DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS VARGA ILDIKÓ PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR

DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS VARGA ILDIKÓ PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR KESZTHELY 2013

PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Iskolavezető: DR. KOCSIS LÁSZLÓ, D.SC. egyetemi tanár Témavezető: DR. TALLER JÁNOS, PH.D. tudományos főmunkatárs A FEHÉR FAGYÖNGY (VISCUM ALBUM) MAGYARORSZÁGI ELTERJEDÉSE ÉS EGYIK KÓROKOZÓJA, A PHAEOBOTRYOSPHAERIA VISCI TULAJDONSÁGAINAK FELTÁRÁSA A BIOLÓGIAI VÉDEKEZÉS SZEMPONTJÁBÓL DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS VARGA ILDIKÓ Okleveles növényorvos (M.Sc.) KESZTHELY 2013 2

A fehér fagyöngy (Viscum album) magyarországi elterjedése és egyik kórokozója, a Phaeobotryosphaeria visci tulajdonságainak feltárása a biológiai védekezés szempontjából Értekezés doktori (Ph.D.) fokozat elnyerése érdekében Írta: VARGA ILDIKÓ Készült: PANNON EGYETEM NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Témavezető: Dr. Taller János Elfogadásra javaslom (igen / nem). Dr. Taller János A jelölt a doktori szigorlaton...%-ot ért el. Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve:... igen /nem. (aláírás) Bíráló neve:... igen /nem. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...%-ot ért el. Keszthely,. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése... Az EDHT elnöke 3

TARTALOMJEGYZÉK 1. KIVONATOK... 7 1.1 Magyar nyelvű kivonat... 7 1.2 Abstract... 9 1.3 Auszug... 11 2. BEVEZETÉS... 13 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 14 3.1 A fehér fagyöngy... 14 3.1.1 Taxonómia... 14 3.1.2 Morfológia... 15 3.1.3 Fenológia... 19 3.1.4 Életciklus... 20 3.1.5 Gazdanövénykör... 21 3.1.6 Elterjedési terület... 22 3.2 A fehér fagyöngy, mint erdészeti károsító... 24 3.2.1 A fehér fagyöngy gazdanövényekre gyakorolt hatásai... 24 3.2.2 A fehér fagyöngy szerepe az erdészeti leromlási spirálban... 24 3.3 A fehér fagyöngy életközössége... 25 3.3.1 A fehér fagyöngyhöz kötődő ízeltlábúak... 25 3.3.2 Mikroszkopikus gombák és baktériumok... 29 3.3.2.1 Phaeobotryosphaeria visci... 31 3.4 A fehér fagyöngy elleni védekezés lehetőségei... 36 3.4.1 Mechanikai védekezés... 36 3.4.2 A herbicides védekezés lehetőségei... 36 3.4.3 A biológiai védekezés lehetőségei... 37 3.4.3.1 A mikoherbicid fejlesztés... 37 4. CÉLKITŰZÉSEK... 41 4

5. ANYAG ÉS MÓDSZER... 42 5.1 A fehér fagyöngy hazai előfordulásának vizsgálata... 42 5.1.1 Irodalmi adatok feldolgozása... 42 5.1.2 Országos fagyöngy felvételezés... 42 5.1.3 Elterjedési térkép megrajzolása... 43 5.2 A Phaeobotryosphaeria visci vizsgálatai... 45 5.2.1 Országos mintavételezés... 45 5.2.1.1 Monospórás tenyészetek... 46 5.2.2 Molekuláris genetikai vizsgálatok... 46 5.2.3 Mikológiai vizsgálatok... 48 5.2.3.1 Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok... 48 5.2.3.2 Növekedés szilárd és folyékony táptalajokon... 48 5.2.3.3 A sporuláció vizsgálata... 50 5.2.3.4 Mesterséges fertőzés és fertőzési küszöbérték vizsgálatok... 52 5.2.3.5 Herbicid érzékenységi vizsgálatok... 54 5.2.3.6 A mikológiai vizsgálatok statisztikai értékelése... 55 6. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK... 57 6.1 A fehér fagyöngy előfordulása Magyarországon... 57 6.1.1 A fehér fagyöngy 1920-as évekbeli elterjedésének rekonstrukciója... 57 6.1.2 A fehér fagyöngy hazai előfordulása az 1990-es évektől napjainkig... 60 6.1.3 A fehér fagyöngy előfordulási gyakorisága napjainkban... 63 6.1.4 A fehér fagyöngy gazdanövényei Magyarországon... 68 6.1.5 A fehér fagyöngy elterjedését befolyásoló tényezők... 73 6.2 A Phaeobotryosphaeria visci vizsgálatai... 76 6.2.1 A Ph. visci hazai elterjedése és a monospórás tenyészetek... 76 6.2.2 Molekuláris genetikai vizsgálatok... 80 6.2.3 A Ph. visci antibiotikum érzékenysége... 83 6.2.4 Ph. visci növekedése szilárd és folyékony tápközegeken... 88 6.2.4.1 Szilárd táptalajok... 88 6.2.4.2 Folyadék táptalajok... 93 6.2.5 Sporulációs vizsgálatok... 98 6.2.6 Mesterséges fertőzés és a fertőzési küszöbérték vizsgálatai... 106 6.2.7 A glifozát és 2,4-D hatása a Phaeobotrioshaeria visci növekedésére... 113 5

7. JÖVŐBENI PERSPEKTÍVÁK... 116 7.1 A Ph. visci, mint lehetséges mikoherbicid: a további kutatások iránya... 116 7.2 Az ízeltlábú fajok lehetséges szerepe a biológiai védekezésben... 117 7.3 A fehér fagyöngy elleni herbicides védekezés lehetőségei... 120 7.4 A kombinált védekezés lehetőségei... 122 8. ÖSSZEFOGLALÁS... 123 9. TÉZISPONTOK... 125 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 129 11. IRODALOMJEGYZÉK... 131 12. MELLÉKLETEK... 145 12.1 A dolgozatban szereplő növények tudományos nevei... 145 12.2 A fehér fagyöngy előfordulása Magyarországon 1990-től 2011-ig... 146 12.3 A leggyakoribb 18 gazdafaj megoszlása a hazai nagytájakon a fehér fagyönggyel fertőzött és nem fertőzött területek arányában... 147 12.4 A Ph. visci rdns-its szekvenciáinak összerendezése... 148 12.5 A mikológiai vizsgálatok eredményei... 154 13. PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK... 162 Fagyöngyöt gyűjtő druida pap a 6. század körül (Grose 1773). 6

1. KIVONATOK 1.1 Magyar nyelvű kivonat A fehér fagyöngy (Viscum album) magyarországi elterjedése és egyik kórokozója, a Phaeobotryosphaeria visci tulajdonságainak feltárása a biológiai védekezés szempontjából A fehér fagyöngy (Viscum album) egy örökzöld, évelő, epifita, félparazita növény, mely hausztóriumai segítségével gazdanövényeitől vizet és ásványi anyagokat szív el. Fellépése az erdőgazdaságokban számottevő károkat okoz, hiszen a faanyag minősége romlik, a biomassza produktum csökken, valamint tömeges megtelepedése a fertőzött egyedek korai pusztulását okozza. A hemiparazita elleni védekezés annak egyre növekvő károsítása ellenére sem megoldott, leggyakrabban a bokrok mechanikai eltávolítását alkalmazzák. A fehér fagyöngy hazai térhódítása is igen jelentős, bár a növény pontos elterjedéséről átfogó vizsgálat az utóbbi években nem született. Hazánkban a fehér fagyönggyel fertőzött területek nagysága az utóbbi 90 évben több mint háromszorosára nőtt, mára az ország területének közel 1/3-a fertőzött. Tömegesen fordul elő a Felső-Tisza-vidékén, továbbá a Bakony, Zalai-dombság, a Belső-Somogy és az Őrség területein. Fertőzésével leggyakrabban nyár (Populus), alma (vad fajok és régi tájfajták), juhar (Acer), hárs (Tilia), akác (Robinia pseudoacacia), fűz (Salix) és nyír (Betula) fajokon találkoztunk. A fehér fagyöngy elleni eredményes biológiai védekezésre a Phaeobotryosphaeria visci gombafaj tűnik leginkább alkalmasnak. A kórokozó laboratóriumi körülmények között jól tenyészthető, melyre leginkább burgonyadextróz és zabkivonat agar alkalmas. A Ph. visci szilárd táptalajon való növekedését jelentősen gátolta a rifampicin, míg a kanamicin és ampicillin akár kombinációban is szabadon használható. Folyadék táptalajon rázatás mellett nem, csak konstans kultúrában tenyészthető a már említett táptalajokon. Bár a kórokozó megvilágítás nélkül fejlődő izolátumai nem sporulálnak, azonban a folyamatos fehér fénnyel történő megvilágítás jelentősen emelte a képződött spóraszámot zabkivonat, burgonya-dextróz és V8-zöldséglé agarokon. 7

A kórokozó legintenzívebb sporulációját szintén zabkivonat agaron 12h fehér fény, 12h közeli-uv alternáló megvilágítás mellett figyeltük meg. A Ph. visci sporulációjának fokozására sem a 12 h fehér/12 h megvilágítás nélküli alternációja, sem a folyamatos közeli- UV nem volt alkalmas, továbbá a sporuláció nem zajlott le S és SN agarokon sem. A Ph. visci spóraszuszszpenziója már az általunk vizsgált legalacsonyabb (6,5 10 3 db/ml) koncentráció esetén is sikeresen fertőzte az egészséges fagyöngy leveleket 20 C-on 70 RH% légnedvesség mellett. A törzsek virulenciájában statisztikailag igazolható különbséget nem találtunk. A klasszikus mikológiai vizsgálatainkat a kórokozó ITS-régióinak molekuláris genetikai vizsgálatával egészítettük ki az izolátumok genetikai diverzitásának megállapítása céljából. Eredményeink alapján a korábbi szakirodalmi adatokhoz képest a Ph. visci jóval nagyobb variabilitást mutatott, hiszen annak három haplotípusát különítettük el. 8

1.2 Abstract The distribution of European mistletoe (Viscum album) in Hungary and investigation of the biological control potential of one of its pathogen, Phaeobotryosphaeria visci European Mistletoe (Viscum album) is an evergreen, epiphytic, perennial hemiparasitic plant, which uptakes water and nutrients with haustoria from its hosts. European mistletoe adversely affects the quality and quantity of the wood, and lowers the vigor of the host, inducing premature mortality. Several means of controlling mistletoes have been tested so far but direct methods, such as pruning of infected branches, or removing infected trees, are still the only effective methods. The Hungarian distribution area rose significantly, but no study has reviewed this topic in the last years. The distribution of European mistletoe has grown almost three times larger in the past 90 years. The mass occurrence was noticed in the mezoregions of Upper Hungarian Tisza region, Bakony, Zala Hills, Inner-Somogy and Őrség. Where the most common infected species are poplar (Populus), apple (wild species and landraces), maple (Acer), lime (Tilia), Black Locust (Robinia pseudoacacia), willow (Salix) and birch (Betula). Phaeobotryosphaeria visci seems to be the most suitable agent for effective biological control of European mistletoe. The pathogen can be easily cultured under laboratory conditions on potato-dextrose and oatmeal agar. Mycelial growth on solid media was significantly inhibited by rifampicin, while kanamycin and ampicillin can be used freely or even in combination. Phaeobotryosphaeria visci can be grown in liquid culture without shacking on media mentioned above. No sporulation was observed in case of isolates, which were kept in dark thermostat, while constant white light induced sporulation on potato-dextrose, oatmeal and V8 vegetable juice media. The spore production significantly increased in case of the combination of oatmeal agar and photoperiod of 12h white light: 12h near-uv. There was no sporulation on S media and SNA media, while constant near-uv and 12 h white light: 12 h dark photoperios also not redounded sporulation. 9

We noticed successful infection of the pathogen even in case of the lowest investigated concentration of the spore suspension (6.5 10 3 spore/ml) under 20 C and 70 RH% conditions. There was no difference in the virulence of the Ph. visci isolates. Our classical mycological study was complemented with molecular genetic analysis of some Ph. visci isolates ITS regions. Based on our results the pathogen is more variable compared to previous literature data, because we have identified three haplotypes of Ph. visci. 10

1.3 Auszug Die Verbreitung der weißbeerigen Mistel (Viscum album) in Ungarn und Untersuchung ihres eineren Erreger, Phaeobotryosphaeria visci mit Focus an deren mögliche Anwendung in biologische Kontrolle Die weißbeerige Mistel (Viscum album) ist ein immergrüner, mehrjähriger, epiphytischer Halbschmarotzer, die mithilfe ihrer Haustorien Wasser und Mineralien ihren Wirtspflanzen entzieht. Ihre Erscheinung in Forstwirtschaften verursacht erhebliche Schäden, weil die Qualität des Holzmaterials beeinträchtigt, das Biomassenprodukt gesenkt und die Lebensdauer der infizierten Bäume verkürzt wird. Die Bekämpfung dieses Hemiparasiten ist trotz seiner wachsenden schädlichen Wirkung nicht gelöst in den meisten Fällen wird die mechanische Entfernung benutzt. Die Raumeroberung der weißbeerigen Mistel ist auch in Ungarn bedeutend, obwohl es im letzten Jahren keine umfassende Studie über die genaue Verbreitung der Pflanze gegeben hat. Die Größe der mit weißbeeriger Mistel infizierten Gebiete in Ungarn hat sich in den letzten 90 Jahren auf das Dreifache vergrößert. Sie kommt im Gebiet der oberen Theiß, des Bakony-Gebirges, des Zalaer Hügellandes, der Inneren Somogy und des Őrség massenhaft vor. Ihre Kolonisierung können wir am meisten an Spezies von Pappeln (Populus), Äpfeln (wilde und alte Landschaftssorten), Ahornen (Acer), Linden (Tilia), Robinien (Robinia pseudoacacia), Weiden (Salix) und Birken (Betula) auffinden. Zur effektiven biologischen Bekämpfung der weißbeerigen Mistel halten wir die Pilzart Phaeobotryosphaeria visci für am meisten geeignet. Dieser Krankheitserreger ist unter Laborverhältnissen gut zu kultivieren, wofür am besten der Kartoffel-Dextrose-Agar und der Haferextrakt-Agar geeignet sind. Der Wuchs des Erregers wird auf festem Nährboden durch Rifampicin deutlich gehemmt, Kanamycin und Ampicillin sind aber sogar in Kombination frei benutzbar. In flüssigen Nährmedien kann er bei Schütteln nicht, nur in konstanten Kulturen mithilfe der schon erwähnten Nährmedien kultiviert werden. Obwohl die sich ohne Beleuchtung entwickelnden Isolate des Erregers nicht sporuliert sind, konstantes, weißes Licht erhöht die Zahl der gebildeten Sporen deutlich auf Haferextrakt, Kartoffel-Dextrose und V8 Gemüsesaft Agar. 11

Die intensivste Sporulation haben wir bei der 12-stündigen nahes-uv Alteration der 12- stündigen Beleuchtung mit weißem Licht auf Haferextrakt-Agar beobachtet. Die Sporensuspension des Erregers hat die gesunden Mistelblätter schon bei einer Konzentration von 6,5 10 3 Stück/ml bei 20 C und 70 RH% Luftfeuchtigkeit erfolgreich infiziert. In der Pathogenität der Stämme zeigten sich keine statistisch nachweisbaren Unterschiede. Wir haben die klassischen mykologischen. Untersuchungen mit der molekularbiologischen Analyse der ITS-Regionen ergänzt, um die genetische Diversität der Isolate zu bestimmen. Der Erreger zeigte in unseren Untersuchungen im Vergleich zu den früheren Ergebnissen in der Literatur eine deutlich höhere Variabilität, da wir vier Haplotypen unterscheiden konnten. 12

2. BEVEZETÉS A történelmi idők kezdete óta a fehér fagyöngyöt mítikus gyógy- és varázsnövényként tisztelték, valamint vallási szimbólumként tartották számon. A télen is zöldellő növénynek kiemelt szerepe volt a téli napforduló ünnepén, később a kereszténységhez és karácsony ünnepköréhez társították (Kanner 1939, Paine és Harrison 1992). Mára a növény szerepe és megítélése jelentősen átalakult, hiszen a 20. század kezdete óta főként mint erdészeti károsító, illetve mint parazita növény ismert. A félélősködő faj károsítása több szempontból is jelentős. Erdészeti kultúrákban való fellépésekor a faanyag minősége romlik, ipari célokra felhasználhatatlanná válik. Tömeges megtelepedése esetén a gazdanövény életképessége csökken, majd kiszárad. Az utóbbi évek intenzív terjedése során a fagyöngy parkjainkban és sorfáinkon is megjelent, ezzel rontva azok esztétikai és díszítő értékét. A globális felmelegedés nyomán a fehér fagyöngy elterjedési területe Európában tovább bővült, károsítása pedig jelentősen fokozódott (Noetzli és mtsai 2003, Idžojtić és mtsai 2008, Rigling és mtsai 2010). A fehér fagyöngy hazai elterjedéséről mindössze egyetlen átfogó tanulmány született a múlt század elején (Roth 1926), azóta a növény elterjedésének részletesebb hazai vizsgálatára nem került sor. Jelenleg a fehér fagyöngy elleni egyetlen eredményes védekezés a bokrok mechanikai eltávolítása, a módszer azonban igen nagy stresszt okoz a gazdanövényeknek és csak igen korlátozottan alkalmazható (Hawksworth 1983). A növény elleni peszticides kezelés hatékonyságát számos alkalommal vizsgálták, azonban az egyes gazdanövények érzékenysége és a kijuttatás korlátozottsága miatt ez a védekezési mód sem nyújtott teljeskörű megoldást a problémára (Delabraze és Lanier 1972, Frochot és mtsai 1983, Brun és mtsai 2001). A biológiai védekezés gondolata már az 1970-es években felmerült, amikor először figyeltek fel a fehér fagyöngy hiperparazita kórokozójára, a Phaeobotryosphaeria visci gombafajra. Az évek során az ismert fagyöngyparazita mikroszkopikus gombák száma közel harmincra nőtt, a fent említett faj jelentősége azonban változatlanul megmaradt (Fischl 1978, Karadžić és Lazarev 2005). Bár a kórokozó kapcsán és annak biológiai védekezésben való alkalmazhatóságáról számos kisebb tanulmány született, azonban Ph. visci ma is igen kevéssé ismert fajnak számít. 13

3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3.1 A fehér fagyöngy 3.1.1 Taxonómia A fehér fagyöngy (Viscum album L.) a fagyöngyfélék (Viscaceae [synonym: Santalaceae sensu lato]) családjába tartozó (Nickrent és mtsai 2010), hemiparazita (félélősködő) növény, amely mára egész Európában elterjedt és jelentősen elszaporodott. Korábban e növényt a Viscaceae családon kívül (Barlow és Martin 1984, Borhidi 1998) a Loranthaceae (Calder 1983), később pedig a Santalaceae családba is besorolták (Der és Nickrent 2008). A klasszikus értelemben vett Santalaceae sensu stricto csoportba közel 40 genus és 550 faj tartozik. Korábbi filogenetikai kutatások megállapították, hogy a Santalaceae sensu stricto csoport parafiletikus eredetű (Der és Nickrent 2008). A monofília fenntartása érdekében a zárvatermő növények filogenetikai rendszerében (Angiosperm Phylogeny Group = APG) létrehozták a Santalaceae sensu lato csoportot, amely magába olvasztja a korábbi Viscaceae család közel 540 faját (APG II 2003), ezzel létrehozva a Santalales renden belül fajszám tekintetében a legnagyobb családot. Ezt az APG III (2009) változatlanul hagyta, a rendszerhez legutóbb megjelent monográfia tartalmazza az egyes családok szinonimáit (Reveal és Chase 2011). A parafília feloldása érdekében Nickrent és mtsai (2010) a Santalaceae sensu lato csoportot 6 monofiletikus egységre osztották, majd ismét leválasztották a Viscaceae családot és annak 7 nemzetségét (Arceuthobium, Dendrophthora, Ginalloa, Korthalsella, Notothixos, Phoradendron, és Viscum). A Phoradendron nemzetség után, melybe ma közel 250 fajt sorolnak, a Viscum nemzetség a második legnépesebb a fagyöngyfélék családjában, hiszen közel 150 növényfajt sorolnak ide. A fajok főként a trópusi és mérsékelt égövben fordulnak elő, hiszen Afrikában a nemzetség közel 2/3-a él (Kirkup és mtsai 2000), addig a többi fajjal Eurázsiában és Ausztráliában, valamint Madagaszkár, Dél-Ázsia és Malajzia területén találkozhatunk (Zuber 2004, Nickrent és mtsai 2010). Európában csak két Viscum faj él, a fehér fagyöngy és a vörösbogyójú fagyöngy (Viscum cruciatum Sieber ex Bois.) (Becker 2000). A fehér fagyöngynek négy alfaját különböztetjük meg aszerint, hogy milyen gazdafajokon fordul elő (Stopp 1961, Ball 1993, Böhling és mtsai 2002): 14

(1) V. album subsp. album, amely általánosan elterjedt a kétszikű fafajokon, leggyakrabban az Acer, Tilia, Robinia, Salix és Populus nemzetség fajain telepszik meg (syn: V. album L. var. platyspermum Keller, V. album L. var. mali Tubeuf). (2) V. album subsp. abietis (Wiesb.) Abromeit, mely az Abies fajokon él (syn: V. laxum var. abietis (Wiesb.) Hayek; V. austriacum Wiesb. var. abietis Wiesb.; V. abietis (Wiesb.) Fritsch). (3) V. album subsp. austriacum (Wiesb.) Vollmann, amely Pinus, Picea, ritkán Larix fajokon fordul elő (syn: V. austriacum Wiesb.; V. laxum Boiss. & Reut.; V. laxum Boiss. & Reut. var. pini (Wiesb.) Hayek; V. album L. var. laxum (B. & R.) Fiek). (4) V. album subsp. creticum Böhling, Greuter, Raus, Snogerup, Snogerup & Zuber, mely Pinus brutia * fajon kizárólag Kréta szigetén él (Zuber 2004). Hazánkban leggyakrabban a lombos fafajokon előforduló V. album subsp. album-mal találkozhatunk, míg a nyitvatermő fafajokon előforduló alfajok fellépése és kártétele jóval kevésbé jelentős. 3.1.2 Morfológia A fehér fagyöngy (1. ábra) egy majdnem szabályos gömb alakú, évelő, örökzöld, félparazita növény (Vancsura 1997, Zuber 2004, Grundmann és mtsai 2012), melynek szívógyökerei mélyen a fatestbe hatolnak. A növény kizárólag fás szárú fajokon jelenik meg, ahol 60 150 cm átmérőjű, gömb alakú telepeket hoz létre (Wangerin 1937, Zuber 2004), bár kutatásaink során megfigyeltünk egy közel 170 cm átmérőjű fagyöngybokrot is Sárospatakon, 2010-ben. A bokrok gömb alakja úgy alakul ki, hogy a szár villás elágazásai először legyezőt, majd az évek múltán lassan gömböt formálnak (Böhling és mtsai 2002). A fehér fagyöngy viszonylag rövid életű (15 30 év) és lassan növő növényfaj (Bartha 2012), mely kedvező körülmények esetén akár 70 évig is élhet (Schmidt és Hecker 2009, Grundmann és mtsai 2012). Hajtásai kezdetben monopodiálisak, az álvillás elágazás csak a harmadik évtől jelenik meg. A kifejlett egyedek esetén minden évben egy álvillás elágazás jelenik meg, mely egy rövidebb és hosszabb internódiumból, valamint egy pár pikkely- és egy pár lomblevélből áll (Troll 1937). * A dolgozatban szereplő, a fehér fagyöngyhöz köthető fafajok jelenleg hivatalosan elfogadott (International Code of Nomenlature for Algae, Fungi and Plants 2012) tudományos neveit abc-sorrendben a Melléklet c. fejezet tartalmazza. 15

