 2007). A különböző morfológiájú csáp típusok fejlődése az evolúció során tehát már meglehetősen korán megkezdődött. A csáprágós-ízeltlábúaknál (Chelicerata) a csáp redukálódott és a pórusos falú szagló szenzillák a lábon és az ajaktapogatókon foglalnak helyet. A rákoknál 2 pár csápot találunk, de csak az egyik pár játszik szerepet a szaglásban. A Copepoda és a Cladocera nemzetségeknél és a sórák lárváknál is (Artemia salina Linné) az egyik pár csáp kimondottan a helyzetváltoztatás 44

45 szerve (Hallberg és mtsai., 1997). A rovarcsápon található apró szőrszerű képletek felelősek az illékony komponensek (pl. tápnövény illatanyagok, feromonok) felfogásáért, feldolgozásért. Ezek a szaglószőrök beborítják a csáp egészét, megnövelve annak felületét és egy rendkívül érzékeny szaglószervet hozva ezzel létre. A vetési bagolylepke (Agrotis segetum Denis & Schiffermüller) hímjének a csápját például darab szenzillum borítja (Valleur, 1998). Az érzékszőröket csoportosíthatjuk külső morfológiai bélyegeik alapján (5. táblázat): lehetnek hártyalemezek (sensillum placoides), szaglókúpok (sensillum basiconicum), szaglószőrök (sensillum trichodeum), gödörszőrök (sensillum coeloconicum) (Ádám, 1991). Csoportosíthatjuk őket elektronmikroszkópos felvételezésük alapján a falszerkezet szerint: lehetnek falán-pórusos szenzillák (wall pore-sensillum), csúcsán-pórusos szenzillák (tip poresensillum), pórus nélküli szenzillák (no pore sensillum). A falán-pórusos szenzillák általában a szaglásban, a csúcsi pórussal rendelkezőek az ízérzékelésben, míg a pórus nélküli szenzillák a mechanikai-, hő- és páratartalom érzékelésben játszanak szerepet. A továbbiakban én csak a szaglásban szerepet játszó pórusos falú szenzillákkal foglalkozom, melyeket falvastagság szerint tovább osztályozhatjuk. Ezek szerint lehetnek szimpla falúak (single walled sensillum) és dupla falúak (double walled sensillum). A szimpla falú szenzillák közé tartozik a sensillum trichodeum, mely vékony kutikulával borított és a falát finom pórusokkal nyíló tubulusok törik át, így válik lehetővé, hogy az illatanyagok behatoljanak a szagló receptorokhoz (4. ábra). Az érzékszőr belsejét a szenzillum limfa tölti ki, ami egy speciális vérnyirok, melyet a szenzillum támasztósejtjei termelnek. A szenzillum limfában, ebben a hidrofil közegben találhatóak az illatanyagok szállítását végző ún. odorant binding protein (OBP) szállító fehérjék, melyek a pórusoktól a szenzillumba benyúló dendritek sejthártyáján elhelyezkedő receptorokhoz szállítják az illatmolekulákat (Vogt, 2005). A rovarok szagló receptora egy bipoláris neuron, amelynek sejtteste a szenzillum alatt helyezkedik el. Belsejében 2-5 bipoláris, primer receptor neuron található, el nem ágazó dendritekkel. A szagló receptor neuron (ORN) sejttestéből induló axon a szaglóidegen át az azonos oldali szaglólebenybe az illatanyaghoz tartozó glomerulusba fut be. A s. basiconicum szintén vékony kutikulával borított, de jóval rövidebb, mint a s. trichodeum és kúp alakú, a benne található neuronok száma 1-50 között változhat. Például a sáskák szaglókúpjában lévő s. basiconicum-ban 51 db receptor neuron található (Keil, 1999). 45

46 5. táblázat. Az érzékszőrök csoportosítása (Keil, 1999 nyomán) Szimpla falú Pórusos fal Pórusos csúcs Pórus nélküli s. trichodeum s. trichodeum s. trichodeum s. basiconicum s. chaeticum s. chaeticum Dupla falú s. coeloconicum - - Funkció szagló szenzillum ízlelő szenzillum Mechano szenzillum 4. ábra. Egy szenzillum felépítése és elhelyezkedése a rovarcsápon (Syntech GC-EAD practical introduction és Keil és Steinbrecht nyomán (1987). 46

47 A gubacsszúnyogok csápmorfológiája A gubacsszúnyogoknál a nemek elkülönítése a csáp alapján is lehetséges. A csápízek száma 6-40 darab is lehet, de általában flagellomerből állnak (Papp és Darvas, 1997). A csáp a fejhez a csápízektől eltérő alakú scapus azaz csáptőízzel és a pedicellus azaz csápcsuklóízzel csatlakozik (5. ábra). A két első csápíz alakja általában eltér a többi csápíztől, lapítottabbak, csésze alakúak. Méretüket tekintve is valamivel nagyobbak, mint a csápízek. Például a feketeribiszke-gubacsszúnyog (D. tetensi) esetében az átmérője a hímeknél 50 µm, a S P Cs Cs Ö 5. ábra. A nőstény lepényfa-gubacsszúnyog csápjának 1000x-es nagyítása pásztázó elektronmikroszkóppal (SLU, Alnarp, Svédország). Jól látható a csáp első két alapi íze a csáptőíz (scape, S) és a csápcsuklóíz (pedicellus, P), melyek összekapcsolják a fejet a csáp hengeres csápízeivel (Cs), (Ö) összetett szem. 47

48 nőstényeknél 40 µm, míg a csápízek átmérője kisebb, rendre 35 µm körüli (Crook és Mordue, 1999). Azt ezt követő csápízek alakja hengeres és méretüket tekintve azonosak. A nőstényeknél ezen csápízek hossza egységesen 80 µm, szélességük 35 µm. A nőstény csápja rövidebb, összehasonlítva a hímekével annál zömökebb. Az elvégzett mérések alapján a nőstény csáphossza átlagosan 542,5 µm ± 3,0 µm (n=10) míg a hímeknél 930 µm ± 4,5 µmnek (n=10) adódott (Crook és Mordue, 1999). Néhány további faj eltérő ivari csápmorfológiai adatait a 6. táblázatban foglaltam össze. Ez a méretbeli különbség a hímek csápízeinek eltérő felépítéséből fakad. A hímeknél a hengeres csápízek egy rövid nyéllel, kocsánnyal kapcsolódnak a következő ízhez (6. ábra). B A B 6. ábra. A hím káposzta-gubacsszúnyog csápízei (F) egy nyeles (Ny) résszel csatlakoznak egymáshoz (A). A nőstényeknél ez a rész hiányzik (B). Jól megfigyelhetőek a sensillum circumfilum csápfelszíntől elemelkedő hurkokkal a csápízt körülölelő típusa a hímnél (A), és a felszínhez simuló típus a nősténynél (B) (Boddum, 2007). 48

49 6. táblázat. Néhány gubacsszúnyog faj csápmorfológiai adata Fajnév Feketeribizli-gubacsszúnyog (Dasineura tetensi) Káposzta-gubacsszúnyog (Contarinia nasturii) Cirok-gubacsszúnyog (Contarinia sorgicola) Hesszeni légy (Mayetiola destructor) Seychellepidosis spinosa Citrom-gubacsszúnyog (Prodiplosis longifila) Ragadozó gubacsszúnyog Aphidoletes aphidimyza Irodalom Crook és Mordue, 1999 Boddum, 2007 Boddum, 2007 Boddum, 2007 Spungis, 2007 Peña és mtsai., 1989 Zhang és Yang, 2008 Csápízek száma (db) Csáphossz hím (µm) Csáphossz nőstény (µm) ±4,5 542,5±3, ±30,0 800±40, ±40,0 700±30, ±70,0 1100±10, ? A csápot apró, szőrszerű, beidegződés nélküli kutikula képletek, a kutikulaszőrök ún. microtrichia borítják (Zhang és Yang 2008). Ezek a csápszőrök beborítják a csáp egészét, ez alól csak a hím gubacsszúnyogok csáp flagellumainak kocsányai képeznek kivételt (Zhang és Yang, 2008). A gubacsszúnyogoknál öt szenzillum típus jellemzi a szagló szőröket, a sensillum trichodeum, melyet már számos rovarfajnál azonosítottak, mint szagló szenzillumot (Hansson, 1995), a sensillum circumfilum, mely csak a gubacsszúnyogokra jellemző speciális alakulású, összetett szagló szőr, a sensillum coeloconicum, a sensillum basiconicum és az egypórusú csap szenzillum (Slifer és Sekhon, 1971). A s. circumfilum-ot először Tozzetti (1866) és Kieffer (1895) fedezte fel egymástól függetlenül (cit. Slifer and Sekhon, 1971; Crook és Mordue, 1999). A s. circumfilum tehát unikális szenzillum típus mind a feromon, mind pedig a tápnövény illatanyagok érzékelésében szerepet játszik (Boddum és mtsai., 2010). Maga a szenzillum egy csápízt körbefogó körkörös, elágazó struktúra, mely a többi szenzillum típussal ellentétben nem csak egy helyen, hanem számos helyen (15-20) kapcsolatba lép a csápíz kutikulájával. Ez azt jelenti, hogy több szaglóreceptor idegsejttel (ORN) áll kapcsolatban. A s. circumfilum fontos morfológiai 49

50 határozó bélyege a gubacsszúnyogok osztályozásának (Gagné, 1989). Feltételezések szerint a s. circumfilum egy összetett szenzillum, mely különálló szenzillumok egyesülésével jöhetett létre (Hallberg és Hansson, 1999). A hím káposzta-gubacsszúnyog csápján például minden s. circumfilum általában tíz szenzillumból épül fel (Boddum és mtsai., 2010). Morfológiai megjelenését tekintve kétféle altípust különböztetünk meg: az egyik altípusnál a szenzillum szorosan körülfogja, öleli a csápszegmenst, ilyen található az eddig leírt összes nőstény gubacsszúnyognál és néhány faj hímjeinél is, például a feketeribiszke-gubacsszúnyognál és a hesszeni légynél. A másik típusnál a szenzillum messze elemelkedik a csáp felszíntől, és úgy alkot hurkokat a szegmens körül, például a káposzta- (6. ábra), cirok-gubacsszúnyog, (C. sorghicola) és a Mycodiplosis erysiphes Rubs hímjeinél (Solinas és Nuzzaci, 1987). A s. circumfilum vékonyfalú kutikuláján található számtalan pórus valószínűsíti, hogy szerepe van a szaglásban. A borsó-gubacsszúnyognál (C. pisi) például Hillbur (2001) szerint a s. circumfilum a szexferomon érzékelésben játszik szerepet a hímeknél, ezt bizonyítja, hogy a hímek szenzilluma sokkal nagyobb kifinomultabb, összehasonlítva a nőstényekével. Hasonló figyelhető meg a cirok-gubacsszúnyognál is (Boddum, 2007). Egy vizsgálat szerint a s. trichodeum száma és a s. circumfilum morfológiája összefüggést mutat. Azoknál a fajoknál, ahol a hímeknek megnagyobbodott a s. circumfilum-ja, a nőstényeknek borítja több s. trichodeum a csápját (Solinas és Nuzzaci, 1987). Úgy tűnik tehát, hogy a s. trichodeum a tojásrakó hely keresésében a tápnövény felkutatásában játszik szerepet. Ennek ellentmondani látszik a feketeribizli-gubacsszúnyog melynél a s. circumfilum esetében nincsen ivari dimorfizmus és a hímeknek van nagyobb számú s. trichodeum szaglószőre, mely a szexferomon érzékelésben betöltött szerepét sejteti (Crook és Mordue, 1999). Beidegződésére jellemző, hogy egy vagy akár több ORN is bocsáthat dendriteket a szenzillum kutikulán túlnyúló részébe (Boddum és mtsai., 2010) (7. ábra). A s. trichodeum-ot minden eddig vizsgált gubacsszúnyog fajnál megtalálták, megjelenése is egységes formát mutat, hosszú és vékony szaglószőr, pórusokkal áttört fallal. A szenzillumban kevés el nem ágazó vagy gyéren elágazó dendrit található. Alapi részén a csápkutikula jellegzetes körkörös ún. zokni vagy lópataszerű megvastagodása, mindkét nemnél megfigyelhető. A hosszú, vékony szenzillumon elektronmikroszkóppal megfigyelhető egy végigfutó gerinc, mely először a szenzillummal párhuzamosan proximalis irányba, majd distalis irányba fut (Boddum, 2007). 50

51 Meg kell említeni további két szenzillum típust, melyek kisebb számban, de találhatóak a gubacsszúnyogok csápján, ezek a s. coeloconicum és a s. chaeticum. A s. coeloconicum egy rövid csapszerű szaglószőr, mindössze 3-4 µm hosszú, elszórtan helyezkedik el a csápszegmenseken. Méreténél fogva meglehetősen beleolvad a csápot borító rengeteg kutikulaszőrbe, de az alapi részén található körkörös zokni jól elkülöníthetővé teszi. Elektronmikroszkóppal jól megfigyelhető hornyok húzódnak a szenzillumon végig, annak csúcsa felé. 7. ábra. A sensillum circumfilum (A) és a sensillum trichodeum (B) beidegződése a hím káposzta-gubacsszúnyognál. A sensillum circumfilum (C) beidegződése a hím hesszeni légynél. A káposzta-gubacsszúnyognál egy, míg a hesszeni légynél két szagló receptor neuron sejt idegzi be a s. circumfilum-ot (Boddum és mtsai., 2010 nyomán). A s. chaeticum dendritjei ízlelő- vagy mechanoreceptorokat hordoznak. A csápízeken általában körkörösen foglalnak helyet, hosszúk hasonló a s. trichodeum-hoz (pl. a hím káposzta-gubacsszúnyognál 60 µm) és a csúcsuk hosszan elhegyesedik. Jellemző a felszínükre a hosszirányú erős barázdáltság, mely az alaptól egészen a szenzillum csúcsa alatt található apró kis elágazásokig tart Elektroantennográfia (EAG) Az 1950-es években több német és francia kutatócsoport párhuzamosan kísérletezett, hogy mérhetővé és megjeleníthetővé tegyék az ingerelt rovarcsápból kiváltott ingerületet, hiszen az ingerületvezetés a potenciálkülönbségen alapul, mely elektromos impulzus formájában jut el felsőbb agyi területekre. Már a korai, kezdetleges oszcilloszkópos műszerekkel is sikerült kimutatni, hogy bizonyos illatanyagokkal történő ingerlés esetén a csáp által felfogott kémiai ingerek által kiváltott elektromos jel megnövekedett. Hamarosan 51

52 sikerült preparált rovarcsápból kimutatni tényleges potenciálváltozást ingerlés során. Az így kapott görbe az elektroantennogram, a műszer pedig az elektroantennográf (EAG) nevet kapta, a korábban már ismert ElektroOlfaktoGram (EOG) és az ElektroRetinoGram (ERG) analógiájára (Schneider, 1957). A gyakorlat számára az elektroantennográfiás (EAG) vizsgálatok Schneider felfedezése nyomán váltak lehetségessé. Az ő megfigyelései alapozták meg a kísérletes rovartan számára a rovarok szagló rendszerének megismerését, illékony komponensek, feromon komponensek vizsgálatának módszerét rovarcsápon. A csáp alapja és csúcsi része között feszültségkülönbséget tudott mérni, amennyiben a faj feromonjával ingerelte azt (Schneider, 1957). Ekkor a mögöttes élettani folyamatokat még nem teljesen értették. Ma már tudjuk, hogy minden, a csápon található receptor sejt megfeleltethető egy ellenállás és egy feszültségforrás kombinációjának (8. ábra). A rovarok csápja nagy számban hordoz receptor sejteket, így az egész csáp egy egységes ellenállás és feszültség forrásnak fogható fel. Illatanyaggal ingerelve a csápot, a csáp összes az adott illatanyagra hangolt szaglóreceptor sejtje ingerületbe kerül és ez egy összegzett potenciálváltozás formájában jelentkezik. A csáp feszültsége meglehetősen alacsony mértékű, míg az ellenállása magas, néhány megaohm. Ez az ellenállás általában emelkedik, ha az izolált csáp kiszárad a kísérlet közben. 8. ábra. Egy szenzillum sematikus rajza. Minden egyes receptor sejt megfelel egy feszültség forrás és egy ellenállás kombinációjának (Syntech GC-EAD practical introduction). 52

53 A feszültség ingadozás mértéke a néhány mikrovolttól (1µV=10-6 V) néhány millivoltig (1mV = 10-3 V) terjed (van der Pers és mtsai., 1980). A szenzillákra is jellemző, hogy nyugalmi állapotban a sejtek elektronnegatívak, a külső környezethez képest. A sejtmembrán külső és belső felszíne között elektromos feszültég különbség áll fenn, ez a nyugalmi potenciál, melynek mértéke kb. 90 mv. A sejtmembrán külső felén Na + nagy mennyiségben, és Cl kisebb mennyiségben található, így a külső fele pozitív töltésű. A membrán belső felén K + és nagyobb mennyiségben anionok találhatóak, így a belső fele negatív töltésű. Ez az állapot fennáll mindaddig, amíg a sejtet valamilyen inger nem éri. A válaszreakciót csak megfelelő erősségű, ún. küszöbinger képes kiváltani. Tehát megfelelő inger hatására létrejön a válasz, az akciós potenciál. Ha egy rovar csápját ingereljük valamilyen illatanyaggal, a szenzillákban található ún. szagló receptor neuronok (ORN) ingerületi állapotba kerülnek és a sejtmembránon potenciálváltozás jön létre. Ez az akciós potenciál az összes az adott illatanyagra receptorral rendelkező - szenzillán bekövetkezik és a mérhető EAG szignál egy összesített akciós potenciált eredményez (9. ábra). A potenciálváltozást a következő szakaszokra oszthatjuk, melyeket az elektroantennogramon jól megfigyelhetünk: nyugalmi potenciálkülönbség-csökkenés, a sejt ingerületbe kerülése; depolarizációs folyamatok; csúcspotenciál; repolarizáció; hiperpolarizáció. Az akciós potenciál hátterében az első szakaszban, a membránban található nátriumion csatornák megnyílása és a nátrium ionok gyorsuló beáramlása áll a nyugalmi állapothoz képest. A sejten belül pozitív ion többlet keletkezik, ez a nyugalmi potenciálkülönbség folyamatos csökkenéséhez vezet. A Na + ion beáramlás hatására tehát a sejt belseje válik pozitívvá azaz depolarizálódik. Az ionbeáramlás eléri a csúcspontját, ez a csúcspotenciál szakasz, majd újra működni kezd a nátrium pumpa és elkezdődik a repolarizáció folyamata a nyugalmi potenciál helyreállítása irányába. A hiperpolarizációs szakaszban (inhibitoros posztszinaptikus potenciál) a membrán belső fele a kiindulási nyugalmi potenciálnál negatívabb lesz átmenetileg, mely gátolja a sejt azonnali ingerelhetőségét. Az akciós potenciál, ha kialakul, nem marad meg a keletkezés helyén, hanem továbbhalad a sejt egész felületén (Roelofs, 1984). Az elektroantennográfiás méréseknél, a csápdetektor ezüst elektródjaira illesztett Ringer oldattal töltött üvegkapillárisokra felpreparált élő rovarcsápban lévő hemolimfa, mely iontartalma révén elektrolit oldatként funkcionál (Kaissling, 1996), lehetővé teszi az ingerlés során, a csáp szenzilláiban bekövetkező potenciálváltozás elvezetését. (9. ábra). 53

54 9. ábra. Az elektroantennográfiás felvételezés elvi vázlata (Syntech GC-EAD practical introduction) Az elvezetett analóg jel erősítő segítségével felerősíthető és számítógéppel megjeleníthető. Az EAG vizsgálatok a rovar perifériális érzékeléséről adnak információt, a mélyebb agyi folyamatokról, viselkedést befolyásoló szerepéről nem, ezért további, a viselkedésre irányuló vizsgálatok szükségeltetnek a kémiai kommunikáció teljesebb körű ismeretéhez (Birch, 1971) Bioszenzoros (csápdetektoros) gázkromatográfia elvi háttere (GC-EAD) Az előbbiekben bemutatott elektroantennográf alkalmas tehát a kivonatok biológiai aktivitásának kimutatására. Következő lépésként tudnunk kell, hogy a kivonatban esetenként található több tucat anyag közül melyik vagy melyek váltottak ki ingerületet a csáp szenzilláiból. Ehhez a kivonatban megtalálható anyagokat időben szét kell választanunk, és úgy juttatnunk a csáphoz. Az elválasztás-technikai módszerek közül a gázkromatográfia alkalmas az illékony anyagok elválasztásához, vizsgálatához. Gázkromatográfot kapcsolva egy elektroantennográfhoz, létrejön egy bioszenzoros gázkromatográfiás nagyműszer, vagy csápdetektoros gázkromatográf (GC-EAD) (Arn és mtsai., 1975). A kapcsolt műszernél a gázkromatográf kapilláris oszlopa (belső felületén az álló fázissal) segítségével időben szétválaszthatjuk az egyes anyagokat, melyeket a lángionizációs detektor (FID, flame ionization detector) érzékel. A csápdetektorhoz a kapilláris oszlop egy speciális elágaztatása 54

55 segítségével a lángionizációs detektorral egy időben érkeznek a szétválasztott minta komponensei, ingerelve a csápdetektorba (EAD) preparált csápot. Így egy szimultán keletkező kémiai és biológiai detektor jelet kapunk (10. ábra). A jelek felerősíthetőek és speciális szoftverrel megjeleníthetőek, értékelhetőek. Ennek segítségével a csáp elektroantennográfiás (EAD) válaszai a lángionizációs detektor felől érkező kromatogram egy illetve több csúcsával, anyagával megfeleltethetőek, és azok retenciós ideje (RT) megállapítható (10. ábra). 10. ábra. A bioszenzoros gázkromatográf (GC-EAD) működésének elvi vázlata (Bäckman, 1999) Ingerület elvezetés egyedi érzékszőrről (single sensillum recording, SSR) elvi háttere A 3.5. fejezetben ismertetett elektroantennográf (EAG) a csápon ingerlés hatására keletkező eredő (összegzett) akciós potenciál mérésére alkalmas, hiszen a csápon található minden az adott anyagra érzékeny kemoreceptor gerjesztett állapotba kerül egyidejűleg. Így tehát az EAG módszer nem alkalmas a szenzillumok egyedi elektrofiziológiás tulajdonságinak vizsgálatára. Számos esetet ismerünk, mikor egy faj csápján, több morfológiailag azonos, de belső felépítésében, beidegződésében eltérő sensillum trichodeum kemoreceptor fordul elő. Például a sárgaláz szúnyognál (Aedes aegypti L.) négy morfológiailag megkülönböztethető sensillum trichodeum-ot találtak, melyeknek a további ingerület elvezetés egyedi érzékszőrről vizsgálatai derítettek fényt rá, hogy valójában, funkciójukat tekintve, tíz típusról van szó (Ghaninia és mtsai., 2007). 55

