A martonvásári agrárkutatások hatodik évtizede SZÁRAZSÁGTŰRÉSI VIZSGÁLATOK GABONAFÉLÉKEN BÁLINT ANDRÁS FERENC 1, SZIRA FRUZSINA 1, GALIBA GÁBOR 1, JÄGER KATALIN 2, FÁBIÁN ATTILA 2 ÉS BARNABÁS BEÁTA 2 1 Genetika és Növényélettan Osztály, 2 Növényi Sejtbiológia Osztály Bevezetés Napjaink egyik legnagyobb kihívása olyan mezőgazdasági növények nemesítése, melyek az abiotikus stresszek szárazság, magas és alacsony hőmérséklet, UV sugárzás károsító hatását jobban elviselik. A szárazság az egyik legnagyobb károkat okozó abiotikus stresszfaktor, mely évről-évre komoly termésveszteségeket okoz termesztett növényeinknél. Szárazságtűrő fajták nemesítése így kiemelkedően fontos, azonban a jelleg komplexitása miatt nehéz feladat. A Genetika és Növényélettan Osztályon már a 90-es években is végeztünk ozmotikus stressz- és szárazságtűréssel kapcsolatos kísérleteket, melyek célja elsősorban a toleranciában szerepet játszó élettani paraméterek azonosítása volt. Az ezredforduló után a kísérletek célja azon lókuszok azonosítása lett, melyek mind az ozmotikus, mind a szárazságstressz elleni toleranciában szerepet játszanak. A kenyérbúza közeli rokona a diploid árpa (Hordeum vulgare L.), mely nem csak gazdaságilag jelentős haszonnövény, de egyszerű genomszerkezete miatt modellnövényként is használható a genetikai vizsgálatoknál. Az árpán kapott eredmények a közeli rokonság miatt átvihetők búzára is, ezért genetikai vizsgálataink elkezdéséhez az árpát választottuk. A utóbbi évtizedekben a Kárpát-medence klimatikus viszonyait egyre inkább jellemzi, hogy a gabonafélék termésfejlődésének és érésének időszakában a csapadékhiányhoz magas hőmérséklet társul. Míg a növények szárazságstresszre adott válasza széles körűen kutatott terület, addig a kombinált szárazság- és hőstressz búza generatív fejlődésére gyakorolt hatásáról kevés számú irodalmi adattal rendelkezünk. A Növényi Sejtbiológia Osztályon 2005- től vizsgáljuk az őszi búza (Triticum aestivum L.) egyedfejlődésének generatív szakaszában fellépő vízmegvonás, valamint a szimultán vízmegvonás és a magas hőmérséklet ivarsejtek kialakulására és szemtermés fejlődésére gyakorolt hatását. Mivel a generatív fejlődési fázisban levő növények együttes stressz hatására bekövetkező terméscsökkenése rendkívül összetett folyamatok eredménye, ezek mélyreható feltárásához szükséges a struktúra (sejt- és szöveti szerkezet) és a funkció (anyagcsere- és génexpressziós változások) összekapcsolása. 43
BÁLINT A. F. és mtsai A különböző egyedfejlődési fázisokban elvégzett ozmotikus stressz- és szárazságtűrési kísérletek összehasonlítása Összehasonlító vizsgálatainkhoz 7 árpa genotípust vizsgáltunk meg három egyedfejlődési fázisban (csíranövény, fiatal növény és felnőtt korban) vízkultúrás és talajos kísérleti rendszerben. Csíranövény tesztben vizsgáltuk a vonalak PEG kezelés hatására bekövetkező hajtás- és gyökérhossz csökkenését. Fiatal növény tesztben, vízkultúrás kísérleti rendszerben tanulmányoztuk a genotípusok ozmotikus stressz hatására bekövetkező biomassza csökkenését. A virágzás alatt bekövetkezett vízelvonás hatását a termésparaméterekre talajos rendszerben vizsgáltuk. A kísérletek eredményei megmutatták, hogy a csíra- és fiatalnövény-korban kapott eredmények nem minden genotípus esetében vágnak egybe a felnőttkori tesztek eredményével. Mindebből következik, hogy az ozmotikus- és szárazságstressz tűrés fejlődési fázis specifikus jelleg, ezért a stressztoleranciát befolyásoló lókuszok azonosításához a vizsgálatokat minden egyedfejlődési fázisban el kell végezni. Szántóföldi tesztelés kontrollált körülmények között: esősátor automata öntözési rendszerrel és talajnedvesség méréssel 2005-ös évben kezdtük el egy olyan tesztelési rendszer tervezését, mely nagyszámú genotípus térképezési populációk szárazságtűrésének tesztelését teszi lehetővé a szántóföldihez hasonló körülmények között úgy, hogy közben a változó időjárás hatását minimalizálni tudjuk. 