Egy búza-thinopyrum ponticum részleges amfiploid molekuláris citogenetikai vizsgálata

Egy búza-thinopyrum ponticum részleges amfiploid molekuláris citogenetikai vizsgálata Sepsi Adél Izabella Doktori értekezés tézisei Eötvös Lóránd Tudományegyetem, Budapest Biológia Doktori Iskola Doktori Iskola vezetője: Prof. Erdei Anna Kísérletes Növénybiológia Doktori Program Programvezető: Prof. Szigeti Zoltán Témavezető: Lángné Molnár Márta DSc. Tudományos tanácsadó Magyar Tudományos Akadémia Mazőgazdasági Kutatóintézet Martonvásár 2010 1

1. Bevezetés A vad fajok genetikai diverzitásának kiaknázásával a termesztett búza (Triticum aestivum L.) biotikus és abiotikus stresszrezisztenciája javítható. Számos nemzetközi program célja előnyös gének búzába történő beépítése, egyrészt génmódosított növények előállításával, másrészt a jó adaptációs készséggel rendelkező tájfajták bevonásával a nemesítési programokba (Bedő és mtsai. 1998). Fokozott érdeklődés tapasztalható a búzával rokonságban álló vad fajok genetikai sokfélesége iránt, amely idegenfajú keresztezések segítségével hozzájárulhat a búza alkalmazkodó képességének növeléséhez. A búzaidegenfajú hibridek előállítása lehetővé teszi, hogy a vad fajokban előforduló génkészlet felhasználhatóvá váljon a búzanemesítés számára. Modern citogenetikai módszerek segítségével komplex interspecifikus hibridek állíthatók elő (Molnár-Láng és Sutka 1994). Az F 1 hibridek azonban általában genetikailag instabilak és csaknem teljesen sterilek, ezért búzával nehezen visszakeresztezhetők. Kolhicin kezelés hatására a hibridek génállománya megkettőződik, így amfiploid növények állíthatók elő. Az amfiploidok fertilisek és genetikailag stabilak ezért fontos szerepük van a búzanemesítési programokban (Jiang és mtsai. 1994). A fertilis hibridek előállítása önmagában nem teszi lehetővé a búza biotikus és abiotikus stresszrezisztenciájának növelését. A hatékony génátvitel érdekében alapvető az előnyös tulajdonságot hordozó hibrid növények genomösszetételének megismerése is. A genomi in situ hibridizáció (GISH) adaptálása növényekre (Schwarzacher és mtsai. 1989) lehetővé tette az idegen genom akár egy kis részének a nyomonkövetését is az interspecifikus és intergenerikus hibridekben (Molnár-Láng és mtsai. 2000). A búza-idegenfajú hibridekben az idegen faj genomján kívül megtalálhatóak a búza homeológ genomjai is (ABD genomok). A nagyszámú-, nagyfokú homeológiát mutató genom jelenléte megnehezití a genomanalízist. A multikolor GISH (mcgish) technika rendkívül hatékony az összetett hibridek vizsgálatára, hiszen lehetővé teszi kettő vagy akár több homeológ genom egyidejű megjelenítését is (Mukai és mtsai 1993, Molnár és mtsai. 2009). A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) során, repetitív DNS szekvenciák hibridizációját követően a kromoszómákon jellegzetes mintázat jelenik meg, így a kromoszómák egyenként azonosíthatók (Rayburn és Gill 1985). A FISH technika alkalmas még a poliploid fajokban intergenomikus átrendeződések kimutatására és azonosítására (Linc és mtsai. 1999). Kisméretű transzokációk, vagy FISH sávozást nem mutató területek átrendeződése azonban nem azonosítható FISH-el, ezek azonosítása molekuláris markerek vizsgálatával 2