56 Az ingerület elvezetése egyedi szaglószőrről, azaz a single sensillum recording (későbbiekben csak SSR vizsgálat) vizsgálat lényege, hogy a szenzillumban található szaglóreceptor neuron vagy neuronok (olfactory receptor neuron, ORN) dendritjein található receptorok a számukra megfelelő illatanyaggal (feromon, tápnövény illatanyag) ingerelve, ingerületi állapotba kerülnek (Hubel, 1957). Az így keletkező akciós potenciál a receptor sejt membránján át a szenzillum limfában, mint ingerületi extracelluláris potenciál mérhető, műszeresen megjelenítve ezt ún. tűzelésnek vagy spike-nak nevezzük (Hansson, 1995, Ignell és Hansson, 2005). Ideg- és izomsejteknél tipikus esetben az elektromos feszültségkülönbség a sejt belseje és külseje közt alakul ki, és ingerlésre legtöbbször gyorsan lefutó impulzus (spike azaz tüske) keletkezik és terjed tovább mint tüskehullám, majd többnyire kémiai közvetítő anyagokkal újabb elektromos jelet vált ki más sejteken. Ezt az eljárást rovarokra először Jürgen Boeckh (1962) adaptálta. Az elektród penetrációs SSR vizsgálatokhoz szükség van egy kellően vékony mikroelektródra, melyet a szenzillumba, az említett szenzillum limfába szúrnak, ez a felvételező (recording) elektród (Hubel, 1957), illetve egy másik mikroelektródra, mely az ún. referencia vagy föld elektród (11. ábra). A referencia elektródot a kísérleti rovartól függően a torba, vagy például csípős szúnyogoknál a rovar szemébe szúrják. Az elektródot wolframszálból készítik, mert jól vezeti az elektromos áramot és kellően szilárd vékony szálként is. A wolfram szálat elektrolitikusan a mérések előtt ki kell hegyezni, hogy képes legyen áthatolni a szenzillum kutikuláján nagyobb mértékű a csáp szerkezetét tönkretevő roncsolás nélkül. Az felvételező elektródon át extracellulárisan elvezethető a potenciál különbség, mint feszültség ingadozás. A keletkező jel a spike vagy tüske, mely egy erősítő és digitális átalakító után jut a számítógépbe, ahol szoftveresen megjeleníthető, feldolgozható. 56

57 11. ábra. Az ingerület elvezetés egyedi érzékszőrről (single sensillum recording, SSR) elvi vázlata (Stensmyr, 2004 nyomán). A gubacsszúnyog felpreparálva (1), az egyik elektrolitikusan kihegyezett wolfram elektród az ún. referencia elektród (2) a szembe vagy a torba szúrva, a másik, a felvételező elektród (3) egy sensillum trichodeum alapi részébe szúrva. Az előerősítő segítségével (4), az idegi aktivitást a szenzillum limfában extracellulárisan mérjük (5), az ingerület, elektromos impulzus formájában az elektródon át az erősítőbe (6) majd a digitális konverterbe (7) jut, hogy számítógéppel (8) vizualizálható legyen (9). 57

58 4.1. Kísérleti rovarok kinevelése 4. ANYAG ÉS MÓDSZEREK A szexferomon összegyűjtéséhez, EAG és GC-EAD vizsgálatokhoz elengedhetetlen, hogy a lepényfa-gubacsszúnyog imágók megfelelő egyedszámban álljanak rendelkezésre a laborban. A faj mesterséges tenyésztése élő tápnövényen lehetséges csak, ami tekintve a tápnövény fa voltát nehézségekbe ütközik. Ennek ellenére az SSR vizsgálatok folyamatossá tétele érdekében laboratóriumban neveltem ki imágókat a tápnövény segítségével. A természetes rajzások közötti holtidő áthidalására laboratóriumban magról, cserépben nevelt G. triacanthos magoncok megfertőzésével sikerült a vizsgálatokhoz kellő számú imágót kinevelni (lásd. 1. melléklet). A lepényfa magokat a SLU Swedish University of Agricultural Sciences alnarpi arborétumából, tövises lepényfákról gyűjtött hüvelytermésekből nyertem. A magokat a vetés előtt forró vizes előkezelésnek vetettem alá, mely a kemény maghéjat felpuhítja, és így elősegíti a csírázást és növeli a csírázási százalékot. Egy 10 cm átmérőjű cserépbe 10 darab magot vetettem és a magoncokat klímakamrában (25 ºC, 80-90% RH, hosszúnappalos megvilágítás, 18/6 világos/sötét) neveltem. Amikor a magoncok elérték a tíz leveles fejlettségi szintet (kb cm-es növénymagasság), a cserepeket nagyméretű (1x1 m) izolátorketrecbe helyeztem, melyet sűrű a gubacsszúnyogok méreténél kisebb lyukú fémhálóval borítottam be. A későbbiekben ismertetésre kerülő módszer szerint, a természetben begyűjtött, fertőzött lombból laborban kinevelt imágókat helyeztem el naponta az izolátorketrecbe. Az izolátorban párosodott nőstények aztán lerakták petéiket a fiatal levelekre, melyekből a kikelő lárvák létrehozták a gubacsokat. Gubacsonként csak 1-2 lárvát tudtam kinevelni, és cserepenként, azaz 10 magonconként gubacs fejlődött mindössze. Ez a módszer a kis számú kísérleti állatot igénylő vizsgálataimhoz még éppen kellő számban tudott imágókat biztosítani. A nagy számú nőstényt igénylő szexferomon kivonáshoz nem alkalmazható ez a kis hatékonyságú tápnövény magoncos módszer. Hatékonyabb imágó kinevelési módszer a fertőzött fák folyamatos megfigyelése és a megfelelő lárvafejlettségnél a gubacsos levelek begyűjtése volt. A begyűjtött lombot, laborban henger alakú üvegedényben (d = 20 cm, 30 cm magas, ún. egérpohárban) itatós papíron helyeztem el. A megfelelő páratartalom biztosításával nedvesített vattával előztem meg a 58

59 levelek elhervadását, ami a lárvák pusztulását okozta volna. Továbbá az üvegedényeket fehér szövettel majd nagyméretű Petri-csészével fedtem le. A lárvák nevelését mesterséges hosszúnappalos fotóperiódus (18/6, világos/sötét) mellett 24 ºC-on végeztem. A szabadföldi nyári fényviszonyokhoz hasonló feltételeket próbáltam teremteni, ezért rásegítő megvilágítást is alkalmaztam, reggel 8:00 órától 13:00 óráig (500 W Hg gőz lámpa). A kikelő imágókat a reggeli órákban ivar szerint szétválogattam, és további kísérletekig a keltetéssel azonos feltételek mellett tartottam őket. A nemek elválasztása a gubacsszúnyogoknál általánosan használt bélyegek alapján történt (Papp and Darvas, 1997). Használható elkülönítő bélyeg például a csáp. A lepényfa-gubacsszúnyog csápízeinek száma mindkét nemnél tizenkettő, az ivari különbség a csápon található érzékszőrök (szenzillum) hossza, illetve száma. Természetesen ez a módszer a nemek elkülönítéséhez meglehetősen körülményes és lassú lenne. A csápízek felépítése viszont ránézésre is elkülöníthetővé teszi a hímeket a nőstényektől, hiszen a hímek gömbölyded csápízei hengeres nyelekkel kapcsolódnak egymáshoz, így a csáp gyöngysorszerűen néz ki (Hillbur, 2001), és sokkal hosszabb, mint a nőstényeké (12. ábra). 12. ábra. A lepényfa-gubacsszúnyog imágói (Benedicty Zsuzsa rajza). Látható a csápok eltérő morfológiája az ivaroknál. A potroh alakja illetve nőstényeknél a tojócső, hímeknél az ivari fogókészülék megléte is segít az ivarok szétválasztásban. 59

60 Természetesen nagymértékben segíti az elkülönítést a nőstények tojócsőve is. Az ivari különbségek már bábállapotban is kiütköznek, hiszen a nőstényeknél a potroh vöröses, míg a hímeknél szürke. Ez az elkülönítő bélyeg az imágóknál is jól megfigyelhető (Thompson, 1998). A kísérletek időzítésénél figyelembe kellett vennem, hogy az imágók élettartama rövid. Irodalmi említések szerint az imágók 2-3 napig élnek, a meg nem termékenyített nőstények esetenként 3-4 napig is (Parella és Thompson, 1998) Lepényfa-gubacsszúnyog csalogató viselkedése és annak napszaki ritmusa A lepényfa-gubacsszúnyog szexferomonjának meghatározásához elengedhetetlen, hogy ismerjük az ivari aktivitásának napszaki ritmusát és a nőstények csalogató viselkedését. Először szabadföldön, lepényfa fasorokban (Palota sétány, Népliget, Lágymányosi-híd pesti hídfő) végeztem a vizuális megfigyeléseket a csalogató viselkedés napi ritmusának megállapítására, reggel 7 órától délután 4 óráig. A következő lépésben az említett fasorokból gyűjtött fertőzött lombból laboratóriumban keltettem imágókat. A módszer részleteit a 4.1. Kísérleti rovarok kinevelése című fejezetben részletesen már taglaltam. A pontosabb megfigyelésekhez a reggel 7 óráig kikelt imágókat ivaruk szerint szétválogattam és a nőstényeket egyesével Petri-csészébe helyeztem egy lepényfa levélre, természetes fényviszonyok mellett. Minden egyes nőstényhez 5 hímet engedtem be és folyamatosan figyeltem a nőstények csalogató és a hímek udvarlási viselkedését. A megfigyeléseket tíz ismétlésben, délután 2 óráig végeztem Szexferomon összegyűjtése légtérből történő visszafogás módszerével Closed loop stripping apparatus (CLSA) A szexferomon meghatározásához a nőstények által légtérbe kibocsátott feromon visszagyűjtésének módszerét alkalmaztam (volatile collection). Az illékony komponensek összegyűjtését egy teljesen zárt üvegrendszerben végeztem (closed loop stripping apparatus, Brechbühler AG, Schlieren Svájc). A készülékben a levegő körbe forgatását egy speciális, 60

61 belső részén inert, teflonnal bevont pumpa végezte (MB-21E, Metal Bellow Corporation, Sharon, USA). Az üvegelemek hézagmentesen csatlakoznak egymáshoz teflon tömítésekkel, és a szoros zárásról szorító bilincsek gondoskodnak. Az üvegrendszer szívó oldalán kialakított részben kell elhelyezni a gyárilag üvegcsőben két fémlemez közé préselt aktív szén adszorbenst. Ez az 1 mm vastagságú, 1,5 mg tömegű adszorbens megfelelően nagy felülettel rendelkezik a nőstények által kibocsátott komponens(ek) megkötéséhez. A rendszer üvegelemei az előzetes szennyeződések eltávolítása érdekében előkezelésen estek át. Forró vizes majd pedig acetonos és etanolos mosás után, 10 órán át 130 ºC-on kihevítettem őket. A lombikba belenyúló szívó csonknál speciális, üvegből készült porózus szűrővel, a nyomó ágnál kihevítet üveggyapottal akadályoztam meg az imágók üvegrendszerbe jutását. A készülék üveglombikjába helyeztem a nőstényeket reggel 8 órakor, még mielőtt a szabadföldi megfigyelések alapján megkezdik a napi csalogató viselkedésüket. A nőstények még a párosodás előtt termelik és bocsátják ki a hímek csalogatására szolgáló szexferomont, a nőstények tojásrakás utáni ismételt párosodása, így ismételt feromontermelése irodalomból más gubacsszúnyog fajoknál sem ismert. A lombikba nem helyeztem sem lombot, sem itatót a nőstények számára, nehogy ez zavaró illatanyag forrása legyen a zárt rendszerben. A gubacsszúnyog imágók már nem táplálkoznak így felesleges is lett volna az itató a kísérlet ideje alatt. A begyűjtött lepényfa gubacsokból folyamosan keltetett imágók tették lehetővé, hogy az illatanyag gyűjtését három napig folyamatosan végezzem az előzőleg megfigyelt, a csalogatás szempontjából aktív időszakban. A kibocsátott szexferomon légtérből történő visszafogását így reggel 8 órától délután 15 óráig végeztem, ezután a levegő keringetését kikapcsoltam, de a nőstényeket bent hagytam a rendszerben másnap reggelig. Következő reggelen az előző napról életben maradt és a frissen kelt nőstényeket helyeztem el a lombikban és ismét elkezdtem az illatanyagok összegyűjtését. Ezt a következő napon még egyszer megismételtem, így az egyik feromon gyűjtés alkalmával, a harmadik nap végére összesen 1800 darab nőstény fordult meg a rendszerben és bocsátotta ki szexferomonját. Az aktív szén filterről csak a harmadik nap végén oldottam le az összegyűjtött komponenseket, evvel mintegy koncentrálva a visszafogott szexferomont. 61

62 Az összegyűjtött szexferomon leoldása az aktív szén szűrőről Az összegyűjtött komponensek aktív szén szűrőről történő eluálásához, leoldásához n- hexánt használtam (pro analysis n-hexane, Merk, Darmstadt, Németország), amelyből 3x10 µl-t mértem az aktív szén adszorbensre fecskendővel (standard syringe 10 µl, Agilent Technologies, Ausztrália) majd átmozgattam az aktív szén rétegen, leoldva ezzel a megkötött anyagokat, végül egyik végén előre leforrasztott üvegpipettába szívtam át. Ezt követően az üvegpipetta alapi részét 60 ºC-on tartottam a másik végét pedig láng felett leforrasztottam. Az így elkészült kivonatokat a vizsgálatokig 60 ºC-on tároltam Stimulusok elkészítése Mind az elektroantennográfiás (EAG), mind pedig a single sensillum recording (SSR) vizsgálatokhoz szükségem volt ingerforrásokra, stimulusokra, melyek a kísérletbe összehasonlítani kívánt komponenseket tartalmazták. Erre a célra 1x1 cm-es szűrőpapír darabokat használtam hordozónak, amiket Pasteur-pipettába csúsztattam. A szűrőpapírt előtte etanolban kifőztük, hogy biztosan illatanyag mentes legyen, erre mértem rá a kivonatokból µl-t, majd mélyen belecsúsztattam a pipettába. Kontrollként két pipettát használtam minden kísérletben az oldószeres- és a levegő kontrollt. Az oldószer vagy esetleges szennyeződései is válthatnak ki ingerületet, ezért 10 µl tiszta n-hexánt mértem a szűrőpapírra oldószeres kontrollhoz. A másik kontroll pipetta csak egy tiszta szűrőpapírt tartalmazott, a csáp mechanikai ingerekre történő válaszreakciójának, illetve a szűrőpapír illatanyag mentességének ellenőrzése végett. Az elektroantennográfiás vizsgálatoknál a Pasteur-pipettáról elpárolgó illatanyagokat manuálisan egy fecskendő segítségével 1 ml levegővel jutattam bele a nedvesített légáramba, mely a preparált csáphoz szállította őket. Az SSR vizsgálatokat Svédországban az SLU Swedish University of Agricultural Sciences, Chemical Ecology laboratóriumában, Alnarpban végeztem. A stimulusokat ebben az esetben is az előzőekben ismertetett módon készítettem. Ezen vizsgálatoknál a szintetikusan előállított szexferomont és antipodját mértem rá a szűrőpapírra, külön-külön illetve együtt, mint racém (1:1 arányú) keveréket. Három dózisban 0,1; 1; 10 µg vizsgáltam az enantiomereket, melyeket minden esetben 10 µl n-hexánnal vittem fel a szűrőpapírra. Az SSR 62

63 vizsgálatok esetében is használtam az oldószeres- és a szűrőpapíros kontrollt. A stimulusokról párolgó illatanyagokat műszeresen ún. Stimulus Controller CS-55 (Syntech, Hollandia) készülékkel szabályozható mennyiségben 0,5 másodperc alatt 10 cm/s sebességgel porlasztottam a párásított és aktív szénnel előszűrt légáramba Elektroantennográfia (EAG) Az aktív szén adszorbensről leoldott kivonatok biológiai aktivitását elektroantennográffal (EAG) vizsgáltam. A készülék segítségével fajtárs hím csápon vizsgáltam, hogy a kivonatokban valóban sikerült-e összegyűjteni a szexferomont, azaz biológiailag aktív-e a kivonat. A mérések során frissen levágott hím csápot illetve a hosszabb életben tarthatóság végett az egész hím fejet preparáltam fel 2 db, láng felett elvékonyított (20 µl) üvegkapilláris közé (belső átmérő: 1,17 mm). Minden egyes méréshez friss csáppreparátumot készítettem. A referencia elektród üvegkapillárisát a fej hátsó részébe szúrtam bele, a fej-tor korábbi ízesülésének a helyén. A felvételező elektród üvegkapillárisának a végét óráscsipesszel óvatosan kanalasra igazítottam, hogy jobban és biztosabban illeszkedjen a csáp csúcsi részéhez. Az üvegkapillárisokat Ringer oldattal (Beadle and Ephrussi, 1936) töltöttem meg. Ezeket csatlakoztattam a mikromanipulátorok (MP15, Syntech, Hilversum, Hollandia) 0,5 mm vastag ezüst elektródjához. Az egyesével üveg fiolában elhelyezett hím gubacsszúnyogot toránál óráscsipesszel megfogtam és pengével eltávolítottam a fejét. A lehető leggyorsabban a fej tor felöli részéhez illesztettem a Ringer oldattal töltött referencia üvegkapillárist, majd a mikromanipulátor referencia ezüst elektródjára csúsztattam. A csápot, esetenként mindkét csápot a mikromanipulátor három irányba függetlenül mozgatható finomállító csavarjai segítségével, az előzetesen a felvételező elektródra csúsztatott, szintén Ringer oldattal töltött üvegkapillárisba illesztettem. A kapilláris kanalas vége segített, hogy a vékony, fonalas csáp csúcsát a felületi feszültség ellenére a Ringer oldatba tolhassam (13. ábra). A művelet végeztével az EAG alapvonal milyenségéből a preparálás sikeressége megállapítható, még a mérések megkezdése előtt. 63

64 13. ábra. Hím lepényfa-gubacsszúnyog csáp-fej-tor preparátuma elektroantennográfiás vizsgálathoz. A bal oldali üvegelektród a referencia, a jobb oldali a felvételező (recording) elektródhoz kapcsolódik (saját felvétel). Az ingerlésre szolgáló stimulusokat a 4.4. Stimulusok elkészítése című fejezetben ismertetett módon készítettem el. Az ingerlés pillanatában a pipetta csúcsát a szűrt, nedvesített légáramba illesztettem, míg a másik végéhez illesztett injekciós tűvel 1 ml levegőt pumpáltam át rajta, bele a csáp felé irányuló légáramba. Ingerlés hatására keletkező ingerület elektromos impulzusként a Ringer oldaton és az ezüst elektródon át az erősítőben (IDAC-232, Syntech) futnak be. A készülék szabályozza a beérkező jelet, felerősíti, és analóg jelből átalakítja digitális jellé, majd továbbítja a számítógépes adatfeldolgozó szoftver felé (GC-EAD 2000 verzió: 2.5, Syntech, Hilversum, Hollandia). A szintetikusan előállított szexferomon enantiomerek biológiai aktivitás vizsgálatát először szintén EAG-vel végeztem. A stimulusok elkészítése itt is a korábban leírtak szerint történt. Megvizsgáltam külön az (R)-, az (S)enantiomert és az 1:1 arányú (racém) keveréküket is. Kontrollként n-hexánt, illetve tiszta szűrőpapíros pipettát használtam. Mind a két enantiomert, illetve a racém keveréket is 0,3; 1; 3; 10 ng-os dózisban (szűrőpapírra rámért dózis) vizsgáltam. A csápválaszokat a CLSA módszerrel nőstényekből összegyűjtött kivonatra adott csápválaszra normalizáltam. A CLSA kivonat 50 FE mennyisége, 2,8 ng természetes szexferomont tartalmazott, a gázkromatográfiás mérések alapján. Az erre a kivonatra adott csápválaszt tekintettem 100%-nak. A méréseket öt hím csápon ismételtem meg. A log(x+1) transzformált adatokat varianciaanalízissel majd Games-Howell posthoc teszttel értékeltem. 64