2006-ban kezdődtek a kivitelezési munkák az MTA Mezőgazdasági Kutatóintézetének területén, az építési munkák 2007 tavaszán fejeződtek be. A rendszer alapja egy fémvázas fóliasátor, melyet egy esőérzékelővel vezérelt elektromotor mozgat a kísérleti terület fölé. A kísérleti terület a fólia alatt 6 parcellát tartalmaz, melyek között a vízmozgást vízzáró fóliák akadályozzák meg. A parcellák öntözését a talajfelszínre helyezett csepegtető öntözési rendszer biztosítja, melyet egy számítógép vezérel. Az öntözőkomputerrel az öntözés ideje és hossza pontosan szabályozható. Az öntözővíz mennyiségét parcellánként vízórák mérik, illetve a talajba jutatott víz mennyiségét talajnedvesség-mérő szenzorokkal is meg tudjuk határozni. Három parcellán optimális, három parcellán pedig csökkentett vízellátottságon neveljük a növényeket. Az esősátor mellett 3 további parcella található, melyek külső szántóföldi kontrollként szerepelnek. Ebben a rendszerben 240 genotípust tudunk évről-évre 3 vízellátottságon, 3 párhuzamos ismétléssel tesztelni. Az árpa ozmotikus stressz- és szárazságtűrését befolyásoló lókuszok azonosítása három egyedfejlődési fázisban Előkísérletek alapján választottuk ki vizsgálatainkhoz az Oregon Wolfe Barley (OWB) árpa térképezési populációt, melynek vonalait csíra-, fiatalnövény- és felnőttkorban is megvizsgáltuk. 44
Szárazságtűrési vizsgálatok 1H 2H 3H 4H 5H 6H 7H 61.05 SD 2.3 SLC, SDWC, RLT, SLT, SDWT, RWCC, TGWT,PHT LOD=2.6, R 88.25 SD 0.07 SDWC, QSLT, SDWT, SLT, FLT, TGWC, TGWT, PHT, GYC, LOD=2.9, D SLT, RLT, SDWT 69.4 SD 0.71 LOD=2.7, D 76.75 SD 0.64 82.6 SD 0.14 SLC, SLT, SDWT LOD=2.35, R LOD=3.2, R/D 133.0 cm 163.0 SD 3.80 SLT LOD=2.5, R 130.5 cm 143.0 cm 150.4 cm SLC, SLT, RLC, SDWC, SDWT, FLT, TGWC, TGWT, OP, GYC 174.5 cm 210.3 cm 222.3 cm 1. ábra. Az Oregon Wolfe Barley populáció segítségével azonosított ozmotikus stresszt és szárazságtűrést befolyásoló lókuszok. Az egyes lókuszok által befolyásolt tulajdonságok rövidítései a lókusz mellett baloldalt vannak feltüntetve. A LOD értékként a legnagyobb LOD értéket adtuk meg. D (DOM) és R (REC) jelzi, hogy mely szülőtől származik a nagyobb fenotípusos értéket adó allél. Rövidítések: SLC: kontroll hajtáshossz, SLT: kezelt hajtáshossz, SDWC: kontroll hajtás száraztömeg, SDWT: kezelt hajtás száraztömeg, RLC: kontroll gyökérhossz, RLT: kezelt gyökérhossz, RWCC: kontroll relatív víztartalom, TGWC: kontroll ezerszemtömeg, TGWT: kezelt ezerszemtömeg, PHT: kezelt növénymagasság, FLT: virágzási idő, OP: ozmotikus potenciál, GYC: kontroll termés. Eredményeink alapján (1. ábra) egyértelmű, hogy a szárazságtűrésre nagy hatást önmagában egy lókusz sem gyakorol (LOD értékek: 2-3 között, fenotípusos varianciára gyakorolt hatás: 15-30 %), ezért megfelelő mértékű toleranciához több allél megfelelő kombinációjú jelenléte szükséges. Mivel kíváncsiak voltunk arra, hogy az OWB populáció DH vonalaiban azonosított QTL-ek más árpa genetikai háttérben is működnek-e, ezért a 7H kromoszómán azonosított génhez kapcsolt markerrel genotipizáltuk az árpa fajtagyűjteményből véletlenszerűen kiválasztott 40 tavaszi árpa genotípust, amelyeknél két alléltípust sikerült azonosítanunk. Ezeknek a vonalaknak az ozmotikus stressztűrését megvizsgálva megállapítottuk, hogy szignifikáns kapcsolat van az alléltípusok előfordulása és a fiatalkori ozmotikus stressztűrés között. Mindez arra utal, hogy a nagy sűrűségű EST alapú térképekkel azonosított szárazságtűréshez kapcsolt markerek, toleráns genotípusok marker alapú szelekciójára felhasználhatók. 45