kivitelezhető. GISH vagy mcgish segítségével kimutatott és FISH-el azonosított intergenomikus átrendeződések nagyszerű genetikai alapanyagként szolgálnak a molekuláris markerek fizikai térképezéshez (Nagy és mtsai. 2002). A Thinopyrum ponticum (Podp.) Z.W. Liu & R. R. -C. Wang [szin. Agropyron elongatum (Host) Beauvoir ssp ruthenicum Beldie] (2n = 10x = 70), a búza rokonsági körébe tartozó dekaploid vad faj, régóta fontos rezisztenciaforrásként ismert. Főként levélrozsda (Puccinia triticina) és a búza foltos mozaikosságával (wheat streak mosaic virus) szembeni rezisztenciája jelentős (Friebe és mtsai. 1996). Genomösszetétele GISH vizsgálatok alapján J s J s JJJ. A J genom homológ a Thinopyrum bessarabicum (2n = 14) J genomjával, míg a J s genom egy összetett genom, amelyet a kromoszómák pericentromérikus régiójában S genom, a teloméráknál pedig J genom jelenléte jellemez (Chen és mtsai. 1998). A BE-1, búza-thinopyrum ponticum részleges amfiploid, az első magyar búza- Thinopyrum keresztezési program keretében jött létre. A keresztezéseket Kiss Árpád és Rajháthy Tibor végezték Martonvásáron 1953-ban (Belea 1964). A BE-1-et Szalay Dezső válogatta ki az F 3 generációból magas fehérjetartalma, levélrozsda- és lisztharmat (Blumeria graminis f. sp. tritici) rezisztenciája miatt (Szalay 1979). Agronómiailag előnyös tulajdonságai mellett a BE-1 stabil és fertilis így előnyös alapanyagként használható a búza fehérjetartalmának növelésére és betegségellenállóságának javítására. Morfológiailag ugyan átmenetet képviselt a búza és a Th. ponticum között, azonban korábban, megfelelő citológiai módszerek hiányában, idegen kromatint közvetlenül nem sikerült kimutatni a növényben. A jelen munka célja volt a BE-1 vonalba beépült idegen kromatin kimutatása és a BE- 1 pontos kromoszómaösszetételének meghatározása GISH-el, különböző Thinopyrum és Pseudoroegneria fajokból származó próbák segítségével. A továbbiakban a búza kromoszómák azonosítása és az előforduló átrendeződések azonosítása volt a cél, amelyet FISH-el, különböző repetitív DNS próbák (Afa-family, psc119.2, pta71) hibridizációjával kívántunk megvalósítani. A kisméretű átrendeződések pontos meghatározásához kromoszómaspecifikus SSR (simple sequence repeats) markereket kívántunk alkalmazni. 3

1.1 Célkitűzések A GISH technika adaptálása annak érdekében, hogy rutinszerűen alkalmazható legyen Thinopyrum kromatin kimutatására búza-thinopyrum hibridekben, megkönnyítve ezzel a kívánt tulajdonságok beépítését a búza genomba A BE-1-ben szereplő Thinopyrum szülőből származó kromoszómák számának meghatározása A búza kromoszómák azonosítása, szubsztituciók vagy addiciók detektálása Búza-Thinopyrum transzlokációk, és a búza A, B és D genomjai közötti átrendeződések azonosítása. A transzlokációs kromoszómák felhasználása molekuláris markerek fizikai térképezésére. Egy keresztezési program elindítása, amelynek célja a BE-1 részleges amfiploid levélrozsda rezisztenciájának beépítése búzába. 2. Anyag és módszer 2.1 Növényi anyag A felhasznált genotípusok a következőek: A BE-1 részleges amfiploid, Triticum urartu Thum. (2n = 2x = 14, AA), Aegilops bicornis Forsk. (2n = 2x, SS = BB), Ae. tauschii Coss. (2n = 2x = 14, DD), Triticum durum Desf. (2n = 2x = 28, AABB), T. aestivum L. (2n = 6x = 42, AABBDD) Bánkúti, Mv Suba, Mv9kr1, Chinese Spring ph mutáns, Elytrigia elongata (Host) Nevski (2n = 2x = 14, EE), Thinopyrum bessarabicum Savul. & Rayss (2n = 2x = 14, JJ), Pseudoroegneria strigosa Bieb. Löve subsp. aegilopoides (Drobow) (2n = 2x = 14, SS), Thinopyrum ponticum (Podp.) Z.W. Liu & R. R. -C. Wang (2n = 10x = 70, J s J s JJJ). 4

