Ács András DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Pannon Egyetem Vegyészmérnöki tudományok és Anyagtudományok Doktori Iskola Témavezetők: Felpécziné Dr. Farkas Anna, tudományos főmunkatárs, MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet és Dr. Kováts Nóra, egyetemi docens, Pannon Egyetem, Limnológia Intézeti tanszék Pannon Egyetem VESZPRÉM, 2010
Bevezetés Alternatív ökotoxikológiai tesztek környezetszennyező komponensek detektálására Ács András A doktori (PhD) értekezés tézisei A xenobiotikumok és toxikus vegyi anyagok toxikológiai vizsgálatát törvény szabályozza, az ember és a környezet biztonságának érdekében. Ezek a vizsgálatok nagyszámú tesztszervezet alkalmazásán, és számos esetben vitatható feltételezések használatával extrapolálhatók az emberre, vagy a környezetre, mint hatásviselőre. A megfelelő humán- és környezet-egészségügyi védelem érdekében, elengedhetetlen annak meghatározása, hogy normál alkalmazás esetén a vizsgált anyag milyen toxikus potenciállal rendelkezik. Az expozíciós utak figyelembevételével felmérhető a különböző vegyi anyagok jelentette kockázat, ezért a toxikológiai vizsgálatok fontos szerepet játszanak a vegybiztonság eszköztárában. A kockázatbecslésre alkalmazott eljárások túlnyomó többsége jelenleg állati tesztszervezetekre épül. A konvencionális ökotoxikológiai módszerek többnyire szabványok által meghatározott módon kerülnek alkalmazásra. A legelterjedtebben az OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development), ISO (International Organisation for Standardisation), valamint az ASTM (American Standards for Testing Materials) által kiadott szabványokat alkalmazzák a laboratóriumok. A standardizált módszerek előnye, hogy a megfelelően definiált eljárásoknak köszönhetően a laboratóriumok által kapott eredmények jól összehasonlíthatóak. Hátrányuk, hogy az újabb eljárások és tesztszervezetek szabványosítása időigényes folyamat, így a korszerűbb módszerek csak kisebb-nagyobb időbeli csúszással jelenhetnek meg. A standardizált tesztek általában egyfajú tesztek, melyek végpontként mortalitást, vagy más életképességhez szorosan kötődő jellemzőt alkalmaznak az akut toxikus hatások meghatározása érdekében. Ez a jellemző általában a mortalitás (immobilitás), vagy növekedés-gátlás. Az ökotoxikológiai új irányvonala szerint olyan szubletális végpontok alkalmazása kívánatos, melyek a toxikus komponensek hatásmechanizmusáról is információkat szolgáltatnak. A szakirodalom számos esetben számol be veszélyes anyagok biológiai jellemzéséről. Elterjedten alkalmazott szubletális végpontok a viselkedéstani és fiziológiai jellemzők, mint például a motilitás, légzés-aktivitás, reprodukciós ráta, vagy a táplálkozási-aktivitás. A biokémiai markerek változását vizsgáló eljárások hasonlóan kiterjedten vizsgált csoportja a szubletális végpontot alkalmazó tesztmódszereknek, melyek során egy kémiai stresszor hatására kialakuló változások követhetőek nyomon az élő szervezeten belül. Ezenfelül, élő sejtvonalakra kidolgozott eljárások során in vitro körülmények között modellezhetőek az élőlényekben indukált toxikus folyamatokat és ezek hatásmechanizmusa. Doktori értekezésem témája az alternatív ökotoxikológiai tesztek környezetszennyező komponensek detektálására való alkalmazhatóságának vizsgálata. Céljaim a következőképp foglalhatóak össze: Új alternatív ökotoxikólógiai tesztek kifejlesztése, melyek megfelelő érzékenységgel és alkalmazhatósággal rendelkeznek ahhoz, hogy gyors és objektív környezeti kockázatbecslést tegyenek lehetővé potenciális környezetszennyezőkkel szemben. Az általam kifejlesztett módszerek kalibrálása az ökotoxikológiában általánosan elterjedt kalibráló/validáló vegyület, a kálium-dikromát révén. A kalibrált Daphnia magna táplálkozás aktivitás-gátlás teszt érzékenységének és hatékonyságának összevetése a konvencionális, mortalitási/immobilitási tesztmódszerrel.
