Bartos Ádám Biológiailag aktív peptidek oldékonyságának növelése oligoetilénglikol származékokkal Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Témavezetők: Dr. Uray Katalin Dr. Hudecz Ferenc MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport ELTE Szerves Kémiai Tanszék ELTE-TTK Kémia Doktori Iskola Vezető: Inzelt György, D.Sc. Szintetikus Kémia, anyagtudomány, biomolekuláris kémia program Programvezető: Horváth István Tamás, D.Sc. 2009.
Bevezetés Mind in vitro, mind in vivo biológiai vizsgálatok esetén a vizsgálandó molekulák (például peptidek) vízoldékonysága igen fontos tényező. A vízoldhatóság problémája többek közt aggregálódásra nagymértékben hajlamos β-redőzött réteg szerkezetű peptidek esetében merül fel. Számos kötődésvizsgálat biotinnal jelzett peptideken alapul. A biotin peptidhez való kapcsolása tovább rontja az oldhatóságot, ami főleg hidrofób peptidek esetében megnehezítheti, akár meg is hiúsíthatja ezeket a vizsgálatokat. További probléma, hogy a biotin közvetlen kapcsolása a peptidhez hamis eredményeket adhat, mivel a biotin avidin kölcsönhatás létrejöttét sztérikus tényezők gátolhatják, vagy az avidin gátolhatja a peptid receptor kölcsönhatást. A térgátlás kiküszöbölésére egy hosszabb szénlánccal módosított biotint használnak, a biotinil-6-aminohexánsavat, ez azonban tovább rontja az oldhatóságot. Biotin csoport beépítése (biotinilálás) minden esetben az oldhatóság csökkenésével jár. Az oldhatóság növelésére kézenfekvő módszer polietilénglikol vegyületek használata, de a jelenleg kereskedelmi forgalomban kapható polietilénglikolok polidiszperz rendszerek, pontos molekulatömeggel nem jellemezhetőek, ami megnehezíti karakterizálásukat. Célkitűzés Doktori munkám célja, hogy biotin tartalmú peptidkonjugátumokat állítsak elő hidrofób peptidek és, hidrofil távtartók segítségével. E célra a humán IgG egyik hidrofób szekvenciáját, és annak rövidebb változatát terveztem előállítani, melynek biotinilált formáit ELISA vizsgálatokban használják. A hidrofil távtartók előállításához két oligoetilénglikolt terveztem kiindulási anyagként használni, 3,6,9-trioxaundekán-1,11-dikarbonsavat (TEG), illetve 4,7,10-trioxa-1,13-tridekándiamint (TTD). Az oligoetilénglikol távtartók a biotin és a peptid közé illesztve várhatóan megnövelik a konjugátum oldhatóságát.
Stratégia Olyan biotin tartalmú peptidkonjugátumot állítottam elő, amely oligoetilénglikol származékot tartalmaz, így nagyobb a vízoldhatósága, mintha az általánosan alkalmazott biotinil-6-aminohexánsavval jelölt konjugátumoké. Doktori munkám három részből áll: I.) a H-C(Acm)VVVDVSHEDP-NH 2 (CP), H-VVDVSHEDP-NH 2 (VP), illetve H-EVTC(Acm)VVVD-NH 2 (ED) peptidek előállítása II.) védett oligoetilénglikol távtartók előállítása és citotoxicitásuk vizsgálata III.) biotin tartalmú peptidkonjugátumok előállítása és oldhatóságuk vizsgálata I.) A kiválasztott H-C(Acm)VVVDVSHEDP-NH 2, H-VVDVSHEDP-NH 2, illetve H- EVTC(Acm)VVVD-NH 2 modell peptidek a humán IgG Fc régiójából származnak. Előállításuk az aggregáció és a hidrofób szekvenciarészletek miatt igen nehéz. Szilárd fázison, kétféle stratégiával terveztem előállítani őket: Boc stratégiával manuálisan, illetve Fmoc technikával automata peptidszintetizátorral. Fmoc / tbu stratégiával való szintézis automata peptidszintetizátor segítségével terveztem előállítani, DIC / HOBt kapcsolóreagensek segítségével. Manuális