65 4.6. Bioszenzoros (csápdetektoros) gázkromatográfiás vizsgálatok (GC-EAD) Az EAG vizsgálatokkal aktívnak talált kivonatokat a továbbiakban bioszenzoros, ún. csápdetektororos gázkromatográffal (GC-EAD) vizsgáltam. A vizsgálatokat az MTA Növényvédelmi Kutatóintézet, Állattani Osztályán végeztem Agilent 6890 N típusú gázkromatográfon (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA). A készülékben poláros DB-WAX (30m x 0,32mm x 0,25µm) kapilláris oszlopot (J&W Scientific) használtam. Az oszlopot a split/splitless injektorral splitless módban üzemeltettem, tehát a beinjektált minta, az injektorban 220 ºC-on elpárologtatva maradéktalanul a kapilláris oszlopra került. Az injektáláshoz 10 µl-es fecskendőt (Agilent Gold Standard Syringe) használtam Az áramlási sebesség a kapilláris oszlopban állandó, 4 ml/perc volt, vivőgázként héliumot használtam. A hőmérsékleti programot úgy választottam meg, hogy megfelelő legyen a komponensek szétválásához, ugyanakkor a feromon várható retenciós ideje (RT) alkalmazkodjon a preparált csáp élettartamához. Az elválasztás 60 ºC-ról indult, egyperces hőntartás után 10 ºC/perc felfűtéssel egészen 220 ºC-ig fűtőtt fel a készülék, ahol 10 percig még tartotta ezt a hőfokot a mérés végéig. A csápdetektor ezen méréseknél megegyezett az előző fejezetben bemutatott EAG készülékkel. A gázkromatográfiás adatok rögzítéséhez, feldolgozásához a ChemStation (verzió: 10.02, Agilent Technologies, Inc., Wilmington, DE, USA) programot használtam. A szoftver nem tudja vezérelni a műszer csápdetektor részét, így ehhez egy másik szoftver is szükséges, mely a holland Syntech cég által fejlesztett GC-EAD 2000 volt (verzió 2.5 Syntech, Hilversum, Hollandia). Az extraktumból minden egyes mérés alkalmával 3 µl-t injektáltam, és friss hím csápot preparáltam fel. Az egymást követő mérések összevethetősége végett, illetve a csúcsok mennyiségi meghatározásához egy ismert szerkezetű és mennyiségű úgynevezett, belső standardot koinjektáltam (1 µl, 50 ng/µl, decenil-acetát S10Ac). A csápválaszt kiváltó ismeretlen szerkezetű csúcsok retenciós ideje az ismert szerkezetű standard retenciós idejének ismeretében a beállított kromatográfiás paraméterek jegyében (hőmérsékleti program) értékes információt jelentenek a további tömegspektroszkópiás szerkezetmeghatározáshoz. Továbbá, ha egy ismeretlen vegyület retenciós ideje egy standard sorozat két tagjának retenciós ideje közé esik, akkor logaritmikus interpolációval megadható az ismeretlen vegyület retenciós indexe (RI). A retenciós index az adott vegyületre jellemző és 65

66 adott kromatográfiás állófázison, izoterm körülmények között független az oszlop paramétereitől, nyomás- és áramlási értékektől. Az EAG aktív csúcs retenciós indexének megállapításához további ismert szerkezetű standardeket injektáltam (S14:Ac, Z11-14:Ac). A szerkezetazonosítást és szintézist David R. Hall professzor végezte Angliában, a Natural Resources Institute, University of Greenwich laboratóriumában Kétválasztásos viselkedési kísérletek Y-olfaktométerrel A kétválasztásos biotesztek egy kis méretű rovarokra is alkalmazható készüléke az Y- olfaktométer. A vizsgálatokat a Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp, Svédország, Chemical Ecology laborjában végeztem el. A készülék központi részét egy Y alakú üvegcső alkotja, melynek mindkét ága 14 cm hosszú és 22 mm belső átmérőjű. Az Y csövek végéhez csiszolatos üvegszűkítők csatlakoztathatóak, melyekben kis üvegcsonkba helyezhetőek el az 1x1 cm nagyságú szűrőpapírra rámért stimulusok. Az Y üvegrész és a szűkítők közé finom szövésű textilhálót tettem, amely megakadályozta, hogy a hímek a stimulusok mögé repülve a csőrendszerbe kerüljenek és összeszennyezzék azt. Az üvegszűkítőkhöz megfelelő belső átmérőjű tefloncsövek csatlakoztathatók, melyek a pumpa (Fürgut DC-12/08FK, Tannheim, Németország) felöl szállítják a levegőt. Előzetesen a levegő egy aktív szénnel töltött 250 ml gázmosó palackon majd egy desztillált vízzel töltött palackon haladt át. A szűrt és párásított levegő egy szabályzó áramlásmérőn haladt keresztül (BA-4AR, Kytola, Muurame, Finland), amellyel szabályozható a megfelelő áramlási sebesség, ez gubacsszúnyogoknál általában 0,6 l/perc. Az Y- olfaktométer egy nagyméretű dobozban foglalt helyet, mely előröl nyitott lehetővé téve a kísérleti állatok vizuális megfigyelését hátulról pedig fehér szövettel borított. A hátsó rész felől a szöveten át egy erős lámpával (400W) világítottam meg a készüléket. A méréseket reggel 9 órától 12 óráig végeztem, 25 C és 70 % relatív páratartalom mellett. A hím gubacsszúnyogokat egyesével helyeztem bele az Y üvegcső szárába és 3 percig figyeltem a viselkedésüket. Amennyiben egyszer már választottak a két stimulus között, a mérést befejezettnek tekintettem. A mérés során amennyiben a hím az Y egyik ágában félútig már eljutott (7 cm-t már megtett) azt az adott stimulus választásának tekintettem. 66

67 Amely hímek 3 perc alatt sem választottak, azokat a nem választott csoportba soroltam és nem vettem figyelembe a statisztikai kiértékelésnél. Tíz egymást követően vizsgált hím után a szűrőpapírt kicseréltem és egy tiszta darabra újra rámértem az adott enantiomert. Az oldalhatás kiküszöbölése végett az Y üvegcsövet a stimulusokkal együtt átfordítottam minden tíz vizsgált hím után. Minden méréssorozat után az üveg és teflon alkatrészeket meleg vízzel majd acetonnal átmostam, és 350 ºC-on kihevítettem egy éjszakán át (10 óra hosszan). Első lépésben az oldószer vagy esetleges szennyeződéseinek vonzó hatását szűrtem ki a n-hexánt vizsgálatával, hexán-hexán összehasonlításban. Az első kísérletsorozatban a szabadföldi csapdázás mintájára a két enantiomerrel, (R) és (S) dolgoztam. Hexánnal hasonlítottam össze külön-külön mindkettőt, majd a két komponenst egymással három különböző dózisban (1 ng, 10 ng, 100 ng). A következő kísérletsorozatban a két enantiomerből összeállított különböző arányú keverékeket vizsgáltam meg. Az 1:1 (R:S) arány (racém), a 2:1, a 3:1 és a 9:1 arány szerepelt az összehasonlítások között 10 ng-os dózisban n-hexánnal és páronként egymással. A továbbiakban csak a racém és a 9:1 arányról fogok említést tenni. Az eredményeket Chi-négyzet teszttel értékeltem ki (StatView 4.5 Software, Abacus Concepts Inc., Berkeley, USA) Pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) Az single sensillum recording (SSR) vizsgálatokhoz mintegy előtanulmányként megvizsgáltam a lepényfa-gubacsszúnyog csápjának felépítését, a szenzillák elhelyezkedését és az ivarok eltérő csápmorfológiáját elektronmikroszkóppal (SLU Svédország, Alnarp). A vizsgálatokhoz az imágókat 96%-os etanolban tároltam és fixáltam a preparálásig. Majd további dehidratáláshoz acetont használtam preparálás előtt. A fejeket levágtam és mind a nőstényeknél mind pedig a hímeknél 2-2 darabot anterior, 2-2-öt poszterior irányban preparáltam fel, hogy a csápoknak mindkét oldalát megvizsgálhassam. A fejeket egy 1 cm átmérőjű alumínium platformra kétoldalas speciális ragasztószalag segítségével preparáltam fel sztereomikroszkóp alatt. Majd a minták arany : palládiummal (80:20) kerültek bevonásra. A vizsgálatokat JOEL6500 LV típusú pásztázó elektronmikroszkóppal végeztük. 67

68 4.9. Ingerület elvezetés egyedi szaglószőrről (SSR) vizsgálatok A mérésekhez elengedhetetlen, hogy a vizsgált imágó mozdulatlan állapotban legyen, ehhez kifejlesztettem egy saját preparálási módszert a feromoncsapdákhoz használt ragacslap (Csalomon RAG, MTA Növényvédelmi Kutatóintézet) segítségével. Az élő gubacsszúnyogot tárgylemezre kétoldalú ragasztószalaggal rögzített 1x1 cm-es ragacslap darabra helyeztem. Óvatosan mikroszkóp alatt kiterítettem és a ragacsba rögzítettem a lábait, majd a szárnyait. A csápokat egymás mellé párhuzamosan előre kinyújtva szintén rögzítettem a ragacsban. A potenciálváltozás méréséhez 0,125 mm vastag wolfram elektródot használtam, melyek gyárilag nem elég hegyesek, ezért elektrolitikusan kihegyeztem őket. Injekciós tűbe töltött telített KNO 2 oldathoz pozitív töltést kapcsoltam, míg az elektród befogására alkalmas manipulátorra negatív töltést. A wolfram elektródot pillanatokra beletolva a KNO 2 oldatba annak csúcsi része kellően kihegyezhető. A vizsgálatokhoz két elektródra volt szükségem. Először a referencia elektródra, melyet leggyakrabban a gubacsszúnyog torába, ritkábban az összetett szembe szúrtam. A másik a felvételező (recording) elektród, melyet jóval hegyesebbre készítettem és mikroszkóp alatt egy piezoelektromos mikromanipulátor (DC-3K, Märzhäuser, Wetzlar-Steindorf, Németország) segítségével a csáp egyetlen szenzillumának az alapi részébe szúrtam. A felvételezéseket mindig a csáp első 1-5 csápízén végeztem. A felvételező elektród beszúrása után a sikeres kapcsolatot a szagló receptor idegsejt (ORN) spontán aktivitása már jelezte, illetve minden mérés előtt egy teszt stimulus sorozattal ellenőriztem a kapcsolat minőségét, érzékenységét. A jel erősítését és digitalizálását IDAC-4 interface segítségével, a szoftveres feldolgozást az Autospike32 programmal végeztem (Syntech, Hilversum, Hollandia). Az egész vizsgálatot mikroszkóp (Olympus BX51W1) alatt 20 és 200x-os nagyítással végeztem. A vizsgálni kívánt szenzillum ingerléséhez 0,1; 1; 10 µg-os stimulosokat a 4.4. Stimulusok elkészítése fejezetben már leírt módon készítettem. Az 1x1 cm-es szűrőpapír darabokat belecsúsztattam Pasteur-pipettába majd mikropipettával rájuk mértem a vizsgálandó enantiomert vagy racém keveréket 10 µl hexánban oldva. Sikeres s. trichodeum felvételező wolfram elektród kontaktus esetén, elkezdtem az ingerlést a stimulosokkal (ún. stimulus sor). Minden szenzillum esetében üres, majd oldószeres (10 µl n-hexán) ingerforrás volt az első, melyek után véletlenszerűen következett az (R)-enantiomer, az (S)-enantiomer vagy a racém keverék növekvő dózisban, végül ismét oldószeres és üres stimulussal záródott a mérés. A 68

69 szenzillum spontán aktivitása esetén mindig megvártam, míg a tüzelésmintázat visszatér alapállapotba mielőtt a következő stimulussal ingereltem volna. Ingerléskor a megfelelő Pasteur-pipettát egy szilikoncsővel csatlakoztattam a stimulus szabályzó egységhez (Stimulus Controllers CS 55, Syntech, Hilversum, Hollandia). A pipetta csúcsát pedig a csáphoz irányított, aktív szénnel szűrt majd párásított állandó légsebességű (0,5 ml/s) légáram üvegcsövébe illesztettem. A stimulus szabályzó egység minden egyes esetben 0,5 mp hosszan ingerelte a csápot az adott stimulussal. Sikeres szenzillum-kontaktus esetén minden szenzillumon csak egyszer teszteltem végig a stimulus-sort, majd újabb sensillum trichodeumot kerestem a további vizsgálatokhoz. Megvizsgáltam a gubacsszúnyogok unikális szaglószőrét, a s. circumfilum-ot is a hímek csápján. Ezzel az összetett szenzillummal négy alkalommal sikerült értékelhető kapcsolatot létrehozni az SSR vizsgálat során. A szexferomon enantiomer, az antipódja és a racém keverék vizsgálatán túl tápnövény-illatanyagokat is teszteltem a szenzillumon. A tövises lepényfa (G. triacanthos) és a tövis nélküli, sárga lombszínű fajta (G. triacanthos Sunburst ) hajtásairól, zárt rendszerű légtérből történő illatanyag visszagyűjtés módszerével készítettem kivonatokat. Az illatanyagok összegyűjtését 100 mg Super Q polimer adszorbenssel (Altech Associates, Deerfield, Illinois, USA) töltött filterrel végeztem. Az filteren megkötött illatanyagokat 400 µl n-hexánnal vittem oldatba. A kivonatokból a fermonhoz hasonlóan stimulusokat készítettem a pipettában elhelyezett szűrőpapír darabra 20 µl-t mértem rá a tápnövény-kivonatokból. Sikeres szenzillum kapcsolat esetén üres kontroll, oldószeres kontroll után vizsgáltam a tápnövényből készült kivonatok hatását. Az SSR vizsgálat során kiváltott akciós potenciál nagyságáról a tüskék, az ún. spike-ok száma és mintázata (tüskehullám) alapján alkothatunk véleményt. Az ingerlés pillanatában illetve azt megelőzően is lehetnek spontán válaszok, melyek a mérést befolyásolják, ezért az ingerlés utáni 1 mp alatt tapasztalt tüskék számából ki kell vonni az ingerlés előtti 1 mp alatti tüskék számát. Az üres és az (R)-enantiomer illetve antipódjának összehasonlításához kétmintás varianciaanalízist végeztem, majd ezt követően az mintaátlagokat páronként összehasonlítottam Tukey-féle post hoc teszttel (STATISTICA 6.0 Statsoft, Tulsa, Oklahoma, USA). 69

70 4.10. Szexferomon-csapdázás szintetikus feromonnal A meghatározott és szintetikus úton előállított lepényfa-gubacsszúnyog szexferomont és antipódját az EAG vizsgálatok után szabadföldön teszteltem. A tesztekhez átlátszó falú cserélhető ragacslapos delta csapdatípust használtam (Csalomon RAG, MTA Növényvédelmi Kutatóintézete). A komponenseket vörös gumigyűrű hordozóra (diszpenzer) mértem rá (MSZ 9691/6, Taurus, Budapest). A csapdatestben egy 10x16 cm-es cserélhető ragacslap (Tangle Trap, Tanglefoot Co., Grand Rapids, MI, Egyesült Államok) segítségével csapdáztam a hímeket. A kísérleteket G. triacanthos Sunburst fasoron végeztük. A csapdák 2 m magasan a koronában, egymástól 10 méterre voltak elhelyezve. A csapdákat naponta illetve a rajzás megindulása után naponta kétszer, reggel (8:00) és délután (16:00) ellenőriztem és cseréltem a ragacslapokat. Az első csapdázás során külön vizsgáltam az (R)- és az (S)-enatiomert illetve a racém keveréket is. A csapdák véletlen blokk elrendezésben kerültek kihelyezésre, hét ismétlésben. Az első csapdázást június 1-3. között végeztem. Az (R) és az (S) csalétkek külön-külön µg-os dózisban tartalmazták az egyes enantiomereket, a racém csapdák csalétkei µg (R)- és (S)-enantiomer dózisban. A második csapdázási kísérletben az (R)-enantiomert és a racém keverékeket különböző dózisban értékeltem, három ismétlésben, június között. A kísérletbe 1, 3, 10, 30 µg-os dózisokat hasonlítottam össze. A racém keverék mind az (R)-, mind az (S)- enantiomerből tartalmazta az említett dózisokat (például (R) 1µg + (S) 1µg), így 2, 6, 20, 60 µg volt az összanyagmennyiség a kibocsátókon. A csapdákat rajzáskor naponta kétszer ellenőriztem reggel és kora délután. A napi fogási adatokat log(x+1) alapján transzformáltam és varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltem, majd Games-Howell post-hoc teszttel páronként összehasonlítottam a kezeléseket. A harmadik csapdázási kísérletsorozatban az (R)- és az (S)-enantiomer optimális arányát kívántam megtalálni. Annak ellenére, hogy a természetes feromonkivonatból, gázkromatográfiás elválasztással, királis oszlopon az (S)-enantiomer jelenléte nem volt egyértelműen kimutatható, azaz az 1%-os detektálhatósági szint alatt volt, az (R)- enantiomerhez képest, ennek ellenére, feltételeztem, hogy a faj kémiai kommunikációjában szerepet játszik. A racém keverék mellett vizsgáltam a 95:5 R:S enantiomer arányt is, 3 70

71 dózisban (0,3; 1; 3 µg), összehasonlítva az (R)-enantiomer azonos mennyiségével. A csapdák véletlen blokk elrendezésbe kerültek kihelyezésre 4 ismétlésben, július között. A csapdákat naponta ellenőriztem, a napi fogási adatokat log(x+1) alapján transzformáltam és varianciaanalízissel (ANOVA) értékeltem, majd Games-Howell post-hoc teszttel páronként összehasonlítottam a kezeléseket. 71

72 5. EREDMÉNYEK 5.1. Csalogató viselkedés és annak napszaki ritmusa A szabadföldi megfigyeléseim alapján a bábból kikelt nőstények felkeresik a kedvelt tojásrakó helyeiket, a friss hajtáscsúcsokat és ott elhelyezkedve kitolják potrohukból a tojócsövüket és felveszik a csalogató testhelyzetet. Kedvelik a napsütötte koronarészeket, ahol már 8 órától elkezdik a csalogatást. Mind a szabadföldi, mind a laboratóriumi megfigyelések azt mutatták, hogy egy nősténynek egyszerre több hím (5-10 darab) is udvarol és próbál vele párosodni. A csalogatás a déli órákban befejeződött és a délután folyamán nem figyeltem meg csalogató nőstényeket. A laboratóriumi, Petri-csészés kísérletek eredményei azt mutatták, hogy a nőstények a kiválasztott hímmel átlagosan 19,6 ± 1,7 másodpercig párosodtak (N = 25), de eközben is több hím próbált hozzáférkőzni a nőstényhez. A párosodott nőstényeket másnap tovább figyelve már nem mutattak csalogató magatartást. Frissen kikelt hímeket helyezve be hozzájuk, azok csak véletlenszerűen találtak rá a nőstényekre. A találkozások rövid ideig tartottak, a hímek elveszítve érdeklődésüket a már párosodott nőstények iránt, tovább keresgéltek Elektroantennográfia (EAG) Az elkészített kivonatok vizsgálata során a hangsúlyt az 1800 szűz nőstény illatanyagát tartalmazó, legnagyobb kivonatra fektettem. A preparált hím csáp szignifikánsan jóval nagyobb EAG választ adott a feromon kivonatra, mint a hexánra, illetve az üres (levegő) stimulusra (14. ábra). A kivonatra a hím csáp átlagosan 0,250 mv ± 0,016 mv, míg a hexánra 0,043 mv ± 0,004 mv-os választ adott (P<0,05). Az üres levegő az alapvonaltól alig megkülönböztethető választ váltott ki, 0,003 mv ± 0,011 mv azaz minden bizonnyal csak a mechanoreceptorokat hozta ingerületbe. Az EAG vizsgálattal bebizonyosodott, hogy a kivonat biológiailag aktív, tehát valóban sikerült kivonni a nőstények által kibocsátott szexferomont. 72

73 14. ábra. Elektroantennográfiás válaszok hím lepényfa-gubacsszúnyog csápjáról levegő, oldószer (hexán) és a szexferomon kivonatra Bioszenzoros (csápdetektoros) gázkromatográfiás vizsgálatok (GC-EAD) Az EAG vizsgálattal biológiailag aktívnak bizonyult kivonatokat bioszenzoros gázkromatográffal vizsgáltam tovább, hogy kiderítsem, az EAG választ egy vagy több anyag váltotta-e ki. A vizsgálatokat többször megismételve, minden alkalommal frissen preparált hím csápon, sikerült kimutatni, hogy a kivonatban csak egy anyag váltott ki választ a csápból, melynek retenciós ideje RT: 14,84 min volt (15. ábra). Szintetikus referencia vegyületek (standard) injektálásával (S10:Ac 8,80 min, S14:Ac 12,99 min, Z11-14:Ac 14,87 min) meghatároztam a feltételezett feromon komponens retenciós indexét, mely a tömegspektroszkópiás szerkezet-meghatározáshoz jelentett nagy segítséget. Ezek alapján a csápválaszt kiváltó anyag retenciós indexe RI: 1597-nek adódott. 73

74 15. ábra. Hím lepényfa-gubacsszúnyog csápjával végzett bioszenzoros gázkromatográfiás (GC-EAD) mérés részlete. Alul a gázkromatográf detektorának kromatogramja (FID), felül pedig a csápdetektor (EAG) görbéje látszik. A hím csápja fajtárs nőstény feromonkivonatának aktív komponensére, a feltételezett feromonra válaszol 14,84 percnél Kémiai szerkezet-meghatározás (GC-MS) A 4.6. Bioszenzoros (csápdetektoros) gázkromatográfiás vizsgálatok (GC-EAD) alfejezetben már megemlítettem, hogy a szerkezet-meghatározást és a szintézist Prof. David R. Hall (Natural Resources Institute, University of Greenwich) végezte, ezért a részletek mellőzésével csak a végeredmény ismertetésére szorítkozom. 74

75 A kivonatban az EAG aktív anyaga a GC-MS vizsgálatok alapján a (Z)-2-acetoxi-8- heptadecén (Z8-17:2Ac) volt. Ez a feromonmolekula korábban rovarok kémiai kommunikációjában nem volt ismert A feromon molekula szintetikus enantiomerjei A hím csáp elektroantennográfiás válaszát kiváltó anyag a kémiai szerkezetmeghatározás alapján a (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén (Z8-17:2Ac) volt. A vegyületnek van egy királis központja, azaz két egymásnak tükörképi (optikai) izomerje, ún. enantiomerje létezik (16. ábra). Professzor David R. Hall enantiomerszelektív szintézissel előállította a vegyület mindkét enantiomerjét, az (R)- és az (S)-enantiomert is. A szintézis eredményeképpen a (2S,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén, azaz az (S)-enantiomer 99,0%, a (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén, azaz az (R)-enantiomer 99,1%-os enantiomerikus tisztaságú (enantiomeric excess, ee) volt. A nőstények által kibocsátott és összegyűjtött kivonat királis oszlopon (CP-Chirasil-DexCB) történő elválasztása során kiderült, hogy az aktív anyag retenciós ideje az (R)-enantiomerrel esik egybe, azaz (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén. Az enantiomerszelektív (királis) gázkromatográfiás oszlopon történt mérés alapján az antipód, (S)-enantiomer mennyisége nem haladta meg a kivonatban a detektálhatósági szintet (<1%), így jelenléte egyértelműen nem volt bizonyítható (17. ábra). Tehát a lepényfa-gubacsszúnyog szexferomonjának feltételezhető főkomponense az (R)-enantiomer vagyis a (2R,8Z)-2-acetoxi- 8-heptadecén. 16. ábra. A (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén, a lepényfa-gubacsszúnyog szexferomon molekulájának térbeli modellje ( nyomán) és a két enantiomerje síkban ábrázolva (David R. Hall nyomán). 75