1. ábra: Illusztráció a 19. századból: Viscum album (Köhler 1887). A lomblevelek sárgászöldek, a hajtások csúcsán átellenesen állnak, gyakran ívelten előreirányulóak (Vancsura 1997), kissé bőrszerűek, hosszúkás tojásdadok, a levélalap fele elkeskenyednek (Ball 1993). A levelek akár 3( 4) évig is élhetnek, méretük 2 8 cm között változhat (Wangerin 1937, Grundmann és mtsai 2012), melyeken 3 5 szabad szemmel is jól kivehető, párhuzamos lefutású levélér látható. A virágos növényekkel ellentétben a fehér fagyöngy leveleinek epidermisz sejtjei tartalmaznak klorofillt, valamint maga az epidermisz jelentősen meg is vastagszik, hiszen a kutikula akár 9 µm is lehet (Luther és Becker 1986). A lomblevelek és a szár hossza a csírázás utáni első öt évben folyamatosan nő, ezután azonban a növény egyre kisebb leveleket és rövidebb internódiumokat képez (Montfort és Müller 1951, Langbehn és Weber 1995). Mindez azt jelenti, hogy a levél mérete inkább függ a növény korától, mintsem a tápanyag ellátottságtól, vagy más abiotikus faktortól (Montfort és Müller 1951). Jelentős eltérés lehet továbbá a levelek alakja és mérete között is, ami nem csupán különböző gazdanövények esetén, hanem ugyanazon gazdanövény két egyede között is megfigyelhető (Griff 1998, Pásztor 2009). Virágai aprók, alig észrevehetőek, sárgászöldek, kétlakiak, többnyire hármasával képződnek az apró fellevelek hónaljában. A termős és porzós virágzatok egyaránt termelnek nektárt, bár a termős virágok jóval többet (Walldén 1961, Luther és Becker 1986). 16

A ragacsos termést gyakran álbogyónak is hívják, mivel a termőn kívül szár eredetű szövetet is tartalmaz. Az álbogyók, melyek a hajtás villás elágazásai közt ülnek (Wangerin 1937), borsó nagyságúak, rendszerint egy négy tojásdad magot tartalmaznak (Vancsura 1997). Ha az összes mag optimális körülmények közé kerül és csírázni kezd, akkor a különböző fagyöngyegyedek akár egymást is parazitálhatják (Tubeuf 1923). A mag epicarpiuma kezdetben zöld, majd fehér színű (Ball 1993). A vastag mezocarpium viscint és egy nyálkás anyagot is tartalmaz (Kuijt 1969, Sallé 1983), ami a gazdanövényen váló megtapadást segíti elő (Vancsura 1997). A magok (2. ábra) terjesztésében számos madárfaj szerepet játszik, melynek jelentőségét már közel 100 évvel ezelőtt is felismerték (Tubeuf 1923). A bogyók leggyakoribb terjesztői a rigók (Turdus viscivorus Linnaeus, 1758; Turdus pilaris Linnaeus, 1758; Turdus iliacus Linnaeus, 1766), de kiemelt szerepe van a barátposzátának (Sylvia atricapilla Linnaeus, 1758) és a csonttollúnak (Bombycilla garrulus Linnaeus, 1758) is (Tubeuf 1923, Frochot és Sallé 1980). Míg a rigók az egész bogyót lenyelik, addig a barátposzáta csak a bogyók húsát csipegeti le, azonban a magok már ebben az esetben is kicsíráznak, vagyis korábbi feltételezésekkel ellentétben a magoknak akkor is képesek kicsírázni, ha nem haladtak át a madarak béltraktusán (Zuber 2004, Grundmann és mtsai 2012). 2. ábra: Csírázó fagyöngy magok. (Fotó: Varga I.) A fehér fagyöngy bogyóit fogyasztó madarak másik csoportja az, mely a bogyóhús elfogyasztása során olyan súlyosan megsérti a magokat, hogy azok elveszítik csírázási képességüket. A cinegefajok (pl. széncinege: Parus major Linnaeus, 1758) táplálkozása nyomán a magok mortalitása közel 100% (Grazi és Urech 1996, 2000, Grundmann és mtsai 2012). 17

Érdekesség továbbá az is, hogy a bogyókat számos egyéb faj is fogyasztja, pl. nyest, európai mókus és vörös róka, valamint a növényt egykor tehenek, szarvasok és őzek takarmányozására is használták (Roth 1926). A fehér fagyöngy endofita rendszere két részből áll (3. ábra). Az egyik a primer hausztórium, ami az első lomblevelek megjelenésével egyidejűleg kezd fejlődni. Az elsődleges szívógyökér a peridermát és háncsrészt áttörve nagyon hamar eléri a gazdanövény kambiumát, ahol jelentős hipertrófiát indukál, így a gazdanövény ága a fagyöngybokrok eredési pontjánál az évek múlásával akár 5 8 cm átmérőt is elérhet (Tubeuf 1923, Hartmann 1994, Nierhaus-Wunderwald és Lawrenz 1997, Grundmann és mtsai 2012). Az endofita rendszer másik része a kéreggyökér, amely keresztülfut a parenchimatikus szövetekben és a kéreg alatt oldal irányba növekszik (Troll 1941, Sallé 1983). A kéreggyökér klorofillal is rendelkezik, mely évente akár 0,75 cm-t is képes nőni, átlagos hossza 4 6 cm (Wangerin 1937, Thoday 1951). Az ilyen élősködőt gyakran chloroparazitának is nevezik (Haracsi 1969). A kéreggyökér semmilyen kapcsolatban nem áll a gazdanövény parenchimatikus sejtjei közt található szállítónyalábokkal (Luther és Becker 1986), bár maga a kéreggyökér is rendelkezik farésszel és háncsrésszel is (Grundmann és mtsai 2012). Ebből a szervből számos másodlagos szívógyökér ered a fatest felé, ami szintén eléri a gazdanövény kambiumát. A kéreggyökér adventív hajtások képzésére is képes, ily módon a fagyöngy vegetatívan szaporodik, bár mindez igen lassan játszódik le (Nierhaus Wunderwald és Lawrenz 1997, Gaubmann és mtsai 2012). 3. ábra: Viscum album L. a gazdanövény hajtásán (Nierhaus-Wunderwald és Lawrenz 1997). 18

3.1.3 Fenológia A Viscum album a csírázást követő 4 5 évben csak a vegetatív szerveit fejleszti, vagyis minden évben egy monopodiális szárrészt, illetve ezeken egy pár levelet képez. Az ötödik év után a növény már csak álvillás elágazásokat képez, valamint minden évben egyszer virágzik, majd álbogyókat érlel (Weber 1993b). A virágzás márciustól áprilisig tart, de meleg tavasz esetén akár már februárban megindulhat (Tubeuf 1923, Stopp 1961). Megfelelő körülmények esetén a nővirágok hamarabb nyílnak a hímvirágoknál (Tubeuf 1923). A növény virágzása mindig ugyanabban az időszakban következik be, függetlenül attól, hogy a gazdanövény korábban (pl. Corylus spp.), vagy később (pl. Tilia spp.) virágzik (Walldén 1961). A hím- és nővirágú egyedeket nem lehet morfológiai bélyegek alapján elkülöníteni, mindez csak akkor lehetséges, ha a növény éppen virágzik, vagy termést érlel. A nemek aránya a kétlaki fagyöngy esetében szinte soha nem egyezik meg, általában nőivarú többlet figyelhető meg (Aparicio és mtsai 1995, Wiens és mtsai 1996), de beszámoltak ennek az ellenkezőjéről is (Dawson és mtsai 1990). Bár a termős virágok több nektárt termelnek, mint a porzós virágok, ezek azonban mégis erősebb illatot árasztanak. A méhek (Apis mellifera Linnaeus, 1758) és poszméhek (Bombus terrestris Linnaeus, 1758) csupán a hím virágokat látogatják (Walldén 1961), így a valódi megporzást a legyek végzik (Hatton 1965). A megporzás történhet szél segítségével is, ennek azonban lényegesen kisebb a jelentősége (Kuijt 1969). A bogyók érése november december tájékán következik be (Nierhaus-Wunderwald és Lawrenz 1997), terjesztése pedig február környékén kezdődik és márciusig tart, de az északi régiókban májusig is elhúzódhat (Wangerin 1937). A magok fő terjesztői a madarak, akik téli kényszertáplálékként elfogyasztják a bogyókat. A magnyugalom általában öt hónapig tart, ami Európában a téli időszakra esik (Wangerin 1937). A csírázása március és április között zajlik, ami akár májusig is kitolódhat. A folyamat teljesen független a rügyező gazdanövénytől, mindehhez azonban megfelelő megvilágítás szükséges (Tubeuf 1923). A levelek a következő év kora tavaszán jelennek meg, de a valódi lomblevelek kifejlődése három évvel később következik csak be (Frochot és Sallé 1980, Weber 1993b). A mag csak az el nem parásodott hajtásokba képes hausztóriumot fejleszteni, így a magoncok általában a hajtások utolsó harmadában helyezkednek el. 19

Hartmann (1990) vizsgálatai szerint az ágak felső részén 34%, az oldalán 57%, az alsó részén pedig 9% valószínűséggel találunk magoncot. Bár a törzs fertőzése is elképzelhető, azonban a fagyöngyök általában a gazdanövény koronájában helyezkednek el, a viszonylag fiatal, vékony kérgű ágakon (Showler 1974). 3.1.4 Életciklus A Viscum album subsp. abietis életciklusát a 4. ábra tekinti át. 4. ábra: A Viscum album subsp. abietis életciklusa (Nierhaus-Wunderwald és Lawrenz 1997, Zuber 2004). 20

Első év: A csírázást követően a magból kibúvó hipokotil egy tapadókorong szerű képletet fejleszt, az epikotil pedig a mag maradványain marad. A rögzítő képlet kifejlődésével véget is ér a fagyöngy rövid nem-parazita életmódja. A parazita fázis a komplex hausztórium, vagy endofita rendszer kifejlődésével kezdődik (Weber 1993a). Ebben az évben még nem jelennek meg levelek, és a hausztórium is csak a téli időszak kezdetéig nő (Zuber 2004). Második év: A hipokotil felemelkedik, a sziklevelek elhalnak, majd megjelenik az első levélpár. A primer hausztórium eléri a gazdanövény kambiumát, illetve a szállítónyalábokat (Sallé 1983). Harmadik év: Megjelenik a második levélpár. Kialakul a kéreggyökér, amiből a másodlagos szívógyökerek is kifejlődnek. A szívógyökerek nagyon hamar a fatest mélyére hatolnak, ekkorra a xilémből már erőteljes a víz és ásványi anyag felszívása (Sallé 1983), valamint a kéreggyökér oldal irányú terjedése intenzívvé válik (Hartig 1876). Negyedik év: Kifejlődik a harmadik levélpár (Zuber 2004). Ötödik év: Kialakul az első álvillás elágazás, melynek csúcsi részénél egy pár valódi lomblevél ül. Később a hajtáscsúcson apró pikkelylevelek jelennek meg, ettől fogva azonban sem a levelek, sem az internódiumok nem tudnak tovább nőni, így a szárrészek egyforma hosszúak, valamint az általuk bezárt szög is közel azonos lesz. Néhány évvel később a hajtásrendszer majdnem szabályos gömb alakot formál, ami az internódiumok csúcsán elhelyezkedő pikkelyleveleknek köszönhető (Luther és Becker 1986, Langbehn és Weber 1995). Az ötödik év leteltével a növény virágozni kezd, majd bogyót érlel (Walldén 1961). 3.1.5 Gazdanövénykör Barney és mtsai (1998) összeállították az ismert gazdanövények listáját. Munkájában 452 fajt nevez meg 96 nemzetségből és 44 családból a Viscum album sensu lato lehetséges gazdanövényeiként. Míg a V. album subsp. abietis csak 20 fajon jelenhet meg, melyből 16 fenyő, a továbbiak pedig a Larix kaempferi, Salix caprea, Acer rubrum, A. saccharinum, addig a V. album subsp. austriacum 12 fenyő és 10 zárvatermő fajt parazitálhat. A V. album subsp. album európai gazdanövényeként 384 fajt jelöltek meg, melyből 190 idegen eredetű faj volt. A Rosaceae családból kerül ki a legtöbb parazitált növényfaj, számuk akár 130 is lehet. Leggyakrabban az Acer-, Crataegus-, Malus-, Salix-, Populus-, Prunus-, Sorbus- és Tilia-fajokon találkozhatunk a félparazitával. Európa egyik leggyakoribb 21

erdőalkotó faját, a bükköt (Fagus sylvatica) soha nem fertőzi meg a növény (Zuber 2004), míg más fajokon (pl. Quercus spp. és Ulmus spp.) is csak ritkán találkozhatunk vele (Becker 2000). Érdekesség, hogy mindössze egyetlen kétszikű növényfaj, a hamuszürke rekettye (Genista cinerea) ismert, melyen mindhárom alfaj természetes körülmények között együtt is megjelenhet (Grazi és Zemp 1986, Schaller és mtsai 1998, Grundmann és mtsai 2012). 3.1.6 Elterjedési terület Bár a fehér fagyöngy igen nagy számban van jelen Európában, előfordulása mégis igen heterogén (5. ábra). A kontinensen sok helyütt tömegesen fordul elő mindhárom alfaj, máshol nagy területeken hiányzik, mint Bohémia nagy részéről Csehországban (Procházka 2004), vagy az Alföld központi régióiból Magyarországon (Roth 1926, Bartha és Mátyás 1995). 5. ábra: A fehér fagyöngy elterjedése Európában a szórványos svédországi és dániai előfordulás nélkül. (Tubeuf (1923), Roth (1926), Bartha és Mátyás (1995), Zuber (2004) és Briggs (2011) adatai alapján készítette Varga I.) 22

A fagyöngy elterjedésének déli és nyugati határa a Földközi-tenger és az Atlanti-óceán (Zuber 2004). Míg a növény az Ír-szigetről teljesen hiányzik, addig tömegesen fordul elő Nagy-Britannia déli részén, valamint néhány helyen Skóciában is megtalálható (Briggs 2011). A fagyöngy keleti elterjedése Ukrajnában a Kárpátokig húzódik, valamint szórványosan megfigyelhető a Krím-félszigeten és a Fekete-tenger keleti partján is (Tubeuf 1923, Fomin 1952, Kubát 1997). A növény északon az é.sz. 60 -ig fordul elő. Bár Hollandiában nem honos és Németország északnyugati területein is csak szórványosan találkozhatunk vele (Briggs 2011, FloraWeb 2013), addig megtalálható Dániában és Svédország déli területein is, ahol Mälaren környékén még elvétve előfordul (Tubeuf 1923, Zuber 2004). A fehér fagyöngy gazdanövényei által meghatározott potenciális elterjedési területe jóval nagyobb, mint az általa meghódított területek. Ennek az oka az, hogy a hemiparazita elterjedését a téli és nyári átlaghőmérséklet befolyásolja, vagyis nem fordul elő azokon a helyeken ahol a téli, vagy a nyári átlaghőmérséklet túl alacsony (Tubeuf 1923, Iversen 1944, Skre 1971, 1979). Magát a növényt szubmontán fajnak tartják, vagyis előfordulása a mérsékelt égöv hegyvidéki, hegylábi területeire jellemző, általában 1000 m-es magasságig (Zuber 2004, Dobbertin és mtsai 2005, Bartha 2012). A globális felmelegedés következtében a fehér fagyöngy elterjedési területei tovább bővültek, melyről Dobbertin és mtsai (2005) számoltak be, hiszen a növény elterjedési határa a svájci Alpokban az elmúlt évszázadban már 200 m-rel feljebb tolódott. Az 1900-as évek kezdetén a fagyöngyöt behurcolták Észak-Amerikába is, ahol Kaliforniában, Sanoma államban tűnt fel először, bár az ottani terjedést sikerült lokalizálni és csak 114 km 2 nagyságú terület fertőzött (Hawksworth és Scharpf 1986, Hawksworth és mtsai 1991). További négy egyedről számoltak be Viktória városából, Kanadából, Brit Columbia tartományból, azonban a növény ottani terjedését is még időben megfékezték (Dorworth 1989). A fehér fagyöngy magyarországi előfordulásáról és a gazdanövényeiről már a 20. század elején több szerző is beszámolt (Anonymus 1910, Fritsch 1928). A korai kutatások közül Tubeuf (1923), Roth (1926) és Boros (1926) munkái kiemelkedőek, akik számos gazdafajt említenek a Magyar Királyság területén. Roth (1926) egy átfogó térképen mutatja be a fagyöngy elterjedését a leggyakoribb gazdanövényekkel a Horvát-Szlavónország nélküli történelmi Magyarországra vonatkoztatva a jelenlegi határral kirajzolva. Később Gencsi és Vancsura (1992), Bartha és Mátyás (1995) és Hirka (2011) tanulmányozta érintőlegesen a fagyöngy hazai elterjedését, valamint 1990-től az Erdészeti Tudományos Intézet gyűjti a hazai elterjedésre vonatkozó adatokat. 23

3.2 A fehér fagyöngy, mint erdészeti károsító 3.2.1 A fehér fagyöngy gazdanövényekre gyakorolt hatásai Bár a fehér fagyöngy csak vizet és ásványi anyagokat von el a gazdanövényétől, ennek a tevékenységnek számos hatása van. A félélősködő faj megtelepedése nyomán (i) szignifikánsan csökken a gazdafajok magassága, törzsátmérője és a termés mennyisége, (ii) a fák életereje csökken, élettartama jelentősen megrövidül, (iii) a faanyag minősége jelentősen romlik, mennyisége csökken és ipari célokra felhasználhatatlanná válik, valamint (iv) egy olyan gyengültségi állapot jön létre, ami utat nyit különböző kártevők és másodlagos kórokozók megtelepedésének is. A gazdafajokon megjelenő tünetek igen eltérőek lehetnek, mindezek a különböző biotikus és abiotikus faktorok, a fagyöngybokrok mennyisége, a gazdafa kondíciója és kora függvényében változhatnak (Hawksworth 1983). Azokon az élőhelyeken, ahol a vízellátottság kedvezőbb, a fagyöngy kártétele mindig alacsonyabb (Hellmuth 1971, Tsopelas és mtsai 2004, Gathumbi és mtsai 2005, Yüksel és mtsai 2005, Dobbertin és Rigling 2006). 3.2.2 A fehér fagyöngy szerepe az erdészeti leromlási spirálban Az erdei károknak csak kisebb része következik be közvetlenül, egyetlen jól meghatározható ok miatt. Az erdőben jelentkező elhalások, pusztulások túlnyomó többsége a leromlási spirál végső elemeként jelentkezik. Az elsődleges tényezők többnyire valamilyen abiotikus hatásra vezethetőek vissza (pl. aszály, globális felmelegedés, légszennyezés). Mindez nem okozna önmagában jelentősebb pusztulást, de felerősíthet olyan további folyamatokat, mint pl. kórokozók, kártevők megjelenése, valamint különböző parazita fajok beleértve a fehér fagyöngyöt is megtelepedését, amelyek révén az állományokban gyengültségi állapot alakul ki. Ez az állapot lehetőséget teremt a normál körülmények között lappangó stádiumban jelenlévő betegségek elhatalmasodására, valamint tovább gyengíti az állományok egészségi állapotát, így létrehozva az ún. decline, vagyis a leromlási spirált (Koltay 2005). Az erdők egészségi állapotának leromlása, valamint a fehér fagyöngy egyedszámának növekedése az utóbbi években még intenzívebbé vált. A félparazita fellépése nem csupán gazdasági károkat okoz, de több európai ősfenyvest is komolyan veszélyeztet. 24

A fagyönggyel fertőzött egyedeknél szignifikánsan magasabb a mortalitási ráta, mint a nem fertőzött egyedeknél. A fagyöngybokrok tömeges megjelenése bizonyítottan további számos negatív hatást gyakorol a gazdanövényekre, melyek jelentősen csökkentik azok élettartamát. A gazdafajok mortalitása egyértelműen a fagyöngy tömeges megjelenésére és hemiparazita tevékenységére vezethető vissza, mely az utóbbi 100 évben egyre fokozottabbá vált (Noetzli és mtsai 2003, Tsopelas és mtsai 2004, Dobbertin 2005, Dobbertin és Rigling 2006, Idžojtić és mtsai 2008, Kanat és mtsai 2009, Barbu 2010, Oliva és Colinas 2010, Rigling és mtsai 2010). 3.3 A fehér fagyöngy életközössége 3.3.1 A fehér fagyöngyhöz kötődő ízeltlábúak A fehér fagyöngyön előforduló ízeltlábú fajokat csupán néhány szerző vizsgálta Európában. A tanulmányok közül kiemelkedik Schumacher (1918) és Hellrigl (2006) munkája, illetve Nagy-Britanniában is megjelent néhány kisebb tanulmány, melyeket Briggs (2011) foglalt össze. Hazánkban a fehér fagyöngy ízeltlábú-katenáriumával foglalkozó átfogó tanulmány még nem született, bár egy rövid közleményben Horváth (1917) néhány szipókás rovarkártevőt már megemlít. Schumacher (1918) összesen 21 fajt írt le a növényről, melyből 6 kizárólagosan a fagyöngyön fordult elő (4 Hemiptera és 2 Coleoptera). Hellrigl (2006) vizsgálatai során szintén 21 fajt figyelt meg a növényen, melyből 8 volt fagyöngy-specialista (3 Hemiptera, 3 Coleoptera, 1 Lepidoptera, 1 Diptera), 13 faj pedig másodlagosan jelent meg a növényen. Mára összesen 37 fajt figyeltek meg a fehér fagyöngyön, ebből 12 specifikusan a fagyöngyhöz köthető (5 Hemiptera, 4 Coleoptera, 2 Lepidoptera, 1 Diptera), 25 faj pedig másodlagosan jelenik meg. A specifikusan fagyöngyhöz köthető fajok a következők: Hemiptera: (1) Fagyöngy-levélbolha: Cacopsylla visci Curtis, 1835 (Psyllidae) (2) Fagyöngypajzstetű: Carulaspis visci Schrank, 1781 (Diaspididae) (3) Fagyöngy-virágpoloska: Anthocoris visci Douglas, 1889 (Anthocoridae) (4) Fagyögy-mezeipoloska: Pinalitus viscicola Puton, 1888 (Miridae) (5) Hypseloecus visci Puton, 1888 (Miridae) 25

Coleoptera: (6) Fagyöngy-cickányormányos: Ixapion variegatum Wencker, 1864 (Apionidae) (7) Fagyöngyálszú: Gastrallus knizeki Zahradnik, 1996 (Anobiidae) (8) Fagyöngydíszbogár: Agrilus viscivorus Bilý, 1991 (Buprestidae) (9) Fagyöngyszú: Liparthrum bartschti Mühl, 1891 (Curculionidae) Lepidoptera: (10) Fakínszitkár: Synanthedon loranthi Králíček, 1966 (Sesiidae) (11) Fagyöngytükrösmoly: Celypha woodiana Barrett, 1882 (Tortricidae) Diptera: (12) Asynapta viscicola Skuhravá, 2007 (Cecidomyiidae) Hazánkban a specifikusan fagyöngyhöz köthető fajok közül hét faj fordul elő (Cacopsylla visci, Hypseloecus visci, Pinalitus viscicola, Ixapion variegatum, Liparthrum bartschti, Synanthedon loranthi, Celypha woodiana). Leggyakrabban a fagyöngy-levélbolha, fagyöngy-cickányormányos, fakínszitkár, illetve a Hypseloecus visci fajokkal találkozhatunk (Horváth 1917, Fauna Europaea 2013). Fagyöngy-levélbolha (Cacopsylla visci) A fagyöngy-levélbolha (6. ábra) imágói 3,8 4,1 mm nagyságúak, általában világoszöldek, de előfordulnak barnás színezetű egyedek is. E fajt először Angliából jelentették (Curtis 1835), mára szinte egész Európában ismert: Magyarország, Franciaország, Belgium, Olaszország, Németország, Svájc, Ausztria, Csehország, Szlovákia, Ukrajna, Moldova és Lengyelország területéről is közölték (Fauna Europaea 2013). Hazánkban először Simontornyán, sárga fagyöngyön figyelték meg (Horváth 1917). Évi két nemzedéke fejlődik, mind lomb-, mind tűlevelű gazdanövényeken előforduló fagyöngyökön nagy egyedszámban képes megjelenni, ahol a levelek szívogatásával és mézharmat termelésével okozhat károkat (Buhr 1965). 26