peptidszintézishez Boc / Bzl stratégiával terveztem előállítani a peptideket PyBOP / HOBt kapcsolóreagensek alkalmazásával. Fmoc / tbu stratégiánál a kész peptid, illetve peptidkonjugátum trifluorecetsav-víz eleggyel hasítható le, Boc / Bzl stratégia esetében folyékony hidrogénfluoriddal. II.) A védett oligoetilénglikol távtartók előállításánál fontos szempont volt, hogy aminosav-típusú szerkezetet hozzak létre, tehát egy védett amino-terminálissal, valamint egy szabad karboxilcsoporttal rendelkezzen a célvegyület. A kereskedelmi forgalomban kapható két oligoetilénglikolt, a 3,6,9-trioxaundekán-1,11-dikarbonsavat, valamint a 4,7,10-trioxa- 1,13-tridekándiamint terveztem használni kiindulási anyagként. A 3,6,9-trioxaundekán-1,11-dikarbonsav esetében az amino-terminális kialakítását védett formában terveztem végrehajtani Boc- illetve Fmoc-védett etilén-diamin (EDA) felhasználásával. Célom volt az amin és a karbonsav között amidkötés kialakítása a peptidkémiában használatos kapcsolóreagensek segítségével, például N,N -diciklohexil-
karbodiimiddel (DCC). A dikarbonsav azonban két karboxilcsoportjának köszönhetően mindkét oldalán reakcióképes, amely kétszeresen acilezett melléktermékhez vezethet. Ezért szükségszerű a dikarbonsav egyik karboxilcsoportját átmeneti védelemmel ellátni. Ezt egy Dowex-ioncserélő gyantán alapuló szelektív átésztereződési eljárással kívántam elérni. Az így kapott félésztert már egyértelműen lehet reagáltatni a védett etilén-diaminnal. Az átmeneti észtervédőcsoport etlávolításával előállítható a Boc, illetve Fmoc védett aminosav típusú távtartó. A 4,7,10-trioxa-1,13-tridekándiamin típusú távtartó előállítását egy eltérő eljárással terveztem végrehajtani. A célom itt is az aminosav-jelleg kialakítása volt. Az amidkötés kialakításának egyik peptidkémiában is használt eljárása az anhidridek alkalmazása. Ha azonban gyűrűs anhidridet alkalmazunk (például borostyánkősavanhidridet), a gyűrűfelnyílás során kialakuló amidkötés mellett egy szabad karboxilcsoport is kialakul. Az aminosav-típus tehát ebben az esetben átmeneti védelem kialakítása nélkül létrehozható. Az izolált ikerionos szerkezetű köztiterméket ezután Boc, illetve Fmoc védelemmel láthatjuk el. Mivel a későbbiekben biológiai célokra is fel kívánom használni ezeket a távtartókat, ezért szükséges volt tudnom, hogy mutatnak-e citotoxikus tulajdonságot. A citotoxicitási vizsgálatokat humán PBMC sejteken terveztem végrehajtani. III.) A biotin tartalmú peptidkonjugátumokat többféleképpen terveztem előállítani. A szilárd fázison előállított tesztpeptidekhez a bevált kapcsolóreagensek segítségével a védett aminosav-típusú oligoetilénglikol távtartókat egy lépésben kapcsolhatom. Mivel aminosavtípusú távtartókat használtunk, ez lehetőséget biztosít arra, hogy egymás után több távtartót kapcsoljak egymáshoz. Célom volt tovább, hogy megvizsgáljam, lehetséges-e 2, illetve 3 távtartó egymáshoz kapcsolása, és milyen változást okoz beépítésük a létrejött peptidkonjugátum oldhatóságában. A tervem továbbá egy másik szintézisút megvalósítása, amelyben szilárd fázison építem fel a biotinnal módosított oligoetilénglikol alapú távtartókat, majd az így felépített biotinilált-oligoetilénglikolt a gyantáról lehasítva egy lépésben kapcsoljam a vizsgálandó peptidhez. A konjugátumok oldhatóságának mérését HPLCkészüléken, illetve tömegmérésen alapuló eljárást kívántam felhasználni.