76 17. ábra. Gázkromatográfiás futás részlete királis oszlopon. Három különböző futás összevetése azonos skálán: a feromon kivonat (középen), a szintetikus racém (Z)-2-acetoxi-8- heptadecén (alul) és a kettő egy futásban ko-injektálva (felül) látható. Jól látható az (R)- enantiomer egyezése a feromon kivonat aktív komponensével. Az (S)-enantiomer nyomnyi mennyiségét a feromon kivonatban nyíl mutatja (David R. Hall nyomán) A feromon molekula szintetikus enantiomereinek biológiai aktivitás vizsgálata csápdetektorral (EAG) A szintetikus feromon enantiomerek biológiai aktivitását külön-külön, és a racém keverékben EAG-vel hím csápon ellenőrizve különböző dózisban, azt találtam, hogy az (R)- enantiomer minden egyes dózisban (0,3; 1; 3; 10 ng) szignifikánsan nagyobb elektroantennográfiás választ váltott ki a hím lepényfa-gubacsszúnyog csápján, mint a hexán (P<0,05) (18. ábra). Az (S)-enantiomer ezzel szemben csak a 3 ng-os dózisban különbözött szignifikánsan a hexántól (P<0,05). A racém keverék, 3 és 10 ng-os dózisban erősebb választ váltott ki, mint az (S)-enantiomer (P<0,05). A vizsgálatok azt mutatták, hogy a hímek csápja az (R)-enantiomerrel ingerelhető. Amennyiben 50-50%-ban kevertük a két enantiomert, a relatív csápválaszok nem különböztek szignifikánsan 3 és 10 ng-os dózisban sem, az (R)- enantiomerhez képest. 76

77 18. ábra. A hím lepényfa-gubacsszúnyog csáp elektroantennográfiás válaszai dóziskísérletben szintetikus feromon enantiomerekkel. A csápválaszokat a természetes feromon kivonatra adott csápválaszra normalizáltuk (100%), ahol az (R)-enantiomer = 2,8 ng Szabadföldi csapdázás a sztereoszelektíven előállított szexferomonnal, antipódjával és a racém keverékkel Az első csapdázás során a szintetikusan előállított feromon, antipódja és a racém keverék szabadföldi biológiai aktivitását vizsgáltam. A racém (Z)-2-acetoxi-8-heptadecénnel illetve az (R)- és (S)-enantiomerekkel csalétkezett csapdák eltérő számban csalogatták a lepényfa-gubacsszúnyog hímeket (F 3,24 = 101,2; P= 0,001). Az (R)-enantiomer többet fogott, mint a racém keverék (P<0,05). Az antipóddal csalétkezett csapdák gyakorlatilag hatástalanok voltak, a csapdák 34-szer kevesebb hím szúnyogot csalogattak, mint a racém csapdák, de a kontroll csapdáknál szignifikánsan többet (P<0,05) (7. táblázat). Az első szabadföldi vizsgálatok alkalmával bebizonyosodott, hogy az (R)-enantiomer vonzóképessége a leghatékonyabb a lepényfa-gubacsszúnyog hímek csapdázására. 77

78 7. táblázat. Átlagos napi csapdafogási adatok hím lepényfa-gubacsszúnyoggal, (R)- az (S)- enantiomer és a racém (Z)-2-acetoxi-8-heptadecénnel csalétkezett csapdákból (Budapest, Lágymányosi-híd pesti hídfő, július 1-3.). Kezelés Dózis (µg) Átlagos napi fogás (db) ± standard hiba (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén ,0 ± 44,2 a (2S,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén 10 2,4 ± 0,9 c Racém (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén 20 81,0 ± 17,4 b Kontroll - 0,7 ± 0,5 c Fogott hímek száma összesen: 2147 db A második csapdázási kísérletben az (R)-enantiomert és a racém keveréket hasonlítottam össze négy különböző dózisban (1, 3, 10, 30 µg). Az elvégzett varianciaanalízis különbséget mutatott a kezelések között (F 8,18 = 6,436; P<0,001), azonban az elvégzett post hoc teszt már nem mutatott szignifikáns különbséget, köszönhetően a fogási adatok nagy szórásának. Az (R)-enantiomer 1, 3, 10, 30 µg-mal illetve a racém 2, 6, 20, 60 µg-mal csalétkezett csapdák hasonló számban csalogatták a lepényfa-gubacsszúnyog hímjeit (P>0,05) (19. ábra). A kezelések, kivéve a racém keverék 2 és 6 µg-os dózisát, szignifikánsan több hímet vonzottak, mint a kontroll csapdák. Az (R)-enantiomer 30 µg-os dózissal csalétkezett csapdái fogták számszerűen a legtöbb hímet, a napi átlagos fogás megközelítette a hétszáz darabot. 78

79 19. ábra. A második szabadföldi csapdázás. Az (R)-enantiomer és a racém keverék vonzóképességének összehasonlítása négy dózisban (Budapest, Lágymányosi-híd, pesti hídfő, június ). A harmadik szabadföldi feromoncsapdázási kísérletben azt a hipotézist vizsgáltam, hogy vajon az (S)-enantiomer kis százalékban hozzáadva az (R)-enantiomerhez, eredményez-e fogásnövekedést a feromoncsapdákban. Erre az adott alapot, hogy a feromon kivonatban nem lehetett kizárni az antipód jelenlétét, még ha csak nyomokban is tartalmazta azt. Az összehasonlításba bevontam a racém keveréket is. Mind a három dózisban (0,3; 1; 3; µg) a racém keverék vonzotta számszerűen legkisebb számban (9,5; 18,5; 35,5) a hím gubacsszúnyogokat. A 0,3 µg-os dózisban a racém keverékkel csalétkezett csapda fogása szignifikánsan nem különbözött a kezeletlen kontrolltól, akárcsak a második csapdázásnál (19. ábra). Mindhárom dózis esetén a 95:5 R:S enantiomer arányú eleggyel csalétkezett csapdák fogták számszerűen a legtöbb hímet (68,8; 90,7; 126,8) közel kétszer nagyobb számban de az értékek nagy szórása miatt egyik dózisban sem szignifikánsan többet, mint az (R)- enantiomer (37,4; 50,4; 68,7) (20. ábra). Mind a három kezelésnél megfigyelhető a dózishatás, az emelkedő dózisokhoz növekvő számú fogások párosulnak. 79

80 20. ábra. A harmadik szabadföldi csapdázás: Az (R)-enantiomer, a racém keverék és a 95:5 R:S enantiomer arányú elegy vonzóképességének összehasonlítása, három dózisban (0,3; 1; 3 µg) (Budapest, Lágymányosi-híd, pesti hídfő, július 3-13.) Az Y-olfaktométeres vizsgálatok Az első kísérletsorozat során 30 hímet reptetve a hexán-hexán összehasonlításban nem volt szignifikáns különbség a két kezelés között (χ 2 =0,6; p<0,5). Az egyik hexán forrást 17, míg másikat 13 hím választotta, tehát az oldószer nem gyakorol vonzó hatást a hímekre, a választások véletlenszerűek voltak. Az enantiomerek összehasonlításában 50 hímet vizsgálva kezelésenként, mind a három dózisban (1, 10, 100 ng) azonos tendencia mutatkozott. Az (R)- enantiomer szignifikánsan több hímet vonzott, mint a hexán, ellentétben az (S)-enantiomerrel, mely nem különbözött szignifikánsan a hexántól. A két enantiomer összehasonlításakor mindhárom dózisban az (R)-enantiomer bizonyult szignifikánsan jobb csalogatónak az (S)- enantiomerhez képest. A 21. ábrán szemléltetésképpen a 100 ng-os dózisnál mért eredményeket mutatom be. A 8. táblázatban összesítve mind a három dózisban mért eredményeket foglaltam össze. 80

81 * ns * 21. ábra. Kétválasztásos Y-olfaktométeres vizsgálat hím lepényfa-gubacsszúnyogokkal (n=50). Az (R)- és (S)-enantiomer összehasonlítva az oldószeres kontrollal, és egymással, 100 ng-os dózisban. 8. táblázat. A kétválasztásos Y-olfaktométeres vizsgálatok eredményei. Összehasonlítva az (R)- és (S)-enantiomert egymással és oldószeres kontrollal három dózisban (1, 10, 100 ng). Dózis (ng) Kezelés 1 / Kezelés 2 (vonzott hímek száma) Khi-négyzet Szig. dif. Szignifikancia R 34 hex 11 χ 2 =0,068 p<0,5 * S 24 hex 21 χ 2 =0,178 p<0,5 ns R 31 S 15 χ 2 =9,78 p<0,001 * R 34 hex 10 χ 2 =24,04 p<0,001 * S 23 hex 21 χ 2 =0,045 p<0,5 ns R 23 S 11 χ 2 =7,12 p<0,001 * R 31 hex 9 χ 2 =22,05 p<0,001 * S 20 hex 20 χ 2 =0 p<0,5 ns R 35 S 12 χ 2 =20,59 p<0,001 * 81

82 A második kísérletsorozatban a racém keverék és a 9:1 R:S enantiomer arány került összehasonlításra. Mindegyik összehasonlításban mind a 30 hím aktív volt és választott a stimulusok között. Mind a racém keveréket, mind pedig a 9:1 arányt összehasonlítva a hexánnal szignifikáns különbséget tapasztaltam a kezelések javára. A 9:1 arányú stimulus számszerűen több hímet vonzott hexán ellenében, mint a racém keverék (22. ábra). A különböző enantiomer arányokat szembeállítva egymással a 9:1 arányú keverék kétszer több hímet csalogatott, mint a racém stimulus, ez szignifikáns különbségnek adódott. Utolsó lépésben a 9:1 arány és az (R)-enantiomer vonzóképességét összevetve, szignifikáns különbséget tapasztaltam a 9:1 enantiomer arány javára. 22. ábra. Kétválasztásos Y-olfaktométeres vizsgálat eredménye, összehasonlítva egymással a racém keverék, a 9:1 R:S enantiomer arány és az (R)-enantiomer hím lepényfa-gubacsszúnyogokra gyakorolt vonzóképességét (N = 30). 82

83 5.9. Elektronmikroszkópos vizsgálatok Mind a hím, mind pedig a nőstény lepényfa-gubacsszúnyog csápja csápízből, szubszegmensből épül fel (23. ábra), melyek két alapi csápízzel a csáptőízzel (scapus) és csápcsuklóízzel (pedicellus) kapcsolódnak a fejhez. A 23. ábra. Hím és nőstény lepényfa-gubacsszúnyog csáp montázsa, 250x nagyításban (A). A hím csáp első csápízei nem látszanak a fej takarásában. A hím csápon jól látszik, hogy egy csápíz egy kerekded és egy hengeres szubszegmensből áll (B). A nőstény csápízek közvetlenül kapcsolódnak egymáshoz (C) (saját felvétel). 83

84 A csáptőíz mindkét ivarnál sűrű mikroszőrökkel (microtrichia) fedett, nincsen rajta érzékszőr, ellentétben a csápcsuklóízzel, amely már tartalmaz körkörösen elhelyezkedő érzékszőröket (sensillum chaeticum) (24. ábra) a mikroszőrök között. A csápcsuklóíz bár már hordoz érzékszőröket, alakja eltér a többi csápíztől, lapított, széles gömbölyded. A hímek csápjai hosszabbak körülbelül 0,7 mm ± 0,03 mm (N = 5), a nőstények csápjához képest 0,51 mm ± 0,04 mm (N = 5). A csápízek mindkét nemnél kerekdedek, a hímeknél a csápízek egy karcsúbb, hengeres szubszegmens résszel csatlakoznak egymáshoz, így mintegy nyelet alkotva minden kerekded szubszegmens között (23. ábra). Ez az oka, hogy a hím szúnyogok csápja hosszabb a nőstényekénél. A hímek csápízei hozzávetőlegesen 71 µm ± 1,4 µm (N = 10) hosszúak, ennek körülbelül az egyharmadát teszi ki a nyeles csápíz rész. A nőstények csápízei átlagosan 50,4 µm ± 1,02 µm (N = 10) hosszúak (23. ábra). 24. ábra. Nőstény lepényfa-gubacsszúnyog első négy csápíze 1000x nagyításban. Az első csápíz a csáptőíz, a második a csápcsuklóíz, majd az uniform csápízek következnek. (S) scapus, (P) pedicellus, (Ö) összetett szem, (Cs) csápíz (saját felvétel). 84

85 A csápízeken sikerült megfigyelni három típusú kemoszenzillumot, a sensillum circumfillum-ot, a sensillum trichodeum-ot, és a sensillum coeloconicum-ot, továbbá két mechanoreceptor érzékszőrt a sensillum cheaticum-t és a terminális érző csapot (terminal sensory peg). A mechanoreceptorokat a morfológiai megfigyeléseken túl nem vizsgáltam. A sensillum circumfilum mindkét nemnél megtalálható, de a nőstényeknél sokkal összetettebb szerkezetű (25. ábra), gyakran alkot a csápízen zárt hurkokat, gyűrűket, melyeket a hím csápon nem figyeltem meg. A szenzillum a csápízt teljesen körülöleli, hímeknél egyszer, a nőstényeknél gyakran kétszeresen. Megfigyelhető, hogy a nőstényeknél a s. circumfilum sokkal szorosabban öleli körül a csápízt, szinte a mikroszőrök közé lapulva. A hímeknél ez a hurok sokkal lazább megjelenést mutat, esetenként eltávolodik a csápíz felszínétől (25. ábra). A s. circumfilum egy komplex szenzillum, több ponton is kapcsolatba lép a csáp felszínével, ami gyakorlatilag azt jelenti, hogy akár darab összeolvadt szenzillum funkcionális és szerkezeti egysége alkotja, mint azt Boddum is megállapította a cirok-, a káposztagubacsszúnyognál illetve a hesszeni légynél (26. ábra) (Boddum, 2007). 25. ábra. A nőstény (balra), és a hím (jobbra) lepényfa-gubacsszúnyog sensillum circumfilum szaglószőre (nyíl jelöli) (saját felvétel). 85

86 26. ábra. Sensillum circumfilum nőstény lepényfa-gubacsszúnyog csápján. A nyilak jelölik az egyes szenzillum kapcsolódási pontjait a kutikulával (saját felvétel). A sensillum trichodeum érzékszőrök mindkét nemnél a csápízek középső részéhez közel, körkörösen helyezkednek el a sensillum circumfilum gyűrűjében. Hosszúak, keskenyek és kardszerűen kihegyesednek. Az érzékszőr az alapi részétől enyhe ívben kihajlik, majd visszagörbülve párhuzamosan fut a csáp csúcsi része felé hossza körülbelül a csápízek hosszával megegyező. Jellegzetes az érzékszőr alapi része, a csáp kutikula ezen a részen zokni vagy lópataszerűen megduzzadt és jól látható a pereme is (27. ábra). A hímek csápján nagyobb számban találtam meg, mint a nőstények esetében. 27. ábra. Sensillum trichodeum mező hím lepényfa-gubacsszúnyog csápján. Látható a szenzillum jellegzetes alapi része a zoknival és a peremmel (saját felvétel). 86

87 A sensillum coeloconicum az előbb említett érzékszőrökhöz képest alig észrevehető. Részben kevés található belőle a csápon, részben a már említett kemoreceptor érzékszőrökhöz képest, mérete azoknak csupán a tizede. Mérete miatt jól elvegyül a csápot borító mikroszőrök között, de a tövi részét körülölelő árok miatt mégsem keverhető velük össze. Mindkét ivar csápján megtaláltam igaz, csápízenként csak 1-5 darabot (28. ábra). Sem a hím sem pedig a nőstény lepényfa-gubacsszúnyog csápján nem találtam sensillum basiconicum szaglószőrt. 28. ábra. Sensillum coeloconicum hím lepényfa-gubacsszúnyog csápján, nyíl jelöli (saját felvétel) Ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről (Single sensillum recording - SSR) vizsgálatok eredményei A SSR-felvételezést összesen 15 hím lepényfa-gubacsszúnyog 20 sensillum trichodeum érzékszőrén végeztem. Egy szenzillumon csak egy méréssorozatot végeztem az enantiomer dózissorral (0,1; 1 ;10 µg). A hím gubacsszúnyogok felpreparálása után a felvételező elektród sikeres beszúrása esetén először a szenzillumban lévő szagló receptor neuron (ORN) spontán aktivitását figyeltem meg, mely már árulkodik a kapcsolat minőségéről (29. ábra). A spontán aktivitás mintázatánál megfigyelhető két eltérő amplitudójú tüske (A és B) a szenzillumban található legalább két szagló receptor neuronról (ORNs) árulkodik (azonos amplitudóval több receptor neuron is kommunikálhat). Az egyik receptor neuron sejt (A) nagyobb, míg a másik sejt (B) kisebb amplitudójú akciós potenciállal bír, így könnyen megkülönböztethetőek egymástól (29. ábra). 87

88 29. ábra. Egy sensillum trichodeum szaglószőrben található szagló receptor neuronok (ORNs) spontán aktivitása (tüskehulláma) hím lepényfa-gubacsszúnyognál. Jól látszik a receptor neuronok különböző amplitudójú akciós potenciálja (A és B). A hím lepényfa-gubacsszúnyog csápján a sensillum trichodeum-ot az (R)-enantiomerrel ingerelve három különböző dózisban (0,1; 1; 10 µg) dózishatást, azaz a tüskék növekvő számát figyeltem meg (30. ábra). A dózisok emelkedésével az akciós potenciál tüskehulláma tovább megmaradt és lassabban tért vissza az alapállapotba. A 10 µg-os dózisban 4-5 másodpercig is eltartott, míg az ingerelt szagló receptor idegsejt (ORN) visszatért az nyugalmi állapotba (30. ábra). 88

89 30. ábra. Dózisfüggő válaszok, tüskehullámok hím lepényfa-gubacsszúnyog sensillum trichodeum érzékszőrről az (R)-enantiomerrel ingerelve 0,1; 1; 10 µg-os dózisban. Az (R)-enantiomer, összehasonlítva az oldószeres kontrollal, mind a három dózisban szignifikánsan nagyobb választ váltott ki az ingerelt szenzillumból (31/A. ábra). Példaként kiemelve a 10 µg-os dózist, nyolc mérés átlagából 55,1 ± 4,5 tüskét, míg az oldószeres stimulus esetén mindösszesen 7,2 ± 0,8 tüskét váltott ki a szenzillumból (31/B. ábra). 89

90 A; B; 31. ábra. Hím lepényfa-gubacsszúnyog sensillum trichodeum-ból kiváltott ORN tüskehullám oldószeres és a feromon stimulusra 10 µg-os dózisban. Az (R)-enantiomerre adott válasz szignifikánsan nagyobb, mint a tiszta oldószerre adott válasz (P<0,05). Az (S)-enantiomer és az oldószeres kontroll összehasonlításkor egyik dózisban sem tapasztaltam szignifikáns különbséget (32. ábra). Kiemelve a 10 µg-os dózist az (S)- enantiomer nyolc ismétlés átlagában 11,7 ± 2,2 tüskét, míg az oldószeres kontroll 7,2 ± 0,8 választ, tüskét váltott ki (32. ábra). Az ingerlés időtartama alatt a 32/A. ábrán bemutatott mérés során tapasztalt tüskehullám mintázat ugyan eltér a spontán mintázattól, de a tüskék száma alapján a különbség nem mutatkozott szignifikánsnak. 90

91 A; B; 32. ábra. Hím lepényfa-gubacsszúnyog sensillum trichodeum-ából kiváltott ORN tüskehullám oldószeres (kontroll) és a feromon stimulusra 10 µg-os dózisban. Az (S)-enantiomer által kiváltott válasz szignifikánsan nem különbözött az oldószerre adott választól (P<0,05). Az enantiomerekkel külön-külön ingerelve a szenzillumot, mindkettő váltott ki akciós potenciál mintázat változást, habár az (S)-enantiomer szignifikánsan nem különbözött a hexántól, ennek ellenére feltételezhetően van receptora mindkettőnek a lepényfagubacsszúnyog sensillum trichodeum szaglószőrében. 91

92 33. ábra. Dózisfüggő tüzelésmintázat hím lepényfa-gubacsszúnyog sensillum trichodeum szaglószőrökről három dózisban külön (R)- és (S)-enantiomerrel illetve racém eleggyel vizsgálva (N = 8) ingerület elvezetés egyedi érzékszőrről módszerével (SSR). A legtöbb akciós potenciál tüskeválaszt az (R)-enantiomer váltotta ki mind a három dózisban, növekvőt az emelkedő dózisoknek megfelelően (33. ábra). Hasonlóan emelkedő tendenciájú, növekedő válaszokat váltott ki a racém keverék is, minden dózisban szignifikánssan többet, mint az (S)-enenatiomer. Az (S)-enantiomer váltotta ki a legkisebb tüzelésmintázatot mind a három dózisban, összehasonlítva a hexánnal szignifikánsan nem különböztek egymástól egyik dózisban. Az (S)-enantiomer esetében dózishatást sem figyelhettem meg. A hímek sensillum circumfilum szaglószőreivel végzett vizsgálatok során a feromonnal, antipódjával és racém eleggyel történt ingerlés során sem tapasztaltam tüskemintázat változást a spontán aktivitáshoz képest egyik dózisban sem. Azonban a lepényfa alapfaj (G. triacanthos) és a sárga levelű, tövis nélküli fajtából (G. triacanthos Sunburst ) készített tápnövény kivonattal ingerelve a szenzillumot az oldószerre adott választól szignifikánsan eltérőt mértem (34. ábra). 92

