LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument

LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA. LightCycler MRSA Advanced Test LC MRSA 96 Tests P/N: 05352894 190 LightCycler Advanced Lysis Kit LYS ADV 96 Tests P/N: 05205743 190 FELHASZNÁLÁS MÓDJA A LightCycler MRSA Advanced Test egy kvalitatív in vitro diagnosztikai vizsgálat a meticillinrezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) nazális kolonizációjának az MRSA-fertőzések egészségügyi intézményekben történő megelőzése és kontrollja céljából történő direkt kimutatására. A vizsgálat a LightCycler 2.0 készülékkel történik olyan betegek nazális tamponos mintáiból, akiknél a kolonizáció gyanúja felmerül; a minta előkészítése tamponos kivonattal és mechanikai roncsolással történik, ezt követi az MRSA DNS amplifikációja polimeráz-láncreakcióval (PCR), és az amplifikált DNS kimutatása fluoreszcens targetspecifikus hibridizációs próbákkal. A LightCycler MRSA Advanced Test nem szolgál az MRSA-fertőzés diagnosztizálására, illetve az MRSA-fertőzés kezelésének irányítására vagy ellenőrzésére. További tenyésztésre csak a baktériumok epidemiológiai tipizálásához, illetve további érzékenységi vizsgálatokhoz van szükség. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A Staphylococcus aureus egy opportunista patogén, amely a normál populáció 30%-ánál kommenzalista organizmusként a bőrön és az orrlyukakban fordul elő, és potenciálisan betegségek széles spektrumát okozhatja, amely 30 napon belül az esetek kb. 34%-ában halálhoz vezet 1,2. A S. aureus gyorsan adaptálódik az antibiotikum-kezelés szelektív nyomásának hatására, ami meticillin-rezisztens S. aureus (MRSA) törzsek megjelenéséhez és elterjedéséhez vezetett. A meca gén a Staphylococcus kazetta-kromoszóma mec (SCCmec) elnevezésű nagy mobilis genetikai elemen lokalizálódik, és a meticillin-, valamint egyéb β-laktám antibiotikum-rezisztenciáért felelős. A meca gén egy módosult penicillinkötő fehérjét (PBP2a vagy PBP2 ) kódol, amely nagyon alacsony affinitása a β-laktám antibiotikumokhoz lehetővé teszi a peptidoglikán-réteg normál szintézisét még ezen antibiotikumok jelenlétében is 3. Világszerte számos MRSA törzs jelent meg és terjedt el, és a meticillin-érzékeny S. aureus különböző genetikai vonalai vették fel az SCCmec gént 4. A mai napig öt SCCmec-típust (I V) különítettek el, valamint ezen SCCmec-típusoknak számos variánsát írták le 5. Az MRSA okozta, egészségügyi ellátással kapcsolatos (HA) fertőzések az utóbbi időben világszerte az egészségügyi intézmények sürgető problémájává váltak a fertőzések nagy aránya, mortalitása és a kezelés magas költsége miatt 6-9. Ezen kívül, a közösségben szerzett MRSA (CA-MRSA) elterjedt az elmúlt évek során 10, utánpótlást biztosítva a kórházi fertőzések számára 11,12, és kihangsúlyozva az átfogó fertőzéskontroll-programok szükségességét. 2008-ban összefoglalták számos állami, szakmai és közegészségügyi szervezet közölt irányelveinek ajánlásait, hogy segítsék az intézeteket az MRSA átvitelének megakadályozását megtervezni és végrehajtani 13. Minden, az MRSA átvitelét megelőző programnak számos kulcsstratégiát kell tartalmaznia, beleértve az aktív felügyeleti szűrést, kézhigiéniát, a beteg elkülönítését és egyéb, az átvitelt megelőző tevékenységeket. Az MRSA valósidejű PCR-kimutatása a standard tenyésztéses vizsgálatokkal szemben szignifikánsan mérsékeli a kimutatási időt (kevesebb, mint 2 óra laboratóriumi idő), ezáltal javítja a kontroll- és kezelési stratégiák hatékonyságát. A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 05548926001-02HU 1 Doc Rev. 2.0

AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI Az MRSA kimutatása a LightCycler MRSA Advanced Test segítségével 3 fő eljáráson alapul: Minta-előkészítés a bakteriális sejtfal mechanikai feltárásával Target DNS PCR-amplifikációja és kimutatása specifikus hibridizációs próbákkal Eredmény automatikus létrehozása az olvadási görbe elemzése során Minta előkészítése A nazális tamponos minták mechanikai feltárása a LightCycler Advanced Lysis Kit és a MagNA Lyser készülék segítségével történik. A levágott tamponvégeket a líziscsövekben hevíteni kell, hogy minden baktérium inaktiválódjon. Ezt követően a líziscsövek a MagNA Lyser készülékbe kerülnek, ahol a bakteriális sejtfal mechanikai roncsolása során nyers lizátum keletkezik. Az üveggyöngyök és a tampon szálainak rövid lecentrifugálását követően LightCycler MRSA Advanced Test segítségével sor kerül a feldolgozott minta PCR-vizsgálatára. PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A LightCycler MRSA Advanced Test primerei és próbái az MRSA DNS jelenlétét jelző, SCCmec kazetta S. aureus kromoszómába történt beépülésére utaló jellegzetes szekvenciát detektálnak. Amplifikáció A feldolgozott mintákat és a hot-start Taq-polimerázt tartalmazó amplifikációs mix a LightCycler kapillárisokba kerül (20 µl), ahol végbe megy a PCR-amplifikáció. Minden LightCycler MRSA Advanced Test reakció tartalmaz egy belső kontrollt, amelyet a minta gátlásának szabályozására és a reagens sértetlenségének ellenőrzésére terveztek. Minden LightCycler MRSA Advanced Test tartalmaz továbbá egy AmpErase (uracil-n-glikozidáz) enzimet. Az enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. Mivel a LightCycler MRSA Advanced Test segítségével készült amplikonok dezoxiuridint tartalmaznak, a előforduló amplikon-szennyeződések a hosszú hevítési lépés során még a PCR-amplifikáció kezdete előtt megsemmisülnek. A pozitív kontrollban egyidejűleg egy plazmid targetszekvencia amplifikálódik. Minden futás tartalmaz pozitív kontrollt, amely a reagens hibájának ellenőrzésére szolgál. Minden futás tartalmaz továbbá egy negatív kontrollt, amely az MRSA DNS-el történő reagens- vagy környezeti szennyeződés kimutatására szolgál. A PCR-termékek specifikus kimutatása hibridizációs próbákkal Az MRSA és a belső kontroll amplikonjai két specifikus hibridizációs próba segítségével fluoreszcens technikával mutathatók ki. A próbák az amplifikált fragmens specifikus belső szekvenciáihoz kapcsolódnak egymáshoz közel. Gerjesztéskor ezek a kötött próbák adott hullámhosszú fluoreszcens jelet bocsátanak ki a FRET-nek (fluoreszcens energia átvitele) nevezett folyamat által. A kibocsátott fényt a LightCycler 2.0 készülék méri. Az MRSA-ra és a belső kontrollra specifikus amplikonok kimutatása két különböző kimutatási csatornán párhuzamosan történik, ezáltal megkülönböztethetők. A valós idejű PCR-eljárás befejeztével a LightCycler 2.0 készülék automatikusan elvégzi az olvadási görbe elemzését. A hibridizációs próbához kötött egyszálú DNS-amplikonokat növekvő hőmérsékletnek teszik ki. Amikor a PCR-termék egy adott hőmérsékletet elér, a két kötött hibridizációs próba egyike leolvad, ami a fluoreszcens jel megszűnését eredményezi. A fluoreszcens jel csökkenése adott hőmérsékleten következik be, és ez olvadási csúcsokat eredményez, amelyekkel lehetővé válik az MRSA-ra és az IC-re specifikus amplikonok észlelése és megkülönböztetése. Eredmény automatikus létrehozása az olvadási görbe elemzése során A LightCycler szoftver T M sávjaiban az olvadási csúcsok vizuális azonosítását követően a vizsgálati eredmények a kijelölt kiértékelő eszközre (Micro Analysis szoftver) továbbítódnak, és elkészül a jelentés. 05548926001-02HU 2 Doc Rev. 2.0