6. ábra: Cacopsylla visci imágói és kárképe fehér fagyöngyön. (Fotó: Varga I. és Keresztes B.) Hypseloecus visci A fajt (7. ábra) Puton (1888) írta le Sthenarus visci néven Franciaországból, hazánkból Horváth (1917) jelentette. Európában továbbá Spanyolország, Ausztria, Svájc, Ukrajna, Németország, Belgium, Hollandia, Csehország, Szlovákia, Lengyelország, Szlovénia, Görögország, Moldova és Macedónia területéről is kimutatták (Fauna Europaea 2013). 7. ábra: Hypseloecus visci imágói és szívogatása. (Fotó: Keresztes B.) Az imágók 3 3,6 mm hosszúak, barnásfeketék, a nőstények rendszerint oválisak, míg a hímek hosszúkásak és kissé nagyobbak a nőstényeknél (Gibbs és Nau 2005). Tojás alakban telel, évi egy nemzedéke fejlődik, az imágók júliustól augusztusig repülnek (Wagner 1973). 27

Fagyöngy-cickányormányos (Ixapion variegatum) A fagyöngy-cickányormányos (8. ábra) a hemiparazita növény egyik legjellegzetesebb specialista kártevője. Az imágók 2,1 2,8 mm nagyságúak, szárnyfedőinek tövi egyharmada drapp színezetű, egyébként egyöntetűen sötétbarna (Green és Meiklejohn 2004). Az imágók nyár elején jelennek meg, majd rövid táplálkozás után helyezik el tojásaikat a növény friss hajtásaira, közvetlenül a csúcsi rügy tövébe. A lárvákat főleg júliusban, a bábokat augusztusban találhatjuk meg, ekkorra a hajtásvégek is elszáradnak (Briggs 2011). A faj egész Európában elterjedt: Anglia, Észtország, Spanyolország, Franciaország, Csehország, Németország, Lengyelország, Szlovákia, Olaszország, Svájc (Fauna Europaea 2013), valamint Magyarország területéről is jelentették (Györffy 1956, Podlussány 1996). 8. ábra: Ixapion variegatum imágója. (Fotó: Varga I.) Fakínszitkár (Synanthedon loranthi) A fakínszitkár (9. ábra) szinte egész Európában elterjedt, mindössze Anglia, Ukrajna, Portugália és Skandinávia területéről nem jelentették (Fauna Europaea 2013). Hazánkban szinte mindenütt előforduló gyakori faj, tápnövénye a fehér fagyöngyön kívül a sárga fagyöngy. 28

9. ábra: Synanthedon loranthi imágója (saját kinevelés), bábinge és járatai. (Fotó: Varga I. és Keresztes B.) 3.3.2 Mikroszkopikus gombák és baktériumok A fehér fagyöngyön élősködő mikroszkopikus gombák nagy része szaprotróf életmódot folytat. A parazita gombák száma azért ilyen alacsony, mert a növény egy effektív védekező rendszerrel rendelkezik, ami valójában nem más, mint a viscotoxin. Holtorf és mtsai (1998) transzgénikus Arabidopsis thaliana-t vizsgáltak, mely a fehér fagyöngy viscotoxin A3 génjét tartalmazta. Az A. thaliana ezután nagy mennyiségű viscotoxint termelt és megnövekedett rezisztenciát mutatott Plasmodiphora brassicae Woronin kórokozóval szemben. Karadžić és mtsai (2004), majd Karadžić és Lazarev (2005) a fehér fagyöngyről közel harminc gombafajt azonosított, később Jandrasits (2011) izlált néhány fajt. Az általuk izolált fajok listáját, a kórokozók életformáját, valamint előfordulásának gyakoriságát az 1. táblázat tartalmazza. Később Kotan és mtsai (2013) 48 gombatörzset azonosítottak a növényről. Az izolátumok nagy része különböző Alternaria alternata törzs, valamint Acremonium kiliense Grütz., Nigrospora oryzae (Berk. & Broome) Petch, Aspergillus flavus Link., Ulocladium chartarum (Preuss) E. G. Simmons, illetve Acreomonium és Geotrichum fajok voltak. A gombatörzsek levélbe injektálását követően 32 törzs esetében tapasztaltak tüneteket, míg a szabadföldi tesztek során csak 12 törzs esetén figyeltek meg hasonlót. Az Alternaria alternata és Acreomonium kiliense törzsek 8 hónappal a kijuttatását követően a fagyöngybokrok teljes elhalását okozták. 29

1. táblázat: A Viscum album L. mikroszkopikus gombái Karadžić és Lazarev (2005), valamint Jandrasits (2011) nyomán. Faj neve Alternaria alternata (Fr.) Keissler (számos törzs) Fertőzött növényi rész (kórokozó életmódja) Előfordulás gyakorisága levélfoltosság (szaprotróf) + Anthostomella visci (Kalchbr.) Sacc. levélfoltosság (szaprotróf) + Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud Botryosphaeria dothidea (Mougeot ex Fries) Cesati & Notaris száraz leveleken (szaprotróf) ++ levélfoltosság (parazita) ++ Camarosporium visci Sacc. szár háncs részén (szaprotróf) + Cladosporium herbarum (Pers.) Link ex S.f. Gray levél (szaprotróf vagy fakultatív parazita) Diplodia visci (DC) Fr. háncsnekrózis (fakultatív parazita) + Epicoccum purpurascens Ehrenb. levél (szaprotróf) +++ Fusarium roseum Link. szár háncs részén (szaprotróf) ++ Fusarium sambucinum Fuckel levél (szaprotróf) + Gibberidea visci Fuckel ág háncs része (fakultatív parazita) +++ Microthyrium visci Rich. szár háncs részén (szaprotróf) + Nectria cinnabarina (Tode) Fr. szár háncs részén (fakultatív parazita) Penicillium spp. levél (szaprotróf) +++ Phaeobotryosphaeria visci (Kalchbr.) A.J.L. Phillips & Crous levél, szár, bogyó (parazita) +++ Phoma visci Sacc. levélfoltosság (parazita) + Plectophomella visci Moesz levélfoltosság (parazita) + Pleospora loculata (Crie) Sacc. levélfoltosság (parazita) ++ Sclerophoma pythiophila (Cda) Hohn száraz ágak háncsrészén (szaprotróf) + Septoria visci Bresad levélfoltosság (parazita) ++ Sordaria fimicola (Roberge) Cesati & de Notaris lehullott levélen (szaprotróf) + Trichoderma viride Pers. ex S.F. Gray száraz levél (szaprotróf) ++ Trichothecium roseum Link. levél, szár, termés (szaprotróf) +++ Trullula heterospora Preuss. levél (szaprotróf) + Verticillium sp. szár (fakultatív parazita) + + nagyon ritkán jelentkező faj + +..közepes mértékben jelentkező faj + + +...nagyon gyakran jelentkező faj + +++ 30

Kotan és mtsai (2013) továbbá közel 200 baktériumtörzset is izoláltak fehér fagyöngyről, de a fajokat csak nemzetség szinten határozták meg. A fajok leggyakrabban a Bacillus (19,5%), Pseudomonas (13,9%), Stenotrophomonas (13,9%) és Acinetobacter (13,4%) nemzetségből kerültek ki. A mesterséges fertőzési kísérletek során öt törzs esetében tapasztaltak hiperszenzitív reakciót a Nicotiana tabacum tesztnövényeken (Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Pandoraea pulminicola és két Burkholderia cepacia törzs), sőt ezen törzsek esetén a levélbe injektálás során is megfigyelték a tüneteket, de szabadföldi kísérletekben egyetlen törzs sem okozott semmilyen tünetet a fagyöngybokrokon. Érdekesség továbbá az is, hogy Kotan és mtsai (2013) által azonosított gombafajok nagyban eltérnek a fehér fagyöngy korábban vizsgált fajoktól, bár a témában nagyon kevés átfogó tanulmány született. Stojanovič (1989) a Phaeobotryosphaeria visci és Colletotrichum gloeosporoides fajokat vizsgálta, addig Fischl (1978, 1980, 1996) a Plectophomella visci és Phaeobotryosphaeria visci-ről készített átfogó tanulmányt. A fehér fagyöngyön megjelenő mikroszkopikus gombákról további munkákat Fischl és mtsai (2009), valamint Jandrasits (2011) közöltek. 3.3.2.1 Phaeobotryosphaeria visci A Phaeobotryosphaeria visci A. J. L. Phillips & Crous [Syn.: Botryosphaerostroma visci (DC.) Petr., Botryosphaeria visci (Kalchbr.) Arx & E. Müll., anamorf: Sphaeropsis visci (Fr.) Sacc.] a fehér fagyöngy kizárólagos kórokozója (10. ábra), mely leginkább alkalmasnak tűnik a félparazita növény elleni védekezésre. A hiperparazita kórokozó első részletes leírását Tubeuf (1923) monográfiájában olvashatjuk, melyben a szerző a fehér fagyöngy legjelentősebb kórokozójának írta le. Magyarországi előfordulását elsőként Tóth és Zeller (1960) a Bükk hegységből jelezte, valamint Vörös és Husz (1965) is közölt egy rövid morfológiai leírást gombáról. A kórokozó biológiai védekezésben való alkalmazhatóságát elsőként Fischl (1978, 1980, 1996) tanulmányozta, majd Karadžić és Lazarev (2005), illetve Fischl és mtsai (2009), valamint Jandrasits (2011) foglalkoztak a Ph. visci-vel. A kórokozó első molekuláris genetikai vizsgálatát Fischl és mtsai (2008), illetve Cseh és mtsai (2008) végezték el RAPD-technikával. Előzetes eredményeik alapján a kórokozó hazai izulátumai igen alacsony polimorfizmust mutatnak, bár ezen vizsgálati eredmények feltételezhetőleg a szűk mintavételezésre vezethetőek vissza. 31

Taxonómia A Ph. visci taxonómiai helyzete sokáig tisztázatlan volt, valamint a kórokozó teleomorf alakját is csak nemrég azonosították (Phillips és mtsai 2008). Korábban Vörös és Léránth (1970) a Deuteromycoták közé sorolta (Sphaeropsidiaceae család [piknídiumos gombák] 5. spóracsoport, Botryosphaerostroma nemzetség), később Phillips és mtsai (2008) tisztázták a faj pontos taxonómiáját morfológiai és multi-génes (SSU, ITS, LSU, α- és β-tubulin EF) vizsgálatokkal. A faj anamorf alakjának neve változatlan maradt (Sphaeropsis visci), melyet összekapcsoltak a teleomorf alakkal, amit az azonosítás után a Phaeobotryosphaeria nemzetségbe (Botryosphaeriaceae család, Ascomycota) soroltak. A Phaeobotryosphaeria fajok jellegzetes morfológiai bélyege az idővel megbarnuló aszeptált aszkospórák, melyek mindkét végén apiculus figyelhető meg (10. ábra, Phillips és mtsai 2008). Morfológiai jellemzők Ivaros termőtestük együregű pszeudotécium, mely leggyakrabban sötétbarna, vagy fekete. A pszeudoparafízisek hialinok, világosak és osztottak, köztük találhatók a 8 aszkospórát tartalmazó kettős falú aszkuszok (Phillips és mtsai 2008). Ivaros termőtestje együregű pszeudotécium, mely leggyakrabban sötétbarna, vagy fekete. A pszeudoparafízisek hialinok, világosak és osztottak, köztük találhatók a 8 aszkospórát tartalmazó kettős falú aszkusz (Phillips és mtsai 2008). Ivartalan termőtestjei az epidermiszbe ágyazott piknídiumok, melyek sötétbarna, majdnem fekete színűek. A párna vagy szemölcs alakú termőtestben 1 3 rétegben rendezett üregek vannak, melyekben a rövid konídiogén sejtekről fűződnek le a konídiumok, amik a hialin, aszeptált parafízisek között fejlődnek. A konídiumok (10. ábra) viszonylag nagyméretűek, széles ellipszoid, vagy tojásdad alakúak 45 55 x 15 26 μm hosszúak, olajcseppekkel bőven ellátottak. A kezdetben színtelen piknokonídiumok később zöldes színűek, majd sötétbarnára színeződnek, víz hatására nagy számban ürülnek ki a piknídiumból. A konídiumtartó egyszerű pálcika, vagy fonál alakú. (Vörös és Husz 1965, Fischl 1978, Phillips és mtsai 2008). 32

10. ábra: Phaeobotryosphaeria visci. A: éretlen aszkusz; B: érett aszkusz aszkospórákkal; C F: barna, aszeptált aszkospórák, az apiculus-t nyíl jelöli; G: érett piknídium fenyőforgácson, H: konídiumok a konídiogén sejtekkel a hosszú fonalas parafízisek között; I: érett konídium, J: fejlődő konídiumok; K: parafízisek; L: érett, olajcseppekkel gazdagon ellátott ovális konídiumok. Méretskálák: A, B = 20 μm; C L = 10 μm; G = 50 μm. (Fotó: Phillips és mtsai 2008.) 33

A betegség tünetei A fertőzés általában gócszerűen jelentkezik, majd hamar átterjed a szomszédos fafajokon lévő fagyöngyre. A félparazita levelein kezdetben világos sárgásbarna, hullámos szélű foltok jelentkeznek, majd ezek az egész levélre kiterjednek és sárgásbarnásra színeződik (11. ábra). A fertőzés indulhat a levél csúcsától, vagy a szélétől, ekkor először egy félhold alakú elszíneződés jelenik meg a levélen (Fischl 1978, Jandrasits 2011). A további kórfolyamat során az egész növény elsárgul, majd a száron, a levélen, bizonyos esetekben a termésen is tömegesen jelennek meg a piknídiumok. Fischl (1978) mérései alapján 1 cm 2 levélfelületen 80 160 db piknídium is képződhet. A gomba a fagyöngyön egész évben megtalálható, a spóraszóródás kora tavasszal történik (Stojanovič 1989). A Ph. visci laboratóriumi fenntartása A kórokozó számos természetes és mesterséges táptalajon jól tenyészthető, kiválóan fejlődik burgonya-dextróz és sárgarépa agaron (Fischl 2009, Varga 2009), megfelelően fejlődik maláta-, szilva- és hagyma-kivonat agaron (Stojanovič 1989), azonban rosszul fejlődik fagyöngy-kivonat agaron (Fischl és mtsai 2009, Varga 2009). A Ph. visci növekedéséhez szükséges optimális hőmérséklet 20 25 C, így kb. 10 14 nap alatt hoz létre egy jól fejlett telepet 90 mm-es Petri-csészében. Más kórokozókhoz képest (pl. Alternaria alternata) viszonylag lassú növekedésűnek mondható (Varga 2009), bár Slippers és Wingfield (2007) a Botryosphaeriacae család fajait gyors növekedésűnek írta le. A telepek leggyakrabban hullámos szélűek, erősen rozettásak, kezdetben a micélium pelyhes, törtfehér színű (11. ábra [C] kép). A telepek színe később sárgásra, majd szürkésre, végül feketére színeződik. A sporuláció mesterséges körülmények között igen nehezen játszódik le, általában 1 2 hónap elteltével jelenik meg néhány piknídium a telepek felszínén (Varga 2009, Varga saját megfigyelések). A konídiumok 5 35 C között csíráznak, az ehhez szükséges optimális hőmérséklet 30 C körüli (Stojanovič 1989), bár Fischl és mtsai (2009) szerint az alacsonyabb hőmérséklet stimuláló hatást gyakorol a csírázásra. A konídiumok akár 210 napig megőrzik csírázóképességüket (Stojanovič 1989). Rázatott kultúrában a Ph. visci pelyhes micéliumot fejleszt (Fischl és mtsai 2009), bár ezt későbbi, folyadékkultúrában történő saját vizsgálataink nem igazolták. Fermentorban szobahőmérsékleten, bő oxigénellátás és mechanikai keverés mellett ez ideig nem sikerült tömegtenyészetet előállítani (Fischl és mtsai 2009). 34

11. ábra: Phaeobotryosphaeria visci. A: A kórokozó tünetei a fehér fagyöngy hajtásán, levelén és bogyóin, B: Ph. visci tünetei mesterséges inokulációt követően 21 nappal, C: 14 napos, erősen rozettás telep burgonya-dextróz agaron (BDA), D: Ph. visci piknídiumai BDA lemezen, E: olajcseppekkel ellátott konídiumok, F: BDA lemezen 24 órája csírázó spóra. (Fotók: Varga I. és Pintér Cs.) 35

3.4 A fehér fagyöngy elleni védekezés lehetőségei 3.4.1 Mechanikai védekezés Bár a fehér fagyöngy elleni számos védekezési módot vizsgáltak, azonban továbbra is a bokrok mechanikai eltávolítása tűnik a leghatékonyabb és legbiztonságosabb módszernek (Schilberszky 1908, Anonymus 1925, Fritsch 1928, Hawksworth 1983, Baltazár és mtsai 2012). A művelet igen nagy munkaerő igényű, ezért leginkább értékes állományok esetében alkalmazzák parkokban és arborétumokban (Weber 1993a). Sajnos, ez a módszer csak igen korlátozottan alkalmazható, hiszen a bokrok eltávolításakor a gazdanövények lombkoronájának egészét, vagy egy részét csonkolják, ami hatalmas stresszt jelent a gazdanövényeknek, valamint súlyos koronadeformációt is okozhat. Előfordulhat továbbá, hogy a gazdafajok mérete, vagy a lombkorona alakja miatt a bokrok eltávolítása nem lehetséges, valamint az is, hogy a fagyöngybokrok az eltávolítás után, a visszamaradt hausztóriumokból újra kihajtanak (Schilberszky 1908, Baltazár és mtsai 2012). Súlyos fertőzés esetén a teljes gazdafát kivágják és az állomány további fertőzött egyedeit is ritkítják, vagy erőteljesen visszametszik. Az állományok ritkítása nyomán a fényviszonyok kedvező alakulása azonban elősegítheti a fehér fagyöngy további terjedését és intenzív növekedését (Noetzli és mtsai 2003). 3.4.2 A herbicides védekezés lehetőségei A fehér fagyöngy elleni herbicides védekezés lehetőségeit több nyitvatermő és zárvatermő gazdanövényen is tanulmányozták, a vizsgálatok eredményei azonban igen eltérőek voltak. Tűlevelű fajok (Abies alba, Pinus halepensis) esetén a gazdanövények károsodása nélkül eredményes kezeléseket hajtottak végre 2,4-diklorofenoxi-ecetsav (2,4-D), 4-klór-2-metilfenoxi-vajsav (2,4-MCPB) és 2,4,5-triklorofenoxi-ecetsav (2,4,5-T) hatóanyagokkal a peszticidek törzsbe injektálásával, valamint légporlasztásos technikák alkalmazásával (Delabraze és Lanier 1972, Brun és mtsai 2001). Frochot és mtsai (1983) Populus fajokon magasabb koncentrációk (43 g/l glifozát-izopropilamin só, 32 g/l 2,4-MCPB) alkalmazása mellett kedvező eredményeket ért el a gazdafák károsodása nélkül (Populus sp.), azonban néhány évvel a kezelést követően a fagyöngybokrok újra kihajtottak. Besri (2005) eredményei alapján jelentős mértékű fitotoxicitás jelentkezett a gazdanövényen (Olea 36

europaea) hasonló hatóanyagok esetén, bár más szerzők ezt a fitotoxicitást nem erősítik meg (Turker és Goksel 1965). Baillon és mtsai (1988) részletesen tanulmányozták a glifozátizopropilamin só, valamint a 2,4-diklorofenoxi-ecetsav penetrációját és transzlokációját fagyöngybokrokon, azonban peszticidek gazdanövényre (Malus domestica) gyakorolt fitotoxikus hatásait nem vizsgálták. 3.4.3 A biológiai védekezés lehetőségei A fehér fagyöngy elleni esetleges biológiai védekezés gondolatát az indította el, amikor az erősen fertőzött területeken a fagyöngybokrok tömeges pusztulását figyelték meg (Fischl 1978, 1980), melyet a Phaeobotryosphaeria visci okozott. Az első sikeres mesterséges fertőzést laboratóriumi körülmények között ugyancsak Fischl (1980) végezte, később Stojanovič (1989), majd Fischl és mtsai (2009) vizsgálták a Ph. visci ökológiai igényeit. Karadžić és mtsai (2004), majd Karadžić és Lazarev (2005) már célzottan tanulmányozták a hemiparazitán élő gombafajokat és a Ph. visci-t a biológiai védekezésben is felhasználható kórokozóként említik, majd a későbbi szabadföldi mesterséges fertőzési kísérleteik során sikeres fertőzést értek el olyan fagyöngybokrokon, melyek levelein előzetesen mikrosérüléseket ejtettek. Bár Kotan és mtsai (2013) munkájában, mely szintén a hemiparazita elleni biológiai védekezést vizsgálta, nincs említés a Ph. visci-ről, így elképzelhető, hogy munkájuk során nem izolálták ezt a kórokozót. 3.4.3.1 A mikoherbicid fejlesztés Jelenleg a fagyöngy elleni biológiai védekezés hasonlóan képzelhető el, mint a biológiai gyomszabályozás. Ezen a területen két jelentős kutatási irányvonal bontakozott ki. Az egyik módszer az ún. inundatív, vagy más néven mikoherbicidek, a másik pedig az ún. inokulatív, vagy klasszikus módszer (Evans és mtsai 2001). A klasszikus stratégia alkalmazása során csak kis létszámú károsító kibocsátására kerül sor, melyek természetes körülmények között tovább szaporodnak. Ha a kijuttatott károsító az adott környezeti feltételek mellett fennmaradásra, szaporodásra és terjedésre is képes, akkor a gyomnövény-populáció szabályozása további emberi beavatkozás nélkül történik (Hasan 1988). Ezt a módszert leginkább az invázív gyomfajok esetén alkalmazzák, amikor a kémiai 37

védekezés sikertelen, vagy környezetvédelmi és egyéb ökológiai okok miatt nem lehetséges (Wapshere 1982, Evans és mtsai 2001). Az inundatív stratégiát, vagyis a mikoherbicidek alkalmazását Daniel és mtsai (1973) vezették be, akik megfigyelték, hogy egy endémikus kórokozó nagy tömegben kijuttatva hogyan képes elpusztítani a gazdanövényét annak egy fogékony életszakaszában. A módszer során az adott gyomnövény faj kórokozóját tömegtenyésztéssel felszaporítják, majd a kémiai herbicidekhez hasonlóan permetezéssel juttatják ki az adott növényállományra (Vajna 1993, Charudattan 1991, Evans és mtsai 2001). Mikoherbicidnek általában jobban megfelel az elpusztítani kívánt növényfaj szaprotróf, vagy fakultatív kórokozója, hiszen ezek általában nagyobb károk okozására képesek, mint a gazdanövény obligát kórokozói (Templeton és mtsai 1979, Charudattan 1991) Az eredményes védekezés egyik további kulcskérdése a jól időzített kijuttatás is, hiszen a sikeres fertőzéshez elengedhetetlen az optimális hőmérséklet és légnedvesség is (Siddiqui és mtsai 2009). A különböző kórokozók mikoherbicidként való alkalmazása előtt számos megelőző vizsgálatra van szükség, melyek a Koch-féle posztulátumok igazolása után kerülnek sorra. A szükséges vizsgálatok első lépéseként a laboratóriumi háttérvizsgálatokat (pl. növekedés folyadék és szilárd táptalajon, sporuláció, tömegtenyésztés lehetőségei, törzsszelekció), majd a szabadföldi kísérleteket végzik el (TeBeest 1985). Mivel a Ph. visci egy kevéssé ismert kórokozó, szinte valamennyi mikológiai háttérvizsgálat elvégzése szükségszerű egy eredményes szabadföldi kijuttatási kísérlethez. A legfontosabb megelőző vizsgálatok első lépése a különböző élőhelyekről származó gombaminták begyűjtése, majd annak molekuláris genetikai vizsgálatai során a kórokozó különböző haplotípusainak azonosítása. A haplotípusok azonosítása PCR-alapú univerzális marker-célrégiók (pl. ITS) vizsgálatával történhet. Sok esetben azonban ezen PCR-technikák elvégzéséhez a kórokozó tiszta tenyészeteiből származó DNS-tisztítás szükséges, ami a monospórás tenyészetek előállítása miatt gyakran nagyon hosszadalmas, a DNS tisztításhoz szükséges speciális kit-ek miatt pedig nagyon költségesek (McDonald és McDermott 1993). A begyűjtött mintákból a monospórás tenyészetek előállítását követően a további kísérletekhez szükséges megfelelő inokulum mennyiségének biztosításához különböző szilárd és folyadék táptalajon való növekedési vizsgálatra van szükség (Daniel és mtsai 1973, Rhomela és mtsai 2000, Campbell és mtsai 2003), míg a tiszta tenyészetek fenntartásához különböző antibiotikum érzékenységi tesztek elvégzése lehet szükséges. A legfontosabb mikológiai tanulmányok egyike az adott kórokozó sporulációs képességeinek vizsgálata (TeBeest 1985, Rhomela és mtsai 2000), mivel a fajok nagy 38