93 34. ábra. Tüzelésmintázat hím lepényfa-gubacsszúnyog s. circumfilum szaglószőrről G. triacanthos és G. triacanthos Sunburst tápnövényről készült kivonatra. Az ingerlés időtartama 0,5 mp volt A lepényfa-gubacsszúnyog új európai elterjedési területe A lepényfa-gubacsszúnyogot és kártételét elsőként sikerült megtalálnom 2007-ben Svédországban, Alnarpban az SLU Swedish University of Agricultural Sciences (Skåne tartomány) arborétumában G. triacanthos Shademaster és Sunburst fajtán illetve a tövises alapfajon is. Ekkor még fajspecifikus feromoncsapda hiányában a faj egyértelmű azonosításához segítséget kértem Dr. Marcela Skuhráva gubacsszúnyog taxonomustól. A 2008-as év nyarán további két városban, Lundban és Malmöben is sikerült megtalálni a fajt. Ebben az évben már feromoncsapával is nyomon követtem a kártevő rajzásmenetét az alnarpi arborétumban (Molnár és mtsai., 2008). A svédországi faunából korábban nem volt ismert a lepényfa-gubacsszúnyog előfordulása Természetes ellenségek A szabadföldi megfigyeléseim szerint Alnarpban, az SLU Swedish University of Agricultural Sciences arborétumában 2008 nyarán a lepényfa-gubacsszúnyog harmadik nemzedékének egyedszáma a fák fertőzöttségének felvételezése alapján becsültnél jóval kisebb mértékű volt. A gubacsok vizsgálata során kiderült, hogy csak kis százalékukból keltek ki imágók. A gubacsok nagy hányada összeszáradt és benne megtaláltam az elpusztult lárvákat is. Ezzel egyidejűleg a lepényfa hajtásokon nagyszámú poloska imágót figyeltem meg. A 93

94 poloskák a Pinalitus cervinus (syn. Orthops cervinus) (Heteroptera, Miridae) fajhoz tartoztak (det. Dr. Kondorosy Előd). A faj polifág, főleg fás növények több nemzedékes kártevője. A lepényfán eddig, táplálkozását nem figyelték meg. További érdekessége ennek a felbukkanásának, hogy a szívogatása kizárólag a levélkegubacsokra korlátozódott. A meleg, száraz nyáron a poloskáknak az intenzív nedvkeringésű gubacsok jelentették a nyári táplálékot. Szívogatásuk nyomán a gubacsok elszáradtak és a bennük fejlődő lepényfagubacsszúnyog lárvák táplálék hiányában elpusztultak. Közvetve tehát a fitofág P. cervinus imágók szívogatásukkal nagymértékben csökkentették a lepényfa-gubacsszúnyog nyári nemzedékének egyedszámát és ezzel kártételének a mértékét, mind a lepényfa alapfajon mind pedig a G triacanthos Sunburst fajtán. Magyarországon a P. cervinus poloska fajt lepényfán nem találtam meg, kártételével sem találkoztam. Svédországi megfigyelések alapján a lárvákat gyérítették a Chrysoperla carnea Stephens fátyolka faj-komplex lárvái is (det. Dr. Szentkirályi Ferenc). Többször sikerült megfigyelni, ahogy a kifejlett L 3 -as lárvák a lepényfa hajtáscsúcsokon vadásznak. 94

95 6. MEGVITATÁS 6.1. A lepényfa-gubacsszúnyog csalogató viselkedésével kapcsolatos vizsgálatok Az észak-amerikai eredetű lepényfa-gubacsszúnyog szexferomonjának meghatározását a közterületeinken okozott tömeges kártétel és a faj eddig ismeretlen szexferomonja motiválta. A lepényfa várostűrő képessége és dekoratív lombszíne miatt széles körben ültetett dísznövénnyé vált, ami segíti a kártevője felszaporodását. A célzott növényvédelmi kezelésekhez a vizuális megfigyeléseken kívül nem állt rendelkezésre más módszer (Rosetta és mtsai., 1998). A feromoncsapda kifejlesztésének igénye azért merült fel, hogy a rajzáshoz igazodó, célzott növényvédelmi permetezéseket végezhessünk a jövőben. A feromoncsapda segítségével az áttelő nemzedék elleni precízen időzített kezeléssel a teljes tenyészidőre megvédhető lenne a lepényfa állomány. A gubacsszúnyogok családjában az első manapság már tudománytörténeti érdekességnek számító megfigyelések a kémiai kommunikációra 1922-ből származnak (Cartwright, 1922). Cartwright vizsgálatai rávilágítottak, hogy a hesszeni légynél a nőstények termelik a szexferomont. Későbbiekben ezt sikerült bebizonyítani sok más gubacsszúnyog faj esetében például a feketeribiszke-gubacsszúnyog (Garthwaite és mtsai., 1986), borsó-gubacsszúnyog (Wall és mtsai., 1985), almalevél-gubacsszúnyog (Harris és mtsai., 1996) stb. A lepényfagubacsszúnyog párosodási viselkedésére nézve, azonban nem volt irodalmi adat. Megfigyeléseim szerint a lepényfa-gubacsszúnyognál is a nőstények termelik a feromont. A csalogató viselkedés megfigyelésekor kiderült, hogy a nőstények kitolt tojócsővel a fiatal hajtáscsúcsokon foglalnak helyet. Azonban általában nem tudnak sokáig egy helyben várakozni, mert egyszerre több akár 5-10 darab hím is felkeresi őket. A nagy tolongásban teljesen körbeveszik a nőstényt, mely elhagyja pozícióját és a leveleken mászkál tovább a hímektől követve egészen a kiválasztott hímmel történő párosodásig. A gubacsszúnyog fajoknál a nőstények kitolt tojócsöve a csalogató viselkedés jól látható, egyértelmű jele. Isidoro és munkatársai (1992) a repcebecő-gubacsszúnyog nőstényeinél figyelték meg ezt a magatartást. Arra a következtetésre jutottak, hogy ez a feromon kibocsátással függ össze, mivel az elkülönített, nem párosodott nőstények életük végéig ismételték ezt a magatartást, 95

96 ellentétben a már párosodott nőstényekkel. Az almalevél-gubacsszúnyog nőstényei is részben vagy teljesen kitolják tojócsövüket és úgy sétálnak, míg egy hím meg nem találja őket (Harris és mtsai., 1999). Mind a szabadföldi megfigyelések, mind a laboratóriumban fertőzött lombból történt kinevelések alkalmával a hím lepényfa-gubacsszúnyogok jelentek meg először, megelőzve a nőstényeket. Természetesen a hímek előjövetele a továbbiakban is folytatódott, párhuzamosan a nőstényekével. A hímelőzés a gubacsszúnyogoknál általánosan ismert jelenség (Harris és Rose, 1989). A cirok-gubacsszúnyog esetében a hímek bábból történő előjövetelének hőküszöbértéke alacsonyabb, mint a nőstényeké, így azok hajnalban korábban kezdenek el kelni (Summers, 1975). A hesszeni légy hímjei még éjszaka előjöve a bábokból jócskán megelőzik a nőstényeiket (Bergh és mtsai., 1990). Az almalevél-gubacsszúnyog hímjei kevéssel ugyan, de megelőzik a reggeli kelésükkel a nőstényeket (Heath és mtsai., 2005). Saját megfigyeléseim szerint a puszpáng-gubacsszúnyog hímjei napkelte után röviddel már nagy számban repkednek a tápnövényük felett, míg a nőstények csak ezután jelentek meg. A csalogató viselkedés napszaki ritmusa akárcsak az imágókelés napszaki ritmusa a lepényfa-gubacsszúnyognál a reggeli, délelőtti órákra korlátozódik. A legaktívabb időszak reggel 8 órától déli 12 óráig tartott. Délután 1 óráig még elvétve találtam éppen párosodó imágókat, de ekkorra már kikelő gubacsszúnyogot nem tudtam megfigyelni. A déli órákban a hőség elől a gubacsszúnyogok többsége elbújt és megszűnt a reggel tapasztalt erős aktivitás. A párosodás méréseim szerint átlagosan 20 másodpercig tartott (19,6 ± 1,7). Hasonló eredményeket tapasztaltak a levéltetűfogyasztó-gubacsszúnyognál van Lenteren és munkatársai (2002). A repcebecő-gubacsszúnyognál átlagosan mp közötti időtartamig kopuláltak a párok (Williams és Walton, 1990). Ezzel szemben a narancssárga búzagubacsszúnyog kopulációja eltarthat akár 4 percig is (Harris és Foster, 1999) A lepényfa-gubacsszúnyog szexferomonjának meghatározása és annak szerkezete A lepényfa-gubacsszúnyog szexferomonjának meghatározására irányuló vizsgálatokhoz szükségem volt nagyszámú imágó kinevelésére egyidejűleg. A gubacsszúnyogok mesterséges körülmények között, tápnövényeiken tenyészthetőek vagy pedig a bábozódáshoz közeli időpontban begyűjtött növényi részekből keltethetőek. Az utóbbi 96

97 eljárást alkalmazták például a krizantémum- (Liu és mtsai., 2009), a borsó- (Hillbur és mtsai., 1999), a málnavessző-gubacsszúnyog (Hall és mtsai., 2009) szexferomjának meghatározásánál is. A tápnövényen való visszafertőzéses tenyésztés módszerét lepényfa magok elvetésével, nevelésével magam is megkíséreltem, de csak a szintetikus feromonnal történő vizsgálatokhoz próbáltam meg így biztosítani a kísérleti példányokat. Ez a módszer nem bizonyult tömegtenyésztésre alkalmasnak. Tehát fertőzött lombot gyűjtöttem és helyeztem el laborban. A tömegesen kikelő imágókat nemük szerint szétválogattam és csak a nőstényeket helyeztem el a légtérből történő feromon visszagyűjtésre szolgáló closed loop stripping apparatus (CLSA) készülékben. A gubacsszúnyognál irodalomból ismert, hogy a nőstények termelik és bocsátják ki a szexferomont (Cartwrigth, 1922; Williams és Martin, 1986; Garthwaite, 1986). A kibocsátott feromon légtérből való visszafogása egy bevált eljárás a gubacsszúnyogoknál is. Sikeresen alkalmazták a feromon összegyűjtésére például a már említett krizantémumgubacszsúnyognál (Liu és mtsai., 2009) vagy a málnavessző-gubacsszúnyognál (Hall és mtsai., 2009). A feromontermelő-mirigyből készült ún. gland extract azaz mirigy kivonat sikeressége erősen kérdéses, figyelembe véve, a nőstények kis méretét és azt, hogy sokáig pontosan nem volt ismert a feromontermő-mirigy elhelyezkedése. Az egész tojócső eltávolítása benne a feromonmiriggyel ún. ovitositor tip extract azaz tojócső kivonat készítésére sikeres példa a vörös cédrus toboz-gubacsszúnyog (Gries és mtsai., 2005) vagy a duglászfenyő toboz-gubacsszúnyog esete (Gries és mtsai., 2002), ahol biológiailag aktív potrohvég kivonat segített a szexferomon meghatározáshoz. A lepényfa-gubacsszúnyog nőstények zárt rendszerben visszafogott szexferomon kivonata három egymást követő napon a készülékbe helyezett összesen 1800 nőstény feromonját tartalmazta. A bioszenzoros (csápdetektoros) gázkromatográfiával (GC-EAD) a kivonatok aktivitását vizsgáltam tovább. A mérések azt bizonyították, hogy az 1800 nőstényből készült kivonat egy nőstényre vetítve körülbelül 50 pg-ot tartalmazott a főkomponensből (1 FE = 50 pg). Természetesen ez a számítás hozzávetőleges, hiszen nem tudjuk, hogy valójában hány nőstény csalogatott és bocsátott ki feromon. A már említett vörös cédrus tobozgubacsszúnyognál készített 5-10 nőstény equivalens tojócsőkivonat mindössze kb. 100 pg-nyi mennyiséget tartalmazott, ami még éppen megfelel a gázkromatográf detektálhatósági szintjének (Gries mtsai., 2005). A bioszenzoros gázkromatográfiás mérésekhez a csápdetektor referencia üvegkapillárisába a hím gubacsszúnyog fej- illetve torpreparátumát illesztettem, míg a csápot a felvételező elektród üvegkapillárisába illesztettem a mikromanipulátorok 97

98 segítségével. Kis méretű rovarok révén a gubacsszúnyogoknál gyakran alkalmazzák csápdetektorhoz történő preparálásnál az egész rovar befogását. Liu és mtsai., (2009) a krizantémum-gubacsszúnyog esetében egész rovart preparált vizsgálataihoz, de eltávolította szárnyait és lábait A szexferomon enantiomer és antipódja David R. Hall GC-MS mérésekkel kimutatta a kivonataimból, hogy a lepényfagubacsszúnyog szexferomonja a (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén (Z8-17:2Ac). A molekula rendelkezik egy királis központtal, azaz két enantiomerje létezik, melyeket Professzor David R. Hall nagy tisztaságban sikeresen előállított. A GC-EAD mérések során a feromonkivonatra adott csápválasz a szintetikus racém eleggyel királis ciklodextrin oszlopon történt gázkromatográfiás elválasztás nyomán egyértelműen az (R)-enantiomerrel esett egybe, azaz a (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén volt. A gubacsszúnyogok családjában a jelenleg ismert szexfermonokra általánosan jellemző a kiralitás (Foster és mtsai.,1991). A molekula elágazás nélküli tizenhét szénatomszámú heptadekán alapvázú, mely a nyolcadik szénatomján kettős kötést hordoz, tehát telítetlen molekula. Tizenhét szénatomszám hosszú telített vázú molekulát használ szexferomonként például a vörös cédrus toboz-gubacsszúnyog (Gries és mtsai., 2005). Ennél a fajnál a nőstények tojócsövéből készített kivonatra a preparált hím csáp, csápdetektoros gázkromatográffal három egymáshoz közeli választ jelzett. Mindhárom meghatározott aktív sztereoizomer S,S konfigurációjú volt: (S,S)-2,12-, (S,S)-2,13- és az (S,S)- 2,14-diacetoxi-heptadekán. Az (R,S)-,a (S,R)-, és az (R,R)-izomerek nem bizonyultak biológiailag aktívnak. Az (S,S)-izomereket egyesével és páronként összehasonlítva nem találtak szignifikáns különbséget a vonzóképességben. Számszerűen legtöbbet a mindhárom (S,S)-izomert tartalmazó keverékkel csalétkezett csapdák fogták. Érdekes, hogy a gubacsszúnyogoknál napjainkig meghatározott szexferomonok (S)-konfigurációjúak mint az előbb említett vörös cédrustoboz-gubacsszúnyog esetében ellentétben a lepényfagubacsszúnyogéval, amely (R)-enantiomert használ. A borsó-gubacsszúnyog esetében is a meghatározott tizenhárom szénatomszám hosszú, elágazás nélküli molekula (S)-enantiomerjei bizonyultak biológiailag aktívnak: (2S,11S)-, (2S,12S)-diacetoxi-tridekán illetve a 2- acetoxitridekán (Hillbur és mtsai., 1999). Hozzáadva a (2R,11R)-, (2R,12R)- sztereoizomereket a korábban meghatározott keverékhez nem tapasztaltak változást a keverék 98

99 vonzóképességében. Ellenben amikor egyesével a (2R,11S)- és a (2S,11R)-diacetoxi-tridekán diasztereomereket adták a keverékhez az szignifikánsan lecsökkentette a vonzóképességet (Hillbur, 2001). Ez a jelenség megfigyelhető más esetekben is, amikor a feromon molekula két királis központtal rendelkezik (Hall és mtsai., 2009). Például a ragadozó gubacsszúnyognál, ahol a szexferomon a (2R,7S)-diacetoxi-tridekán, a többi diasztereomer (RR, SR, SS) inhibitorként működik, amennyiben a keverékhez adták (Choi és mtsai., 2004). A krizantémum-gubacsszúnyog 2009-ben meghatározott szexferomon főkomponense is (S)- sztereoizomer, nevezetesen a (2S,8Z)-2-butyroxi-8-heptadecén. Az (R)-enantiomer biológiai aktivitást nem mutatott a fajnál (Liu, 2009). Aktívnak bizonyult azonban a főkomponenshez hasonló, de hidroxil-csoportot tartalmazó, alkohol molekula (alkohol származék) a (Z)-8- heptadecén-alkohol [(2S,8Z)-8-heptadecén-2-ol]. Az általam készített lepényfa-gubacsszúnyog nőstény kivonatban ellenben a (Z)-8-heptadecén-2-alkohol nem volt kimutatható (<0,5%). A hesszeni légy esetében 1991-ben a gubacsszúnyogok családjában elsőként meghatározott szexferomon molekula a (2S,10E)-acetoxi-tridekán volt (Foster és mtsai., 1991). Csaknem húsz év elteltével Andersson és munkatársai (2009) újrahatározták a faj feromonját. A kifinomultabb technikáknak köszönhetően a kivonatban hat komponenst találtak, köztük a már Foster által is leírtat. A meghatározott hat új anyag mindegyike S- konfigurációjú és közülük öt aktívnak is bizonyult (lásd Szexferomon kémiai szerkezete a gubacsszúnyogok családjában c. fejezetben 3. táblázat). Érdekes, hogy a hesszeni légynél is megtalálták a hidroxil-csoportot tartalmazó alkohol származékot, azaz 2S,10Etridekén-alkoholt [(2S,10E)-10-tridekén-2-ol]. A hat komponens közül ötből összeállított feromon keverék (blend) szignifikánsan több hímet csalogatott mind Y-olfaktométeres, mind pedig szabadföldi csapdázásos kísérletben, mint a három komponensű keverék (Andersson és mtsai., 2009). Az újonnan meghatározott feromon komponensekkel nagy hasonlóságot mutat a duglászfenyő toboz-gubacsszúnyog szexferomonjának szerkezete. Mindkét fajnál telítetlenek a molekulák, tizenhárom szénatomszám hosszúak az alapmolekulák, és csak az (S)- enantiomereket használják kémiai kommunikációjukhoz. Az utóbbinál két kettős kötés található a molekulában a 4. és a 7. szénatomon Z,Z konfigurációban (2S-Z4Z7-acetoxitridekén). Az előbbinél megtaláljuk az E,E illetve a Z,E izomert is, nevezetesen a 2S-E8E10- acetoxi-trideként és a 2S-Z8E10-acetoxi-trideként. A málnavessző-gubacsszúnyog szexferomon keveréke is tartalmaz három (S)-konfigurációjú molekulát (Hall és mtsai., 2009). Ennél a fajnál is megtalálták az alkohol származékot az S-undekán-alkoholt [(S)-undekán-2-99

100 ol)]. A feromon főkomponens az (S)-2-acetoxi-5-undekanon egy ketoészter, ehhez hasonlót eddig csak az almalevél-gubacsszúnyognál találtak a gubacsszúnyogok családjában (Cross és mtsai., 2009). Az feromon molekula (R)-enantiomerje a málnavessző-gubacsszúnyognál sem mutat biológiai aktivitást, és nem is befolyásolja az (S)-enantiomer vonzóképességét a racém keverékben. Ez a jelenség megfigyelhető több, egy királis központtal rendelkező gubacsszúnyog szexferomon estében. Például a már említett duglászfenyő toboz- és a krizantémum-gubacsszúnyognál. Saját kísérleteimben az (S)-enantiomerrel végzett Y-olfaktométeres vizsgálatok és szabadföldi csapdázások is azt mutatták, hogy az (S)-enantiomer önmagában nem attraktív a hím lepényfa-gubacsszúnyogokra. Azonban a 9:1 R:S enantiomer arányban igenis játszik szerepet az antipód is, hiszen szignifikánsan többet csalogatott az (R)-enantiomernél és a racémnél is. Ezt látszik alátámasztani a harmadik szabadföldi csapdázás is, ahol a 95:5 R:S arány számszerűen kétszer több hímet vonzott, mint az (R)-enantiomer, ugyan nem szignifikáns mértékben. A feromon kivonatban nem volt egyértelműen kimutatható az (S)- enantiomer jelenléte (detektálhatósági szint alatt <1%). Ennek ellenére kis mennyiségben ugyan, de feltételezhetően termelődik és szerepe van a faj kémiai kommunikációjában. Ezt az optimális arányt közelítette meg az olfaktométeres vizsgálatoknál és a harmadik csapdázásnál használt elegy. Az (S)-enantiomer szerepének tisztázására irányuló vizsgálatokat a jövőben folytatni szeretném. A nőstényekből készített kivonatokban a (Z)-2-acetoxi-heptadecénhez viszonyítva mintegy 4%-nyi 2-acetoxi-heptadekánt találtunk. A hesszeni légynél a 2009-ben meghatározott további feromonkomponensek egyike is a főkomponens molekula telített formája a 2S-acetoxi-tridekán (Andersson és mtsai., 2009). A málnavessző-gubacsszúnyog is használja kémiai kommunikációjában a főkomponense telített formáját a 2S-acetoxi-undekánt (Liu és mtsai., 2009). A lepényfa-gubacsszúnyognál a telített molekula biológiai aktivitásának vizsgálata a jövőbeni terveim között szerepel. Szintén érdekes kérdés a feromonkeverékben az alkoholszármazék jelenléte és szerepe. A példaként előbb említett két fajnál megtaláljuk az alkoholszármazékot is a feromonkeverékben, a hesszeni légynél a 2S-E10-tridekanolt, a málnavessző-gubacsszúnyognál a 2S-undekanolt. A lepényfa-gubacsszúnyog nőstényekből készített kivonatokban ugyan nem találtuk meg az alkoholszármazékot, de ez a kivonatkészítési módszerből is adódhatott. A közeljövőben ezt a kérdést is szeretném megvizsgálni. 100