REAGENSEK LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced líziskészlet (P/N: 05205743 190) LYS (roncsoló reagens) trisz puffer EDTA < 15% szilikongyöngy 0,09% nátrium-azid LYS ADV 96 teszt 96 x 0,6 ml LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: 05352894 190) LC MRSA 96 teszt MRSA RXNMX (MRSA reakciómix) trisz puffer < 0,1% magnézium-klorid kálium-klorid < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp 0,19% oktilglikozid 0,03% marha szérumalbumin (emlős) < 0,1% FastStart Taq DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid MRSA DETMX (MRSA detekciós mix) 0,05% Brij 35 oldat trisz puffer < 0,01% EDTA < 0,01% MRSA primerek < 0,01% MRSA-ra és MRSA belső kontrollra specifikus fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próbák 0,09% nátrium-azid 0,001% poli-ra RNS (szintetikus) < 0,001% MRSA primerkötő szekvenciákat és egy egyedi próbakötő szekvenciát tartalmazó, nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális) MRSA (+) C (MRSA pozitív kontroll) trisz puffer < 0,01% EDTA 0,002% poli-ra RNS (szintetikus) 0,09% nátrium-azid < 0,001% MRSA-szekvenciákat tartalmazó, nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális) 3 x 0,352 ml 3 x 0,176 ml 1 x 0,176 ml 05548926001-02HU 3 Doc Rev. 2.0

FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. B. Ez a teszt kizárólag nazális tamponos minták vizsgálatára alkalmas. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, köpenyt és szemvédőt a minták és a kit reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. E. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális szennyezését. Steril, egyszer használatos pipetták és pipettahegyek használata javasolt. F. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. G. Ne keverje a különböző gyártási tételű kitekből származó reagenseket. H. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. I. A kitet ne használja a szavatossági idő után. J. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Rocheirodában. K. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 14 és a CLSI Document M29-A3 15 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. L. A LYS, MRSA RXNMX, MRSA DETMX és MRSA (+) C nátrium-azidot tartalmaz. A nátriumazid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. M. Viseljen szemvédőt, köpenyt és egyszer használatos gumikesztyűt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagenseket kiömlés esetén a letörlés előtt vízzel hígítsuk. N. A pozitív kontrollokból és pozitív mintákból származó szennyeződés a helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartásával elkerülhető. TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. A LightCycler Advanced Lysis Kit (LYS) az átvételt követően függőleges helyzetben, 15 és 25 C között tárolja. B. A LightCycler MRSA Advanced Test Kitet (MRSA RXNMX, MRSA DETMX és MRSA (+) C) az átvételt követően függőleges helyzetben, -15 és -25 C között tárolja. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontás után a maradék MRSA RXNMX és MRSA DETMX reagenseket -15 és -25 C vagy 2 és 8 C között, legfeljebb 30 napig tárolja. Az MRSA RXNMX és MRSA DETMX reagenseket legfeljebb 5 fagyasztás-olvasztás ciklusnak lehet kitenni. 05548926001-02HU 4 Doc Rev. 2.0