2.2 Genomi in situ hibridizáció Teljes genomi DNS-t izoláltunk fiatal levelekből a fenol-kloroform módszer szerint (Anderson et al. 1992). A próbák jelőlését nick-transzlációval végeztük digoxigenin-16-dutp és biotin-11-dutp jelölő molekulák segítségével. A kromoszómapreparátumokat a jelőlt DNS próbák jelenlétében 42 C-on, egy éjszakán át hibridizáltuk. A biotinilált és digoxigenált szekvenciákat streptavidin-fitc (fluorescein isothiocyanate) és anti-digoxigenin-rhodamin segítségével detektáltuk. A fluoreszcens jeleket DAPI-szűrővel (Zeiss, Filterset 01) és a FITC és rhodamin jelek egyidejű közvetitésére alkalmas kétsávos-szűrővel (Zeiss, Filterset 24) felszerelt Zeiss Axioscope 2 fluoreszcens mikroszkóppal észleltük. A fotók elkészítéséhez Spot CCD kamerát (Diagnostic Instruments, Inc., USA) használtunk. A képek rögzítéséhez az Image-Pro Plus 5.1 (Media Cybernetics, USA) szoftvert alkalmaztuk. 2.3 Fluoreszcens in situ hibridizáció A FISH három repetitív próba (psc119.2, Afa-family és pta71) egyidejű hibridizációjával történt. A psc119.2 és Afa-family szekvenciákat PCR-el amplifikáltuk és jelőltük biotin-11-dutp (psc119.2) és digoxigenin-16-dutp (Afa-family) molekulákkal (Contento és mtsai. 2005; Nagaki és mtsai. 1995). A pta71 klónt 50%-ban biotin-11-dutpvel és 50%-ban digoxigenin-11-dutp-vel jelőltük. GISH után a kromoszóma preparátumokat 4 SSC Tween-ben 25 C-on egész éjszakán át mostuk majd ezeken a preparátumokon végeztünk FISH-t. A FISH-t hasonló körülmények között hajtottuk végre, mint a GISH-t kivéve a hibridizációs hőmérsékletet, amely ebben az esetben 37 C volt. 2.4 SSR marker vizsgálatok Teljes genomi DNS-t izoláltunk Anderson és mtsai. (1992) alapján. Huszonöt 7Dspecifikus és tizenegy 7A-specifikus búza mikroszatellit markert válogattunk ki a GrainGenes 2.0 adatbázisból (http://wheat.pw.usda.gov/gg2/index.shtml). A PCR reakciókat a Sepsi és mtsai. (2008) szerint végeztük. 5

3. Eredmények Az 56 kromoszómaszámú részleges amfiploidban 16 Thinopyrum és 40 búza kromoszómát mutattunk ki, ami arra utalt, hogy egy búza kromoszómapárt egy idegenfajú kromoszómapár helyettesít (szubsztitúció). Hat Thinopyrum kromoszóma pericentromérikus régiójában idegen genomból származó szakaszokat figyeltünk meg a J genomi próba hibridizációjakor. A hat transzlokációs kromoszóma közül négyet J s típusú kromoszómaként azonosítottunk, mivel ezek pericentromerikus régiójához erős kötődést mutatott az S genomi próba. Különböző fluorokrómokkal jelőlt J- és A genomi próbák, majd J- és D genomi próbák egyidejű hibridizációjával 14 A kromoszómát, 14 B kromoszómát és 12 D kromoszómát mutattunk ki a 16 Thinopyrum kromoszóma mellett. Megállapítottuk, hogy a kiesett búza kromoszómapár a D genomból származott. Az amfiploidban jelenlévő búzakromoszómákat egyenként azonosítottuk. Kimutattuk, hogy az eliminálódott búza kromoszómapár a 7D. Leírtuk a Thinopyrum kromoszómák FISH mintázatát, így az utódokba átadódott idegen kromoszómák azonosítása megoldható. Egy új intergenomikus átrendeződést mutattunk ki a búza A és D genomjai között. FISH segítségével a transzlokációban részt vevő A kromoszómát 7A-ként azonosítottuk. SSR marker analizíssel pontosan azonosítottuk a transzlokációban részt vevő rövid D genom szegmentumot is. A transzlokációt 7AL.7DL átrendeződésként írtuk le. Egy rövid deléciót igazoltunk a 7AL terminális régiójában 7A specifikus SSR markerekkel, ami arra utalt, hogy a transzlokáció előtt a 7AL terminális régiójából egy rövid szegmentum eliminálódott.. A transzlokációs töréspont helyzete, mind a 7AL mind a 7DL esetében eltért a korábban leírt deléciós vonalak töréspontjaitól, így új fizikai határjelzőként használhatók a 7AL és 7DL terminális régiókban. Az új transzlokáció töréspontjának helyzete lehetővé tette egy korábban ismeretlen lokalizációjú 7D specifikus marker pontos elhelyezését a 7DL terminális régióra, ami bizonyította, hogy a transzlokáció alkalmas molekuláris markerek fizikai térképezésére. 6