többsége nem, vagy nehezen sporulál hagyományos, a törzsek fenntartására szolgáló szilárd, vagy folyékony táptalajon (Churcill 1982). A sporuláció indukálására leggyakrabban alkalmazott módszerek a hőmérséklet megváltoztatása (Prasad és mtsai 1973), továbbá speciális táptalajok (Booth 1971) és váltakozó megvilágítások alkalmazása (Smith és Berry 1974, Guo és mtsai 1998), esetleg ezek kombinációja (Crous és mtsai 2006, Wulandari és mtsai 2009, Su és mtsai 2012). A sporuláció leggyakrabban akkor következik be, ha a micélium növekedés számára kedvezőtlen feltételeket alakítunk ki (Dahlberg és Etten 1982). Míg a különböző izolátumok fenntartására leggyakrabban burgonya-dextróz agart (BDA) használnak, addig a spóraindukció során gyakoriak a kevés tápanyagot tartalmazó táptalajok, min pl. vizes agar, ½, vagy ¼ BDA, cukorszegény BDA (Masangkay és mtsai 2000), vagy a táptalajt szemipermeábilis membránnal borítják, majd arra helyezik az inokulumot (Cooke 1980, Browne és Cooke 2004). Elterjedt a magas CaCO 3 tartalmú táptalajok (pl. S agar) (Shahin és Shepard 1979, Masangkay és mtsai 2000), vagy a speciális V8-zöldséglé táptalaj (Campbell Co.) alkalmazása is (Cooke és Jones 1970, Booth 1971, Raymond és Bockus 1982, Raymond és mtsai 1985, Babadoost és Johnston 1998, Masangkay és mtsai 2000). Sikereket értek el zabkivonat agaron (Weber 1922, Cooke és Jones 1970, Kim és mtsai 2005, Paparu és mtsai 2006, Xiao 2006) és SNA agaron is (Aoki és O Donell 1999, Paparu és mtsai 2006). A speciális táptalajok mellett gyakran alkalmaznak különböző megvilágítást, mivel a természetes fény és a közeli-uv (NUV, vagy fekete fény, melynek hullámhossza 300-400 nm), vagy ezek alternációja (pl. 12h NUV/ 12h fény, 12 h NUV/ 12 h sötétség) jelentősen képesek a különböző táptalajok hatását felerősíteni (Marsh és mtsai 1959, Cooke és Jones 1970, Cooke 1980, Babadoost és Johnston 1998, Masangkay és mtsai 2000, Campbell és mtsai 2003). A különböző fajok igen eltérően reagálnak a fény hatásaira, melynek pontos mechanizmusa mindmáig nem ismert (Su és mtsai 2012.). A kórokozó első sikeres szabadföldi kísérleteihez nem csupán egy nagyobb tömegben rendelkezésünkre álló spóramennyiség szükséges, hiszen egy eredményes fertőzést számos további tényező is befolyásol, mint abiotikus tényezők (pl. hőmérséklet, páratartalom, légnedvesség), vagy a kórokozó különböző törzseinek virulenciája, illetve a kórokozó fertőzési küszöbértéke (NTI= numerical threshold of inoculum/ infection) (Amsellen és mtsai 1990). Gäumann (1950) szerint a kórokozó fertőzési küszöbértéke (NTI) nem más, mint az a minimum propagulum mennyiség, amely jelenléte kedvező feltételek mellett szükséges a sikeres fertőzéshez. Ez azt feltételezi, hogy egy adott minimum spóramennyiség jelenléte alatt a fertőzés nem következik be. Később Van der Plank (1975) megerősítette, hogy valóban van 39

kapcsolat a betegség tüneteinek kialakulása és az inokulum mennyisége között, de bizonyította azt is, hogy sok esetben már egyetlen spóra is képes megfertőzni a gazdanövényét (pl. Puccinina graminis Pers., vagy Phytophthora infestans (Mont.) de Bary). Bár egy sikeres és megbízható fertőzéshez sok esetben magasabb spóraszám szükséges, vizsgálatai alapján Van der Plank (1975) a fertőzési küszöbérték (NTI) kifejezés helyett, a hígítási végpont kifejezést tartja helyénvalónak, ami az a legkisebb koncentráció, mely esetén a fertőzés még biztosan megtörténik és kialakulnak a betegség tünetei. Mindazonáltal Van der Plank (1975) közlése ellenére számos szakirodalom továbbra is a fertőzési küszöbérték kifejezést használja (Amsellen és mtsai 1990, Fokunang és mtsai 2000). Így egy, a mikoherbicid fejlesztésben, majd a biológiai védekezésben alkalmazni kívánt kórokozó sporulációjának vizsgálatán túl számos egyéb laboratóriumi vizsgálat elvégzése is szükséges az első szabadföldi kísérleteket megelőzően. Mindezen laboratóriumi háttérvizsgálatok megléte feltétlenül szükséges a Ph. visci esetében is, hiszen a jelenlegi szakirodalomban nem található utalás a kórokozó ilyen irányú vizsgálataira, vagy azok eredményeire. Ezen ismeretek tükrében a Ph. visci-vel kapcsolatos kutatásaink fő irányvonalát a szakirodalomban fellelhető adatokra támaszkodva a legfontosabb alapvető mikológiai jellegű laboratóriumi vizsgálatok adták, melyek remélhetőleg továbbvezetnek majd az eredményes szabadföldi kísérletekhez és egy esetleges jövőbeni biopreparátum tényleges kifejlesztéséhez is. 40

4. CÉLKITŰZÉSEK A kutatásaink célja a fehér fagyöngy hazai elterjedésének felmérésén túl, a Phaeobotryosphaeria visci azon tulajdonságainak feltárása volt, melyek előremutatnak egy későbbi esetleges mikoherbicid fejlesztés, illetve a biológiai védekezés irányába. A fehér fagyöngy hazai előfordulásának vizsgálata kapcsán célunk volt: (i) a növény pontos elterjedési területének, illetve a fertőzöttség intenzitásának felmérése, (ii) az elterjedési terület változásainak értékelése az elmúlt 90 évben a saját adataink és a szakirodalmi adatok feldolgozásával, (iii) a fehér fagyöngy, illetve a leggyakoribb gazdanövényeinek előfordulási területeinek összehasonlítása. A Phaeobotryosphaeria visci esetében célul tűztük ki a hiperparazita kórokozó molekuláris genetikai azonosításán túl több klasszikus mikológiai tanulmány elvégzését, melyek közül a legfontosabbak: (iv) a kórokozó laboratóriumi fenntarthatóságának (pl. antibiotikum érzékenység), valamint az izolátumok növekedésének vizsgálata több természetes és szintetikus táptalajon, illetve táplevesen, (v) a kórokozó sporulációs képességének tanulmányozása különböző megvilágítások alkalmazása mellett, (vi) a kórokozó fertőzési küszöbérték vizsgálata, valamint a különböző törzsek virulenciájának tanulmányozása, (vii) a kórokozó olyan szisztémikus herbicid-hatóanyagokkal, mint a glifozát-izopropilamin só és a 2,4-diklorofenoxi-ecetsav szembeni érzékenységének vizsgálata, egy esetleges jövőbeni kombinált herbicid és spóraszuszpenzió kijuttatás céljából. 41

5. ANYAG ÉS MÓDSZER 5.1 A fehér fagyöngy hazai előfordulásának vizsgálata 5.1.1 Irodalmi adatok feldolgozása Az irodalmi adatok feldolgozása során áttekintettük az elmúlt közel 100 évben megjelent valamennyi tanulmányt, mely a fehér fagyöngy magyarországi elterjedésére vonatkozik. Bár 1930 és 1990 között jelentős átfogó tanulmány nem született a témában, Tubeuf (1923) monográfiája, valamint Roth (1926) tanulmánya részletesen bemutatja a fehér fagyöngy helyzetét az 1920-as években. Később Bartha és Mátyás (1995) közöl egy térképet, valamint Gencsi és Vancsura (1992) foglalkozott érintőlegesen a fehér fagyöngy hazai elterjedésével. Feldolgoztuk továbbá az Erdészeti Tudományos Intézet (ERTI) által 1990 óta napjainkig gyűjtött, a fehér fagyöngy hazai elterjedésére vonatkozó valamennyi adatot is. Az Erdővédelmi Figyelő Jelzőszolgálati Rendszer keretein belül az erdőgazdálkodók évente jelentik a félparazita kártételének mértékét és a fertőzött területek nagyságát az Erdővédelmi Jelzőlapokon. A kártétel mértéke gyenge, ha a törzsek kevesebb, mint 10%-a, közepes, ha a törzsek 11 20%-a fertőzött, míg erős kártételről beszélünk, ha a törzsek több mint 20%-a fertőzött (Hirka és Janik 2009). Az adatok feldolgozását nem az Erdészeti Igazgatóság területei, hanem Magyarország geográfiai nagytájai (Marosi és Somogyi 1990) alapján végeztük, így sokkal reálisabb és árnyaltabb képet kaptunk a vizsgált területek fertőzöttségéről. 5.1.2 Országos fagyöngy felvételezés A fehér fagyöngy elterjedésének megismerése céljából 2010 augusztusában bejártuk Magyarország nagy részét, különös tekintettel a fertőzött és kérdéses területekre. A 14 napos terepbejárás útvonalát Bartha és Mátyás (1995) térképe alapján terveztük meg, majd több mint 4000 km-et tettünk meg (12. ábra). Az út során megfigyeltük a fehér fagyöngy leggyakoribb gazdafajait, az elterjedés pontos határait és rögzítettük a fertőzés intenzitásának mértékét. Azokon a területeken, melyeken a fehér fagyöngy megjelenése kérdéses volt (pl. Kőrös- Maros vidéke, Kecskemét) a helyi nemzeti parkok információira is támaszkodtunk. 42

A doktori képzés ideje alatt (2008 2012) számos további kisebb tanulmányutat tettük az ország különböző pontjaira (pl. Őrség, Nyírség, Felső-Tisza-vidék, Mohács stb.), melyek során minden esetben hasonlóan jártunk el és rögzítettük a fehér fagyöngy jelenlétét, leggyakoribb gazdafajait és a fertőzöttség mértékét. 12. ábra: A 2010. évi országos fagyöngy felvételezés útvonala (piros). 5.1.3 Elterjedési térkép megrajzolása A fehér fagyöngy jelenlegi pontos elterjedési térképét a Közép-Európai Flóratérképezési Program (Niklfeld 1971) hálórendszeréhez illeszkedően készítettük el. Ez a rendszer a földrajzi fokhálózatra támaszkodva az ország területét majdnem négyzet alakú alapmezőkre osztja fel, melynek mérete 10 földrajzi hosszúsági perc és 6 földrajzi szélességi perc, mely kb. 12,5 11,2 km. Az alapmezők negyedelésével alapmezőnegyedeket, vagyis kvadrátokat alakítottak ki, melyek mérete 5 földrajzi hosszúsági perc és 3 földrajzi szélességi perc. Az ország területét 2834 kvadrát érinti, melyből 2474 teljes kvadrát, a többi az országhatár által van metszve (Király 2003). 43

A hazai hálórendszerű flóratérképezés alapját a kvadrátok jelentik, így a fehér fagyöngy jelenlétét a kvadrátok határai alapján határoztuk meg, továbbá összevetettük Magyarország nagytájainak (13. ábra) határaival és a középtájakkal is (Marosi és Somogyi 1990). A 2008 2012 alatt gyűjtött saját megfigyeléseinket összevetettük továbbá a Nyugat-magyarországi Egyetem Növénytani és Természetvédelmi Intézete által vezetett Magyar Flóratérképezési Program 2002 óta gyűjtött adataival is, így megrajzolva a Viscum album sensu lato jelenlegi elterjedési térképét. 13. ábra: Magyarország nagytájai (A: Alföld, B: Kisalföld, C: Nyugat-Dunántúl, D: Dunántúli-középhegység, E: Dunántúli-dombság, F: Északi-középhegység) és a középtájak vékony szürke vonallal jelölve (Marosi és Somogy 1990). A térképen a 2005 előtti, a Magyar Flóratérképezési Program szereplő, de általunk nem megfigyelt pontokat szürkével jelöltük (bizonytalan adatok), míg a nem fertőzött kvadrátokat fehéren hagytuk. A térképen a fertőzés intenzitását is jelöljük, a kategóriákat az ERTI fertőzöttségi kategóriái alapján alakítottunk ki. A kártétel mértéke gyenge, ha a törzsek kevesebb mint 15%-a, közepes, ha a törzsek 15 30%-a fertőzött, míg erős kártételről beszélünk, ha a törzsek több mint 30%-a fertőzött az adott kvadrátban. A gyenge fertőzést sárga, a közepes fertőzést narancs, míg az erős fertőzést piros szín jelöli a kvadrátokban. 44

A V. album subsp. austriacum és V. album subsp. abietis jelenlegi elterjedését külön térképeken jelöltük, hiszen ezen alfajok elterjedése és kártétele elenyésző a lombos fajokon fellépő alfaj kártételéhez képest. A V. album sensu lato jelenlegi elterjedési területeit összevetettük a növény korábbi elterjedési területeinek nagyságával (Roth 1926, Bartha és Mátyás 1995), valamint ezen korai elterjedéseket a jelenlegi flóratérképezési alapmező rendszerében kialakított térképen is jelöltük, amit a Digitera v.3.0. programmal készítettünk. A fertőzött területek nagyságának változásait összehasonlítottuk az ország erdősültségének változásával (Halász 1994, Kottek 2008), valamint a léprigó elterjedési területeinek alakulásával is (Magyar Madártani Egyesület 2013). Mivel a fehér fagyöngy elterjedését leginkább a gazdafajok elterjedése határozza meg (Wangerin 1937), ezért elkészítettük a Magyar Flóratérképezési Program adatbázisa alapján 18 leggyakoribbnak tartott gazdanövény közös elterjedési térképét is, majd ezt is összevetettük a fehér fagyöngy jelenlegi elterjedésével és azt is vizsgáltuk, hogy potenciális gazdafajok jelenlétével arányosan változik-e a fagyöngy fellépése az adott kvadrátokban a különböző tájegységek estén. 5.2 A Phaeobotryosphaeria visci vizsgálatai 5.2.1 Országos mintavételezés A 2010. évi országos fagyöngy felvételezés során nemcsak a fehér fagyöngy állományainak hazai elterjedését mértük fel, hanem számos helyről begyűjtöttük a Ph. visci által fertőzött fagyöngyleveket is monospórás tenyészetek előállítása céljából, melyek egyaránt szükségesek voltak a mind klasszikus mikológiai, mind a molekuláris genetikai vizsgálatokhoz. A gyűjtés során feljegyeztük azokat a helyszíneket, ahol a Ph. visci fertőzését megfigyeltük, majd ezen adatokat is jelenlegi flóratérképezési rendszerben kialakított finomfelbontású kvadrát térképen is megadtuk. A térképen a Ph. visci előfordulásán túl a fehér fagyöngy pontos elterjedését is jelöltük, melyet a Digitera v.3.0. programmal készítettünk. 45

5.2.1.1 Monospórás tenyészetek A különböző lokalitásokról származó fertőzött fagyöngyleveleket 70%-os alkohollal fertőtlenítettük, majd nedves kamrába helyeztük és 24 órát inkubáltuk 25 C-on, hogy a piknídiumok a vízfelvétel nyomán kellően megduzzadjanak. Ezután a levelekből kb. 30-30 piknídiumot emeltünk ki, amit 800 µl steril desztillált vízben szuszpendáltunk. A szuszpenzióból 250-250 µl-t cseppentettünk burgonya-dextróz agarra (BDA: 4 g burgonya kivonat, 20 g glükóz, 15 g agar L -1 ), majd üvegkacs segítségével szélesztettük. A 90 mm-es Petri-csészéket 25 C-on további 24 óráig inkubáltuk, majd a csírázásnak indult spórákat kiemeltük és egyesével ismét BDA-ra helyeztük. A tenyészeteket 20 C-on BDA-n két ismétlésben tartottuk fenn és átlagosan 4 6 hetente passzáltuk. 5.2.2 Molekuláris genetikai vizsgálatok A vizsgált minták A molekuláris genetikai vizsgálatok elvégzéséhez 2010 augusztusában Keszthelyen három különböző helyszínről és gazdanövényről (Acer saccharinum, A. pseudoplatanus, Populus nigra) fertőzött leveleket gyűjtöttünk. A fertőzött levelekből izoláltuk a kórokozót, majd 20 db monospórás tenyészetet állítottunk elő. A DNS-tisztításhoz a már többször passzált, 7 napos telepek aktív növekedési zónájából 5 mm átmérőjű agarkorongot vágtunk ki, amit egy szemipermeábilis membránnal (celofán) borított burgonya-dextróz agarra oltottunk, hogy megakadályozzuk a minta táptalajjal való szennyeződését. A DNS-tisztítást 10 nappal később Zhang és mtsai (1996) CTAB-módszere alapján végeztük. PCR-amplifikáció és szekvenálás A PCR-technika alkalmazása során a sejtmagi riboszómális DNS ITS-régióit (Internal Transcribed Spacer = átíródó elválasztó szakaszok) vizsgáltuk. A PCR-amplifikációt White és mtsai (1990) leírása alapján ITS1 (5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ) és ITS4 (5 -TC CTCCGCTTATTGATATGC-3 ) primerekkel végeztük. 46

A PCR-amplifikáció 20 izolátumon 50 μl térfogatú oldatban zajlott, ami 25 μl nukleáz mentes vizet, 20 ng templát DNS-t, 0,5-0,5 μm primert, 0.2 mm dntp-t, 5 μl 10 PCR puffert (1 mm Tris-HCl, ph 8.8 25 C-on, 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl és 0.1% Triton X- 100), valamint 0,5 U DyNazyme II polimerázt (Finnzymes, Finnország) tartalmazott. A PCR-reakció ciklusai a következők voltak: (i) 2 perc előzetes denaturáció 94 C-on, (ii) 35 ciklus 30 másodperces denaturáció 94 C-on, 1 perc kapcsolódás (annealing) 50 C-on és 2 perc láncépítés 72 C-on, (iii) majd egy végső lánchosszabbítás 5 percig 72 C-on. Az amplifikáció során keletkezett terméket 1,5%-os agaróz gélen szétválasztottuk, majd etidum-bromiddal festettük. Az így kapott fragmenteket NucleoSpin Extract II Kit (Macherey-Nagel, Németország) segítségével a gélből kivágtuk és tisztítottuk, majd a kapott terméket mindkét irányba direkt szekvenáltuk ABI 3130XL készüléken ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit és a korábban használt ITS1 és ITS4 primerek segítségével. Szekvencia-összerendezés és parszimónia analízis A vizsgálat során kapott szekvenciákon nukleotid blastn keresést hajtottunk végre összesen 100 szekvenciát engedélyezve maximum 10-es várható határértékkel az NCBI adatbázisban. Azon további szekvenciákat, melyek magas blastn hasonlóságot mutattak a Ph. visci-vel, a további adatelemzés céljából szintén letöltöttük az NCBI adatbázisból. Azokat a mintákat, melyek a Botryosphaeriaceae kládba tartoztak a többszörös külcsoport termininálishoz használtunk fel. A szekvenciák filogenetikai elemzéseit parszimóniai alapon végeztük el a PAUP* 4.0b10 program segítségével (Swofford 2002). A nem-informatív karaktereket kizártuk, míg a maradék karaktert egyenlő arányban súlyoztuk. Az összerendezési árkokat hiányzó adatként kezeltük az elemzések során, amelyek a TBR és ág-felcserélő (branch-swapping) algoritmuson alapultak. Ezt 1000 random heurisztikus további ismétléssel értük el elmentve és megtartva minden lehetséges fát. A kereséshez a MulTrees és határ nélküli MaxTrees lehetőségeket választottuk, felcserélve az összes lehetséges fát (swapping on all trees). A parszimónia beállítási során egyszerű taxon hozzáadást használtunk, míg a fa ágakat megszüntettük, ha minimális hosszuk nulla volt (amb-). Kiszámoltuk továbbá a fa hossz konzisztencia (CI, Kluge és Farris 1969) és retenciós index (RI, Farris 1989) értékeit is. A szigorú konszenzus fát a FigTree v1.3.1 program (http://tree.bio.ed.ac. uk/software/figtree/) segítségével szerkesztettük és hoztuk létre. 47

5.2.3 Mikológiai vizsgálatok 5.2.3.1 Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokat Ajkáról, ezüst juharról (Acer saccharinum) begyűjtött Ph. visci izolátumon (kód: 20/1; A) végeztük el. (Az izolátum gyors növekedése és a spontán sporulációs előtanulmányokat követően ezt az izolátumot választottuk a további laboratóriumi kísérletek nagy részéhez). A különböző antibiotikumok és kombinációik Ph. visci telepnövekedésére gyakorolt hatásait burgonya-dextróz agaron öt ismétlésben vizsgáltuk. A vizsgált antibiotikumat az oldatok filtersterilizálását követően a 60 C-osra hűlt táptalajba kevertük. A 7 napos tiszta tenyészetek aktív növekedési zónájából származó 5 mm átmérőjű agarkorongot helyeztünk el 90 mm-es Petri-csészékbe, majd a lemezeket 25 C-on sötét termosztátban inkubáltuk. A telepátmérőt 12 napon keresztül minden második nap mértük, kontrollnak az antibiotikumot nem tartalmazó lemezek fejlődését tekintettük (Karwa és mtsai 2008). A vizsgálatok során felhasznált antibiotikumok koncentrációi a következők voltak: (i) ampicillin 100 mg L -1,(ii) kanamicin 30 mg L -1, (iii) rifampicin 100 mg L -1, (iv) nisztatin 50 mg L -1. Az antibiotikumok esetleges növekedésgátló hatásait továbbá az alábbi kombinációkban is teszteltük: (i) ampicillin és kanamicin, (ii) ampicillin és rifampicin, (iii) kanamicin és rifampicin, illetve (iv) ampicillin, kanamicin és rifampicin. 5.2.3.2 Növekedés szilárd és folyékony táptalajokon A Ph. visci szilárd táptalajon való növekedését az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokhoz hasonlóan Karwa és mtsai (2008) módszere alapján a következő táptalajokon vizsgáltuk öt ismétlésben: (1) BDA: burgonya-dextróz agaron 20 C és 25 C-on, hogy megállapítsuk van-e különbség a növekedés intenzitásban és a telepátmérőkben ilyen alacsony hőmérséklet különbség esetén a későbbi sporulációs vizsgálatokhoz, (2) ZA: zabkivonat agaron (100 g zabpehely felfőzve, 15 g agar L -1 ) 25 C-on, 48