Erre a célra a xenobiotikumok egy speciális csoportját, a vízi környezetre veszélyt jelentő cianobakteriális metabolit komplexet választottam. A cianobaktérium mátrixban található bioaktív anyagok toxicitásának jellemzése biokémiai marker vizsgálatok alapján in vivo- kísérletekben az Artemia salina sórákon és a Dikerogammarus villosus amphipoda rákon. A cianobaktériális kivonatokban megtalálható metabolitok minőségi és mennyiségi vizsgálata folyadék-kromatográfia és tömegspektrometria útján, valamint az analitikai adatok összehasonlítása az ökotoxikológiai tesztek eredményeivel. Anyag és módszer A konvencionális tesztek alkalmazása ISO, OECD és Magyar szabványokban leírt protokolloknak megfelelően történt: Daphnia magna immobilitás teszt: MSZ EN ISO 6341:1998; Thamnocephalus platyurus immobilitás teszt: MSZ 20359:2003; Lemna minor növekedési inhibíció teszt: OECD Test No. 221 (2006), Vibrio fischeri biolumineszcencia-gátlás vizsgálat: ISO 11348-1-2-3:2007; Artemia salina immobilitás teszt: ArToxKit standard protokoll alapján (MicroBioTests, Belgium). A biokémiai marker vizsgálatok (tejsav dehidrogenáz aktivitás, glutation S-transzferáz aktivitás, acetilkolinészteráz aktivitás) standard protokolloknak megfelelően történtek, a cianobakteriális nyers kivonatok toxikus hatásmechanizmusainak meghatározása érdekében. Az alkalmazott cianobaktérium törzsek által termelt másodlagos metabolitok analitikai elemzése LC-ESI- MS technika alkalmazásával történt. A metabolitok azonosítása retenciós idő, molekulatömeg, UV tulajdonságok és MS fragmentációs mintázat alapján történt. Tézispontok 1. Új eljárást fejlesztettem ki xenobiotikumok környezeti kockázatbecslésére, amellyel az anyaghatást a Daphnia magna táplálkozás aktivitásában bekövetkezett gátlás alapján minősíthető. A teszt a szubletális anyaghatások becslésére alkalmas, és egy viselkedés-élettani végpont mérésén alapul. Az új módszer előnye az emberi szubjektivitásból adódó tévedés lehetőségének kiküszöbölése, ezen felül a táplálkozás aktivitás gátlása ökológiai szempontból sokkal relevánsabb és specifikusabb végpontot jelent. 2. Szoftveres képelemzési módszert fejlesztettem ki a hitelesített Lemna minor növekedés-gátlás teszt adatainak kiértékelésére, amely kiküszöböli az emberi szubjektivitásból adódó növényi fejlődés változások becslésének bizonytalanságát. Az új eljárás kalibrációja során káliumbikromáttal számottevően kisebb szórást találtunk a párhuzamos vizsgálatok adatai között. 3. Az alkalmazott ökotoxicitási tesztek a cianobakteriális toxicitás környezeti kockázatának becslése során, a legnagyobb toxicitást a cilindrospermopszint termelő C. raciborskii (AQS) törzsre jelezte. A balatoni C. raciborskii, valamint az anatoxinokat termelő Oscillatoria sp. (PCC 6506) törzseknél minden teszt számottevően kisebb különbségeket jelzett a toxicitás mértékében. Valamennyi teszt azonos trendet mutatott a cianobaktérium törzsek toxicitásának mértékében. 4. Számottevő különbségek az ökotoxicitási vizsgálatok során a metodikák gyakorlati kivitelezésében jelentkeztek, így a legnagyobb hatékonyság a Vibrio fisheri és Daphnia magna táplálkozás-aktivitás tesztre jellemző, a rövid kivitelezési idő, ill., nagyobb pontosság miatt. A legérzékenyebb eljárásnak a Thamnocephalus platyurus teszt bionyult. Az Artemia salina és a Daphnia magna immobilitás teszt érzékenysége a Vibrio fisheri módszerével közel azonos, az