46 BÁLINT A. F. és mtsai A vízmegvonás és magas hőmérséklet hatása az őszi búza ivaros folyamataira A szárazságstresszt és a kombinált szárazság és hőstresszt, eltérő szárazságtoleranciájú genotípusokon, kontrollált körülmények között, fitotroni klímakamrákban szimuláltuk, a generatív fejlődés legkorábbi fázisában a meiózis idején, a megporzás után 1-5 napig, és a szemfejlődés 5-9. napja között. A meiózis idején alkalmazott stresszek hatására szignifikánsan csökkent a fertilitás, az ezerszemtömeg és a kalászonkénti szemtömeg mindkét genotípusnál. A pollen megtermékenyítő képességének csökkenésében (23-35%) nem volt szignifikáns különbség a szárazság toleráns Plainsman V és a szárazságra érzékeny Cappelle Desprez fajta között. A Plainsman V kalászok felső harmadainak portokjaiban a mikrosporogenezis korai fázisaiban megrekedt pollenszemek voltak megfigyelhetők a virágzás idején. Az érzékeny fajtánál ezt a kedvezőtlen jelenséget a mikrosporogenezis érintettségéből eredő abnormis pollenformák megjelenése is kísérte. Szövettani vizsgálataink igazolták, hogy a megporzást követő 1-5. nap között fellépő stressz hatására mindkét genotípusnál jelentősen felgyorsult a szemtermések fejlődése a 14. napig. A Plainsman V szignifikánsan jobban tolerálta a két stressztípust, mint az érzékeny fajta, melynél a szárazságstressz 65%-kal, a kombinált stressz 83%-kal csökkentette a kalászonkénti szemtömeget. A terméscsökkenés oka a kalászok felső harmadában bekövetkezett terméselhalás, az endospermium csökkent mértékű sejtesedése, és a vegetatív szervek sérülése miatti tápanyagtranszport csökkenés, illetve elmaradás volt. A szárazságstressz a szemfejlődés 5-9. napja között alkalmazva okozta a legnagyobb mértékű terméskiesést (71-77%), mely elsősorban az ezerszemtömeg drasztikus csökkenéséből eredt. A korábbi kezeléseknél megfigyeltekhez hasonlóan a Cappelle Desprez fajta ebben a fejlődési fázisban is érzékenyebben reagált a kombinált stresszre. A szemtermés fejlődésének 14. napján a kontrollal (2A-D ábra) összehasonlítva az embrió előrehaladott fejlődését (2E ábra), az embrió és a raktározó szövet határán képződő ún. összeroppant sejtréteg kialakulását (2F ábra), az aleuron réteg differenciálódását (2G ábra) és az endospermium nagy mennyiségű A-típusú keményítőszemcse felhalmozását (2H ábra) mutatták ki szövettani vizsgálataink. Mivel a B-típusú keményítőszemcsék a kezelt 14 napos szemtermésekben csupán ritka kivétellel és igen kis számban voltak megfigyelhetők, ezért feltételezzük, hogy azok a fejlődés későbbi időszakában jelennek meg. Ennek igazolására pásztázó elektronmikroszkóp segítségével vizsgáltuk az érett légszáraz szemtermések endospermiumát, de feltételezésünk nem igazolódott be. A felgyorsult fejlődés a tápanyagraktárak kimerülése folytán nem folytatódott a termésérés befejeztéig (3A-H ábra). Míg az érett kontroll szemterméseinek endospermium sejtjeiben nagy számú B-típusú keményítő szemcse volt megfigyelhető (3E és F ábra), addig a kezelt Cappelle Desprez-nél nem (3G ábra), a kezelt Plainsman V szemtermésekben pedig elvétve