(3) ¼ BDA+V8A: 25%-os burgonya-dextróz és V8-zöldséglé agaron (1 g burgonya kivonat, 5 g glükóz, 150 ml V8 zöldséglé (Campbell South Co.), 3 g CaCO 3, 15 g agar L -1 ) 25 C-on. A táptalajok ph-ját 6,5-re állítottuk be. A vizsgált táptalajokon kapott eredményeket összevetettük az általunk korábban tanulmányozott (Varga 2009) táptalajokon mért növekedéssel is. A folyadék táptalajon való növekedést az alábbi tápleveseken vizsgáltuk: (1) BDL: burgonya-dextróz táplevesen (4 g burgonya kivonat, 20 g glükóz L -1 ) és (2) ZL: zabkivonat táplevesen (100 g zabpehely felfőzve L -1 ). A táplevesek ph-ját 6,5-re állítottuk be. A folyékony táplevesen való növekedést 21 napon keresztül mértük 24 (3x8) ismétlésben mindkét táplevesen. Az inokulum előkészítése során 7 napos monospórás tenyészet (kód: 20/1; A) aktív növekedési zónájából származó ~5 mm átmérőjű agarkorongot oltottunk szemipermeábilis membránnal (celofán) borított BDA lemezre. Az inokulumok 5 napig növekedtek 25 C-os megvilágítás nélküli termosztátban. Az inokulumok nedves tömegét a táplevesre való áthelyezés előtt lemértük. Az 1000 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 200-200 ml táplevest öntöttünk, majd az inokulumok elhelyezését követően 20 C-os, fehér fénnyel (Standard light color 865 fénycső) megvilágított termosztátba (Binder ATP line KTM ) helyeztük (14. ábra). 14. ábra: Ph. visci növekedése zabkivonat (felső) és burgonya-dextróz táplevesen (alsó). (Fotó: Varga I.) 49

A vizsgálatok előtanulmányaként mindkét táptalajon 6-6 ismétlésben a fent leírt körülmények mellett teszteltük, hogy a rázatás (60 min -1 ) milyen hatással van a telepek fejlődésére. Az értékelés során minden 7. nap 8-8 Erlenmeyer-lombikot bontottunk fel, mértük a kultúrák telepátmérőit, nedves és száraz tömegét Prosser (1995) szerint. Felvételeztük továbbá a makromorfológiai változásokat és az esetlegesen bekövetkező sporuláció meglétét is. A keletkezett spóraszám meghatározására a száraztömegek lemérése miatt nem volt lehetőség. 5.2.3.3 A sporuláció vizsgálata A Ph. visci sporulációját az alábbi táptalajokon 8-8 ismétlésben vizsgáltuk: (1) BDA: burgonya-dextróz agar, (3) Cel BDA: szemipermeábilis membránnal (celofán) fedett burgonya-dextróz agar, (2) Csz BDA: cukorszegény burgonya-dextróz agar (4 g burgonya kivonat, 15 g agar L -1 ), (4) ZA: zabkivonat agar (100 g zabpehely felfőzve, 15 g agar L -1 ); (5) ¼ BDA+V8A: 25%-os burgonya-dextróz és V8-zöldséglé agar, (6) SA: S agar (20 g szacharóz, 30 g CaCO 3, 15 g agar L -1 ) és (7) SNA: SN agar (KH 2 PO 4 1g, KNO 3 1g, MgSO 4 x 7 H 2 O 0.26 g, KCl 0,5 g, glükóz 0,2 g, szacharóz 0,5 g, agar 15 g L -1 ). A táptalajok ph-ját 6,5-re állítottuk be. A vizsgálatokat 90 mm-es Petri-csészékben végeztük, melyek 20-20 ml táptalajt tartalmaztak. Inokulumnak 7 napos monospórás tenyészetek (kód: 20/1; A) aktív növekedési zónájából származó 3-5 mm átmérőjű agarkorongot használtunk. A BDA, Csz BDA, Cel BDA, ZA és ¼ BDA+V8A esetében az inokulumot közvetlenül a táptalajra helyeztük, majd a lemezeket 7 napig sötét, 25 C-os termosztátban inkubáltuk az intenzív micélium növekedés érdekében. Mivel az SA és SNA táptalajok a Ph. visci telepei nem fejlődnek, ezért a megfelelő méretű telepek előállításához az inokulumot megelőzőleg szemipermeábilis membránnal borított BDA-ra oltottuk és ezen a táptalajon 7 napig sötét, 25 C-os termosztátban inkubáltuk. A 7 napos telepeket közvetlenül a SA és SNA lemezekre oltottuk, majd a többi előkészített táptalajon fejlődő Ph. visci izolátummal együtt 14 napig 20 C-os termosztátban inkubáltuk. 50

Az inkubálás ideje alatt a következő megvilágításokat alkalmaztuk: (1) 24 h sötét (megvilágítás nélkül), (2) 24 h közeli-uv (NUV: Philips TLD 18W/08 fénycső, 300 400 nm) (15. ábra), (3) 24 h fehér fény (Standard light color 865 fénycső, 400 750 nm, 6400 K), (4) 12 h sötét/ 12 h fehér fény, (5) 12 h sötét/ 12 h NUV és (6) 12 h fehér fény/ 12 h NUV. 15. ábra: Spóraindukciós előtanulmányok: Ph. visci izolátumok NUV alatt. (Fotó: Varga I.) A képződött piknídiumokat 21 nappal az inokulálást követően 5-5 ml steril desztillált vízzel, üvegkacs segítségével lemostuk a lemezek felszínéről majd szuszpendáltuk. A képződött konídiumok mennyiségének meghatározásához megvilágításonként 4-4 Petricsészét véletlenszerűen kiválasztottunk, majd fénymikroszkóp alatt, százszoros nagyítás mellett hemocitométerben (Bürker-kamrában) számoltuk a spóraszámot (Karwa és mtsai 2008). A spórákat a hemocitométer mindkét kamrájában megszámoltuk, átlagoltuk, majd következő módon visszaszámoltuk az 5 ml vízre, mellyel a 90 mm-es Petri-csésze felületéről a spórákat eltávolítottuk: Az összes keletkezett spóra mennyiségének számítása: 51

A Petri-csésze 1cm 2 -én keletkező spóra mennyisége: A spóraszám meghatározásán kívül a különböző megvilágítások és táptalajok hatására bekövetkezett telepmorfológiai változásokat (pl. sporuláció zónázottsága, micélium fejlődése, színbeli eltérések) is értékeltük. A táptalajonként és fényhatásonként megmaradt 4-4 db Petri-csészét 14 napra visszahelyeztük 25 C-os sötét termosztátba, hogy vizsgáljuk a képződött spórák csírázási képességét, melyet vizuálisan értékeltünk. 5.2.3.4 Mesterséges fertőzés és fertőzési küszöbérték vizsgálatok A mesterséges fertőzési kísérletek előtanulmányaként (16. ábra) Karadžić és Lazarev (2005) eredményeit vizsgáltuk felül, mely szerint a Ph. visci eredményes fertőzéshez a fagyöngylevélen mikrosérülések megléte szükséges. 16. ábra: Mesterséges fertőzés micélium koronggal. (Fotó: Varga I.) 52

A vizsgálat során két, keszthelyi gyűjtésű monospórás tenyészetet (K 1, K 2 ) használtunk. Az inokulum előállításához 7 napos izolátumok aktív növekedési zónájából származó 3 5 mm átmérőjű agarkorongot szemipermeábilis membránnal fedett BDA lemezekre oltottunk, melyet 5 napig 25 C-on inkubáltuk, majd az így képződött friss micéliumut használtuk a mesterséges fertőzéshez. Az inokulálást ép és a mikrosérülések előállítása céljából karborundummal kezelt fagyöngyleveleken végeztük 4 ismétlésben 8-8 levélen. A fagyöngyhajtásokat csapvízzel feltöltött, 1 dl űrtartalmú virágfiolába állítottuk, majd azt parafilmmel légmentesen lezártuk. A növénymintákat inkubátorba helyeztük, ahol a relatív légnedvességet (RH) 75%-osra állítottuk be glicerin és víz azeotrópos keverék segítségével (Grover és Nicol 1940), majd 12 h fény/ 12 h sötét megvilágítás mellett 20 C-os termosztátban inkubáltuk. Ezen hőmérsékleti és légnedvességi értékekkel a tavaszi időjárást próbáltuk modellezni, hiszen Stojanovic (1989) szerint a spóraszóródás, valamint a fertőzés ekkor zajlik. A leveleket megnedvesítettük, majd rögzítettük a ~1,5 cm átmérőjű micélium korongokat. A frissen fertőzött leveleket kétszer nedvesítettük meg az első négy napban, majd 4 hétig inkubáltuk a növényeket. Az előtanulmányokat követően az ország különböző pontjairól gyűjtött 8 monospórás tenyészettel (2. táblázat) 3 ismétlésben végeztük el a mesterséges fertőzési vizsgálatokat, ezúttal ép fagyöngy leveleken. A kísérleti körülmények, valamint a piknídiumok meghatározása az adatelemzés módja is megegyezett az előtanulmányoknál alkalmazottakkal. A tünetek értékelése során ebben az esetben a kialakult klorózis mértkét a 2. és 4. héten felvételeztük és egy 0 4 skálán (0= nincs klorózis, 4= a levélfelület 100%-a klorotikus) értékeltük. 2. táblázat: A vizsgált minták gyűjtési helyei és kódjai. Kód Gyűjtés helye V. album gazdanövénye Kód Gyűjtés helye V. album gazdanövénye A Ajka Acer saccharinum K 3 Katafa Tilia sp. B Bánhorváti Populus sp. K 4 Körmend Acer saccharinum D Dombóvár Acer saccharinum N Nagybajom Tilia cordata H Harkány Acer saccharinum R Rábagyarmat Tilia platyphyllos *K 1 Acer saccharinum Keszthely *K 2 Populus sp. * Az előtanulmányok során vizsgált minták. Sz Szalonna Populus sp. 53

A fertőzési küszöbérték, más néven hígítási végpont vizsgálatok (NTI) során különböző koncentrációjú spóra szuszpenzióval fertőztünk egészséges fagyöngyleveleket in vitro körülmények között. A fertőzéshez használt spóraszuszpenziót a megelőző spóraindukciós kísérletek során nyertük. A spóraszuszpenzió törzsoldatát 10 percig 5000 rpm sebességgel centrifugáltuk a micélium törmelék és a spórák szétválasztása érdekében. A centrifugálást követően a felülúszóval dolgoztunk tovább, melyből steril desztillált vízzel történő hígítást követően a következő koncentrációjú spóraszuszpenziókat készítettünk el: 6,5 10 3, 1,25 10 4, 2,5 10 4, 5 10 4, 1 10 5, 2 10 5 spóra/ml. A vizsgálatokat 4 4 ismétlésben végeztük 4 különböző bokorról származó ép fagyöngylevélen. Az előzőleg 70%-os alkohollal fertőtlenített leveleket, melyek alá steril szűrőpapír került, kezelésenként különböző steril Petri-csészébe helyeztünk el, majd minden levél felszínére 2 50 µl szuszpenziót cseppentettünk. A növénymintákat inkubátorba helyeztük, ahol a relatív légnedvességet (RH) 75%-osra állítottuk be glicerin és víz azeotrópos keverék segítségével (Grover és Nicol 1940), majd 12 h fehér fény/ 12 h sötét megvilágítás (Standard light color 865 fénycső) mellett 20 C-os termosztátban (Binder ATP line KTM ) 28 napig inkubáltuk. A tünetek értékelése során a kialakult klorózist az előtanulmányok során alkalmazott módon értékeltük. A képződött piknídiumokat a 28. napon számoltuk, valamint a levelek felületét is lemértük. 5.2.3.5 Herbicid érzékenységi vizsgálatok A Ph. visci (20/1; A törzs) herbicidekkel szembeni érzékenységét a fehér fagyöngy esetében korábban alkalmazott szisztémikus herbicid hatóanyagok (glifozát-izopropilamin só és 2,4-diklorofenoxi-ecetsav) hatóanyagok esetében vizsgáltuk, egy esetleges komplex herbicid-spóraszuszpenzió kijuttatása céljából. A herbicid érzékenység vizsgálathoz a már kb. 50 60 C-osra hűlt burgonya-dextróz agarba kevertük az előzőleg filtersterilizált herbicideket, amelyek koncentrációi megegyeztek a szántóföldi normál dózissal, valamint annak felével és másfélszeresével. A koncentrációk a következőképpen alakultak: (1) glifozát-izopropilamin só: 4,8 g/l; 9,6 /l; 14,4g/l; (2) 2,4-diklorofenoxi-ecetsav: 3 g/l; 6 g/l; 9 g/l. 54

Vizsgálatainkat BDA-n 4 ismétlésben végeztük. Kezeletlen kontrollnak a herbicidet nem tartalmazó táptalajon fejlődő Ph. visci telepeket tekintettük. A kórokozó növekedését 12 napon keresztül Karwa és mtsai (2008) módszere szerint mértük. 5.2.3.6 A mikológiai vizsgálatok statisztikai értékelése Az adatok feldolgozását a Microsoft Office Excel 2010 programban, statisztikai elemzést pedig az R program 2.15.1. verziójával (R Development Core Team 2012), míg az R szkriptumokat Tinn-R kódszerkesztő segítségével végeztük (Faria 2011). Az elemzés során a micélium növekedésének jellemzésére, illetve a különböző faktorok hatása miatt bekövetkezett növekedés intenzitás változás megállapítására marginális regressziós modellt alkalmaztunk az nlme csomagból (Pinheiro és mtsai 2011). Ebben az esetben függő változóként a telepek átmérőit vettük, és a következő faktorokat használtunk fel kategóriás magyarázó változóként: (1) antibiotikumok illetve azok kombinációi, (2) herbicid koncentrációk, (3) hőmérséklet és (4) szilárd és folyékony táptalajok típusai. Az eltelt napokat (2, 4, 6, 8, 10 és 12) folytonos magyarázó változónak tekintettük. A marginális regresszió modell paramétereit az ún. restricted maximum likelihood (REML) becslési elv alapján határoztuk meg. A statisztikai elemzést a folytonos magyarázó változó (napok) kihagyásával is elvégeztük. Az esetleges szignifikáns különbség megállapítására egyfaktoros varianciaelemzést (ANOVA) végeztünk, amely során az I. típusú (szekvenciális) négyzetösszegtípus szerinti felbontási elvet követtük. Az antibiotikumok esetében a 4., 8. és 12. napon, az antibiotikum kombinációk esetében a 10. napon, a herbicid koncentrációk esetében a 12. napon, a hőmérséklet esetében 4., 8. és 12. napon, a szilárd táptalajok esetében a 10. napon, valamint a folyékony táptalajok esetében pedig a 7., 14. illetve a 21. napon mért telepátmérők adatait vettük alapul. Szignifikáns különbség esetén az átlagokat Tukey-Kramerféle próbával hasonlítottuk össze, melyhez az R program DTK csomagját használtuk fel (Lau 2011). A főhatások és az interakciók finomabb elemzésére illetve az elsőfajú hiba (Type I error) elkerülése végett az elemzést megismételtük különböző kontrasztokkal is, aminek segítségével elsősorban azokat a szignifikáns különbségeket kerestünk, ami a kontroll illetve a 55

különböző kezelések között alakult ki. Az ún. treatment contrast-ot használtuk az egyes faktorszintek átlagának becslésére, amihez 95%-os konfidencia intervallumot (CI) is megadtunk. Az összes elemzés elvégzése után ellenőriztük az adott próbára vonatkozó alkalmazhatósági feltételeket. A normalitás vizsgálatra elsősorban a Shapiro-Wilk próbát, a szóráshomogenitás vizsgálatra pedig a Bartlett-próbát használtuk fel 1 %-os szignifikancia szint mellett. Ezenkívül az adott modell illeszkedésének jóságát megvizsgáltuk különböző diagnosztikus ábrákkal is. A mesterséges fertőzési vizsgálatok előtanulmánya során kétváltozós varianciaanalizissel értékeltük a kapott eredményeket. Az elemzés során az egyik faktor a kezelés típusa (ép és karborundummal kezelt levelek), a másik pedig az inokulumok (K 1, K 2 ) voltak. Ezen faktorok függvényében vizsgáltuk az összpiknídium mennyiséget, a piknídiumok mennyiségét a levelek színén és fonákján, valamint összefüggést kerestünk a levelek nagysága és a képződött piknídiumok mennyisége között. Az összes elemzés elvégzése után ellenőriztük az adott próbára vonatkozó alkalmazhatósági feltételeket. A sporulációs, a mesterséges fertőzés és fertőzési küszöbérték vizsgálataink elemzése esetében is egyfaktoros varianciaanalízist (ANOVA) használtunk fel. Ebben az esetben a piknídiumok mennyiségét vettük folytonos függő változóként, kategóriás magyarázó változóként az egyes táptalajok típusait, a megvilágítást, az egyes spórakoncentráció mennyiségét, valamint a vizsgált törzseket. A spórakoncentráció esetében második faktorként a fagyöngylevél szerepét is figyelembe vettük, vagyis vizsgáltuk a piknídium mennyiségét egyaránt a levél színén és a fonákán is. Az elemzés további lépései megegyezik az előbb leírtakkal. A statisztikai eredményeket különböző ábrákkal is szemléltettük. Oszlopdiagramokkal ábrázoltuk az egyes telepátmérőket a különböző faktorok függvényében. Regressziós egyenessel ábrázoltuk a telepátmérők növekedését az eltelt napok, illetve a különböző faktorok függvényében. Dobozdiagramot (boxplot) használtunk fel a piknídiumok mennyiségének adataiból számolt statisztika grafikus ábrázolására. A doboz közepén a vastag vízszintes vonal jelöli a mediánt, maga a doboz az interkvartilis terjedelmet (IQR) szemlélteti, a legkisebb és a legnagyobb értékek egy-egy talppal vannak ábrázolva. A doboz elhelyezkedése a teljes talphoz viszonyítva, illetve a medián helyzet a dobozon belül információt ad az eloszlásról. Minél kisebb az interkvartilis terjedelem, annál kisebb a variancia. Az önmagában álló üres körök jelölik a kiugró értékeket. 56

6. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 6.1 A fehér fagyöngy előfordulása Magyarországon 6.1.1 A fehér fagyöngy 1920-as évekbeli elterjedésének rekonstrukciója A fehér fagyöngy hazai elterjedéséről készült első részletes tanulmányt Tubeuf (1923) közölte monográfiájában, aki Roth Gyulát kérte fel a növény hazai előfordulásának tanulmányozására. Roth még 1913-ban kezdte meg az adatgyűjtést, megfigyelései azonban az I. világháború miatt csak 1926-ban kerültek közlésre. Így Tubeuf (1923) munkájában csupán a fehér fagyöngy néhány fontosabb előfordulási helyét és gyakoribb gazdanövényeit közölte hazánk területéről, addig Roth (1926) egy pontos elterjedési térkép mellett részletesen ismertette a fontosabb gazdanövényeket és azon városok listáját, ahol a fehér fagyöngyöt megfigyelték. Munkáját Boros (1926) egészítette ki, aki számos más helyről is jelentette a félélősködőt. Az általuk megadott előfordulási helyek és Roth (1926) elterjedési térképe alapján rekonstruáltuk a fehér fagyöngy 1920-as évekbeli elterjedését, melyet florisztikai alapmező (12,5 11,2 km) térképen mutatunk be (17. ábra). 17. ábra: A fehér fagyöngy magyarországi elterjedése az 1920-as években a florisztikai alapmezőkön jelölve. (Tubeuf 1923, Boros 1926 és Roth 1926 közlései alapján.) 57

Az első irodalmi jelentések alapján az 1920-as években a fehér fagyöngy összesen 67 alapmezőn volt jelen, vagyis hozzávetőlegesen az ország mindössze 9%-a volt fertőzött (3. táblázat). Ekkor hazánkban az erdős területek nagysága 1,1 10 6 ha volt, tehát az ország mindössze 12%-át borította erdő. A nagyobb és egybefüggő állományok főként Dunántúlon és az Északi-középhegységben fordultak elő (Halász 1994). 3. táblázat: Magyarország nagytájainak fertőzöttsége az 1920-as években. Nagytájak A fertőzött alapmezők aránya (db és %) Összes alapmező Alföld 9 2,09 388 Kisalföld 8 14,04 57 Északi-középhegység 16 16,84 95 Dunántúli-középhegység 11 23,40 47 Dunántúli-dombság 12 13,04 92 Nyugat-Dunántúl 12 18,18 66 Összes fertőzött alapmező 67 8,9 745 A potenciális gazdanövények jelenlétének hiányában a fehér fagyönggyel az Alföldön szinte egyáltalán nem találkoztak, hiszen a növény előfordulását a nagytáj területéről sem Tubeuf (1923), sem Roth (1926) nem jelentette. Boros (1926) megfigyelései alapján szórványosan a Tisza ártereiben Populus-fajokon, valamint hasonló gazdanövényen a Nyírségben és a Felső-Tisza-vidékén azonban előfordult. Ekkoriban az Alföld alig 2% volt fertőzött, hiszen a 384 alapmezőből mindössze 9 mezőn találkoztak a hemiparazita növénnyel. Bár a Tisza mentén alig, addig a Duna völgyében számos helyről beszámoltak a fagyöngy jelenlétéről. Míg Tubef (1923) nyárfákról és fűzről (Salix sp.), addig Boros (1926) hasonlóan nyárfákon, illetve akácon (Robinia pseudoacacia) is találkozott vele több Dunamenti nagyvárosban (Hegyeshalom, Mosonmagyaróvár, Esztergom). Horváth (1917) Tatán figyelte meg szintén nyárfán. Bár a folyó felső szakasza erősen, addig az Alsó-Duna-völgye egyáltalán nem volt fertőzött, hiszen mindössze egyetlen településről (Kalocsa) jelentették a növény előfordulását (Menyhárth 1887). 58

Ami a Kisalföldet illeti, Roth (1926) csak néhány szórványos előfordulást közölt a Marcal-medencéből, addig Tubeuf (1923), Linhart György elmondásaira támaszkodva, már 11 különböző gazdanövényről jelentette a hemiparazitát. Az általa megfigyelt gazdanövények az Acer rubrum, Betula pubescens, Juglans nigra, Juglans regia, Malus domestica, Populus nigra, P. euramericana, Pinus sylvestris, Pyrus communis és Robinia pseudoacacia voltak. Ebben a tájegységben összességében 57-ből 9 alapmezőn figyelték meg a növényt, így a terület 14%-a volt fertőzött. Tubeuf (1923) monográfiájában kiemelt egy parkot Sárváron, mely Habsburg-Estei Mária Terézia Henrietta Dorottya (1849 1919) osztrák főhercegnő tulajdonában állt. A területen különösen erős fagyöngyfertőzést tapasztaltak a következő gazdanövényeken: Acer campestre, Acer rubrum, Alnus glutinosa, Betula pendula, Carpinus betulus, Celtis occidentalis, Crataegus monogyna, Fraxinus pennsylvanica, Juglans nigra, Malus domestica, Populus euramericana, Rosa canina, Salix alba és Tilia tomentosa. Érdekesség továbbá az is, hogy fehér fagyöngy hiperparazitizmusát, vagyis a szintén parazita európai sárgafagyöngyön (Loranthus europeaeus) való élősködését, ebben a parkban már ekkor megfigyelték. Roth (1926) a Nyugat-Dunántúlon 12 alapmezőről jelentette a növényt, így a tájegység mindössze 18%-a volt fertőzött. Az Őrségben fenyőféléken (Abies alba, Picea abies, Pinus sylvestris) is megfigyelték a növényt, vagyis a V. album mindhárom alfaja már ekkor is jelen volt ezen a területen. Tubeuf (1923) munkájában a Dunántúli-középhegységet még csak nem is említi, azonban Roth (1926) számos helyről (Vértes, Bakonyalja, Öreg-Bakony) gyakori fajként jelentette a fagyöngyöt. Az 1920-as években ez a tájegysége volt az ország legfertőzöttebb területe, hiszen a Dunántúli-középhegység közel ¼-én fordult elő a növény. Ezeken a területeken főként almán (vad fajok és nemes fajták), nyárfán, juharon és hárson figyelték meg, bár Boros (1926) vörös vadgesztenyéről (Aesculus pavia) is leírta, ezzel szemben közönséges vadgesztenyén (Aesculus hippocastanum) való előfordulását ekkoriban hazánkból még jelentették. A Dunántúli-dombság területéről Tubeuf (1923) további számos gazdanövényt sorolt fel mint pl. Betula-, vagy Tilia-fajokat, illetve a vadkörtét (Pyrus pyraster). Ezen kívül Boros (1926) erős fertőzésről számolt be a Belső-Somogy területéről, leggyakrabban nyár (Populus), alma (Malus) és fűz (Salix) fajokon figyelte meg a növény károsítását. Ezzel szemben Roth (1926) a Dél-Dunántúlon szórványos fajnak tartja és csak 12 alapmezőről jelentette. 59