elemzés lényegesen hosszabb időtartama miatt azonban, ha csak az általános toxikus hatásbecslés a cél, az immobilizációs tesztek kevésbé előnyösek. 5. Kifejlesztettem egy teszteljárást, amelyben az Artemia salina akut toxicitási teszt során párhuzamosan meghatározható mind a toxikus anyagok letalitási mutatója (LC 50), egyben az expozíciót túlélő naupliák, biokémiai enzimatikus marker vizsgálatokba vonhatók. Az expozíciót túlélő sórák naupliák egyszerű szűréssel és mosással elkülöníthetők és a biokémiai vizsgálatokig fagyasztva tárolhatók. 6. A sórák naupliák GST aktivitásának változásai hűen tükrözték az AQS C. raciborskii vizes kivonatában a cilindrospermopszin jelenlétét, melynek toxicitása proteinszintézis gátlásban nyilvánul meg. Az exponált sórák naupliákban észlelt változó mértékű LDH aktivitás növekedés mértéke szoros pozitív korrelációt mutatott a nyers cianobaktérium kivonatok általános toxicitási mutatójával. Az acetilkolineszteráz enzimaktivitásban észlelt változások, néhány cianobaktérium kivonat esetében antikolineszteráz tulajdonsággal rendelkező metabolitok szintézisét jelzi. 7. A Dikerogammarus villosus amphipoda rákokkal végzett akut vizsgálatok legjelentősebb eredménye az, hogy a természetben is gyakran előforduló tömegprodukció, még az egzotikus AQS C. raciborskii (cilindrospermopszin termelő) ill. PCC 6506 Oscillatoria sp. (anatoxinokat termelő) fajok sem jelentenek számottevő környezeti kockázatot a vízi ökoszisztéma élőlény együtteseire. 8. A mortalitási tesztek kiválthatóak szubletális végpontú eljárások által. A mellett, hogy utóbbiak érzékenyebbnek, pontosabbnak bizonyultak, ökológiai relevanciájuk alapján megfelelőbben extrapolálhatók az ökoszisztémára nézve. További fontos előnyük, hogy a megfelelően kiválasztott módszereket egymással kombinálva fontos többletinformációkat nyerhetünk a bioaktív anyagok hatásmechanizmusát illetően. 9. A cianobaktérium minták analitikai elemzése az AQS törzs cilindrospermopszin termelését mutatta ki nagy mennyiségben (12,7 mg/g). A PCC 6506 mintánál mindkét anatoxin homológ termelése igazolódott, az irodalomban leírt mennyiségi különbségekkel egyezően (anatoxin-a: 124 μg/g; homoanatoxin-a: 3,2 mg/g). A balatoni alga liofilizátumok analitikai elemzése alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a törzsek a közismert cianotoxinokat nem termelik. A disszertáció anyagából megjelent közlemények Kováts, N., Ács, A., Kovács, T., Vasas, G., Hiripi, L., Paulovits, G. (2007). Screening potential of Vibrio fischeri bioluminescence-inhibition bioassay for assessing cyanobacterial toxicity. Central European Journal of Occupational and Environmental Medicine, 13(3-4):335-344 Kovács, T., Ács, A., Kováts, N., Paulovits, G. (2007). Daphnia pulex táplálkozási aktivitásának gátlása cianobakteriális toxicitás hatására. Hidrológiai Közlöny, 87. évf. 4. szám, pp. 25-28 Ács, A., Kováts, N., Refaey, M. (2009). Novel Daphnia test for detecting chemical pollution. Exposure and risk assesment of chemical pollution-contemporary methodology. L. Simeonov and M. Hassanien (eds.), Exposure and Risk Assessment of Chemical Pollution Contemporary Methodology. Springer Science+Business Media B.V. pp. 439-444. ISBN 978-90-481-2333-9. Vehovszky, Á., Ács, A., W. Kovacs, A., Szabó, H., Gyori, J., Farkas, A., (2009). Isolated strains of Cylindrospermopsis raciborskii from Lake Balaton (Hungary) produce anatoxin-a like neurotoxins,
Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology, Volume 153, Issue 2, Supplement 1, June 2009, Page S88, IF:1,709 Vehovszky Á., Szabó H., Ács, A., Győri, J., Farkas, A. (2010). Effects of rotenone and other mitochondrial complex I. inhibitors on the brine shrimp Artemia, Acta Biologica Hungarica, Acta Biologica Hungarica 61 (4) If.: 0.619 Kováts, N., Kiss, I., Ács, A. A békalencse-növekedés gátlásának vizsgálatán alapuló ökotoxikológiai teszt bizonytalansági tényezői. Hidrológiai Közlöny, közlésre elfogadva A disszertáció témaköréhez kapcsolódó közlemények Kováts, N., Ács, A., Kovács, T., Lugosi, Sz., Refaey, M., Paulovits, G. (2006). Alternatív ökotoxikológiai tesztek cianobakteriális toxicitás meghatározására. Országos Környezetvédelmi Konferencia, Siófok, 2006. szept. 19-21., pp. 272-276. Refaey, M., Ács, A., Kovács, T., Kováts, N., Paulovits, G. (2007). Novel ecotoxtest based on Daphnia pulex feeding inhibition. International Conference of PhD Students, University of Miskolc, Innovation and Technology Transfer Centre, Natural Science pp. 237-242, ISBN 978-963-661-781-3 Ács, A., Borbély, G., Császár, G., Kováts, N., Mainóne, H., Refaey, M. (2008). Duckweed Detector v.02 képelemző szoftver validálása standard ökotoxikológiai tesztprotokoll alapján. Műszaki Kémiai Napok 08, 2008. április 22-24, Veszprém, pp. 308-311. Ács A., Kováts N., Refaey, M., Thury, P., 2009, Monitoring of Wastewater Toxicity Changes due to Biodegradation, Environment & Progress 13, EFES Publishing House, Cluj Napoca, p. 1-5. Kováts, N., Gölöncsér, F., Ács, A., Refaey, M. (2010). Quantification of the antibacterial properties of Artemisia absinthium L., A. vulgaris L., Chrysanthemum leucanthemum L. and Achillea millefolium L. using the Vibrio fischeri bacterial bioassay. Acta Botanica Hungarica, 52 (1-2) 137-144 Abdel-Hameid, N-A., Kováts, N., Kovács, K., Kovács, K., Ács, A., Paulovits, G. (2010). Toxicitási tesztek alkalmazása hazai kagylófajokra. Acta Biologica Debrecina Oecol. Hung. 21 pp. 9-14. Kováts, N., Refaey, M., Ács, A., Gölöncsér, F. Quantification of bactericide properties of medicinal plants. Egyptian Journal of Natural Toxins, közlésre elfogadva Kováts, N., Refaey, M., Ács, A. Ecological risk posed by treated paper mill effluent. Journal of Environmental Engineering and Management, közlésre elfogadva Kováts, N., Ács, A., Refaey, M., Paulovits, G. Ecological risk assessment of heavy metal contamination. Bulletin Resurse Minerale, közlésre elfogadva Kováts, N., Abdel-Hameid, N.A., Ács, A., Kárpáti, Á., Paulovits, G. Kommunális szennyvíz ökotoxicitásának becslése lapos tavikagyló (Pseudanodonta complanata) lárváival. Állattani Közlemények (2010) 95(1):11-23
A disszertáció témaköréhez kapcsolódó előadások, poszterek Kovács, T., Ács A., Kováts, N., Lugosi Sz., Refaey, M., Paulovits, G. (2006). Assessing cyanobacterial toxicity in the Kis-Balaton Water Protection System (Hungary). Cyanobacterial water blooms: effects, consequences and management, Brno, Sept.1-2 Kovács, T., Kováts, N., Ács, A., Lakó, J., Refaey, M., Lugosi, R. (2007). Risk assessment of cyanobacterial toxicity in Lake Balaton. 9th DKMT Euroregional Conference on Environmental Health and Protection, Environmental Biodiversity and Health, Arad, máj. 11-13. Kováts, N., Refaey, M., Ács, A., Horváth, B., Kovács, T., Vájer, É. (2007). Response of Lemna minor clones to Microcystis toxicity. 