4. Következtetések A BE-1 részleges amfiploidban szereplő Thinopyrum kromoszómák részletes citogenetikai jellemzése lehetővé teszi a visszakeresztezések során az utódokba átadódott Th. kromoszómák nyomonkövetését. A jelen munka példaként szolgál arra, hogy az in situ hibridizációs technikák SSR markeres vizsgálatokkal kombinálva rendkivül hasznosak intergenomikus átrendeződések kimutatására és azonosítására, ami lehetővé teszi olyan növények kiválogatását, amelyek alkalmasak fizikai térképezésre. A 7AL.7DL transzlokáció térképezése lehetővé teszi molekuláris markerek pontosabb lokalizációját a 7DL és 7AL terminális régiókban. 5. Irodalomjegyzék Anderson JA, Ogihara Y, Sorrells ME, Tanksley SD (1992) Development of chromosomal arm map for wheat based on RFLP markers. Theor Appl Genet 83: 1035 1043. Bedő Z, Vida Gy, Láng L, Karsai I (1998) Breeding for breadmaking quality using old Hungarian wheat varieties. Euphytica 100: 179 182. Belea A (1964) Néhány Triticum L. fajhibrid genetikai elemzése és nemesítési értékelése. Kandidátusi értekezés. TMB. Budapest 1-277. Chen Q, Conner RL, Laroche A, Thomas JB (1998) Genome analysis of Thinopyrum intermedium and Thinopyrum ponticum using genomic in situ hybridization. Genome 41: 580 586. Contento A, Heslop-Harrison JS, Schwarzacher T (2005) Diversity of a major repetitive DNA sequence in diploid and polyploid Triticeae. Cytogenet Genome Res 109: 34 42. Friebe B, Jiang J, Raupp WJ, McIntosh RA, Gill BS (1996). Characterization of wheat-alien translocations conferring resistance to diseases and pests. Euphytica 91: 59 87. Jiang J, Friebe B and Gill BS (1994) Recent advances in alien gene transfer in wheat. Euphytica 73: 199 212. Linc G, Friebe B, Kynast RG, Molnár-Láng M, Köszegi B, Sutka J, Gill BS (1999) Molecular cytogenetic analysis of Aegilops cylindrica Host. Genome 42: 497 503. Molnár I, Benavente E, Molnár-Láng M (2009) Detection of intergenomic chromosome rearrangements in irradiated Triticum aestivum- Aegilops biuncialis amphiploids by multicolour genomic in situ hybridization. Genome 52: 156-165. 7

Molnár-Láng M, Sutka J. (1994) The effect of temperature on seed set and embryo development in reciprocal crosses of wheat and barley. Euphytica 78: 53-58. Molnár-Láng M, Linc G, Friebe RB, Sutka J (2000) Detection of wheat barley translocations by genomic in situ hybridization in derivatives of hybrids multiplied in vitro. Euphytica 112: 117 123. Mukai Y, Nakahara Y, Yamamoto M (1993) Simultaneous discrimination of three genomes in hexaploid wheat by multicolor fluorescence in situ hybridization using total genomic and highly repeated DNA probes. Genome 36: 489 494. Nagaki K, Tsujimoto H, Isono K, Sasakuma T (1995) Molecular characterization of a tandem repeat, Afa family, and its distribution among Triticeae. Genome 38: 479 486. Nagy ED, Molnár-Láng M, Linc G, Láng L (2002) Identification of wheat barley translocations by sequential GISH and two-colour FISH in combination with the use of genetically mapped barley SSR markers. Genome 45: 1238 1247. Rayburn AL and Gill BS (1985) Use of biotin-labelled probes to map specific DNA sequences on wheat chromosomes. J Heredity 76: 78 81. Schwarzacher T, Leitch AR, Bennett MD, Heslop-Harrison JS (1989). In situ localization of parental genomes in a wide hybrid. Ann Bot 64: 315 324. Sepsi A, Molnár I, Szalay D, Molnár-Láng M (2008) Characterization of a leaf rust resistant wheat Thinopyrum ponticum partial amphiploid BE-1 using sequential multicolor GISH and FISH. Theor Appl Genet 116: 825-834. Szalay D (1979) Faj- és nemzetséghibridek felhasználása a búzanemesítésben. Bálint A (szerk.) A búza jelene és jövöje. Mezögazdasági Kiadó, Budapest, 61 66. 8