Az Északi-középhegység tekintetében sem Tubeuf (1923), sem Boros (1926) nem számolt be a fagyöngy jelenlétéről, azonban Roth (1926) 96-ból 16 alapmezőn találta meg a növényt. A tájegységek közül itt volt a legmagasabb a fertőzött alapmezők száma, a fertőzöttség aránya azonban így is csak 16% volt. A fagyöngy jelenléte a Gödöllőidombságban igen markáns, míg a Sajó és Hejő völgyében (Miskolc és Miskolctapolca környéke) szórványos volt. Roth (1926) a már említett gazdanövényeken kívül megfigyelte továbbá Acer pseudoplatanus, A. platanoides, Populus alba, Prunus domestica, P. avium, Salix alba, Salix fragilis, Sorbus aucuparia, Tilia cordata, T. platyphyllos, T. tomentosa fajokon is. Az általa jelzett 258 megfigyelés során 41 alkalommal nyárfán, 60 alkalommal almán (vad fajokon és nemes fajtákon egyenlő arányban), szintén 60 alkalommal akácon, 21 alkalommal fűzfán és körtén, 19 alkalommal hárson, 16 alkalommal juharon és 14 alkalommal nyitvatermő fajokon találta meg a fehér fagyöngyöt. Kiemelte továbbá annak takarmánynövényként való alkalmazását, melyet tehenek, szarvasok és őzek téli takarmányozásra alkalmaztak. 6.1.2 A fehér fagyöngy hazai előfordulása az 1990-es évektől napjainkig Tubeuf (1923) monográfiája és Roth (1926) részletes vizsgálata után kb. 60 évig átfogó tanulmány a fehér fagyöngy hazai elterjedéséről nem született, bár néhány szerző tanulmányozta a növény biológiáját, terjedését és népi gyógyászatban betöltött szerepét (Rapaics 1938, Natter-Nád 1943, Palocsay és Szilágyi 1971, Fekete 1972), majd az 1990-es évek elejétől ismét megszaporodtak a növénnyel kapcsolatos florisztikai jellegű tanulmányok. Gencsi és Vancsura (1992) a Dunántúlon gyakori, míg az Északi-középhegység és a Duna-Tisza közén szórványosan előforduló fajnak írta le. Az erdőgazdálkodók 1990 óta jelentik a fehér fagyöngy kártételét az Erdészeti Tudományos Intézet (ERTI) központja felé. Az összesített adatok (18. ábra) alapján a kártétel mértéke az 1990-es évek elején 300 1300 ha között mozgott, 10 évvel később 800 és 1200 ha között változott, majd 2007-től ugrásszerűen megemelkedett. Ekkor 1800 3000 ha volt a jelentett fertőzött területek nagysága. A terület növekedésével a fertőzés intenzitása is változott, hiszen amíg a 90-es évek elején az alacsony és közepes, addig napjainkban az ERTI adatai alapján az erősen fertőzött területek részaránya a meghatározó (18. ábra, az összefoglaló táblázat a Mellékletek c. fejezetben található). 60

18. ábra: A fertőzött területek nagysága és a fertőzés erősségének megoszlása az Erdészeti Tudományos Intézet (ERTI) adatai alapján 1990 és 2011 között. Gencsi és Vancsura (1992) rövid jelentése után Bartha és Mátyás (1995) közölt egy összefoglaló térképet, melyen a fehér fagyöngyöt összesen 275 alapmezőről jelentették (4. táblázat és 19. ábra) elterjedéséről. Az 1990-es évek közepére Roth (1926) megfigyeléseihez képest a fertőzött területek nagysága háromszorosára nőtt és az ország alapmezőinek kb. 1/3-a volt fertőzött. 4. táblázat: Magyarország nagytájainak fertőzöttsége az 1920-as évektől napjainkig. Nagytájak A fertőzött alapmezők aránya (db és %) 1920-as évek 1990-es évek 2010-ben Alapmező % Alapmező % Alapmező % Összes alapmező Alföld 9 2,09 48 12,37 66 17,01 388 Kisalföld 8 14,04 34 59,65 48 84,21 57 Északiközéphegység Dunántúliközéphegység Dunántúlidombság Nyugat- Dunántúl Összes fertőzött alapmező 16 16,84 60 63,16 41 43,16 95 11 23,40 42 89,36 35 74,47 47 12 13,04 34 36,96 64 69,57 92 12 18,18 57 86,36 59 89,39 66 67 8,99 275 36,91 313 42,01 745 61

19. ábra: A fehér fagyöngy magyarországi elterjedése az 1990-es évek közepén a florisztikai alapmezőkön jelölve. (Bartha és Mátyás (1995) nyomán.) Az ország tájegységei közül a legnagyobb arányban a Nyugat-Dunántúlon és a Dunántúli-középhegységben volt jelen a növény, itt a fertőzött területek nagysága közel 90% volt. Az Északi-középhegységben a fehér fagyöngyöt közel 60 alapmezőről jelentették, így a terület több mint 60%-a volt fertőzött. Hasonló volt a helyzet a Kisalföldön is, hiszen 34 alapmező, vagyis a terület 60% volt fertőzött, míg az Alföld esetében csak a terület 12%-án találtak fagyöngyöt. A fertőzött területek növekedésén túl az erdősültség is jelentősen nőtt az utóbbi 90 évben, hiszen az erdőborítottság az 1920-as években 1,1 10 6 ha, az 1990-es években 1,7 10 6 ha, majd 2006-ra már 1,8 10 6 ha volt, ami az ország közel 20%-a. A legnagyobb egybefüggő erdővel borított területek napjainkban is a Dunántúlon találhatóak. Az erdősültség aránya a Nyugat-Dunántúlon (Zala és Vas megye) a legnagyobb, de az Alföld és az Északiközéphegység területein is jelentős volt az erdővel borított területek növekedése (Kottek 2008). Napjainkban a Magyar Flóratérképezési Program adatbázisa és a saját megfigyeléseink alapján jelenleg a fehér fagyöngy 313 alapmezőn van jelen, vagyis Bartha és Mátyás (1995) 62

megfigyeléseihez képest az alapmezőkre vetítve kevesebb, mint 15 év alatt további kb. 5%-ot emelkedett a fertőzött területek nagysága. A legnagyobb arányú növekedést a Dunántúli-dombság területén figyeltük meg, ahol az 1990-es évek közepén még csak 34 alapmező volt fertőzött. Itt a fertőzött alapmezők száma csaknem megduplázódott, hiszen 64 alapmezőn találkoztunk a növénnyel. Jelenleg a nagytájak közül az Alföldön detektálható a legtöbb fertőzött alapmező (66 db), bár arányaiban tekintve továbbra is ebben a térségben a legalacsonyabb a fertőzöttség, hiszen mindössze a terület 17%-án fordul elő a hemiparazita. Jelentős növekedést tapasztaltunk a Kisalföld területén is, ahol mára 57-ből 48 alapmező fertőzött, vagyis a terület több mint 80%-án jelen van a fehér fagyöngy. Arányaiban tekintve a legnagyobb fertőzöttség a Nyugat-Dunántúlon fordul elő, hiszen itt 66-ból 59 alapmezőről jelentették a növényt, vagyis a terület, több mint 90%-a fertőzött. Érdekesség továbbá az is, hogy vizsgálataink során a Dunántúli-középhegységben és az Északi-középhegységben kevesebb fertőzött alapmezőt találtunk, mint amennyit Bartha és Mátyás (1995) tizenöt évvel korábban jelentett. Mindazonáltal ezeken a tájegységeken is jelentős területeken találkozhatunk a növénnyel, hiszen a Dunántúli-középhegység 74%-a, az Északi-középhegység 43%-a fertőzött. 6.1.3 A fehér fagyöngy előfordulási gyakorisága napjainkban Bár a fertőzött terültetek nagysága közel négyszeresére nőtt Roth (1926) megfigyelései óta, azonban az ország kb. 2/3 része továbbra sem fertőzött. Az ERTI adatai alapján napjainkban az erősen fertőzött területek jóval magasabb arányúak (18. ábra), azonban saját megfigyeléseink alapján a kevésbé és közepesen fertőzött területek részaránya magasabb. Vizsgálataink szerint a gyengén fertőzött területek az ország összterületének 11%-át érintik, valamint a közepesen fertőzött területek aránya szintén 10% körüli, addig erős fertőzés pedig csak az ország kb. 5 6%-án tapasztalható (5. táblázat). Azok a területek, ahol a fehér fagyöngy erősebb fellépését tapasztaltuk, ott fordulnak elő, ahol eredetileg már Roth (1926) is megfigyelte a fagyöngy fellépését. A nem fertőzött területek részaránya továbbra is az Alföldön a legnagyobb, itt a fertőzött területek főleg a tájegységek határain találhatóak, míg a terület központi régiója továbbra sem fertőzött. Bár ebben a tájegységben is a kevésbé fertőzött területek vannak többségben (kb. 4%), valamint az erősen fertőzött területek részaránya is csak 2%, azonban a 63

legnagyobb egybefüggő és összességében az ország legerősebben fertőzött területe is az Alföldön fordul elő (20. ábra). 5. táblázat: A fehér fagyöngy fertőzés intenzitásának alakulása Magyarország nagytájain napjainkban. A fertőzött kvadrátok aránya (db és %) Nagytájak Nem fertőzött Bizonytalan Gyenge fertőzöttség Közepes fertőzöttség Erős fertőzöttség Összes kvadrát Kvadrát % Kvadrát % Kvadrát % Kvadrát % Kvadrát % Alföld 1386 90,77 11 0,72 63 4,13 35 2,29 32 2,10 1527 Kisalföld 54 30,34 13 7,30 57 32,02 38 21,35 16 8,99 178 Északiközéphg. Dunántúliközéphg. Dunántúlidombság Nyugat- Dunántúl Összes kvadrát 280 79,77 4 1,14 38 10,83 17 4,84 12 3,42 351 84 44,92 2 1,07 46 24,60 42 22,46 13 6,95 187 181 51,86 4 1,15 72 20,63 56 16,05 36 10,32 349 51 21,07 17 7,02 44 18,18 86 35,54 44 18,18 242 2036 71,84 51 1,80 320 11,29 274 9,67 153 5,40 2834 A Felső-Tisza-vidékén található nyárfaligetek és az utak menti nyárfasorokon tömegesen találkozhatunk a hemiparazitával, a bokrok nagysága pedig jóval átlag feletti. Mindezt saját megfigyelésünk is alátámasztja, ugyanis a 2010-es mintavételezés során Sárospatakon, egy nyárfán növő 1,6-1,7 m átmérőjű fagyöngybokrot dokumentáltunk. Nagyobb számban van jelen továbbá a fehér fagyöngy a Tisza-völgyében főleg Salix fajokon, addig a Nyírségben már alacsonyabb számban főként akácon (Robinia pseudoacacia) találkozhatunk vele. Az Alföld dunántúli részein magasabb fertőzés csak Mohács környékén (Mohácsi teraszos sík és Mohácsi-sziget) detektálható, továbbá a Drávamelléken szórványosan, míg a Mezőföldön szinte egyáltalán nem találkozhatunk fagyönggyel (20. ábra). 64

20. ábra: A fehér fagyöngy fertőzöttség intenzitásának alakulása 2002-től napjaikig. (Fehér: nem fertőzött területek; sárga: alacsony, narancs: közepes, piros: erősen fertőzött kvadrátok; szürke: 2005 előtti, bizonytalan adatok. Készült a saját megfigyelésink és a Flóratérképezési Program adatbázisa alapján.) Míg az Alföld igen jelentős része nem fertőzött, addig a másik síkságunkon, a Kisalföldön, alacsony egyedszámban ugyan, de szinte mindenütt előfordul a fagyöngy. Napjainkra a Szigetköz közepesen fertőzött területté vált, míg erősebb fertőzést tapasztalhatunk a Duna-völgyében és a Győr-Tatai teraszvidéken, valamint a Marcalmedencében. Érdekesség, hogy amíg Roth (1926) idejében egy erősebben fertőzött régiót a Marcal-medence szomszédságában elterülő Öreg-Bakonyban találhattunk, addig mára ez a központ kissé északkeletebbre terjedt, illetve áttolódott a Marcal-medencébe. Természetesen közepesen és erősebben fertőzött területekkel még mindig találkozhatunk az Öreg-Bakonyban és Bakonyalján, ma már azonban az Észak-Dunántúl legerősebben fertőzött régióját ezen két középtáj együttesen alkotja. Az Északi-középhegység az ország második legkevésbé fertőzött tájegysége az Alföld után, mivel a terület alig 10%-a fertőzött. Ebben a tájegységben szórványosan alacsony fertőzöttségű kvadrátok fordulnak elő, míg a Gömör-Hevesi-dombság és a Borsodi-dombság 65

északi területei közepesen fertőzöttek. Továbbá hasonló erősségű fertőzöttséget tapasztaltunk a Cserehát-hegység déli lábánál a Sajó és Hernád közötti területeken, de ez az összterület mindössze 5%-a. Az Északi-középhegységben a megszokottaktól jelentős eltérést tapasztaltunk a Gödöllői-dombság területén, itt ugyanis a fehér fagyöngy számos gazdanövényen nagy tömegben fordul elő. A terület egyik centruma a Gödöllői kastélypark, ahol a V. album leggyakoribb gazdanövényei nagy számban fordulnak elő. Erről a területről egyébként már Roth (1926) is erősebb fertőzést jelentett, mely a mai napig megmaradt. Érdekesség, hogy Bartha és Mátyás (1995) a tájegység 2/3-áról jelentette a fehér fagyöngyöt, addig mi a Gödöllői-dombság erősebb fertőzött régióin kívül szinte alig találkoztunk a növénnyel. A fehér fagyöngy jelenléte a Dunántúli-középhegységben igen változatos képet mutat. Az erősen fertőzött területek, mely a tájegység mindössze 7%-a, az Öreg-Bakony és Bakonyalja vidékére centralizálódnak, addig a jóval nagyobb arányban előforduló (kb. 22%) közepesen fertőzött területek elszórva fordulnak elő (Keszthelyi-hegység, Déli-Bakony). A Balaton északi partja szinte egyáltalán nem fertőzött, valamint a Balaton-felvidéken és a Veszprém-Nagyvázsonyi-medence területén is csak alacsony egyedszámban figyeltük meg a növényt. A Dunántúli-dombságon az erősen fertőzött területek a Zselicben és Belső-Somogyban találhatóak, vagyis ugyanott, ahol Roth (1926) szintén megfigyelte a fehér fagyöngyöt. Ugyancsak találkozhatunk egy erősebben fertőzött területtel a Mecsektől északra fekvő Völgységben is. A közepesen fertőzött vidékek ezen területek körül elszórva találhatóak és keleten egészen a Belső-Somogy határáig, nyugaton pedig a Sió-csatornáig elnyúlnak. Az erősen fertőzött területek részaránya 10%, a közepesen fertőzötteké 18%, míg a gyengén fertőzött területek nagysága kb. 20%. A Nyugat-Dunántúlon, ahol a legnagyobb az erdősültség az országban (Kottek 2008), tapasztaltuk a fehér fagyöngy legnagyobb arányú fertőzését. Ennek a tájegységnek több mint ¾-e fertőzött, sőt az erősen fertőzött területek részaránya is itt a legnagyobb, ami közel 20%. A fehér fagyöngy terjedése Roth (1926) megfigyeléseihez képest szintén a Nyugat- Dunántúlon volt a legnagyobb, hiszen míg ő csak néhány helyről említi a növényt, addig mára ez a legfertőzöttebb tájegység. Az erősen fertőzött területek a tájegység nyugati vidékén (Alpokalja, Őrség), valamint a Zalai-dombságban és a Rába-völgyében találhatóak. Ezen területeken kívül majdnem az egész tájegység közepesen fertőzött, melynek aránya 36%. A kevésbé fertőzött területek a Nyugat-Dunántúl északi vidékén találhatóak (Kemeneshát, Vas- Soproni-síkság), mely részaránya 18%. 66

További érdekesség ezzel a tájegységgel kapcsolatban az is, hogy csak itt fordulnak elő a fagyöngy nyitvatermőkön élő alfajai. Az Abies fajokon megtelepedő V. album subsp. abietis példányaival csak az Soproni-helységben találkozhatunk (21. ábra [A] kép). Hasonlóan alacsony egyedszámban fordul elő hazánkban a V. album subsp. austriacum is, bár ennek az alfajnak az előbbinél valamivel nagyobb az elterjedési területe. Szórványos előfordulását a Soproni-hegységben figyelhetjük meg, míg nagyobb egyedszámban a Kőszegi-hegységben, a Vasi-hegyháton és a Balfi-dombságban találkozhatunk vele. A növény elterjedési területe az Őrség déli és nyugati vidékére is elnyúlik, ahol leggyakrabban erdeifenyőt (Pinus sylvestris) parazitál (21. ábra [B] kép).). 21. ábra: A V. album subsp. abietis (A) és a V. album subsp. austriacum (B) elterjedése hazánkban. (Készült a saját megfigyelésink és a Flóratérképezési Program adatbázisa alapján.) 67

6.1.4 A fehér fagyöngy gazdanövényei Magyarországon 22. ábra: Fehér fagyöngy fertőzése különböző gazdanövényeken. A: Nyár (Populus sp.), Pósfa; B: alma (Malus sp.), Keszthely; C: körte (Pyrus sp.), Gödöllő; D: erdeifenyő (Pinus sylvestris), Sopron; E: berkenye (Sorbus sp.), Sásd; F: ezüst juhar (A. saccharinum), Dombóvár. (Fotó: Varga I.). 68

A fehér fagyöngy leggyakoribb gazdanövényei tekintetében jelentős változást nem figyeltünk meg, azok javarészt megegyeztek Roth (1926) által közölt fajokkal. Az országos fagyöngy felmérésen leggyakrabban a következő fajokon találkoztunk a növénnyel: nyár (Populus spp.), alma (főként vad és régi tájfajták), juhar (Acer spp.), hárs (Tilia spp.), akác (Robinia pseudoacacia), fűz (Salix spp.) és nyír (Betula spp.). Erős fertőzést figyeltünk meg továbbá ezüst juharon (Acer saccharinum) és berkenyén (Sorbus spp.) lakott területeken, városi parkokban vagy útmenti fasorokon (22. ábra). Bár a fent említett fajokon találkozhatunk leggyakrabban a növénnyel, előfordulhat továbbá vadgesztenyén (Aesculus hippocastanum), gesztenyén (Castanea sativa), szirti fanyarkán (Amelanchier ovalis), mandulán (Amygdalus spp), ostorfán (Celtis spp.), meggyen és cseresznyén (Cerasus spp.), mogyorón (Corylus avellana), naspolyán (Mespilus germanica), komlógyertyánon (Ostrya carpinifolia) és vörös tölgyön (Quercus rubra) (Bartha 2012). Napjainkban a következő fajok sorolhatók a fehér fagyöngy 18 leggyakoribb gazdanövénye közé a Flóratérképezési Program adatbázisa alapján: Acer campestre, A. platanoides, A. pseudoplatanus, A. saccharinum, A. tataricum, Betula pendula, Malus domestica, M. sylvestris, Populus canescens, P. alba, P. nigra, P. tremula, Robinia pseudoacacia, Salix alba, S. fragilis, Tilia cordata, T. platyphyllos, T. tomentosa. Ezen fajok előfordulásának gyakoriságában igen nagy változatosság tapasztalható az ország különböző tájegységei esetében. A fajok előfordulását a 23. ábra mutatja, valamint megtalálható egy összefoglaló táblázat a Melléklet c. fejezetben. Vizsgálataink alapján hazánk területén egyetlen olyan kvadrát sem található, melyben a maximális 18 gazdanövény egyidőben előfordulna, illetve csupán néhány kvadrátban mutattuk ki 17 potenciális gazdanövény egyidejű jelenlétét. Az ország legnagyobb részén (36%-án) egyszerre egy kvadrátban átlagosan 5 8 gazdanövény fordul elő, míg 9 12 gazdanövényt az ország területének 29%-án, 1 4 gazdanövény jelenlétét pedig az ország területének 22%-án találhatunk. A gazdanövények arányáról az ország 2834 kvadrátjának mindössze 7%-ából nincs adatunk, azonban ezen vak kvadrátok jelentős része Duna-Tiszaközén található, ahol a fehér fagyöngy nem fordul elő (23. ábra). 69

23. ábra: A fehér fagyöngy 18 leggyakoribb gazdanövényének előfordulása hazánkban a Flóratérképezési Program adatbázisa alapján. (Fehér/üres kvadrát: nincs adat, citromsárga kvadrát: egyetlen potenciális gazdanövény sincs jelen, fekete kvadrát: 17 potenciális gazdanövény együttes jelenléte.) Hazánkban fehér fagyönggyel fertőzött területek legnagyobb részén (54 %-án) olyan kvadrátok fordulnak elő, melyben a potenciális gazdafajok száma 9 12 közötti. Azokban a kvadrátokban, ahol a potenciális gazdanövények száma ennél magasabb a fertőzött területek aránya is növekszik, mivel 13 16 faj jelenléte esetén már a kvadrátok 2/3-a fertőzött. Abban az esetben, ha a potenciális gazdanövények száma nagyobb mint 8, a fagyöngy jelenléte ugrásszerűen nő, míg azokban a kvadrátokban, ahol a fajok száma ennél alacsonyabb, ugrásszerűen csökken (24. ábra). 70

24. ábra: A 18 leggyakoribb potenciális gazdanövény előfordulásának megoszlása Magyarország összterületén a fagyönggyel fertőzött és nem fertőzött kvadrátokban. Azokban a kvadrátokban, ahol a fehér fagyöngy nincs jelen, 5 8 potenciális gazdanövény jelenléte a leggyakoribb (38%), valamint a nem fertőzött területek további 22%- án 1 4 potenciális gazdanövény található. Mindez azt mutatja, hogy a fehér fagyöngy által nem fertőzött területek területek közel 2/3-án a 18 leggyakoribb gazdanövényből mindössze maximálisan csupán 8 lehetséges gazdafajok fordul elő egyidőben. Így megállapítható, hogy azokon a területeken, ahol a fehér fagyöngy nincs jelen, a félparazita által kedvelt gyakori gazdanövényekkel sem találkozhatunk. Érdekesség azonban, hogy a két legkevésbé fertőzött tájegység, az Alföld és az Északiközéphegység esetén jelentős eltérés tapasztalható a lehetséges gazdanövények előfordulásában a nem fertőzött területeken, fehér fagyönggyel mindkét tájegység esetén azonban igen ritkán találkozhatunk (25. ábra). Amíg az Alföld nem fertőzött területeinek legnagyobb részén a 18 legkedveltebb gazdanövények közül mindössze 5 8 fajt található, addig az Északi-középhegység hasonlóan nem fertőzött területein már 9 12 fajjal találkozhatunk, vagyis utóbbin a fehér fagyöngy megtelepedésére alkalmas gazdanövények száma jóval magasabb. A kedvelt gazdanövények nagyobb arányú jelenléte erősebb fagyöngy fertőzöttséget feltételezne, ez azonban az Északi-középhegység esetén mégsem így van, hiszen ezen a területen az Alföldhöz hasonlóan a fehér fagyöngy csak elszórtan fordul elő. 71