Alkalmazott módszerek Az új oligoetilénglikol származékok szintézisére általános szerves kémiai szintetikus módszereket és eszközöket használtam. Az oligoetilénglikolok peptidhez való konjugálása a peptidkémiában használatos kapcsolóreagensek segítségével történt. Az új termékek azonosítását tömegspektrometriás vizsgálatokkal, illetve aminosavanalízissel végeztem el. Az aminosav és peptidszármazékok tisztaságának vizsgálatához, valamint az oldhatósági vizsgálatokhoz HPLC-s módszereket alkalmaztam. Eredmények 1.) Doktori munkám során elvégeztem három biológiailag aktív, hidrofób IgG peptid szintézisét szilárd fázison Boc-, illetve Fmoc-stratégiával. A H- C(Acm)VVVDVSHEDP-NH 2 H-VVDVSHEDP-NH 2 és a H-EVTCVVVD-NH 2 peptidek biotinilált változatai egyaránt nagyon rossz oldhatósággal rendelkeznek. Szilárdfázison, kétféle stratégiával állítottam elő őket, Boc stratégiával manuálisan, illetve Fmoc technikával automata peptidszintetizátorral. 2.) Munkám során eljárást dolgoztam ki 3,6,9-trioxaundekán-1,11-dikarbonsav monobutilészterének előállítására heterogén fázisban, egy Dowex-ioncserélő gyantán alapuló szelektív átésztereződési eljárással. 3.) Előállítottam egy új típusú 3,6,9-trioxaundekán-1,11-dikarbonsav alapú védett oligoetilénglikol távtartót. A 3,6,9-trioxaundekán-1,11-dikarbonsav esetében az aminoterminális kialakítása védett formában Boc- illetve Fmoc-védett etiléndiamin felhasználásával amidkötés kialakításával történt. Az amino- és karboxiterminálissal rendelkező EDA-TEG távtartó használatával elkerülhető az esetleges melléktermékek képződése. 4.) Munkám során előállítottam egy új 4,7,10-trioxa-1,13-tridekándiamin alapú oligoetilénglikol távtartót. A diamint borostyánkősavval reagáltatva gyűrűfelnyílás közben amidkötést hoztam létre. A gyűrűfelnyílás során kialakuló amidkötés mellett egy szabad karboxilcsoport is kialakul, így az aminosav-típust ebben az esetben átmeneti védelem kialakítása nélkül hoztam létre. Az izolált ikeriont ezután Boc, illetve Fmoc védelemmel láttam el.
5.) Az előállított védett EDA-TEG, illetve TTD-Su oligoetilénglikol távtartók előállítása egyszerű, olcsó, különleges berendezést nem igényel, a peptidkémiában használatos eszközök segítségével elvégezhető. A sikeresen előállított oligoetilénglikol távtartók egyszerűen alkalmazhatók peptidszintézisben. E származékokat egy lépésben lehet peptidekhez/fehérjékhez, valamint egyéb, gyógyászatban alkalmazható vegyületekhez kapcsolni. 6.) A kiválasztott tesztpeptidek és az előállított oligoetilénglikol távtartók segítségével olyan biotint tartalmazó peptidkonjugátumokat terveztem és állítottam elő, amelynek oldhatósága többszöröse a hagyományos biotinil-6-aminohexánsavas peptideknek. 7.) A szilárd fázison előállított tesztpeptidekhez a bevált kapcsolóreagensek segítségével kétféleképpen készítettem el a biotinilált oligoetilénglikol tartalmú peptidkonjugátumokat. Az egyik szintézisút szerint szilárdfázison építettem fel az oligoetilénglikolhoz kapcsolt biotint, majd az így felépített biotinilált-oligoetilénglikolt a gyantáról lehasítva egy lépésben kapcsoltam a vizsgálandó peptidhez. A másik módszer szerint magán a tesztpeptiden építettem fel a biotiniloligoetilénglikolt, a védett távtartók és biotin segítségével. Ez a módszer kisebb, kevésbé aggregálódó peptidek esetében jó alternatívát jelent. 8.) Doktori munkám során megvizsgáltam, hogy lehetséges-e több TTD-Su távtartó egymáshoz kapcsolása. Mivel a távtartók aminosav-típusúak, tehát N- terminálissal és szabad karboxilcsoporttal rendelkeznek, ez lehetőséget adott arra, hogy több oligoetilénglikol távtartót tartalmazó, hosszabb konjugátumokat állítsak elő, ezek további oldhatatlan peptidek vizsgálatát könnyíthetik meg. 9.) Megvizsgáltam az előállított biotnilált peptidkonjugátumok oldhatóságát. Az általam felvázolt (tömegmérésen, ileltve RP-HPLC-mérésen alapuló) oldhatóság meghatározások kiválóan alkalmazhatók egyéb peptidkonjugátumok oldhatóságának meghatározására. Az előállított oligoetilénglikol tartalmú biotinilált konjugátumok több mint kétszer akkora oldhatóságot mutattak, mint a hagyományosan használt biotin-6-aminohexánsavval módosított peptidek. 10.) Megvizsgáltam, hogy az általam előállított oligoetilénglikol távtartók mutatnak-e citotoxikus hatást humán vérből preparált PBMC sejteken. Mivel az előállított EDA- TEG és TTD-Su távtartók citotoxicitást nem mutatnak 0,5 M koncentrációig, ezért valószínűleg képesek különböző potenciális gyógyszerhatóanyagok vízoldékonyságának és farmakokinetikai jellemzőinek javítására.