11th EuCheMS International Conference on Chemistry and the Environment, Torun, September 9-12 Ács, A., Refaey, M., Kováts, N. (2007). Alternatívák az ökotoxikológiai gyakorlatban. I. Országos Környezetgazdaságtani Ph.D.-konferencia, Budapesti Corvinus Egyetem, 2007. nov. 27 Kováts, N., Ács, A., Refaey, M., Simonné, B. Zs. (2008) Medical use and toxic properties of rue (Ruta graveolens) and peppermint (Mentha piperita) Természet-, Műszaki- és Gazdaságtudományok Alkalmazása 7. Nemzetközi Konferenciája Szombathely Május 17. Farkas A., Ács A., Kovács W. A., Kováts N., Vehovszky Á. (2008). Cianobaktérium minták toxicitásának összehasonlító vizsgálata alternatív ökotoxikológiai tesztek alkalmazásával. Tox 2008 Magyar Toxikológusok Társasága Éves Konferenciája Sopron, 2008, október 15-17. Kováts, N., Ács, A., Gölöncsér, F., Refaey, M. (2008). Gyógynövények által termelt baktericid hatóanyagok vizsgálata bakteriális ökotoxikológiai teszt alkalmazásával. XXXI. Kémiai Előadói Napok, 2008 okt. 27-29, Szeged Kováts, N., Refaey, M., Ács, A., Gölöncsér, F. (2008). Quantification of bactericide properties of medicinal plants. 3rd International Conference on Natural Toxins 16-18 December 2008 Cairo Ács, A., Kováts, N., Refaey, M. (2009). Environmental risk assessment of paper mill effluent. Environment & Progress 2009 május 08 Nov. Cluj-Napoca Kovács, A., Felföldy, T., Farkas, A., Ács, A., Győri, J., Vehovszky, Á, Szalontai, K. (2009). Mikrocisztin cianotoxin termelésre képes genotípusok kimutatása molekuláris módszerekkel, LI. Hidrobiológus Napok Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában, Tihany, 2009 szept. 30 - okt. 2 Farkas, A., Ács, A., Kovács, A., Törő, N., Győri, J., Vehovszky, Á., Kiss, Gy., (2009). Balatoni Cylindrospermopsis raciborskii törzsek toxicitásának vizsgálata cianotoxinok azonosítás,. Tox 2009 Magyar Toxikológusok Társasága Éves Konferenciája Galyatető, 2009. október 14-16. Kovács, A., Felföldy, T., Farkas, A., Szalontai, K., Ács, A., Vasas, G., Győri, J., Vehovszky, Á. (2009). Mikrocisztin cyanotoxin termelésre képes genotípusok kimutatása molekuláris módszerekkel és előfordulásuk felmérése természetes vizeink cianobaktérium populációiban. Tox 2009 Magyar Toxikológusok Társasága Éves Konferenciája Galyatető, 2009. október 14-16.
Oktatási segédanyag Ács, A. (2008) Enzyme assays (In): Toxic cyanobacteria in drinking water sources: problem and sanitation, Padisák, J., Kováts, N., (eds.) University of Pannonia, University Press ISBN 978 963 9696 49 5 pp.95-110 Kováts, N., Ács, A., Environmental health effects of cyanobacterial toxins (In):Toxic cyanobacteria in drinking water sources: problem and sanitation, Padisák, J., Kováts, N., (eds.) University of Pannonia, University Press ISBN 978 963 9696 49 5 pp.38-45 Kováts, N., Ács, A., (2009) Applying Ecotoxicology in the Water Framework Directive, TEMPUS- JEP-41121-2006 CD-ROM Tanulmányok, jelentések Kováts, N., Ács, A., Refaey, M. (2008). Toxikológiai vizsgálatok a DUNAPACK Papír és Csomagolóanyag Rt. által kezelt szennyvizekre. Pannon Egyetem Környezetmérnöki és Kémiai Technológia Tanszék, pp. 12. Kováts, N., Ács, A., Refaey, M. (2008). Degradáció során bekövetkező toxicitás-változás monitorozása a DUNAPACK papír és csomagolóanyag Rt. által kezelt szennyvizekre. Pannon Egyetem Környezetmérnöki és Kémiai Technológia Tanszék, pp. 9. Tehetséggondozás Kovács Anikó diploma és TDK munkájának témavezetője