25. ábra: A 18 leggyakoribb potenciális gazdanövény előfordulása a fagyönggyel nem fertőzött kvadrátokban (Alf.: Alföld, Kisa.: Kisalföld, Ny-Dt.: Nyugat-Dunántúl, É-kh.: Északi-középhegység, D-kh.: Dunántúli- középhegység, D-Dt.: Dunántúli-dombság). Az Alföld esetében a tájegység nem fertőzött régiói, illetve az alacsony számú potenciális gazdanövényt tartalmazó kvadrátok is a tájegység központi részében centralizálódnak. A tájegység északkeleti részén (Felső-Tisza vidéke, Nyírség stb.) a potenciális gazdanövények száma már jóval magasabb, itt átlagosan 9 12, vagy ennél több faj fordul elő egyidőben. A fehér fagyöngy nagyobb arányú jelenlétével leginkább ezeken a területeken találkozhatunk, mindez azonban csak a tájegység mindössze 12%-át érinti. A másik síkságunkon, a Kisalföld területének közel felén (41%-án) 9 12 potenciális gazdanövény található, valamint a terület további 38%-án 5 8 potenciális gazdanövény fordul elő egyidőben. Elképzelhető, hogy az Alfölddel ellentétben az itt megtalálható magasabb gazdanövényszám is hozzájárul ahhoz, hogy a terület közel 60% fertőzött, igaz a terület nagy része gyengén, vagy csak közepesen fertőzött. A többi tájegységben (Dunántúli-középhegység, Nyugat-Dunántúl és Dunántúlidombság) szintén azok a kvadrátok vannak többségben (kb. 50%), melyben 9 12 potenciális gazdanövény található, míg a maradék terület 30-40%-án 5 8 potenciális gazdanövény fordul elő. Azokban a tájegységekben, ahol a magasabb az egy kvadrátban élő potenciális gazdanövények száma a fehér fagyönggyel fertőzött területek aránya is jóval nagyobb (26. ábra). 72

26. ábra: A 18 leggyakoribb potenciális gazdanövény előfordulása a fagyönggyel fertőzött kvadrátokban (Alf.: Alföld, Kisa.: Kisalföld, Ny-Dt.: Nyugat-Dunántúl, É-kh.: Északiközéphegység, D-kh.: Dunántúli- középhegység, D-Dt.: Dunántúli-dombság). A fehér fagyöngy, illetve a leggyakoribb gazdanövényeinek előfordulását vizsgálva megállapítható, hogy a félparazita jóval nagyobb arányban fordul elő azokon a helyeken, ahol a növény által kedvelt gazdanövényeinek aránya magasabb, míg előfordulása ritkább azokon a területeken, ahol a gyakori gazdafák jelenlét is alacsonyabb. Ez alól kivételt képez az Északi középhegység, ahol bár magasabb a fehér fagyöngy lehetséges gazdafajainak jelenléte, a növény fertőzésével csak szórványosan találkozhatunk. 6.1.5 A fehér fagyöngy elterjedését befolyásoló tényezők A V. album egy adott élőhelyen való megtelepedését és terjedését számos tényező befolyásolhatja, mint pl. az adott terület erdősültsége, a növényállomány összetétele és vitalitása, abiotikus hatások (pl. aszály, talajállapot, fény) és különböző emberi beavatkozások (pl. művelési módok). A fehér fagyöngy terjedésének egyik kulcskérdése a kedvező élőhely, vagyis jó vízellátottságú területeken élő potenciális gazdanövények és a terjesztő ágensek (pl. léprigó) megléte. Így mindazok az emberi tevékenységek, melyek ezek meglétét, vagy hiányát befolyásolják közvetve, vagy közvetlenül hathatnak a növény elterjedésére. A potenciálisan elérhető gazdanövények jelenlétét előrelendítik, arányát pedig kedvezően alakítják az erdőtelepítések, városokban a gyarapodó közparkok, lakott területeken 73

kívül a sorfák megjelenései, sík területeken a ligeterdők, ártéri erdők, papírnyár ültetvények telepítései. Az utóbbi 100 év erdőtelepítései nyomán Magyarország erdősültsége majdnem a duplájára nőtt, mely tényező minden bizonnyal jelentősen hozzájárult a fehér fagyöngy terjedéséhez. Természetesen nem elhanyagolható tényező az sem, hogy az erdőtelepítések és parkosítások, összességében a fajok kiültetésekor az eltelepített fafajok aránya milyen volt, hiszen frissen eltelepített területeken a fagyöngy számára kedvező faji összetétel is hozzájárulhat a növény további terjedéséhez. A különböző emberi beavatkozások azonban nemcsak pozitívan, hanem negatívan is befolyásolhatják a fagyöngy terjedését. A mezőgazdasági művelési módok megváltozásával az utóbbi évtizedekben jelentősen csökkent a fagyöngybokrok száma a nemes gyümölcsfajtákon (alma, körte, cseresznye, szilva stb.), hiszen az intenzív termesztési módok alkalmazása mellett nevelt alma, vagy más gyümölcs ültetvényeken a fehér fagyöngy megtelepedésére szinte lehetetlen, mivel a növények vágási fordulója nagyon rövid, valamit metszéssel a parazitát rögtön eltávolítják. Így az egykoron leggyakoribb gazdafajon, az almán (Malus domestica) ma már csak akkor találkozhatunk fagyönggyel, ha egy régi tájfajtákból álló elhagyatott ültetvényen járunk (Jandrasits 2011). Erősebb fertőzés fordulhat elő napjainkban elhanyagolt telkek magányos almafáin, vagy közparkok idősebb díszfának ültetett almák esetében is. Kétségtelen tehát az ember közvetett hatása a gazdanövényeken, az erdő- és mezőgazdasági művelésen keresztül, de hozzájárulhat-e még az ember a fagyöngy terjedéséhez valamilyen módon? Számos kutatás bizonyította, hogy azokon a helyeken, ahol nagyobb az erózió és több az aszályos napok száma, a gazdanövények legyengülnek, ezáltal fogékonyabbá válnak a hemiparazita fertőzésére. Bár a fehér fagyöngy megtelepedését és annak, az erdészeti leromlási spirálban való szerepét nem lehet teljesen szétválasztani, az kétségtelen, hogy a globális felmelegedés és annak károkozása emberi tevékenységre vezethető vissza. Bár a fehér fagyöngy egy adott területen való megtelepedéséhez elengedhetetlen a megfelelő gazdanövények jelenléte, a terjedéshez az is szükséges, hogy egy adott területre, ahol sok potenciális gazdanövény fordul elő, eljussanak a magok. Így a terjesztő vektorok előfordulása, azok élőhely igénye és a költő párok száma is igen jelentős befolyással bír a hemiparazita terjedésére. Mindezt már Tubeuf (1923) is felismerte, aki számos madárfajt nevezett meg (pl. Turdus viscivorus, T. pilaris, T. iliacus) terjesztőként. Roth (1926) ezen fajok szerepét nem ismerte el és inkább más fogyasztó ágenseket (Martes foina, Vulpes vulpes, Sciurus vulgaris) emelt ki. 74

Hazánkban a Turdus fajok közül a legjelentősebb terjesztő a léprigó, mely hegy- és dombvidéki erdeink helyenként (Nyugat-Dunántúl, Dunántúli- és Északi-középhegység) viszonylag gyakori fészkelője (27. ábra, Hagemeijer és Blair 1997, Magyar Madártani Egyesület 2013). Szórványos a Tiszántúl öreg maradványtölgyeseiben, illetve a Kiskunság homoki erdőiben, valamint a Nyírségben is költ (Zalai és Haracsi 2008, Juhász 1995). Megfigyelték továbbá a Hanságban (Balsay 1986), és a Dunántúli-dombságban is (Kasza 1983). A Magyar Madártani Egyesület (2013) adatai alapján 1992 és 2002 között a költőpárok számát 4.000 25.000-re becsülték, mely az utóbbi években folyamatosan emelkedik. A nyugat-európai populációkhoz hasonló urbanizációjának kérdése már korábban felmerült (Horváth 1976) de a tényleges városi környezetben való költést csak később írták le (Füri és Tamás 2009, Juhász 1995, Rózsa 2003). Mindazonáltal a léprigó városokba való behúzódása inkább a téli időszakban, a fagyöngybogyók érésekor jellemző (Zalai és Haracsi 2008). 27. ábra: Léprigó élőhelyei Magyarországon 1985 1992 között. (Forrás: Magyar Madártani Egyesület.) Összevetve a fehér fagyöngy és a léprigó elterjedési területeit, egyértelműen kijelenthető, hogy a két terület között igen nagy átfedések vannak. A Dunántúl azon részein, ahol a léprigó is jelen van, agy fehér fagyöngy erősebb fertőzést mutattunk ki. A Kisalföldön, ahol a léprigó alacsonyabb számban fordul, ott a fagyöngy fertőzöttsége is alacsonyabb intenzitású. Ami az Alföldet illeti, a fehér fagyöngy hiányzik ugyan a Duna-Tisza közéről, de a Nyírségben és a Felső-Tisza-vidékén tömegesen fordul elő, és ezekről a területekről a léprigót is többször jelentették. Az Alföld középső régióiban, ahol a léprigó nem fordul elő, valamint a potenciális gazdanövények jelenléte is igen alacsony, fehér fagyönggyel sem lehet találkozni. 75

6.2 A Phaeobotryosphaeria visci vizsgálatai 6.2.1 A Ph. visci hazai elterjedése és a monospórás tenyészetek A 2010. évi országos mintavételezés során 39 helyről gyűjtöttünk be fertőzött fagyöngyleveleket (28. ábra és 6. táblázat). A laboratóriumi vizsgálatok során valamennyi mintából megkíséreltünk monospórás tenyészetet előállítani, ez azonban csak 20 minta esetén sikerült (6. táblázat), a többi minta esetében a Ph. visci spórái nem csíráztak. A nem csírázó minták általában olyan helyekről származtak, ahol a fehér fagyöngy előfordulása is ritkább volt. Elképzelhető, hogy ezeken a helyeken az alacsony számú gazdanövényen a fertőzés ritkábban tud kialakulni és ezért is tudtunk csak idősebb, már nem csírázó mintákat begyűjteni. 28. ábra: A fehér fagyöngy hazai elterjedése (szürke) és a Ph. visci (fekete) minták gyűjtési helyei (fekete). A monospórás tenyészetek spontán sporulációját, vagyis az ivartalan termőtestek (piknídiumok) képződését a passzálások során feljegyeztük, valamint az átlagnál gyorsabban növekedő izolátumokat megjelöltük. Ezen tenyészetek listája szintén a 6. táblázat mutatja. 76

6. táblázat: Ph. visci gyűjtési helyei és a monospórás tenyészetek jellemzése. Kód Gyűjtési hely Monospórás tenyészet Spontán sporuláció Növekedés BDA-n G20 Ajka Igen ++++ ++++ G17 Bakonykoppány Nem G33 Baktalórántháza Igen Nem + G28 Bánhorváti Igen + + G30 Belegrád Igen Nem + G7 Borsfa Nem G35 Dombóvár Igen + + G5 Esztergályhorváti Nem G14 Fertőszentmiklós Nem G6 Galambok Nem G25 Gödöllő Igen Nem ++ G38 Harkány Igen Nem ++ G1 Hévíz Nem G19 Iszkáz Nem Ö5 (K 3 ) Katafa Igen +++ ++++ GK Igen ++ ++ Keszthely K 1, K 2 Igen +++ ++ G12 Kisunyom Nem Ö6 (K 4 ) Körmend Igen +++ +++ G36 Mánfa Nem G32 Mezőladány Nem G22 Mór Nem G41 Nagybajom Igen + ++ G11 Nova Nem G23 Oroszlány Igen + + G10 Páka Igen ++ ++ G18 Pápa Nem G37 Pécs Nem *A Keszthelyen gyűjtött mintákból számos további monospórás tenyészetet állítottunk elő a molekuláris genetikai vizsgálatokhoz, kódjuk Phaeo1 Phaeo20 volt. 77

6. táblázat (folytatás) Monospórás Spontán Növekedés Kód Gyűjtési hely tenyészet sporuláció BDA-n G16 Pénzesgyőr Nem G13 Pósfa Igen + ++ Ö7 Rábagyarmat Igen + ++ G29 Szalonna Igen Nem + G34 Szekszárd Igen + + G21 Szentgál Nem G40 Szentlászló Nem G39 Szigetvár Igen ++ + G24 Tarján Nem G31 Tiszabezdéd Nem G15 Veszprémvarsány Nem Ö4 Zalaegerszeg Igen +++ ++ Sporuláció és micélium növekedés: intenzíven ++++ jól +++ gyengén..++ nagyon gyengén...+ A monospórás tenyészetek közül nagyon intenzív sporulációt (30-40 db piknídium/ Petri-csésze) és gyors növekedést tapasztaltunk az Ajkán (G20) gyűjtött mintákon, míg a Katafán (Ö5) Körmenden (Ö6), Zalaegerszegen (Ö4) és Keszthelyen (K 1 ) gyűjtött minták esetén a törzsek jól sporuláltak (10-20 db piknídium/petri-csésze) 8 hét után. Általánosságban a jobban sporuláló törzsek intenzívebben is fejlődtek. Számos törzs lényegesebben lassabban növekedett, valamint 8 hét után még egyáltalán nem, vagy alig (3-5 db piknídium/petricsésze) sporulált. A Ph. vsci tenyészeteinek fenntartása során egyetlen esetben sem figyeltük meg az ivaros termőtestek képződését. A törzsek makromorfológiája minden esetben hasonló volt, egyetlen törzs esetében sem tapasztaltunk különösebb eltérést. A micélium a kezdeti időszakban pelyhes és krémszínű volt, míg 2 3 hét elteltével kezdetben a telepek fonákja, végül az egész izolátum sötétbarnára, majd feketére színeződött. 78

A 2010-es mintagyűjtés során a Ph. visci természetes előfordulása jóval gyakoribb volt a Dunántúlon, különösen azokon a helyeken, ahol a fehér fagyöngy erősebb fertőzöttségét tapasztaltuk. Igen jelentős számú mintát gyűjtöttünk a Dunántúli-középhegység, valamint a Nyugat-Dunántúl azon területeiről, ahol a fehér fagyöngy nagyobb egyedszámban volt jelen. Számos mintát gyűjtöttünk továbbá az Őrség területéről is, ahol Jandrasits (2011) is megfigyelt a Ph. visci jelenlétét. Érdekesség azonban, hogy a Dunántúli-dombság területén főként a fehér fagyönggyel közepesen fertőzött régiókban találkoztunk a Ph. visci fellépésével. A kórokozó jelen volt a tájegység erősen fertőzött területein is, ahol egyéb szabadföldi vizsgálataink során számos alkalommal figyeltük meg. Ezzel szemben a Kisalföldön nem találkoztunk jelentős Ph. visci fertőzéssel, melynek egyik magyarázata a fehér fagyöngy igen szórványos előfordulása lehet. Ami az ország fehér fagyönggyel kevésbé fertőzött régióit illeti (Északi-középhegység és Alföld), a Ph. visci előfordulása roppant ritka volt. Erősebb fertőzést tapasztaltunk a Gödöllői-dombságban, ahol a fehér fagyöngy is nagyobb egyedszámban fordul elő, valamint néhány esetben megfigyeltük a Felső-Tisza-vidékén is. Ezeken a területeken azonban a kórokozó előfordulása még olyan esetben is nagyon ritka volt, amikor a fehér fagyöngy tömegesen fordult elő. A Felső-Tisza-vidékén a fehér fagyöngy másik, szintén levélfoltosodást okozó kórokozójával (Plectophomella visci) (29. ábra) találkoztunk nagy tömegben. 29. ábra: Plectophomella visci tünetei fehér fagyöngyön 40-szeres nagyításban. (Fotó: Varga I.) 79

6.2.2 Molekuláris genetikai vizsgálatok A PCR-amplifikáció során egyetlen terméket szaporítottunk fel, mely valamennyi esetben közel azonos hosszúságú volt. A vizsgálatok során nem azonosítottunk paralóg lókuszokból származó alternatív ITS-kópiát, ami azt mutatja, hogy az izolátumok azonosítása domináns ortológ ribotípusokon alapult (30. ábra). 30. ábra: (A) A PCR-amplifikáció és elektroforézis eredménye az izolátumok (balról jobbra Phaeo1-8 minta) rdns-its-regiói, melyek egy ~560 bp hosszúságú tiszta fragmentet mutatnak. Két oldalt 100 bp-os marker (GeneRuler 100 bp DNA Ladder, Thermo Scientific, USA). (B) A Phaeo6 és Phaeo8 izolátumok elektroferogrammjának azon részlete, melyen egy példa T/A transzverziós mutáció látható az összerendezet 70. pozícióban. Az ITS-szekvenciák hossza 560-562bp volt, mely a Pheo9, 10 és 14 izolátumok esetében egy T addíciót, míg a Pheo13 izolátum esetében egy GT-addíciót tartalmazott az összerendezett 70-71. pozícióban. (A teljes összerendezés FASTA formátumban a Melléklet c. fejezetben található.) A további hossz polimorfizmusok a 81. pozícióban található C addíció (Phaeo1 izolátum) és (A)CT(G) bázisok beépülése volt a 88. pozícióban (Pheo4 izolátum). Az ITS4-primerrel végzett reverz (3 -) irányú szekvenálás megerősítette ezen inszerció-deléció alapú polimorfizmusok jelenlétét. A végső összerendezés 28 terminálisból és 621 karakterből állt, amelyből 552 karakter konstans, míg 53 karakter mutatott változatosságot, de csak 16 karakter volt parszimoniailag informatív. Az adatokból készült konszenzus fát a 31. ábra mutatja. 80

31. ábra: A 41.444 egyenlő parszimóniai fából (EPT) képzett szigorú konszenzus fa, mely az ITS adatok elemzése alapján készült (konzisztencia index (CI) = 0.925, retenciós index (RI) = 0.778). Az ágak fölötti számok bootstrap értékek, míg a felső indexek a Ph. visci izolátumok gyűjtés helyét mutatják ( + Németország, *Ukrajna és **Luxemburg). Az elemzéseink során a Ph. visci nem várt ITS-variabilitást mutatott és három haplotípust azonosítottunk. Phillips és mtsai (2008) korábbi tanulmányában közölt, különböző gyűjtési helyről származó izolátumainak szekvenciája teljes mértékben megegyezik, köztük nem mutatható ki polimorfizmus. Ezek az izolátumok 100%-os egyezést mutatnak az általunk vizsgált minták nagy többségével és a parszimóniai fán a legnagyobb csoportot alkotják (31. ábra). Ezen eredmények felhasználhatók a kórokozó diagnosztizálásában és pontos azonosításához is. 81

7. táblázat: A molekuláris vizsgálat során használt izolátumok és génbanki azonosítói. Faj Minta kód Gazdanövény Származási hely Ph. visci Pheo1-20 V. album Magyaro. Minden inszerció, deléció és egypontos nukleotid-polimorfizmus (SNP) az ITS1- régióból volt kimutatható. Egyetlen esetben sem találtunk olyan mutációt, amelyek az 5.8S-exonban, vagy az ITS2-régió szekvenciájában interkalálódtak volna, ami a további feltételezett kompenzáló pontmutációk hiányát mutatja. Ez azzal magyarázható, hogy az ITS1 régióban számos SNP akkumulálódik az ITS2- és 5.8S rdns-régióval szemben (Poczai és Hyvönen 2010). A korábbi tanulmányok nem mutattak ki polimorfizmust az egyes Ph. visci izolátumok között az ITS-régiót (Philips és mtsai 2008) vagy RAPD-technikát használva (Fischl és mtsai 2008, Cseh és mtsai 2008). Az általunk gyűjtött izolátumokon kívül vizsgált 4 további minta szekvenciái a GenBank-ból származtak, melyek a vizsgálataink alapján egyetlen nagy csoportba estek. Ezen izolátumok közül 2 db Ukrajnából (EU673326-27), 1-1 db pedig Németországból (EU673325) és Luxemburgból (EU673324) származott (7. táblázat). A nagy geográfiai távolság ellenére ezek a szekvenciák teljes mértékben azonosak voltak egymással. Mindez azt mutatja, hogy a genetikai diverzitás a populációk között feltételezhetően alacsony. Génbanki (NCBI) azonosító JQ291707- JQ291726 Ph. visci CBS186.97 V. album Németo. EU673325 Ph. visci CBS100163 V. album Luxembourg EU673324 Ph. visci CBS122526 V. album Ukrajna EU673326 Ph. visci CBS122527 V. album Ukrajna EU673327 Külcsoport Phaeobotryosphaeria citrigena Phaeobotryon mamane Botryosphaeria dothidea Diplodia cupressi Citrus sinensis Új-Zéland EU673328 Sophora chrysophylla Hawaii EU673331 Prunus sp. Svájc AY236949 Cupressus sempervierns Izrael DQ458893 82

A további elemzések során a mintavételezést érdemes lenne kiegészíteni a különböző gyűjtési helyekről származó nagyobb mintaszámmal, hogy a ritka és alacsony frekvenciával rendelkező haplotípusok (pl. a Pheo 1 és Pheo9-15), vagy allélek jelenléte a magyarországi populációkban kimutatható legyen. A Ph. visci ITS-régióra alapozott molekuláris azonosítása megbízhatónak tűnik, mert a szekvenciák hasonlósága ellenére számos parszimóniailag informatív helyet mutattunk ki, amelyek segíthetnek a haplotípusok elkülönítésében is. További tanulmányok során ez a régió feltételezhetően használható lesz az egyes populációk közötti nukleotid diverzitás és populációs struktúra elemzéséhez. A jelenlegi tanulmány egy, a Ph. visci nagyobb területre kiterjedő diverzitás vizsgálatának az első lépése volt, amely segíthet megérteni a kórokozó populációinak biológiáját is, ami a későbbiekben felhasználható lenne az esetleges mikoherbicid fejlesztésben is. Az a tény, hogy egy kisebb populáción belül a korábbi vizsgálatok ellenére polimorfizmust tudtunk kimutatni azt igazolja, hogy egy sokkal alaposabb egész Magyarországra kiterjedő mintavételezés esetlegesen további információval szolgálhat a gomba szaporodásáról és diverzitásáról is. 6.2.3 A Ph. visci antibiotikum érzékenysége A Ph. visci monospórás tenyészeteinek fenntartásához, vagy további törzsek izolálásához, esetleg egy, a tiszta tenyészeteken megjelenő fertőzések elleni különböző antibiotikumok alkalmazása nyújthat nagy segítséget. Mivel a Ph. visci antibiotikum érzékenységéről szakirodalmi adat nem állt rendelkezésünkre, feltétlenül szükségét éreztük néhány, igen gyakran alkalmazott antibiotikum vizsgálatát. A választott antibiotikumokat önállóan és kombinációban is vizsgáltuk burgonya-dextróz agaron fejlődő Ph. visci izolátumok esetében (32.ábra). 32. ábra: Különböző antibiotikumok hatásai a Ph. visci növekedésére: ampicillin 100 mg L -1 (A), kanamicin 30 mg L -1 (B), rifampicin 100 mg L -1 (C) és nisztatin 50 mg L -1 (E). (Fotó: Varga I.) 83

A marginális regressziós elemzés statisztikailag igazolta az antibiotikumok micélium növekedésére gyakorolt hatását (antibiotikum: F 4,165 = 18.32, p<0.001; nap: F 1,165 = 2724.42, p<0.001; antibiotikum nap: F 4,165 = 216.5, p<0.001 (33. ábra). Abban az esetben, ha rifampicin volt jelen a táptalajban, a micélium növekedésének intenzitása szignifikánsan csökkent (p<0.001), míg az ampicillin és a kanamicin nem csökkentette szignifikánsan a Ph. visci micéliumnövekedés intenzitását. Mindazonáltal a 8. napot követően a micélium növekedésenek intenzitása valamennyi esetben visszaesett, így a növekedés nem volt teljesen lineáris. Ezt a csökkenést a kontroll telepek esetén is megfigyeltük, vagyis nem az antibiotikumok okozták. Mindez nagy valószínőséggel a Petri-csésze méretére vezethető vissza, hiszen a telepnövekedés arányával a tápanyagmennyiség és az élettér is csökkent. 33. ábra: A micélum növekedés marginális regressziós modelljei különböző antibiotikumok jelenléte mellett (A), valamint a telepátmérők (B) átlagainak (CI 95%) alakulása a negyedik, nyolcadik és tizenkettedik napon. A marginális modellek egyenletei: telepátmérő (kontroll)= 0,52 + 0,95*nap; telepátmérő (ampicillin)= 0,51 + 0,87*nap, telepátmérő (kanamicin)= 0,51 + 0,88*nap; telepátmérő (rifampicin) = 0,504 + 0,48*nap; telepátmérő (nisztatin)= 0,5 (nincs növekedés). Az egyfaktoros varianciaelemzés már a 4. napon szignifikáns különbséget mutatott a telepátmérők tekintetében, mivel a rifampicin jelenléte nemcsak a micélium növekedésének intenzitását, de a telepátmérőket méretét is szignifikánsan csökkentette (F 4,20 = 270.81, p<0.001). Míg a kontroll telepek átmérője 4,5 cm (95% CI: 4,36 4,80) volt, addig a rifampicin jelenléte nyomán ez az érték csak 2,7 cm (95% CI: 2,52 2,96) volt. 84