Szárazságtűrési vizsgálatok (egyedülállóan vagy kisebb csoportokban) fordult B-típusú keményítő szemcse elő (3H ábra). Az eredményekből kitűnik, hogy a kísérletbe bevont genotípusok a vizsgált fejlődési fázisok közül a korai szemfejlődés 5-9. napja között voltak a leginkább érzékenyek az alkalmazott stresszekre. A két fajtát összehasonlítva megállapítottuk, hogy a Plainsman V fajta nem csupán a szárazságstresszel, hanem a kombinált szárazság és hőstresszel szemben is nagyobb toleranciát mutatott. Megfigyeléseinket igazolták az SZBK Növénybiológiai Intézetével közösen végzett vizsgálatok is, melyek az embrió- és endospermium-specifikus gének expressziójának jelentős megnövekedést mutatták ki a kezelt szemtermésekben. 2. ábra A kontroll (A-D), valamint a termésfejlődés 5-9. napja között együttes hő- és szárazságstressznek kitett (E-H) Cappelle Desprez embriók (A, E), az embrió és endospermium határán kialakuló összeroppant sejtrétegek (B, F), az aleuront határoló anyai sejtrétegek (C, G) és a fejlődő endospermiumok (D, H) fénymikroszkópos felvételei a megporzást követő 14. napon. 3. ábra Légszáraz, megfelezett kontroll (A, B) és a termésfejlődés 5-9. napja között együttes hő- és szárazságstressznek kitett (C, D) Cappelle Desprez (A, C) és Plainsman V (B, D) szemtermések, továbbá az A és B típusú keményítőszemcsék megoszlása ugyanezen genotípusok kontroll (E, F) és kezelt (G, H) szemterméseinek endospermiumában. 47
BÁLINT A. F. és mtsai Köszönetnyilvánítás Munkánkat a MÖB-DAAD 2005-2006, a GVOP-3.11-2004-05-0441/3.0, az NKFP OM 0018, az OTKA K67987, a Német-Magyar Plant Resource Phase I Nap-Bio, és az AGRISAFE 203288 sz. EU-FP7-REGPOT 2007-1 pályázatok támogatták. Megjelent publikációk Bálint, A. F., Szira, F., Börner, A., Galiba, G. (2008): Segregation- and association based mapping of loci influencing osmotic tolerance in barley. Acta Biologica Szegediensis, 52, 101-102. Bálint, A. F., Vágújfalvi, A., Szira, F., Börner, A., Cattivelli, L., Dubcovsky, J., Galiba, G. (2008): QTLs and genes for abiotic stress tolerance in cereals: their general role in the environmental adaptation and their developmental-stage specificity.. In: Cereal Science and Technology for Feeding 10 Billion People: Genomics Era and Beyond. 13-17 November 2006. Lleida, Spain. Eds. J.L. Molina Cano et al. Options Médediterranéennes, 197-200. Barnabás, B., Jäger, K., Fehér A. (2008): The effect of drought and heat stress on reproductive processes in cereals. Plant Cell & Environment, 31, 11-38. Fábián, A., Jäger, K., Barnabás, B. (2008): Effects of drought and combined drought and heat stress on germination ability and seminal root growth of wheat (Triticum aestivum L.) seedlings. Acta Biologica Szegediensis, 52, 157-159. Jäger, K., Fábián, A., Barnabás, B. (2008): Effect of water deficit and elevated temperature on pollen development of drought sensitive and tolerant winter wheat (Triticum aestivum L.) genotypes. Acta Biologica Szegediensis, 52, 67-71. Kerepesi, I., Galiba, G., Bányai, É. (1998): Osmotic and salt stresses induced differential alteration in water-soluble carbohydrate content in wheat seedlings. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, 5347-5354. Nagy Z., Galiba G. (1995): Drought and salt tolerance are not necessarily linked: a study on wheat varieties differing in drought tolerance under consecutive water and salinity stresses. Journal of Plant Physiology, 145, 168-174. Neumann, K., Weidner, A., Balint, A. F., Varshney, R. K., Börner, A. (2008): Detecting loci for abiotic stress tolerance via segregation- and association-based mapping in barley. European Wheat Aneuploid Co-operative Newsletter, 60-64. Szira, F., Bálint, A., Galiba, G., Varsnhey, R. K., Börner, A. (2006): Mapping of QTLs for drought tolerance in barley at different developmental stages. Vorträge für Pflanzenzüchtung, 70, 113-115. Szira, F., Bálint, A. F., Börner, A., Galiba, G. (2008): Evaluation of drought-related traits and screening methods at different developmental stages in spring barley. Journal of Agronomy and Crop Science, 194, 334-342. 48