101 6.4. Lepényfa-gubacsszúnyog szexferomon meghatározásának gyakorlati felhasználása A szintetikusan előállított szexferomon lehetővé teszi a kártevő rajzásának előrejelzését és az ezen alapuló célzott növényvédelmi permetezések elvégzését. A kifejlesztett, lepényfa-gubacsszúnyog szexferomonnal csalétkezett ragacsos deltacsapda es évtől a Csalomon csapdacsalád új tagjaként már forgalomban is kapható. Közterületeken, lepényfa fasorokban alkalmazva a feromoncsapdát, a lepényfa-gubacsszúnyog első, áttelelő nemzedékének előrejelzésével a növényvédelmi kezelés pontos időzíthetősége válik lehetővé. Így akár egyetlen kezeléssel megvédhető a tenyészidőszakra az állomány a gubacsszúnyog kártevővel szemben Csápmorfológia és a kemoszenzillumok egyedi ingerületelvezetése (SSR) Az elektronmikroszkópos vizsgálatok segítségével sikerült feltérképezni a hím és nőstény lepényfa-gubacsszúnyogok csápmorfológiáját. Ezek a vizsgálatok messzemenő segítséget nyújtottak a további, ingerület elvezetés egyedi szaglószőrről (single sensillum recording, SSR) vizsgálatokhoz. Megállapítottam, hogy a csápok mindkét nemnél csápízből, ún. szubszegmensből épülnek fel. A méréseim szerint a hímek csápjai másfélszer hosszabbak (0,7 mm ± 0,03 mm), mint a nőstényeké (0,51 mm ± 0,04 mm), köszönhetően a hímek eltérő csápíz felépítésének. A lepényfa-gubacsszúnyog hímek csápízei ugyanis egy kerekded szubszegmensből és egy nyélszerű, karcsú, hengeres vékony szubszegmensből állnak, ez okozza, hogy másfélszer hosszabb a csápjuk. A cirok-gubacsszúnyognál a csápok még a lepényfa-gubacsszúnyogénál is hosszabbak mindkét nemnél. A hímek esetében kétszer (1,4 mm ± 0,04 mm), a nőstényeknél másfélszer (0,7 mm ± 0,03 mm) hosszabbak, annak ellenére, hogy a csáp itt is 12 csápízből épül fel (Boddum, 2007). Ennek magyarázata, hogy a hímeknél egyetlen csápíz két kerekded szubszegmensből és az azokat összekötő hengeres nyélszerű részből áll. A nőstényeknél ezek a nyeles szubszegmensek hiányoznak, azonban a csápízek megnyúltak, hosszúkásak. Hosszúk eléri a 60 µm ± 1,8 µm-t, a lepényfa-gubacsszúnyog nőstényeknél ez csak 50,4 µm ± 1,02 µm. A káposzta-gubacsszúnyognál is hasonló a helyzet, a hímek csápja két kerekded szubszegmensből és a közte lévő összekötő nyélből áll, ennek köszönhetően a csápjuk hossza megközelíti a cirok-gubacsszúnyog hímekét (1,3 mm ± 0,03 101

102 mm) (Boddum és mtsai., 2010). A csápízek a fejhez két a csápízektől eltérő alakú, funkciójú szegmenssel kapcsolódnak. A fejhez a csáptőíz (scapus) kapcsolja a következő ízt a csápcsuklóízt (pedicellus), ami mint a neve is mutatja a csáp mozgatásában, hátra hajtásában játszik szerepet. Ezen ízek más gubacsszúnyog fajokhoz hasonlóan nem vagy csak alig hordoznak érzőszenzillumokat, viszont gazdagon borítják a mikroszőrök, például a cirok-, a káposzta- a ragadozó-gubacsszúnyognál (Boddum, 2007; Zhang és Yang, 2008). A feketeribizli-gubacsszúnyog csápja mindkét ivarnál az említett fajoktól eltérően tizenhárom szubszegmensből áll (Crook, 1998). Korábbi vizsgálatok alapján a gubacsszúnyogoknál eddig összesen öt kemoszenzillum típust találtak: 1; sensillum circumfilum 2; sensillum trichodeum 3; sensillum basiconicum 4; sensillum coeloconicum 5; egypórusú szenzillum csap (Slifer és Sekhon, 1971; Crook és Mordue, 1999). A lepényfa-gubacsszúnyognál mind a hímek mind pedig a nőstények csápján megtaláltam három kemoszenzillum típust: a s. trichodeum-ot, a s. circumfillum-ot és a s. coeloconicum-ot. A borsó-gubacsszúnyognál is ezt a három kemoszenzillum típus jellemzi a csápot (Hillbur, 2001). A ragadozó-gubacsszúnyognál szintén az említett három típus került elő, azonban a hímek csápjának második szegmensén találtak, egy korábban kétszárnyúaknál még le nem írt szenzillum típust a sensillum styloid-ot (Zhang és Yang, 2008). Funkciója még nem ismert, de mivel csak a hímeknél találták meg feltehetően a szexferomon érzékelésben játszik szerepet. A feketeribizli-gubacsszúnyog csápján az említett öt típusból szintén három fordul elő, mint a lepényfa- és a borsó-gubacsszúnyognál, azzal a különbséggel, hogy a s. coeloconicum helyett s. basiconicum-ot találták meg (Crook, 1998). A lepényfa-gubacsszúnyog s. circumfilum szaglószőre, mint a gubacsszúnyogok unikális szaglószőre (Hallberg és Hansson, 1999) morfológiailag hasonló az eddig már vizsgált fajokéval. Megfigyeléseim szerint ivari dimorfizmus jellemzi a lepényfagubacsszúnyognál ezt a szaglószőrt. A nőstényeknél a s. circumfilum bonyolultabb, hurkokat, gyűrűket alkot és szorosan rásimul a csápíz felszínére. A hímeknél ezzel szemben lazán öleli körbe a csápízt és alig alkot hurkokat. Az ivari különbség a s. circumfilum megjelenésében számos fajnál megfigyelt jelenség a családon belül. Szintén a nőstényeknél jelenik meg bonyolultabb formában a feketeribizli-gubacsszúnyognál (Crook és Mordue, 1999). A borsógubacsszúnyognál és a Mycodiplosis erysiphes fajnál, ellenben a hímeké az összetettebb megjelenésű, jelezve evvel a feromon-érzékelésben játszott szerepét (Hillbur, 2001). Hasonló a cirok-, és a káposzta-gubacsszúnyognál is, ahol szintén a hímeknél elágazóbb a 102

103 s.circumfilum. Ezeknél a fajoknál teljesen egyedi formát ölt ez a szenzillum a hímeknél, hiszen a szenzillum kocsány messze eltávolodva a csápíztől többszörös hurkokat alkot, mielőtt kapcsolatba lép a kutikulával (Boddum, 2007). Az ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről módszerével (SSR) vizsgálva a s. circumfillum-t a vizsgálataim során nem sikerült feromonválaszt kapnom. A szenzillum válaszok nem mutattak szignifikáns különbséget az oldószeres kontrollhoz képest sem az (R)-, sem pedig az (S)-enantiomer esetében. A tápnövény illatanyagra, azonban válaszolt a szenzillum. Boddum (2007) és munkatársai vizsgálták a káposzta-gubacsszúnyognál a s. circumfilum-ot SSR módszerrel és tíz ismétlésben dózisfüggő ingerületválaszt tapasztaltak a feromonkomponensekkel történt ingerlés hatására. A három feromonkomponensre külön-külön és a keverékekre adott válaszok alapján nyolc csoportba sorolták a s. circumfilum szagló receptor idegsejtjeit (ORNs). Általánosan elfogadott, hogy a s. circumfilum, mint összetett szaglószőr szerepet játszik nemcsak a feromonális, de a tápnövény illatanyagok érzékelésben is (Crook és Mordue, 1999). A s. circumfilum szaglószőr egyediségének köszönhetően még további vizsgálatokat igényel, melyek egyértelműen kideríthetik szerepét a kémiai kommunikációban. A lepényfagubacsszúnyog esetében elvégzett vizsgálataimban mindössze négyszer sikerült értékelhető kapcsolatot létrehozni s. cirfumfilum-val, ez nem elegendő ismétlésszám a messzemenő következtetésekhez, hiszen egy összetett, bonyolult érzékszőrről van szó. Lehetőségeim szerint szeretném a jövőben tovább vizsgálni ezt a szenzillum típust mind feromon- mind pedig tápnövény érzékelés oldaláról hímekkel és nőstényekkel is. A sensillum trichodeum érzékszőrt számtalan rovarcsoportnál vizsgálták már és mint a feromon érzékelésben szerepet játszó szaglószőrt azonosították (Hansson, 1995). A hím lepényfa-gubacsszúnyogok csápján SSR módszerrel én is megvizsgáltam ezt a szenzillumot. Az (R)-enantiomerrel és a racém eleggyel ingerelve dózisfüggő tüzelésmintázatot tudtam kimutatni, ellenben az (S)-enantiomerrel, amely nem váltott ki nagyobb válaszokat, mint az oldószer a vizsgált dózisokban. Napjainkig kevés azon gubacsszúnyogok száma, melyek feromonja ismert és végeztek velük single sensillum recording vizsgálatokat is. Például a hesszeni légy s. trichodeum szaglószőre ingerelhető volt négy feromonkomponensével, az ötödikre azonban nem válaszolt. 103

104 6.6. Természetes ellenségek A gubacsszúnyog lárvák rejtett életmódjuk ellenére kedvelt táplálékot jelentek úgy parazitáknak, mint predátor állatoknak. A vegetatív növényi részeken gubacsot képező fajokat előszeretettel és nagy számban fogyasztják a kis énekes madarak. Saját megfigyeléseim szerint a lepényfa-gubacsszúnyog és az akác-gubacsszúnyog levélszéli gubacsaiban fejlődő lárvák gyakran esnek madarak áldozatául, melyek kicsipkedik a lárvákat a felnyitott gubacsokból. Hasonlóan hatékony természetes ellenségek a fürkészdarázs parazitoidok, melyeket számos gubacsszúnyog fajnál megfigyeltek. Leggyakrabban az Eulophidae, Eurytomidae, Chalcidoidea, Pteromalidae, Platygasteridae családból kerülnek ki a gubacsszúnyogok fürkészdarázs parazitoidjai. A repcebecő-gubacsszúnyognál például Laborius (1972) tíz parazitoid Hymenoptera fajt mutatott ki. A máktok-gubacsszúnyog lárvákat parazitáló fürkészdarazsak közül (Dasineura papaveris Winnertz) Szelényi (1971) öt fajt említ. A kutatástörténetileg is fontos hesszeni légynél nagy elterjedési területének köszönhetően számos parazitoidot írták már le. Esetenként a lárvák 50%-át is elpusztító fertőzöttséget több mint tíz fürkészfaj okozta (Jermy és Szelényi, 1958). Az általam vizsgált lepényfagubacsszúnyognál legnagyobb számban a Mesopolobus mediterraneus (Mayr) (Hymenoptera, Pteromaildae) (Parella és Thompson, 1998) és az Eupelmus urozonus (Dalman) (Hymenoptera, Eupelmidae) (Bene és Landi, 1993) került elő. A lárvák a kialakított gubacsban védetten fejlődnek ugyan, de a gubaccsá összehajolt levéllemez nem akadályoz meg néhány ragadozót abban, hogy felnyissa vagy befurakodjon a gubacsba. Megfigyeléseim szerint a fátyolka lárvák képesek befurakodni és elragadni a lárvákat a lepényfa levélkéin kialakult gubacsokból. Számos esetben láttam ragadozó poloskákat is a lepényfa hajtásokon mászkálva, de táplálkozásukat nem sikerült megfigyelni. Svédországban egymást követő két nyáron sikerült azonban megfigyelni egy fitofág poloskafaj a Pinalithus cervinus (syn. Orthops cervinus) (Heteroptera, Miridae) imágóinak közvetett lárvagyérítő tevékenységét lepényfán. A poloska imágók fás növények lombján szívogatnak előszeretettel. Az eddigi vizsgálatok szerint tölgyről (Leston, 1961), és kőrisről (Göllner-Scheiding, 1972) írták le. A lepényfa esetében a lepényfa-gubacsszúnyoggal fertőzött fákon az intenzív anyagcserével bíró gubacsokat szívogatták. A szívogatásuk következtében a gubacsok elszáradtak, a bennük fejlődő lárvák pedig elpusztultak. A 2008-as év nyarán a tömeges poloska kártételnek köszönhetően a nyári lepényfa-gubacsszúnyog nemzedékek egyedszáma erősen lecsökkent. 104

105 Ezt a poloskafajt napjainkig hazánkban nem írták le, annak ellenére, hogy a környező országokból már említik az irodalmak. A fajt hazánkban eddig lepényfán én sem találtam meg kozmopolita életmódja ellenére. A jövőben tovább vizsgálva szeretnék többet megtudni a behurcolt lepényfa-gubacsszúnyog hazai természetes ellenségeiről. 105

106 7. ÖSSZEFOGLALÁS 7.1. A lepényfa-gubacsszúnyog szexferomon meghatározása és a szintetikus feromonnal kapcsolatos vizsgálatok A lepényfa-gubacsszúnyoggal kapcsolatos vizsgálataim során a faj addig ismeretlen szexferomonjának meghatározását tűztem ki célul. A gubacsszúnyogok családjából napjainkig alig két tucat faj szexferomonját ismerjük, ez további motivációt jelentett számomra. A feromonkutatásban elengedhetetlen ismerni a nőstények csalogató viselkedésének napszaki ritmusát, melyet ennél a fajnál még nem vizsgáltak. Megfigyeléseim szerint a nőstények a délelőtti órákban mutatják a csalogató pozíciót, azaz ekkor bocsátják ki a hímek csalogatására a szexferomont is. A nőstényeknél ismételt párosodást és párosodás után ismételt csalogatást nem figyeltem meg. Ezen megfigyeléseim egybevágnak az irodalomban leírt más gubacsszúnyog fajoknál megfigyeltekkel. A nőstények csak egyszer kopulálnak, tehát feromont is csak addig, viszonylag rövid ideig termelnek. Ezen ismeretek tudatában végeztem a nőstények által kibocsátott feromon összegyűjtését. Kivonatokat készítettem zárt légtérben történő feromon visszafogás módszerével (CLSA). A kivonatok biológiai aktivitását elektroantennográfiásan, hím csápon ellenőriztem. Csak a csápválaszt kiváltó feltehetően szexferomont tartalmazó kivonatokkal dolgoztam tovább. Következő lépésben gázkromatográfhoz kapcsolt elektroantennográf segítségével meghatároztam a kivonatban található egyéb anyagok közül a szexferomon retenciós idejét (RT). A legígéretesebb kivonat 1800 szűz nőstény által kibocsátott szexferomont tartalmazott, az egész kivonatra vetítve a gázkromatográfiás kvantifikálás alapján összesen 200 ng-ot. A kivonatban a feromon retenciós idejének ismeretében Prof. David R. Hall (Nagy-Britannia, Chatham Maritime) tömegspetroszkópiásan meghatározta a szexferomon kémiai szerkezetét és szintetikusan elő is állította azt. A lepényfa-gubacsszúnyog szexferomonja a (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén. A molekulának királis központja miatt két enantiomerje létezik, (R)- és (S)-enantiomer. Az enantiomerek biológiai aktivitását elektroantennográfiasan megvizsgálva, azt tapasztaltam, hogy az (R)-enantiomer és a racém keverék szignifikánsan nagyobb csápválaszokat váltott ki, mint az (S)-enantiomer. Az első szabadföldi csapdázás megerősítette az elektrofiziológiás megfigyeléseket, hiszen az (R)-enantiomer csalogatta a legtöbb hímet, majd a racém keverék következett a sorban. Az (S)-enantiomer gyakorlatilag hatástalannak bizonyult önmagában. A 106

107 második csapdázás alkalmával összehasonlításra kerülő (R)-enantiomer és racém keverék a vizsgált négy dózis egyikében sem mutatott szignifikáns különbséget egymástól. A királis (sztereoszelektív) gázkromatográfiás oszlopon történt elválasztás alapján az (S)- enantiomer jelenléte nem volt egyértelműen bizonyítható a kivonatokban (<1%). Laboratóriumban, Y-olfaktométeres kísérletekben megvizsgálva a 9:1 R:S enantiomer arányt, a vonzóképessége szignifikánsan felülmúlta a racém keverék, sőt az (R)-enantiomer vonzóképességét is. Következő lépésben, a harmadik csapdázási kísérlet során 95:5 R:S enantiomer arányt három dózisban vizsgáltam a racém és (R)-enantiomer ellenében. Mind a három dózisban a 95:5 R:S enantiomer arány másfélszer több hím gubacsszúnyogot vonzott, de az adatok nagy szórása miatt a különbség egyik esetben sem volt szignifikáns. A gyakorlati felhasználás szempontjából a racém keverék megfelelő biztonsággal használható a kártevő előrejelzéséhez. A racém keverék előállítása sztereokémiailag egyszerűbb és gazdaságosabb, mint az (R)-enantiomeré. Az optimális enantiomer arány megállapítására, a jövőben további kísérletek szükségesek Csápmorfológia és ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről vizsgálatok (SSR) Az elektromikroszkópos vizsgálatok segítségével feltérképeztem a lepényfagubacsszúnyog csápját mindkét ivarnál. A csáp felépítése egyéb vizsgált gubacsszúnyog fajoknál már ismert felépítést mutatja. Csápízek száma a lepényfa-gubacsszúnyognál tizenkettő. Általános, hogy a hímek csápja mintegy másfélszer hosszabb, mint a nőstényeké. Ez a csápízek eltérő felépítéséből adódik, ugyanis a hímeknél a gömbölyded szegmenseket egy hengeres nyél köti össze, mely a nőstényeknél hiányzik. A lepényfa-gubacsszúnyognál a hímek csápjának hossza 0,7 mm ± 0,03 mm, míg a nőstényeké 0,51 mm ± 0,04 mm. A csápízeken három típusú kemoszenzillát találtam, a sensillum trichodeum-ot, a sensillum coeloconicum-ot és a kizárólag a gubacsszúnyogokra jellemző sensillum circumfilum-ot. Mechanoreceptorokat hordozó érzékszőrök közül a sensillum cheatica-t és a terminális érző csapot (terminal sensory peg) figyeltem meg. A lepényfa-gubacsszúnyog s. circumfilum érzékszőre eltérő felépítést mutatott az ivaroknál, és a családban általánosan ismert ivari bélyegek részben fordítva mutatkoztak. Megfigyeléseim alapján a nőstények esetében a szenzillum összetettebb hurkokat alkot, mint a hímek esetében. Általában a hímekre 107

108 jellemző az összetett s. circumfilum. A s. trichodeum megjelenésében nincsen ivari dimorfizmus a lepényfa-gubacsszúnyog esetében és a családra jellemző bélyegeket mutatja. A csápízeken körkörös vonalban fordulnak elő a csápíz középső legszélesebb részén és könnyen felismerhetőek az alapi részükön lévő ún. zokni vagy lópataszerű kutikula megvastagodásról. A s. coeloconicum mindkét ivar csápján előfordult, de csak 1-5 darabot találtam csápízenként. A s. basiconicum érzékszőrt azonban nem találtam a lepényfa-gubacsszúnyog csápján. Az elektronmikroszkópiás megfigyelések előtanulmányként szolgáltak az ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről (SSR) vizsgálataimhoz. A kemoszenzillák közül a s. trichodeum és a s. circumfilum vizsgálatára került sor. Először a s. trichodeum szaglószőr spontán aktivitását figyeltem meg. A tüskemintázatban megfigyelt két eltérő amplitudójú akciós potenciál arra utal, hogy a s. trichodeum szaglószőrt minimum két szagló receptor neuron idegzi be. A szenzillumot ingerelve az (R)-enantiomerrel dózisfüggő akciós potenciál mintázatot kaptam, növekedő tüskeszámmal a növekedő dózisoknak megfelelően. Nagyon hasonló volt a racém eleggyel történő ingerlés során tapasztalt ingerületválasz, de a tüskeszám valamivel kevesebb volt dózisonként, mint az (R)-enantiomer esetén, azonban szignifikánsan több az oldószeres kontrollnál. Az (S)-enantiomerrel történő ingerlés során számszerűen tapasztaltam ugyan különbséget, de ezek egyik dózisban sem mutatkoztak szignifikánsnak az oldószeres kontrollhoz viszonyítva. A s. circumfilum esetében hím csápon egyik dózisban sem tapasztaltam ingerületválaszt SSR vizsgálatokkal. Sem az (R)-enantiomer, sem az antipódja, sem pedig a racém keverék nem váltott ki szignifikánsan nagyobb választ az oldószeres kontrolltól. A tápnövényből készült kivonattal, azonban a tüskemintázat változását váltotta ki az oldószerhez képest. A nőstények csápján eddig még nem vizsgáltam az említett két szenzilla típust, ezt a közeljövőben szeretném megtenni A lepényfa-gubacsszúnyog új európai előfordulása és egy új természetes ellensége Kutatómunkám során, svédországi együttműködés keretében lehetőségem volt behatóbban foglalkozni lepényfa-gubacsszúnyog kémiai ökológiájával. A laboratóriumi munkák mellett, a szabadföldi lepényfa állományok (útsorfák, parkfák) szisztematikus, vizuális megfigyelése nyomán sikerült megtalálni a gubacsszúnyog jellegzetes kártételét Svédország déli részén, Skåne tartományban Alnarp, Lund és Malmö városokban. A 2008-as 108

109 évben az ekkor már fejlesztés alatt álló szexferomon csapdával sikerült nyomon követni a második harmadik nemzedék rajzásmenetét. A szabadföldi felvételezések nyomán Svédországban sikerült megfigyelni a lepényfagubacsszúnyog két természetes ellenségét is. A fátyolka lárvákat (Chrysoperla carnea fajkomplex) rendszeresen megfigyeltem miközben befurakodnak a lepényfa-gubacssszúnyog gubacsokba és ott elfogyasztják a lárvákat. A másik faj egy fitofág poloskafaj a Pinalithus cervinus, amelynek imágói a gubacsok szívogatásával, közvetve jelentős mértékben képesek csökkenteni a következő gubacsszúnyog nemzedék egyedszámát. Ezt a poloskafajt fás növények kártevőjeként tartják számon. Tápnövényei a különböző tölgy és kőris fajok. A kártevőt napjainkig Magyarországról még nem írták le, és szabadföldi felvételezéseim során én sem találtam meg. 109