A telepátmérők a további két mérési napon is kisebbek voltak a rifampicin jelenléte esetén, a 8. napon csak 4,1 cm (95% CI: 402 4.34), míg a 12. napon 4,4 cm-esek (95% CI: 4,33 4.63) voltak a telepek, vagyis a rifampicin közel 50%-kal csökkentette a Ph. visci telepeinek méretét (p<0.001). Bár sem a kanamicin, sem az ampicillin nem okozta a micélium növekedésének csökkenését a marginális modellezés alapján, azonban a 8. naptól az ampicillin jelenléte esetén szignifikánsan kisebb telepátmérőket mértünk (F 4,20 = 45.786, p<0.001). A telepátmérő ekkor 7,1 cm (95% CI: 6,94 7,26) volt, míg a kontroll telepek 7,5 cm (95% CI: 7,38 7,70) nagyságúak voltak. A 12. napon mért telepátmérők az ampicillin jelenléte esetén már csak 5%-os szignifikancia (p<0.005) esetén voltak kisebbek, átlagosan 8,7 cm-esek (95% CI: 8,61 8,91) voltak. Ekkorra a kontroll telepek már elérték a maximális 9 cm-es átmérőt és tovább már nem tudtak fejlődni, így elképzelhető, hogy nagyobb Petricsésze alkalmazása esetén 1%-os szignifikancia szint mellett lehetne szignifikáns különbséget kimutatni. A nisztatin alkalmazása esetén a vártnak megfelelően nem mértünk micélium fejlődést, ezért ezt az antibiotikumot a kombinációkban már nem vizsgáltuk. Az antibiotikum kombinációkban való alkalmazása esetében a marginális regressziós elemzés alapján szignifikánsan csökkent a micélium növekedésének intenzitása valamennyi olyan kombináció esetén, mely rifampicint tartalmazott (antibiotikumok: F 4,165 = 3124.2, p=0.28; nap: F 1,165 = 3694.3, p<0.001; antibiotikumok nap: F 4,165 = 120.90, p<0.001). Mindazonáltal nem volt szignifikáns különbség (p<0.001) az ampicillin és kanamicin kombinációjának jelenléte, valamint a kontroll telepek növekedésének intenzitása között (34. és 35. ábra). A 8. napot követően a micélium növekedésenek intenzitása valamennyi esetben visszaesett, így a növekedés nem volt teljesen lineáris. Ezt a csökkenést a kontroll telepek esetén is megfigyeltük, vagyis nem az antibiotikumok okozták, nagy valószínőséggel ebben az esetben is a Petri-csésze méretére vezethető vissza. 34. ábra: Ph. visci 12 napos telepei különböző antibiotikum koncentrációk mellett: ampicillin és kanamicin (A), rifampicin, kanamicin és ampicillin (B) rifampicin és kanamicin (C), ampicillin és rifampicin (D). (Fotó: Varga I.) 85

35. ábra: A micélum növekedés marginális regressziós modelljei különböző antibiotikum kombinációk (amp & kan, amp & kan & rif, amp & rif, kan & rif) jelenléte mellett (A), valamint a telepátmérők átlagainak (CI 95%) alakulása a negyedik, nyolcadik és tizenkettedik napon. A marginális modellek egyenletei: telepátmérő (kontroll)= 0.54+0.94*nap; telepátmérő (amp & kan) =0.55+0.9*nap, telepátmérő (amp & kan & rif)= 0.42+0.39*nap; telepátmérő (amp & rif) = 0.41+0.43*nap; telepátmérő (kan& rif)= 0.46+0.45*nap. A varianciaanalízis alapján a 10. napon mért telepátmérők (8. táblázat) valamennyi antibiotikum kombináció alkalmazása esetén szignifikánsan kisebbek voltak, mint a kontroll Ph. visci telepei (F 3,16 = 13.88, p<0.001). 8. táblázat: A Ph. visci telepátmérői BDA-n különböző antibiotikumok alkalmazása mellett. Antibiotikumok Telepátmérők (cm) átlagai a 10. napon. (95% CI) Kontroll (nincs antibiotikum) 8,34 (8,23 8,45) kanamicin 8,12 (8,01 8,23) ampicillin 7,88 (7,77 7,99) ampicillin & kanamicin 8,02 (7,918,13) rifampicin 4,42 (4,20 4,64) ampicillin & rifampicin 4,92 (4,72 5,16) kanamicin & rifampicin 4,88 (4,66 5,10) ampicillin & kanamicin & rifampicin 4,46 (4,24 4,67) nisztatin nincs növekedés 86

Nem találtunk szignifikáns különbséget az ampicillin és kanamicin kombináció és a csak ampicillint (p=0.54), vagy csak kanamicint (p=0.26) tartalmazó telepek nagyságai között. Abban az esetben sem volt szignifikáns különbség kimutatható, ha csak rifampicin, vagy rifampicin és kanamicin (p=0.04), rifampicin és ampicillin (p=0.02), valamint ampicillin, kanamicin és rifampicin (p=0.99) volt jelen a táptalajban. Bár az antibiotikumok és azok kombinációik okoztak bizonyos telepátmérő csökkenést, a kombinációk esetében negatív szinergenizmust nem figyeltünk meg. Az elvégzett vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a Ph. visci izolálásához és fenntartásához a kanamicin szabadon használható. Ez az aminoglükozid antibiotikum a 16S és a 30S rdns-alegységekhez való kapcsolódásával a transzlációt gátolja meg mind Grampozitív, mind Gram-negatív baktériumok esetében, a Ph. visci növekedésére azonban hatástalan. Hasonló eredményt ért el Palmer (1991), valamint Blodgett és mtsai (2003) is a szintén aminoglükozid antibiotikum családjába tartozó sztreptomicin alkalmazása esetén, mely hatástalan volt a Sphaeropsis sapinea (Fr.) Dyko & B Sutton faj növekedésére. Ezen megfigyelések és saját kísérleteink alapján megállapítható, hogy a Ph. visci esetében az aminoglükozid antibiotikumok a kórokozó izolálásához és tenyészetek fenntartásához szabadon felhasználhatóak. A Gram-pozitív és Gramm-negatív baktériumok ellen alkalmazható ampicillin, mely egy β-laktám antibiotikum, enyhén visszavetette ugyan a Ph. visci telepátmérőit, de negatív hatása nem volt jelentős. Ez a két antibiotikum akár kombinációban is használható, hiszen együttes alkalmazásuk sem gátolta jelentősen a micélium növekedését. A rifampicin alkalmazásakor jelentősen csökkentette a micélium növekedésének intenzitása, valamint a telepátmérők nagysága is közel 50%-kal esett vissza. Mindez azért is volt lehetséges, mivel a rifampicin egy olyan félszintetikus antibiotikum, ami megakadályozza a DNS-függő RNS-szintézist az RNS-polimeráz gátlásán keresztül. A rifampicin általában Gram-pozitív baktérium ellen, továbbá különböző Mycobacterium és Actinomyces fajok fellépése esetén is eredményesen használható, bár a Gramm-negatív Pseudomonas fajok rezisztensek erre az antibiotikumra (Kohanski és mtsai 2010). Bár a rifampicin erős növekedésgátló hatással bír a Ph. visci-re, használata erősen szennyezett minták, vagy törzsek esetén indokolt, hiszen a rifampicin igen hatékony és széles hatásspektrummal rendelkezik. A nisztatin a gombasejtek membránjainak ergoszterol bioszintézisét gátolja, pórusokat képez a membránokon, ami K + kiáramláshoz és végül sejthalálhoz vezet (Ghannoum és Rice 1999). Alkalmazása a Ph. visci esetében nem tanácsos. 87

6.2.4 Ph. visci növekedése szilárd és folyékony tápközegeken 6.2.4.1 Szilárd táptalajok A Ph. visci növekedését eddig csupán néhány természetes és mesterséges táptalajon (pl. Czapec-Dox agar, hagymakivonat és szilvakivonat agar, sárgarépa agar stb.) tanulmányozták (Stojanovič 1989, Varga 2009). Jelen vizsgálatunk célja az volt, hogy felmérjük a kórokozó növekedését V8-zöldséglé és zabkivonat agarokon is, hiszen ezeken a táptalajokon számos, köztük más Sphaeropsis fajok sikeres sporulációját érték el (Kim és mtsai 2005, Xiao 2006). Vizsgáltuk továbbá, hogy van-e különbség a Ph. visci micélium növekedésének intenzitásában 20 C és 25 C-on. Ennek oka az volt, hogy előtanulmányaink, illetve Fischl és mtsai (2009) eredménye alapján a kórokozó kevésbé sporulál magasabb hőmérsékleten, azonban a micélum növekedésének intenzitása nagyobb, így a későbbi spóraindukciós kísérletekben egy esetleges osztott hőmérsékleti kezelés lenne alkalmazható. Elsőként Ph. visci növekedését 20 C és 25 C-on mértük burgonya-dextróz agaron. A marginális regressziós elemzés nem mutatott különbséget a micélium növekedésének intenzitásában a különböző hőmérsékletek esetén (hőmérséklet: F 1,66 = 27.70, p<0.001; nap: F 1,66 = 916.94, p<0.001; hőmérséklet-nap: F 1,66 = 2.83, p=0.097) (36. ábra). Hasonlóan az antibiotikum növekedési kísérletekhez a 8. naptól a telepek növekedése lassult, mely valószínűleg a Petri-csésze méretére volt visszavezethető. 36. ábra: A micélium növekedésének marginális regressziós modellje (A) 20 C és 25 C-on. A különböző hőmérsékleten mért telepátmérők átlagai (CI 95%) a negyedik, nyolcadik és tizenkettedik napon (B). (Marginális modellek egyenletei: telepátmérő (20 C)= 0.41 + 0.64*nap,telepátmérő (25 C)= 1.05 + 0.81*nap). 88

Bár a marginális regresszió nem, de a varianciaanalízis eredménye alapján a 25 C-on fejlődő telepek átmérője valamennyi mérési napon szignifikánsan nagyobb volt, mint a 20 C-on fejlődő telepeké, melyek a 8. napon már közel 2 cm-mel volt nagyob (9. táblázat). Ez az eredmény egybevág Stojanovič (1989) megfigyelésével, valamint azt mutatja, hogy a spóraindukciós kísérletek során első lépésben a telepek gyors kezdeti növekedése érdekében érdemes magasabb hőmérsékleten inkubálni a Ph. visci izolátumait. A telepek gyors kialakulásához ezen a hőmérsékleten kb. 1 hét kell, ezután az inkubációs hőmérsékletet már csökkenteni lehet kb. 18 20 C-ra, majd a sporulációt előidéző kezeléseket megkezdeni. (Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit A sporuláció vizsgálata c. alfejezetben tárgyaljuk). 9. táblázat: A Ph. visci telepátmérői BDA-n különböző hőmérsékletek alkalmazása mellett. Nap F-érték Telepátmérők (cm) átlaga (95% CI) 20 C-on Telepátmérők (cm) átlaga (95% CI) 25 C-on 4. F 1,8 =76.528 3,0 (2,73 3,31) 4,6 (4,29 4,87) 8. F 1,8 =75.571 5,7 (5,43 6,13) 7,6 (7,27 7,97) 12. F 1,8 =110.68 7,9 (7,82 8,14) 9,0 (8,84 9,16) A Ph. visci szilárd táptalajon való növekedését ¼ BDA +V8-zöldséglé agaron, illetve zabkivonat agaron vizsgáltuk (37. ábra), mivel szakirodalmi adatok alapján mindkét táptalaj sikeres lehet a spóraindukció szempontjából. A kórokozó ezeken a táptalajokon való növekedését összevetettük a már általunk korábban tanulmányozott táptalajokkal (Varga 2009), hiszen a mikoherbicid fejlesztés kezdeti lépéseinek egyik legfontosabb fázisa a kórokozó fenntartásához szükséges megfelelő táptalaj megtalálása, melyen a további laboratóriumi vizsgálatokhoz szükséges nagy mennyiségű inokulum is könnyen előállítható (Masangkay és mtsai 2000). 37. ábra: Ph. visci változatos telepmorfológiája burgonya-dextróz agaron (A), ¼ BDA + V8-zöldséglé agaron (B) és zabkivonat agaron (C). (Fotó: Varga I.) 89

A Ph. visci telepmorfológiája ¼ BDA + V8-zöldséglé agaron és burgonya-dextróz agaron is hasonlóan alakult. A telepek leggyakrabban hullámos szélűek, erősen rozettásak és zónázottak voltak. A micélium kezdetben pelyhes, törtfehér színű, majd az inokulációs ponttól kezdődően idővel szürkére, végül feketére színeződik. Ezzel szemben a zabkivonat agaron fejlődő izolátumokon a rozettáltság nem volt megfigyelhető, bár a koncentrikus zónák így is jól kivehetőek voltak az ép szélű fehér telepeken (37. ábra). Ami a micélium növekedésének intenzitását illeti, a Ph. visci telepei a marginális regressziós elemzés alapján leggyorsabban zabkivonat agaron fejlődnek (táptalaj: F 8,234 = 172.79, p<0.001; táptalaj-nap: F 8,234 = 65.92, p<0.001; nap: F 1,234 =5935,336, p<0.001). A telepátmérők ezen a táptalajon a 8. napra elérték a 8 cm-t (38. ábra), majd a lineáris növekedés kissé lassult, végül a telep a 10. napra teljesen benőtte a Petri-csészét. 38. ábra: (A) Ph. visci növekedése különböző táptalajokon (ZA: zabkivont agar, BDA: burgonya-dextróz agar, RA: sárgarépa agar, V8A: ¼ BDA + V8-zöldséglé agar, MA: maláta agar, FgyA: fagyöngy agar, KLA: kukoricaliszt agar, M&SA: Murashige & Skoog agar, CzA: Czapec-Dox agar). (B) A növekedés marginális regressziós modellje. A marginális modellek egyenesei: ZA= 0,52+0,75*nap; BDA= -0,62+0,76*nap; RA= 0,26+0,66*nap; V8A= 0,27+0,63*nap; MA= -0,15+0,47*nap; Fgy= -0,08+0,47*nap; KL= 0,42+0,38*nap; MS= - 0,17+0,4*nap; CZ= -0,28+0,28*nap. 90

A marginális regressziós elemzés alapján a micélium növekedésének intenzitásában nem volt szignifikáns különbség zabkivonat agaron és burgonya-dextróz agaron (p=0.832), valamint a korábban vizsgált sárgarépa agaron sem (p=0.089). A növekedés igen kiváló volt ¼ BDA + V8-zöldséglé agaron is, itt csak 5%-os szignifikancia esetén volt kisebb a micélum növekedésének intenzitása a zabkivonat agaron mért növekedéshez képest (p=0.015). A többi táptalaj esetében a micélium növekedése valamennyi esetben szignifikánsan kisebb volt (p<0.001), illetve számos esetben a telepek is rosszul fejlettek voltak (Varga 2009). A varianciaelemzés (F 8,27 = 1415.9, p<0.001) hasonló eredményeket mutatott a 10. napon mért telepátmérők tekintetében (10. táblázat), hiszen a szignifikánsan legnagyobb telepátmérőt zabkivonat agaron mértük. A többi táptalaj esetében a telepátmérők minden esetben szignifikánsan kisebbek voltak a zabkivonanat agaron mértekéhez képest, így míg a marginális regresszió a micélium növekedésének intenzitásában nem mutatott különbséget burgonya-dextróz, V8-zöldséglé és sárgarépa agar esetében, addig a variancianalízis igen. 10. táblázat: Ph. visci telepátmérőinek átlaga (95% CI) a 10. napon különböző táptalajokon. Táptalaj Telepátmérők (cm) átlaga (95% CI) a 10. napon ZA (zabkivonat agar) 8,42 (8,31 8,53) BDA (burgonya-dextróz agar) 7,37 (7,26 7,48) RA (sárgarépa agar) 7,12 (7,01 7,23) V8A (¼ BDA + V8-zöldséglé agar) 6,35 (6,24 6,45) MA (maláta agar) 4,82 (4,71 4,93) KLA (kukoricaliszt agar) 4,20 (4,09 4,30) FgyA (fagyöngy agar) 4,00 (3,89-4,10) M&SA (Murashige & Skoog agar) 3,95 (3,84 4,05 CzA (Czapec-Dox agar) 2,45 (2,34 2,55) A varianciaanalízis alapján a burgonya-dextróz és sárgarépa agaron mért telepátmérők tekintetében nem volt szignifikáns különbség (p=0.051), addig a V8-zöldséglé agaron fejlődő telepek már szignifikánsan kisebbek voltak a fent említett mindkét táptalaj telepeihez képest (p<0,001). Összességében megállapítható, hogy a Ph. visci telepeinek fejlődése valamennyi vizsgált táptalajon megfigyelhető volt, azonban a micélium fejlődését nagyban befolyásolta a rendelkezésre álló táptalaj. 91

Az izolátumok fenntartására és tenyésztésére a burgonya-dextróz agar és a zabkivonat agar volt a legalkalmasabb. Eredményünk egybevág számos más Sphaeropsis (Botryosphaeriaceae, Ascomycota) fajon végzett korábbi tanulmánnyal, mely szerint a legintenzívebb növekedést ezeken a táptalajokon figyelték meg (Palmer és mtsai 1987, Palmer 1991, Kim és mtsai 2005, Xiao 2006). Bár Slippers és Wingfield (2007) a Botryosphaeriaceae család fajait viszonylag gyors növekedésűnek tartja, addig ezek a kórokozók számos más fajokhoz (pl. Macrophomina, Alternaria spp.) képest lassú növekedésűnek mondhatóak. Mindez sajnos nem kedvez a mikoherbicid fejlesztés szempontjából, hiszen a tenyészetek sterilitásának fenntartása érdekében egy gyorsabban növő gombafaj mindig szerencsésebb. Mindazonáltal a Ph. visci növekedése más Sphaeropsis fajhoz képest egyáltalán nem mondható lassúnak, mivel a Sphaeropsis pyriputrescens 20 25 C-on átlagosan napi 6-8 mm növekedést ért el zabkivonat agaron (Kim és mtsai 2005). Így a Sphaeropsis fajok tekintetében az általunk vizsgált fagyöngyparazita kórokozó igen jól teljesített, mivel mind burgonya-dextróz, mind zabkivonat agaron hasonló napi 7 9 mm-es fejlődést ért el. Az izolátumok jól fejlődtek továbbá sárgarépa agaron, mely egybevág Stojanovič (1989) korábbi méréseivel, aki mind burgonya-dextróz, mind sárgarépa agaron hasonló nagyságrendű telepátmérőkről számolt be Ph. visci esetében. Egyéb Sphaeropsis faj esetében a sárgarépa agar hatékonyságát eddig nem vizsgálták, jelenleg ezt a táptalajt leggyakrabban Phytophthora fajok fenntartására használják (Drasier és mtsai 1995). Bár a V8-zöldséglé agar tekintetében már jóval kisebb telepátmérőt mértünk, a Ph. visci növekedése ezen az agaron is hasonlóan alakult, mint Kim és mtsai (2005) megfigyelései alapján a Sphaeropsis pyriputrescens növekedése, hiszen mindkét faj napi 5 6 mm-t fejlődött ezen a táptalajon. Ezt az agart leginkább Drechslera fajok esetében alkalmazzák (Raymond és Bockus 1982, Raymond és mtsai 1985, Babadoost és Johnston 1998), bár számos egyéb faj sporulációját is vizsgálták már rajta (Masangkay és mtsai 2000). A kukoricaliszt agar tekintetében is azonos megfigyeléseket tettünk Kim és mtsai (2005) által közöltekkel, hiszen míg ezen a táptalajon a telepátmérők nagysága jóval nagyobb, addig a micélium színtelen, a telep egyenes szélű, a táptalajból alig kiemelkedő volt. Míg más Sphaeropsis (S. sapinea, S. tumefaciens) fajok fenntartására alkalmas a kukoricaliszt agar (Rodriguez és mtsai 1985, Swart és mtsai 1991), addig sem a Kim és mtsai (2005) által vizsgált Sphaeropsis pyriputrescens, sem az általunk vizsgált Ph. visci esetében nem használható. 92

A legkisebb telepátmérőt Czapec-Dox agaron mértük, ezen a táptalajon csak 1/3-a volt a 10. napon mért telepátmérő a zabkivonat agaron mérthez képest. Amíg a Ph. visci esetében az izolátumok fenntartására a Czapec-Dox agar nem alkalmas, addig más Sphaeropsis (S. sapinea, S. tumefaciens) fajok jól fejlődnek ezen a táptalajon (Swart és mtsai 1991, Kim és mtsai 2005). 6.2.4.2 Folyadék táptalajok Mivel a Ph. visci igen kiválóan fejlődött zabkivonat és burgonya-dextróz agarokon, ezért ezeken tovább vizsgáltuk a micélium növekedését immáron tápleves formában is. Az előtanulmányaink során azt vizsgáltuk, hogy 60 min -1 rázatás mellett képes-e a kórokozó fejlődni, vagy inkább a konstans kultúra kedvez majd a növekedésének. A 7 napos előtanulmány végére egyetlen rázatott lombikban sem indult meg a Ph. visci fejlődése, mely egybevág Prosser (1995) megállapításával, mely szerint a fonalas micéliumtelepet jól fejlesztő fajok kevésbé, vagy nem fejlődnek rázatott, vagy levegőztetett kultúrában (39. ábra). 39. ábra: Előtanulmányok burgonya-dextróz táplevesen: rázatás hatása (jobbra) a Ph. visci fejlődésére. (Fotó: Varga I.) A konstans kultúrában a telepek a tápleves felszínén úszva jól fejlettek voltak. A telepek kompaktak és homogén törtfehér színűek, fonákjukról számos pelyhes micélium mélyen a táplevesbe nyúlott, azonban a telepek nem estek szét. 93

Az előtanulmányokat követően zabkivonat és burgonya-dextróz táplevesen vizsgáltuk a Ph. visci fejlődését. A hetente mért nedves és száraz tömegek átlagait a 11. táblázat mutatja. 11. táblázat: A Ph. visci átlagos nedves és száraz tömege. Tömeg (g) Táplevesek 7. nap 14. nap 21. nap Nedves tömeg Burgonya-dextróz (BDF) 4,41 g 8,16 g 9,63 g Zabkivonat (ZF) 7,26 g 16,33g 18,47 g Száraz tömeg Burgonya-dextróz (BDF) 0,42 g 1,01 g 1,22 g Zabkivonat (ZF) 0,39 g 0,87 g 1,09 g A varianciaanalízis alapján Ph. visci telepeinek nedves tömegei zabkivonat táplevesen szignifikánsan nagyobbak voltak (F 1,46 =30.91, p<0.001), mint burgonya-dextróz táplevesen. A különböző folyadékokon fejlődő telepek száraz tömegei tekintetében szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk (F 1,46 =1.0559, p=0.309). A 21. napon az átlagos nedves tömeg burgonya-dextróz táplevesen 9,63 g (95% CI: 8,45 10,84) míg zabkivonat táplevesen 18,47 g (95% CI: 17,25 19,69) volt (11. táblázat és 40. ábra). 40. ábra: A Ph. visci átlagos (CI 95%) nedves és száraz tömege burgonya-dextróz (BDF) és zabkivonat (ZF) tápleveseken. A tápleveseken fejlődő telepátmérők kevésbé alakultak változatosan, mivel a Ph. visci micéliuma már az első mérési napon (7. nap) majdnem teljesen benőtte a táplevesek felszínét, majd növekedése a 14. naptól jelentősen lelassult (12. táblázat és 40. ábra). 94