6. Publikációk 6.1 Lektorált tudományos cikkek: Sepsi A, Németh K, Molnár I, Szakács É, Molnár-Láng M 2006. Induction of chromosome rearrangements in a 4H(4D) wheat-barley substitution using a wheat line containing a Ph suppressor gene. Cereal Research Communication 34: 1215-1222 (IF: 1.2) Sepsi A, Molnár I, Szalay D, Molnár-Láng M 2008. Characterization of a leaf rust resistant wheat Thinopyrum ponticum partial amphiploid BE-1 using sequential multicolor GISH and FISH. Theoretical and Applied Genetics 116: 825-834 (IF: 3.5) Sepsi A, Molnár I, Molnár-Láng M 2009. Physical mapping of a 7A..7D translocation in the wheat Thinopyrum ponticum partial amphiploid BE-1 using multicolour genomic in situ hybridization and microsatellite marker analysis. Genome 2: 748 754. (IF: 1.7) 6.2 Szerkesztett konferencia kiadvány: Sepsi A, Németh K, Lángné Molnár M 2005. Kromoszóma átrendeződések indukciója a 4H/4D búza-árpa szubsztitucióban ph szuppresszor gént tartalmazó búzavonallal. XI. Ifjúsági Tudományos Fórum, Veszprémi Egyetem Georgikon Mezőgazdaságtudományi Kar, Keszthely, 2005. március 24. Növénytermesztés szekció, 315 pdf. Sepsi A, Németh K, Lángné Molnár M 2005. Kromoszóma átrendeződések indukciója a 4H/4D búza-árpa szubsztitúcióban ph szuppresszor gént tartalmazó búzavonallal. XI. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 2005 március 3-4. pp 175. Lángné Molnár M, Szakács É, Linc G, Molnár I, Sepsi A 2006. A búza és az árpa keresztezéséből Martonvásáron létrehozott genetikai alapanyagok. XII. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 2006 március 7-8. pp 65 Sepsi A, Molnár I, Szalay D, Molnár-Láng M 2007. A BE-1 búza-thinopyrum ponticum (szinonima: Agropyron elongatum) részleges amfiploid molekuláris citogenetikai 9

vizsgálata. XIII. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 2007 március 12. pp 72. Sepsi A, Molnár I, Szalay D, Molnár-Láng M 2007. Egy levélrozsda rezisztens, magas fehérjetartalmú búza Thinopyrum ponticum (szinonima: Agropyron elongatum) részleges amfiploid molekuláris citogenetikai vizsgálata. VII. Magyar Genetikai Kongresszus XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Balatonfüred, 2007 április 15-17. pp 163-164. Sepsi A, Molnár I, Szalay D, Molnár-Láng M 2008. Egy levélrozsda rezisztens, magas fehérjetartalmú búza Thinopyrum ponticum (szinonima: Agropyron elongatum) részleges amfiploid molekuláris citogenetikai vizsgálata. XIV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 2008 március 12, pp.28 Sepsi A, Molnár I, Szalay D, Molnár-Láng M 2008. Molecular cytogenetic analysis of the wheat-agropyron elongatum partial amphiploid BE-1. Acta Biol Szeged 52: 139-141. Sepsi A, Bucsi J 2009. Physical mapping of the 7D chromosome using a wheat/barley translocation line (5HS.7DL) produced in a Martonvásár wheat background using microsatellite markers. VIII. Alps-Adria Scientific Workshop Neum, Bosnia-Herzegovina, 2009, Cereal Res. Comm. Suppl 2.: 297-300 Bizzarri M, Pasquini M, Vida G, Sepsi A, Molnár-Láng M, De Pace C 2009. Dasypyrum villosum 6V chromosome as source of a gene for adult plant resistance to Puccinia recondita f. sp.tritici, the pathogen causing the leaf rust. 53 Annual Congress Societa Italiana di Genetica Agraria, Torino, 16-19 September 2009. 10