A munkám jelentősége egy olyan új, irodalomban nem ismert oligoetilénglikol alapú vegyületcsoport kifejlesztése, amely előnyösen befolyásolja a módosított peptidek, hatóanyagok oldhatóságát. Ezeknek a reagenseknek előállítása,és peptidhez való kapcsolása várhatóan új immundiagnosztikai és gyógyászati eljárásokhoz is vezethetnek. Publikációk Folyóiratban megjelent közlemények: Bartos Á., Uray K., Hudecz F., New biotin derivatives for labelling and solubilysing IgG peptides Biopolymers:Peptide Science (2009) DOI: 10.1002/bip.21141 Bartos Á., Hudecz F., Uray, K., Water soluble 3,6,9-trioxa-undecanedioic acid based linker and biotinylating reagent Tetrahedron Letters (2009) (elfogadott kézirat) *Uray K., Bartos Á., Kiss A., Tugyi R., Iván D., Windberg E., Majer Zs., Perkins A., Hudecz F. Identification and structural modification of antibody epitopes of muc2 glycoprotein J. Pept. Sci. 10, Suppl., H32 (2004) * Uray, K., Bartos, Á., Sármay, G., Hudecz, F. IgG Fc binding peptide chimeras The FEBS Journal 272 S1 530 (2005) *Bartos, Á., Uray, K., Hudecz, F. Biotin-derivatives with enhanced solubility for the labelling of IgG Fc peptides J. Pept. Sci. 12, Suppl. S, 105 (2006) *: referált folyóiratban megjelent előadásösszefoglaló Konferencia kiadványban megjelent közlemény: Bartos, Á., Uray, K., Hudecz, F. Biotin-derivatives with enhanced solubility for the labelling of IgG Fc peptides In: Peptides 2006 (Ed. by K. Rolka, P Rekowski and J. Silberring), Kenes International, Israel, 2007, p 700-701. Előadások, poszterek nemzetközi konferenciákon: Uray K., Bartos Á., Kiss A., Tugyi R., Iván D., Windberg E., Majer Zs., Perkins A., and Hudecz F. Identification and structural modification of antibody epitopes of muc2 glycoprotein 4 th Hellenic Forum on Bioactive Peptides, Patras, Greece, 22-24 April 2004 Uray, K., Bartos, Á., Sármay, G., Hudecz, F. IgG Fc binding peptide chimeras 30 th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, 2-7 July 2005
Uray K., Tugyi, R., Bartos, Á., Iván, D., Schlosser, G., Hudecz, F. Identification and manipulation of mucin 2 glycoprotein epitopes by combinatorial chemistry towards improved diagnosis and therapy 1st European Conference on Chemistry for Life Sciences Understanding the Chemical Mechanism of Life, Rimini, Italy, 4-8 October 2005 Bartos Á., Uray K., Hudecz F. Hydrophylic oligoethyleneglycol linkers for biotinylated peptides 1st European Chemistry Congress, Budapest, 27-31 August 2006 Bartos, Á., Uray, K., Hudecz, F. Biotin-derivatives with enhanced solubility for the labelling of IgG Fc peptides 29 th European Peptide Symposium, Gdansk, Poland, 3-8 September, 2006 Előadások, poszterek hazai konferenciákon: Bartos Á., Uray K., Hudecz F. Biotinil-oligoetilénglikol építőelemek előállítása peptidek jelzésére és vízoldékonyabbá tételére. MKE Vegyészkonferencia, Hajdúszoboszló, 2005. Bartos Á, Uray K, Hudecz F IgG peptidek oldhatóságának növelése etilénglikol származékokkal MKE Centenáriumi Vegyészkonferencia, Sopron, 2007. május 29-június 1. Előadások munkabizottsági üléseken: Bartos Á., Uray K., Medgyesi D., Sármay G., Hudecz F. New biotinylating reagents with enhanced solubility in Fc peptide binding studies Bioorganic Chemistry Meeting-2, June 23-24, 2005 Bartos Á., Uray K., Hudecz F. Tetraetilénglikol alapú biotiniláló reagensek MTA Peptidkémiai Munkabizottság Ülése, Balatonszemes, 2006. május 29 31 Bartos Á, Uray K, Hudecz F. Peptidek szolubilizálása és biotinnal való jelölése MTA Peptidkémiai Munkabizottság Ülése, Balatonszemes, 2007. június 5-7.