110 9. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1) Megfigyeltem a lepényfa-gubacsszúnyog csalogató viselkedését és annak napszaki ritmusát. 2) Zárt rendszerben légtérből történő visszafogás módszerével (CLSA) sikeresen összegyűjtöttem a nőstények feromonját. A legnagyobb készített kivonat 1800 nőstény lepényfa-gubacsszúnyog által kibocsátott feromont tartalmazott. 3) Elektroantennográffal (EAG) kimutattam a feromonkivonat biológiai aktivitását. 4) Bioszenzoros gázkromatográfiával (GC-EAD) rámutattam az aktív kivonat egyetlen elektroantennográfiásan aktív anyagára és megállapítottam annak retenciós idejét. 5) Elektroantennográffal ellenőriztem a szintetikus feromon (2R,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén, antipódja (2S,8Z)-2-acetoxi-8-heptadecén és a racém keverék biológiai aktivitását. 6) Csapdázással igazoltam, hogy a (Z)-2-acetoxi-8-heptadecén (R)-enantiomerje szabadföldön is aktív és szignifikánsan több hímet fog, mint a racém keverék. Antipódja az (S)-enantiomer gyakorlatilag hatástalan az (R)-enantiomerhez viszonyítva. Gyakorlati felhasználás szempontjából a szintetikus úton könnyebben előállítható racém keverék megfelelő biztonsággal használható a lepényfa-gubacsszúnyog előrejelzéséhez. 7) Y-olfaktométeres, kétválasztásos vizsgálatokkal kimutattam, hogy a 9:1 R:S enantiomer arány vonzóképességében felülmúlja a racém keverék, de még az (R)-enantiomer vonzóképességét is. 8) Ingerületelvezetés egyedi érzékszőrről (SSR) vizsgálatokkal kimutattam, hogy a sensillum trichodeum szaglószőrök tartalmazzák az (R)-enantiomer receptorait, az (S)-enantiomer a vizsgált dózisokban nem mutatott szignifikáns különbséget az oldószertől. A sensillum circumfilum esetében nem sikerült feromonválaszt mérnem, azonban a lepényfa kivonatra reagált a szenzillum. 9) A tövises lepényfán (G. triacanthos L.) és a Sunburst fajtán megtaláltam egy polifág poloskafaj (Pinalithus cervinus) imágóit, melyek a lepényfa-gubacsszúnyog lárvák által indukált gubacsokat szívogatták, melyek így elszáradtak és a lárvák bennük elpusztultak. A fitofág poloska közvetve erősen csökkentette táplálkozásával a kártevő populációját. 10) Elsőként találtam meg a lepényfa-gubacsszúnyogot Dél-Svédországban, ahol addig a faunából még nem írták le a fajt. 110

111 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Hálás köszönetet szeretnék mondani Dr. Szőcs Gábornak nemcsak a doktori munkámban nyújtott segítségért és témavezetésemért, hanem az elmúlt évek során átadott rengeteg szakmai tudásért és hogy megszerette velem a rovarok kémiai kommunikációjának rejtelmeit. Kutatásaimhoz elengedhetetlen segítséget jelentett a GC-EAD nagyműszer, amelynek beszerzését a Kutatás-fejlesztési Pályázati és Kutatáshasznosítási Iroda (KPI) GVOP /3.0 és az OTKA T37355 pályázat támogatott. A műszerhez tartozó nélkülözhetetlen kiegészítők, szoftverek beszerzésében Dr. Jan van der Pers szíves segítségéért tartozom köszönettel. Köszönettel tartozom egyetemi témavezetőmnek Dr. Nádasy Miklósnak, aki tragikus hirtelenséggel távozott el közülünk és már nem élvezhette a közös munkánk gyümölcsét. Köszönöm neki az egyetemi ügyintézésekben nyújtott odaadó segítségét és az állandó motiválást dolgozatom megírásához. Dr. Kondorosy Elődnek szeretném megköszönni a poloska, Dr. Szenkirályi Ferencnek a fátyolka határozást. Köszönettel tartozom feleségemnek, Bokán Kátyának, aki rengeteget segített a dolgozat megírásában és a korrektúrában is. Köszönettel tartozom Dr. Kárpáti Zsolt (KáZsé) munkatársamnak és jó barátomnak, aki bevezetett az elektroantennográfia titkaiba és segített a lepényfa-gubacsszúnyoggal kapcsolatos csapdázásokban is. Az egyszerű hétköznapokért is köszönet neki, amiért megkázsésította őket. Lakatos András munkatársamnak, barátomnak ezúton szeretném megköszönni a folyamatos segítséget, amivel sok terhet levett a vállamról a dolgozat megírásának ideje alatt, továbbá a statisztikai kérdésekben nyújtott kimerítő válaszait. Köszönet illeti Dr. Vuts József munkatársam, barátomat, akivel mindig építő jellegű beszélgetéseket folytattunk az elektroantennográfiás vizsgálatokról. Köszönet illeti Pintér Eszter, Nyíri Andrea asszisztenseket, akik számtalan kísérlet előkészítésében és a végeláthatatlannak tűnő labormunkákban segítettek. Dr. Balázs Klárinak és Mihályi Krisztinának a biztatást és a szakmai tanácsokat, nem kevésbé az újfehértói kiszállásokat szeretném megköszönni. Szeretnék továbbá köszönetet mondani az MTA Növényvédelmi Kutatóintézet további munkatársainak, Dr. Szentesi Árpádnak, Ujj Tamásné Kati néninek, Szekeres Dórának. Köszönet a Magyar Ösztöndíj Bizottságnak a Magyar Állami Eötvös Ösztöndíjért, amely anyagi segítséget nyújtott a svédországi kutatómunkához. Sok köszönettel tartozom Dr. Ylva Hillburnak az ösztöndíj alatti témavezetésért az SLU Swedish University of Agricultural Sciences alnarpi laborjában. Köszönöm Tina Boddumnak, aki szakdolgozatos létére rengeteget tud a gubacsszúnyogokról, továbbá Eline Eisbergnek, Dr. Peter Anderssonnak. 111

112 Gyeviki Mártának, aki sokszor végighallgatta a munkám kezdeti nehézségeit és segített a csapdaleolvasásban is. Végül, de nem utolsó sorban nagyon nagy köszönettel és hálával tartozom családomnak, Anyukámnak, Apukámnak, akik támogattak tanulmányaim során, akik mindvégig kitartottak mellettem, akik nélkül nem tarthatnék ma itt. Köszönöm nagynénémnek, aki sokat segített a gázkromatográfia rejtelmeiben és egyég szakmai kérdésekben, és noszogatott a munkámban és a tanulmányaimban. Köszönettel tartozom húgomnak, Anitának, férjének Tibinek, keresztlányomnak, Annának és az ikreknek, akik sokszor felvidítottak, ha valami kedvemet szegte a munkában. 112

113 IRODALOM Ahman, I. (1985): Larval feeding period and growth of Dasineura brassicae (Diptera) on Brassica Host Plants. Oikos, Vol. 44, No. 1, Plant-Animal Interactions. Proceedings of the Third European Ecological Symposium. Lund, Sweden p Alberts, S.A., Kennedy, M.K., Cardé, R.T. (1981): Pheromone-mediated anemotactic flight and mating behavior of the sciarid fly Bradysia impatiens. Environ. Entomol. 10: Amarawardana, L. (2009): The chemical diversity of midge pheromones. PhD thesis, University of Greenwich UK. Amarawardana, L., Hall, D.R., Cross, J.V. (2006): Investigations on the sex pheromone of pear leaf midge, Dasineura pyri (Bouché), and other gall midges pests of fruit crops. Proceedings of IOBC Workshop on Arthropod Pest Problems in Pome Fruit, Lleida, Spain. Ambrus, B. (1994): Gubacsszúnyogok p In: Jermy, T. és Balázs, K. (eds.) (1994) A Növényvédelmi állattan kézikönyve, Akadémiai Kiadó, Budapest. Andersson, M.N., Haftmann, J., Stuart, J.J., Cambron, S.E., Harris, M.O., Foster, S.P., Franke, S., Francke, W., Hillbur, Y. (2009): Identification of sex pheromone components of the hessian fly, Mayetiola destructor. J. Chem. Ecol. 35: Anfora, G., Isidoro, N., Cristofaro, D.A, Ioriatti, C. (2005a): Description of Macrolabis mali sp. nov. (Diptera Cecidomyiidae), a new inquiline gall midge species from galls of Dasineura mali on apple in Italy. Bulletin of Insectology 58 (2): Anfora G., Ioriatti C., Moser S., Germinara G.S., De Cristofaro A., (2005b): Electrophysiological responses of two different species of apple gall midges (Diptera Cecidomyiidae) to host plant volatiles. IOBC wprs Bulletin 28(7): Arn, H., Städler, E., Rauscher, S. (1975): The electroantennographic detector a selective and sensitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Z. Naturforsch. 30: Ádám, Gy. (1991): Az érzőreceptorok élettana In: Élettani jegyzet biológusoknak II. Tankönyvkiadó, Budapest,

114 Bäckman, A-C. (1999): Olfactory communication in the codling moth, Cydia pomonella L. Doctoral thesis. Agraria 165. Department of Plant Protection Sciences, Swedish University of Agricultural Scienses, Alnarp, Sweden. Balás, G., Sáringer, Gy. (1982): Kertészeti kártevők. Akadémia Kiadó, Budapest. p Barnes, H.F. (1944): Investigations on the raspberry cane midge, Journal of the Royal Horticultural Society, 69: Bayram, S., Skuhravá, M., Cobanoglu, S. (2005): Cystiphora sonchi (Vallot, 1827) and Dasineura gleditchiae (Osten Sacken, 1866) (Diptera: Cecidomyiidae), two new records from Turkey. Türkiye Entomoloji Dergisi 29(4): Beadle, G., Ephrussi, B. (1936): A technique of transplantation for Drosophila. American Naturalist 70: Bene, G., Landi, S. (1993): Natural enemies of Dasineura gleditchiae (Osten Sacken) (Diptera, Cecidomyiidae) in Italy. Redia 76(1): Bergh, J.C., Harris, M.O., Rose, S. (1990): Temporal patterns of emergence and reproductive behavior of the Hessian fly (Diptera: Cecidomyiidae). Annals of the Entomological Society of America 83: Birkett, M., Bruce, T., Martin, J., Oakley, J., Wadhams, L. (2004): Response of female orange wheat blossom midge, Sitodiplosis mosellana, to wheat panicle volatile. J. Chem. Ecol. 30: Birch, M.C. (1971): Intrinsic limitations in the use of electroantennograms to bioassay male pheromones in Lepidoptera. Nature 233: Birch, M.C. (1974): Introduction. p.1-7. In: Birch M. C. Pheromones. New York, Elsevier. Blomquist, G.L., Dillwith, J.W., Addams, T.S. (1987): Biosynthesis and endocrine regulation of sex pheromone production in Diptera. In Prestwich G. D. and Blomquist G. J. (eds.). Pheromone Biochemistry. Academic Press, Orlando. Boeck, J. (1962): Elektrophysiologische Untersuchungen an einzelnen Geruchsrezeptoren auf den Antennen des Totengräbers (Necrophorus, Coleoptera) Z. Vergl. Physiol. 46: Boddum, T. (2007): Morphology and function of antennal sensilla in gall midges: a comparative study. Master project, SLU Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp, Sweden. 114

115 Boddum, T., Skals, N., Hill, R.S., Hansson, B.S., Hillbur, Y. (2010): Gall midge olfaction: Pheromone sensitive olfactory neurons in Contarinia nasturtii and Mayetiola destructor. Journal of Insect Physiology 56: Bolchi, S.G., Volonte, L. (1985): Dasineura gleditchiae Osten Sacken, a gall midge new to Italy (Dipera, Cecidomyiidae). Bollettino Zoologia Agraria e di Bachicoltura 18: Bruyne, M., Clyne, J.P., Carlson, J.R. (1999): Odor coding in a model olfactory organ: The Drosophila maxillary palp. The Journal of Neuroscience 19(11): Brewer, J.W., Skuhrava, V., Skuhrava, M. (1984): Biology, distribution, and control of Monarthropalpus buxi (Laboulbene) (Diptera, Cecidomyiidae). Zeitschrift für Angewandte Entomologie 97: Carlson, D.A, Nelson, D.R., Langley, P.A., Coates, T.W., Davis, T.L., Leegwater Van Deer Linden, M.E. (1984): Contact sex pheromone in the tsetse fly Glossinia pallidipes (Austen): Identification and synthesis. J. Chem. Ecol. 10: Cartwright, W.B. (1922): Sexual attraction of female Hessian fly (Phytophaga destructor Say.) Canadian Entomologist 54: Choi, M-Y., Khaskin, G., Gries, R., Gries, G., Roitberg, B.D., Raworth, D.A., Kim, D-H, Benett, R.G. (2004): (2R,7S)-diacetoxytridecane: sex pheromone of the aphidophagous gall midge, Aphidoletes aphidimyza. J. Chem. Ecol. 30: Csóka, Gy. (2006): Az akác-gubacsszúnyog [Obolodiplosis robiniae (Haldeman 1847)] megjelenése Magyarországon. Növényvédelem 42(12): Crook, D.J. (1998): Interactions of the blackcurrant leaf curling midge, Dasineura tetensi with resistant and susceptible host plant cultivars. PhD thesis. University of Aberdeen. Crook, D.J., Mordue, A.J. (1999): Olfactory responses and sensilla morphology of the blackcurrant leaf midge Dasineura tetensi. Entomologia Experimentalis et Applicata 91: Crook, D.J., Cross, J., Birch, A.N.E., Brennan, R.M., Mordue, A.J. (Luntz) (2001): Oviposition and larval survival of Dasineura tetensi on four blackcurrant Ribes cultivars. Entomol. Exp. et Applicata 101: Cross, J.V., Hall, D.R., Shaw, P., Anfora, G. (2009): Exploitation of the sex pheromone of apple leaf midge Dasineura mali Kieffer (Diptera: Cecidomyiidae): Part 2. Use of sex pheromone traps for pest monitoring. Crop Protection 28(2):

116 d Eustachio, G., Raupp, M.J. (2001): Application of systemic insecticides in relation to boxwood leafminer s life history. Journal of Arboriculture 27(5): Dini-Papanastasi, O., Skarmoutsos, G. (2001): Relative susceptibility of the honeylocust (Gleditsia triacanthos L.) clones to attack by the honeylocust pod gall midge (Dasineura gleditchiae Osten Sacken) in Northern Greece. Proceedings International Conference Forest Research: a challenge for an integrated European approach Thessaloniki, GR), del Estal, P., Soria, S., Vinuela, E. (1998): Nota de la presencia en Espana de Dasineura gleditchiae (Osten Sacken), sobre acacia de tres espinas. Bol. San. Veg. Plagas 24: European and Mediterranean Plant Protection Organization (2008): EPPO Reporting Service 2008, No. 11, Paris. Fischer, S., Pivot, D. (1992): Apparition en Suisse de la cécidomyie Dasineura gleditchiae O.S. (Diptera, Cecidomyiidae) ravageur de feviér commun Gleditsia triacanthos L. Revue suisse de viticulture, arboriculture et horticulture. 24(4): Foster, S.P., Harris, M.O. (1997): Behavioural manipulation methods for insect pestmanagement. Annual Review of Entomology. 45: Foster, S.P., Harris, M.O., Millar, J.G. (1991): Identification of the sex pheromone of the Hessian fly, Mayetiola destructor (Say). Naturwissenschaften. 78: Gagné, R.J. (1989): The plant-feeding gall midges of North America. Cornell University Press, Ithaca, New York. Gagné, R.J. (1994): The gall midges of the Neotropical region. Cornell University Press, Ithaca New York, p Gagné, R.J., Peña, J.E., Acevedo, F.E. (2008): A new Lestodiplosine (Diptera: Cecidomyiidae) preying on the avocado lace bug, (Pseudacysta perseae) (Heteroptera: Tingidae) in Southern Florida. Florida Entomologist 91(1): Galanihe, L.D., Harris, M.O. (1997): Plant volatile mediate host-finding behaviour of apple leafcurling midge. J. Chem. Ecol. 23: Garcia-Bellido, D.C. (2007): Reassessment of the genus Leanchoilia (Arthropoda, Arachnomorpha) from the middle Cambrian Burgess Shale. British Columbia, Canada. Palaeontology 50:

117 Garthwaite, D.G., Wall, C., Wardlow, L. (1986): Further evidence for a female sex pheromone in the blackcurrant leaf midge Dasineura tetensi. Britsih Crop Protection Conference. Pest and Diseases 1: Geissler, K. (1966): Untersuchungen zur Morphologie und Ökologie der Erbsengallmücke (Cotarinia pisi Winn.). Archiv für Pflanzenschutz 2: Ghaninia, M., Ignell, R., Hansson, B.S. (2007): Functional classification and central nervous projections of olfactory receptor neurons housed in antennal trichoid sensilla of female yellow fever mosquitoes, Aedes aegypti. European Journal of Neuroscience 26: Gordon, S.C., Williamson, B. (1991): Raspberry cane midge. pp In: Ellis, M.A., Converse, R.H., Williams, R.N., Williamson, B. (eds.): Compendium of Raspberry and Blackberry Diseases and Insects. APS Press, St. Paul, Minnesota, USA. p.128. Göllner-Scheiding, U. (1972): Beiträge zur Heteropteren-Fauna Brandenburgs. 2. Übersicht über die Heteropteren von Brandenburg. Teil 1. Beiträge zur Tierwelt der Mark 9: Gries, R., Gries, G., Khaskin, G., King, S., Olfert, O., Kaminski, L., Lamb, R., Benett, R. (2000): Sex pheromone of wheat blossom midge, Sitodiplosis mosellana. Naturwissenschaften 87: Gries, R., Khaskin, G., Gries, G., Bennett, R.G., King, G.G.S., Morewood, P., Slessor, K.N., Morewood, W.D. (2002): (Z,Z)-4,7-Tridecadien-(S)-2-yl acetate: Sex pheromone of Douglas-fir cone gall midge, Contarinia oregonensis. J. Chem. Ecol. 28: Gries, R., Khaskin, G., Bennett, R.G., Miroshnychenko, A., Burden, K., Gries, G. (2005): (S,S)-2,12-, (S,S)-2,13- and (S,S)-2,14-Diacetoxyheptadecanes: sex pheromone components of red cedar cone gall midge, Mayetiola thujae. J. Chem. Ecol. 31: Guo, S.J., Qu, A.J., Sun, W. (1997): A preliminary study on the parasitic wasps of Dryocosmus kuriphilus. Scientia Silvae Sinicaea 33(3): Hall, D.R., Farman, D.I., Cross, J.V., Pope, T.W., Tetsu, A., Yamamoto, M. (2009): (S)-2- Acetoxy-5-Undecanone, female sex pheromone of the raspberry cane midge, Resseliella theobaldi (Barnes). J. Chem. Ecol. 35:

118 Hallberg, E., Johansson, K.U.I., Wallén, R. (1997): Olfactory sensilla in crustaceans: morphology, sexual dimorphism, and distribution pattern. Int. J. Insect Morphol. Embryol. 26: Hallberg, E., Hansson, B.S. (1999): Arthropod sensilla: morphology and phylogenetic considerations. Microscopy research and technique 47: Halstead, A.J. (1992): The 1991 Presidential address part 2. Some pests new to Britain in recent years. British J. Entomol. Nat. Hist. 5: Halstead, A.J. (1995): The hemerocallis gall midge (Contarinia quinquenotata): where is it now? Cecidology 10: CAB Abstract. Hansson, B.S. (1995): Olfaction in Lepidoptera. Experimentia 51: Harris, K.M. (1979): Descriptions and host ranges of the sorghum midge, Contarinia sorghicola (Coquillett) (Diptera: Cecidomyiidae), and of eleven new species of Contarinia reared from Gramineae and Cyperaceae in Australia. Bulletin Ent. Res. 69: Harris, M.O. (1976): The sorgum midge. Annals of Applied Biology 84: Harris, M.O., Rose, S. (1989): Temporal changes in the egglaying behaviour of the Hessian fly. Entomolgia Experimentalis et Applicata 53: Harris, M.O., Foster, S.P. (1991): Wind tunnel studies of sex pheromone mediated behavior of the Hessian fly (Diptera: Cecidomyiidae). J. Chem. Ecol. 17: Harris, M.O., Rose, S. (1991): Factors influencing the onset of egglaying in cecidomyiid fly. Physiological Entomolgy 16: Harris, M.O., Foster, S.P., Agee, K., Dhana, S. (1996): Sex pheromone communication in the apple leafcurling midge (Dasineura mali). Proceedings of 49th New Zealand Plant Protection Conference p Harris, M.O., Galanihe, L.D., Sandanayke, M. (1999): Adult emergence and reproductive behaviour of the leafcurling midge Dasineura mali (Diptera: Cecidomyiidae). Annals of the Entomogical Society of America 92(5): Harris, M.O., Foster S.P. (1999): Gall midges, p , in Hardie J., Minks A. K. (eds.). Pheromones of non-lepidopteran insects associated with agricultural plants. CAB International, Oxford, UK. 118

119 Haynes, K.F., Birch, M.C. (1984): The periodicity of pheromone release and male responsiveness in the artichoke plume moth, Platyptilia carduidactyla. Physiol. Entomol. 9: Haynes, K.F., Birch, M.C. (1986): Temporal reproductive isolation between two species of plume moths (Lepidoptera: Pterophoridae). Ann. Entomol. Soc. Am. 79: Heath, J.J., Zhang, A.J., Roelofs, W.L., Smith, R.F. (2005): Flight activity and further evidence for a female-produced sex pheromone of the apple leaf midge, Dasineura mali, in Nova Scotia, Northeast. Nat. 12: Hedlin, A.F. (1959): Description and habits of a new species of Phytophaga (Diptera: Cecidomyiidae) from western red cedar cones. Can. Entomol. 91: Hedlin, A.F. (1961): The life history and habits of a midge, Contarinia oregonensis Foote (Diptera: Cecidomyiidae) in Douglas-fir cones. Can. Entomol. 93: Hellqvist, S. (2001): Phenology of the Blackcurrant Leaf Midge (Dasineura tetensi) in Northern Sweden. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B - Plant Soil Science, 51(2): Hillbur, Y., Löfqvist, J. (1996): Progress in the identification of the sex pheromone of the pea midge, Contarinia pisi (Diptera: Cecidomyiidae). In: Proceedings of International Society of Chemical Ecology, 13th Annual Meeting, Prague. Hillbur, Y., Anderson, P., Arn, H., Bengtsson, M., Löfqvist, J. (1999): Identification of sex pheromone components of the pea midge, Contarinia pisi (Diptera: Cecidomyiidae). Naturwissenschaften 86: Hillbur, Y. (2001): Tracking the tiny- identification of the sex pheromone of the pea midge as a prerequisite for pheromone-based monitoring. Doctoral thesis, Swedish Univerity of Agricultural Sciences, Alnarp, Sweden. Hillbur, Y. (2004): Chemical Ecology in Insect Pest Management. Journal of the Swedish Seed Association 1: Hillbur, Y., Celander, M, Baur, R., Rauscher, S., Haftmann, J., Franke, S. (2005): Identification of the sex pheromone of the swede midge, Contarinia nasturtii. J. Chem. Ecol. 31: Hrubík, P. (2007): Alien insect pests on introduced woody plants in Slovakia. Acta Entomologica Serbica 12(1):

120 Hubel, D.H. (1957): Tungsten microelectrode for recording from single units. Science 125: Hunger, T., Steinbrecht, R.A. (1997): Functional morphology of a double-walled multiporous olfactory sensillum: the sensillum coeloconicum of Bombyx mori (Insecta, Lepidoptera). Tissue and Cell 30: Hrubík, P. (2007): Alien insect pests on introduced woody plants in Slovakia. Acta Entomologica Serbica 12(1): Ignell, R., Hansson, B.S. (2005): Insect olfactory neuroethology an electrophysiological perspective p In Christensen, T. A. (Ed.). Methods in insect sensory neuroscience. CRC press. Boca Raton. Isidoro, N, Williams, I.H., Solinas, M., Martin, A. (1992): Mating behaviour and identification of the female sex pheromone gland in the brassica pod midge (Dasineura brassicae Winn.: Cecidomyidae, Diptera). Bollettino dell Instituto di Entomologia G. Grandi Universitá di Bologna 47: Jermy, T., Szelényi, G. (1958): Az őszi búza állattársulásai. Állatt. Közl. 46: In: Jermy, T. és Balázs, K. (eds.) (1994) A Növényvédelmi állattan kézikönyve, Akadémiai Kiadó, Budapest. Kaissling, K-E. (1996): Peripherial mechanism of pheromone reception in moth. Chem. Senses 21: Kanno, H., Harris, M. (2000): Leaf physical and chemical features influence selection of plant genotypes by Hessian fly. J. Chem. Ecol. 26: Karlson, P., Lüscher, M. (1959): Pheromones: a new term for a class of biological active substances. Nature 183: Keil, T.A., Steinbrecht, R.A. (1987): Diffusion barriers in silkmoth sensory epithelia: application of lanthanum tracer to olfactory sensilla of Antheraea polyphemus and Bombyx mori. Tissue Cell 119: Keil, T.A. (1999): Morphology and development of the peripheral olfactory organs. In: Insect olfaction. (Ed. B. S. Hansson) Springer-Verlag Berlin. p Kostelc, J.G., Girard, J.E., Hendry, L.B. (1980): Isolation and identification of sex attractant of mushroom-infesting sciarid fly. J. Chem. Ecol. 6:

121 Labanowska, B.H., Cross, J. (2008): Raspberry cane midge Resseliella theobaldi (Barnes) flight and egg laying dynamics on raspberry fruiting on two year old cane. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research 16: Labanowski, G, Soika, G. (1997): New and lesser known pests occurring on ornamental trees and shrubs. Progress in Plant Protection 37(1): Laborius, A. (1972): Untersuchungen über Parasitierung des Kohlschotenrüsslers (Ceutorrhynchus assimilis PAYK.) und de Kohlschotengallmücke (Dasyneura papaveris WINN) in Schleswig-Holstein. Z. angew. Entomol. 72: Lambinon, J., Schneider, N., Feitz, F. (2001): Contribution à la connaissance des galles de Diptères (Insecta, Diptera) du Luxembourg. Bulletin de la Société des Naturalistes luxembourgois 102: Larousse, T. (2005): Rapport Annuel Qualité et de la Protection des Végétaux. Année Production Horticole. Pépinières Ligneuses Ornementales, p. 33. Law, J.H., Regnier, F.E. (1971): Pheromones. Ann. Rev. Biochem. 40: Lee, B.Y., Chung, Y.J., Park, K.N., Byun, B.H., Bae, W.I. (1997): Distribution of the pine needle gall midge, Thecodiplosis japonensis Uchida et Inouye (Diptera: Cecidomyiidae), infestations in Korea: a brief history. FRI Journal of Forest Science 56: Liu, Y.J., Hall, D., Cross, J., Farman, D., Amarawardana, L., Liu, Q.R., He, X.K., (2009): (2S,8Z)-2-Butyroxy-8-heptadecene: major component of the sex pheromone of chrysanthemum gall midge, Rhopalomyia longicauda. J. Chem. Ecol. 35: Lerin, J. (1984): The effect of two isothiocyanates on the levels of capture in yellow traps of insect pests of colza. Acta Oecol. 5: Leston, D. (1961): The Miridae (Hemiptera) of Bedfordshire. Proceedings of the South London Entomological and Natural History Society 1960: Lyrene, P.M., Payne, J.A. (1992): Blueberry gall midge; a pest on rabbiteye blueberry in Florida. Proceedings, Florida State Horticulture Society. 105: Mackley, J.W., Broce, A.B. (1981): Evidence of a female sex recognition pheromone in the srewworn fly. Environ. Entomol. 10: Maia, V.C., Constantino, P.A.L., Monteiro, R.F. (2005): New gall midges (Diptera, Cecidomyiidae) associated with two species of Eugenia (Myrtaceae). Revista Brasileira de Entomologia 49(3):

122 Manninger, G.A. (1966): A lucerna védelme. In: Kemenesy, E. és Manninger, G. A.: A lucerna termesztése és védelme Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. Martinovich, V. (1975): Puszpángszúnyog. In Martinovich, V. (szerk.) Dísznövényvédelem. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. Mckay, P., Hatchett, J. (1984): Mating behaviour and evidence of female sex pheromone in hessian fly, Mayetiola destructor (Say) (Diptera: Cecidomyiidae) Annals of the Entomological Society of America Miller, G.E., Borden, J.H. (1984): Reproductive behaviour of the Douglas-fir cone gall midge, Contarinia oregonensis (Diptera: Cecidomyiidae). Canadian Entomologist 116: Molnár, B., Boddum, T., Szőcs, G., Hillbur, Y. (2009): Occurrence of two ornamental pest gall midges, Obolodiplosis robiniae (Heldman) and Dasineura gleditchiae (Osten Sacken) (Diptera: Cecidomyiidae) in Sweden. Entomologisk Tidskrift 130: Murchie, A.K., Smart, L.E., Williams, I.H. (1997): Responses of Dasineura brassicae and its parasitoids Platygaster subuliformis and Omphale clypealis to field traps baited with organic isothiocyanates. J. Chem. Ecol. 23: Nijveldt, W. (1980): Niewe galmuggen voor de Nederlandse fauna. VII. Entomologische Berichten Amst., 40: Noirot, C., Quennedy, A. (1991): Gland, gland cells, glandular units: some comments on terminology and classification. Annales de la Societé Entomologique de France 27: Odorfer, M. (1992): Összehasonlító állatszervezettan III.rész, Tankönyvkiadó, Budapest Parella, M.P, Thompson, P.B. (1998): Life history and description of Dasineura gleditchiae (Diptera: Cecidomyiidae) in California. University of California Agriculture and Natural Resources, Slosson Endowment for Ornamental Horticulture, Slosson Project Reports, Slosson Endowment for Ornamental Papp, L., Darvas, B. (1997): Contributions to a manual of palaearctic Diptera. 2. Vol. Nematocera and lower Brachycera. Science Herald, Budapest. Peña, J.E., Baranowski, R.M., McMillan, R.T. (1987): Prodiplosis longifilia (Diptera: Cecidomyiidae), a new pest of citrus in Florida. Florida Entomologist 70:

123 Peña, J.E., Gagné, R., Duncan, R. (1989): Biology and characterization of Prodiplosis longifila (Diptera: Cecidomyiidae) on lime in Florida. Florida Entomologist 72: Percy, J.E., Weatherston, J. (1974): Gland stucture and pheromone production in insects. In: M.C. Birch (ed.), Pheromones. North Holl and Publishing Company, p Petterson, J. (1976): Ethology of Dasineura brassicae Winn. (Dipt., Cecidomyiidae). laboratory studies of olfactory reactions to host-plant. Symp. Biol. Hung. 16: Pivnick, K.A, Labbé, E. (1992): Emergence and calling rhythms, and mating behaviour of the orange wheat blossom midge, Sitodiplosis mosellana (Géhin) (Diptera: Cecidomyiidae). Can. Entomol. 124: Pivnick, K.A. (1993): Response of males to female sex pheromone in the orange wheat blossom midge, Sitodiplosis mosellana (Géhin) (Diptera: Cecidomyiidae). J. Chem. Ecol. 91: Postletwait, J.H., Schneiderman, H.A. (1971): Pattern formation and determination in the antenna of the homoeotic mutant, Antennapedia of Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 25: Raina, A.K., Menn, J.J. (1987): Endocrine regulation of pheromone production in Lepidoptera. In: G.D. Prestwich and G.J. Blomquist (eds.) Pheromone Biochemistry, Academic Press, Orlando, USA p Rajamani, S., Pasalu, I.C., Mathur, K.C., Sain, M. (2004): Biology and ecology of rice gall midge. pp In: Bennett, J., Bentur, J. S., Pasalu, I. C., Krishnaiah, K. (eds.) (2004) New approaches to gall midges resistance in rice. Los Banos, IRRI, International Rice Research Institute. Riolo, P., Hillbur, Y., Isidoro, N., Peri, E., Haftman, J., Francke, S., Francke, W. (2006): Electrophysiological responses of Contarinia sorghicola (Coquillett) (Diptera: Cecidomyiidae) to candidate sex pheromone compounds. 22nd ISCE Annual Meeting Barcelona, Spain, p. 81. Ripka, G. (1996): A Dasineura gleditchiae (Osten Sacken) (Diptera, Cecidomyiidae) kártétele tövises lepényfán. Növényvédelem 32: Roelofs, W.L. (1984): Electroantenogramm Assay: Rapid and convenient screening procedures for pheromones. In: Techniques in pheromone research (eds.: H. E. Hummel and T. A. Miller), Springer Verlag. p

124 Rosetta, R.B., Thompson, P., Bell, N. (1998): IPM of honey locust pod gall midge. The Digger 42(3): Sato, S., Ganaha, T., Yukawa, J., Liu, Y.J., Xu, H.L., Paik, J.C., Uechi, N., Mishima, M. (2009): A new species, Rhopalomyia longicauda (Diptera: Cecidomyiidae), inducing large galls on wild and cultivated Chrysanthemum (Asteraceae) in China and on Jeju Island, Korea. Appl. Entmol. Zool. 44: Sain, M., Kalode, M.B. (1985): Traps to monitor gall midge population in rice. Current Science 54(17): 876. Sain, M. (1988): Studies on varietal resistance and bionomics of rice gall midges Orseolia oryzae (Wood-Mason). PhD thesis, Osmania University, Hyderabad. Schneider, D. (1957): Elektrophysiologische Untersuchungen von Chemo- und Mechanoreceptoren die Antenne des Seidenspinners Bombyx mori L. Z. Vergl. Physiol. 54: Sefrová, H., Lastuvka, Z. (2005): Catalogue of alien animal species in the Czech Republic. Acta Univ. Agric. Silvic. Mendelianae Brun, 53(18): Sharma, H.C., Vidyasagar, P. (1992): Orientation of male sorghum midge, Contarinia sorghicola to sex pheromones from virgin females in the field. Entomol. Exp. Et Applicata 64(1): Sharma, H.C., Agrawal, B.L., Vidyasagar, P., Abraham, C.V., Nwanze, K.F. (1992): Identification and utilization of resistance to sorghum midge, Contarinia sorghicola (Coquillet), in India. Crop Protection 12(5): Shetlar, D.J., Herms, D. (1999): Insect and mite control on woody ornamentals and herbaceous plants. p , The Ohio State University, Columbus, Ohio. Shorey, H.H., Bartell, R.J. (1970): Role of a volatile female sex pheromone in stimulating male courtship behavior in Drosophila melanogaster. Anim. Behaviour. 18: Shorey, H.H. (1977): Concepts and metodology involved in pheromonal control of Lepidoptera by disruption of premating communication. In.: Crop protection agents: their biological evaluation. (1975) McFarlane N. R. (Ed.) p Simova-Tossic, D., Skuhravá, M. (1995): The occurrence and biology of Dasineura gleditchiae O. S. (Dipera, Cecidomyiidae) in Serbia. Acta Soc. Zool. Bohem. 59:

125 Skuhravá, M. (1986): Family Cecidomyiidae, p In Soós, Á., Papp, L. (eds.): Catalogue of Paleartic Diptera. Vol. 4. Sciaridae Anisopodidae. Akadémia Kiadó, Budapest, p Skuhravá, M., Stöcklin, J., Weppler, T. (2006a): Geomyia n. gen. alpina n. sp. (Diptera: Cecidomyiidae), a new gall midge species associated with flower heads of Geum reptans (Rosaceae) in the Swiss Alps. Mitteilungen der Schweizerischen Entomologischen Gesellschaft 79: Skuhravá, M., Skuhravy, V., Jørgensen, J. (2006b): Gall midges (Diptera: Cecidomyiidae) of Denmark. Entomologiske Meddelelser 74 (special issue), p Slifer, E.H. (1954): The permeability of sensory peg on the antennae of the grasshopper (Orthoptera, Acrididae). Biol. Bulletin 106: Slifer, E.H., Prestage, J.J. és Beams, H.W. (1959): The chemoreceptors and other sense organs on the antennal flagellum of the grasshopper (Orthoptera, Acrididae). J. Morphol. 105: Slifer, E.H., Sekhon, S. (1971): Circumfila and other sense organs on the antenna of Sorgum midge (Diptera: Cecidomyiidae). Journal of morphology 133: Solinas, M., Nuzzaci, G. (1987): Antennal sensilla of Mycodiplosis erysiphes Ruebs. (Cecidomyiidae, Diptera). Bolleti dell Instituto de Entolomgia Guido Grandi della Universitá de Bologna. 41: Solinas, M., Isidoro, N. (1991): Identification of the female sex pheromone gland in the sorgum midge, Allocontarinia sorghicola (Coq.) Solinas (Diptera, Cecidomyiidae). Redia 74: Soné, K., Takeda, H. (1983): Studies on the distribution pattern of the pine needle gall midge, Thecodiplosis japonensis Uchida et Inouye (Diptera: Cecidomyiidae) in a pine forest. Res. Popul. Ecol. 25: Soné, K. (1985): Within-tree distribution of the infestation by the pine needle midge, Thecodiplosis japonensis Uchida and Inouye (Diptera: Cecidomyiidae). Japan. Forest Soc. 67: Spungis, V. (2007): New genus and species of gall midges (Diptera, Cecidomyiidae) from the Seychelles. Latvijas Ent. 44: Steinbrecht, R.A. (1969): On the question of nervous syncytia: lack of axon fusion in two insect sensory nerves. J. Cell. Sci. 4: 39:

126 Steinbrecht, R.A. (1999): Pore structures in insect olfactory sensilla: a review of data and concepts. Int. J. Insect Morphol. and Embryol. 26: Stensmyr, M.C. (2004): The fly nose function and evolution. Doctoral thesis, Swedish University of Agricultural Sciences, Alnarp, Sweden. Steyrer, G., Cech, T.L., Fürst, A., Krehan, H., Krenmayer, W., Kristöfel, F., Perny, B., Schaffer, H., Stagl. W.G., Tomiczek, C. (2002): Forest protection situation 2001 in Austria - surveys and diagnosis of the BFW and documentation of forest damaging factors Forstschutz Aktuell 28: 66. Suckling, D.M., Walker, J.T.S., Shaw, P.W., Manning, L., Lo, P., Wallis, R., Bell, V., Sandanayaka, W.R.M., Hall, D.R., Cross, J.V., El-Sayed, A.M. (2007): Trapping of Dasinuera mali (Diptera: Cecidomyiidae) in apples. J. Econ. Entomol. 100: Summers, C.G. (1975): Daily adult emergence in the sorghum midge, Contarinia sorghicola. Envir. Ent. 4(4): Sylvén, E. (1970): Field movement of radioactively labelled adults of Dasineura brassicea Winn. (Dipt., Cecidomyiidae). Ent. Scand. 1: Syntech official website: Szelényi, G. (1971): Die Artengruppen Tetrastichus flavovarius auct. Und T. brevicornis auct. Ein Beitrag zur Systematik der Gattung Tetrastichus HAL. S. l. (Hym., Chalc. Eulophidae). Z. angew. Entomol. 28: In: Jermy, T. és Balázs, K. (eds.) (1994) A Növényvédelmi állattan kézikönyve, Akadémiai Kiadó, Budapest. Thompson, P.B., Parella, M.P., Murphy, B.C. (1998): Life history and descripition of Dasineura gleditchiae (Diptera: Cecidomyiidae) in California. Pan-Pacific Entomologist 74(2): Tewksbury, L., Casagrande, R., Blossey, B., Häfliger, P., Schwarzländer, M. (2002): Potential for biological control of Phragmites australis in North America. Biological Control 23: Valleur, P. (1998): Male moth behaviour and perception in pheromone plumes. Doctoral thesis, Department of Ecology-Animal Ecology, Lund University, Lund, Sweden. Vallotton, R. (1969): Contribution á la biologie de la Cécidomyi de pois Contarinia pisi Winn. (Diptera, Cecidomyiidae) avec étude particuliére du phénoméne de la diapause. Mitteilungen der Schweizerischen Entomologischen Gesellschaft, Bulletin de la Société Zoologique Suisse 42:

127 van der Pers, J.N.C., Thomas, G., Otter, C.J. (1980): Interactions between plant odours and pheromone reception in small ermine moth (Lepidoptera: Yponomeutidae) Chemical Senses. 5: van Lenteren, J.C., Woets, J. (1988): Biological and integrated pest control in greenhouses. Annu. Rev. Entomol. 33: van Lenteren, J.C. Schettino, M., Isidoro, N., Romani, R., van Schelt, J. (2002): Morphology of putative female sex pheromone glands and mating behaviour in Aphidolethes aphidimyza. Entomologia Experimentalis et Applicata 102: van Tol, R.W., Swarts, H.J., van der Linden, A., Visser, J.H. (2007): Repellence of the red bud borer Resseliella oculiperda from grafted apple trees by impregnation of rubber strips with essential oils. Pest Manag. Sci. 63(5): Vétek, G., Pásztor, B., Pénzes, B. (2010): A puszpáng-gubacsszúnyog (Monarthropalpus flavus Schrank) nemek közötti kémiai kommunikációjának igazolása szűz nőstényes csapdákkal. Növényvédelem 46(1): Vogt, R.G. (2005): Molecular basis of pheromone detection in insects. In: Comprehensive molecular insect science vol.: 3. (eds.) Gilbert, L. I., Iatrou, K., Gill, S. S. p Wall, C., Pickett, J.A., Garthwaite, D.G., Morris, N. (1985): A female sex pheromone in the pea midge, Contarinia pisi. Ent. Exp. Appl. 39: Wani, R.L., Poe, S.L., Greene, G.L. (1979): Emergence pattern of the sorghum midge, Contarinia sorghicola, and its parasite, Aprostocetus diplosidis. Florida Entomologist 62(1): Wilson, E.O. (1963): Pheromones. Sci. Amer. 208: Williams, I., Martin, A. (1986): Evidence for a female sex pheromone in the brassica pod midge Dasineura brassicae. Physiological Entomology, 11: Williams, I.H., Walton, M. (1990): A bibliography of the parasitoids of the brassica pod midge (Dasineura brassicae Winn.) IOBC/WPRS Bull. 13: Whittaker, R.H., Feeny, P.P. (1971): Allelochemicals: chemical interactions between species. Science 171: Zhang, J., Yang, M. (2008): Scanning electron microscopy of antennae of Aphidoletes aphidomyza (Diptera: Cecidomyiidae). Zoological Research 29:

128 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE CLSA EAG FID GC GC-EAD GC-MS ORN Rac (R)-enantiomer RI RT SSR S10:Ac S14:Ac (S)-enantiomer Z8-17:2Ac Z11-14:Ac Closed loop stripping apparatus zárt rendszerben történő illatanyag visszafogásra szolgáló készülék Elektroantennográf (csápdetektor) Flame ionization detector gázkromatográf lángionizációs detektora Gázkromatográf Bioszenzoros gázkromatográf (gázkromatográfhoz kapcsolt csápdetektor) Gázkromatográffal kapcsolt tömegspektrográf Olfactory receptor neuron szagló receptor idegsejt Racém elegy az (R)- és (S)-enantiomer 1:1 arányú elegye (2R,8Z)-2-acetoxy-8-heptadecén Retenciós index Retenciós idő Single sensillum recording ingerületelvezetés a csáp egyetlen érzékszőréről Decenil-acetát Tetradecenil-acetát (2S,8Z)-2-acetoxy-8-heptadecén (Z)-2-acetoxy-8-heptadecén Z(11)-tetradecenil-1-acetát 128

129 1; Lepényfa-gubacsszúnyog nősténye tojásrakás közben 2; A lerakott tojások 3; 2500 nőstény, illatanyag gyűjtés után 4; Gleditsia triacanthos Sunburst a Várban 5; Lepényfa fasor a Várnegyedben 6; Gubacsos Gleditsia t. Sunburst lomb 7; Felpreparált hím gubacsszúnyog (EAG) 8; Kirajzás után elszáradó gubacsok 9; Imágók keltetése laboratóriumban, fertőzött lombból 10; Lepényfa magvetés mesterséges fertőzéshez 11; Károsított lepényfa Budapesten 12; A kifejleszett feromoncsapda használat közben

130 MELLÉKLET2 1-2; Egy L3 fátyolka lárva (Chrysoperla carnea faj-komplex) cserkészik a lepényfa-gubacsszúnyog gubacsok között 3; G. triacanthos Sunburst fasor a Könyves Kálmán körúton 4; Pinalithus cervinus által károsított lepényfa-gubacsszúnyog gubacsok (Svédország, Alnarp) 5; Az elkövető: Pinalithus cervinus (Herrich-Schaeffer, 1841) imágója (Heteroptera, Miridae) (fotó: 6; Kilátás a Budai Várból lepényfa fasorral 131