C. Felbontás után a maradék MRSA (+) C reagenst -15 és -25 C között legfeljebb 30 napig, illetve 2 és 8 C között legfeljebb 30 napig tárolja. Az MRSA (+) C reagenst legfeljebb 22 fagyasztás-olvasztás ciklusnak lehet kitenni. D. Az MRSA DETMX reagenst óvja a fénytől. E. A master mix munkareagens (MRSA RXNMX és MRSA DETMX hozzáadásával készül) fénytől védve 2 és 8 C között legfeljebb 30 napig tárolható. F. A feldolgozott minták -15 és -25 C között legfeljebb 30 napig, 2 és 8 C között 6 napig, illetve 15 és 25 C között 1 napig tárolhatóak. G. Az amplifikációt azonnal el kell kezdeni, amint a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez adta. Amennyiben ez nem lehetséges, a töltött kapillárisokat fénytől védve, 2 és 8 C között legfeljebb 3 órán át tárolja. A KÉSZLET TARTALMA A. LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced líziskészlet (P/N: 05205743 190) LYS ADV LYS (roncsoló reagens) B. LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: 05352894 190) LC MRSA MRSA RXNMX (MRSA reakciómix) MRSA DETMX (MRSA detekciós mix) MRSA (+) C (MRSA pozitív kontroll) SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver LightCycler 2.0 készülék (P/N: 03 531 414 201) LightCycler szoftver 4.1 (P/N: 04 898 915 001) vagy magasabb LightCycler MRSA Advanced szoftverszett v1.0 CE (P/N: 05 414 326 190) vagy magasabb LC mintatárcsa-centrifuga 2.0 [P/N: 03 709 582 001 (230 V) vagy P/N: 03 709 507 001 (110 V)], illetve standard asztali mikrocentrifuga 2,0 ml csövekhez való rotorral és LC centrifuga-adapterekkel (P/N: 11 909 312 001) MagNA Lyser készülék [P/N: 03 358 976 001 (230 V) vagy 03 358 968 001 (110 V)] Opcionális vonalkód-leolvasó [P/N: 05 536 421 001] Reagensek és egyszer használatos anyagok LightCycler Multicolor Compensation Set (P/N: 04 484 355 001) LightCycler kapillárisok, 20 µl (P/N: 04 929 292 001) 05548926001-02HU 5 Doc Rev. 2.0

EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK BD CultureSwab Stuart-folyadék (BD P/N: 220109), illetve Copan Venturi Transystem Stuart-folyadék (Copan Italia International P/N: 139C); Vagy BD CultureSwab és szén nélküli Amies-gél (BD P/N: 220117), illetve Copan Venturi Transystem és szén nélküli Amies-gél (Copan Italia International P/N: 134C); Vagy BD CultureSwab és szenes Amies-gél (BD P/N: 220122), illetve Copan Venturi Transystem és szenes Amies-gél (Copan Italia International P/N: 136C) Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Géz, illetve olló Etanol (70 %) Állítható pipetták*: (kapacitás: 10 µl, 100 µl és 1000 µl) steril, DNáz-mentes, filteres vagy pozitív kiszorításos mikropipettahegyek 95 C-os szárazfűtőblokk (± 2 C): VWR (P/N: 12621-088) vagy ennek megfelelő blokk 2,0 ml-es csövek számára: VWR (P/N: 12985-050) 8000-20000 x g centrifugális erő kifejtésére képes mikrocentrifuga 2,0 ml-es csavarókupakos csövekhez való rotorral: P/N: 5417R típusú Eppendorf vagy ennek megfelelő Steril 1,5 ml-es, szilikonos polipropilén mikrocentrifugacső: P/N: 0030 108.051 rendelési számú Eppendorf vagy ennek megfelelő Vortex keverő: Fisher (P/N: 12-812) vagy ennek megfelelő Mikrocsőnyitó: VWR (P/N: 20170-688) vagy ennek megfelelő * A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését. A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA Megjegyzés: Valamennyi mintát és kontrollt fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. A minta levétele 1. Nedvesítse be a tampont két csepp (körülbelül 50 µl) steril sóoldattal, vagy használja szárazon. 2. Óvatosan helyezze a tampont az orrlyuk belsejébe, körülbelül 0,5 hüvelyk vagy 1,3 cm mélyen (duplafejű tampon esetében egyszerre mind a két fejet), és az orra kívülről enyhe nyomást gyakorolva ötször forgassa körbe a nyálkahártyán (így biztosítva a tamponfejek érintkezését az orr belsejével). 3. Helyezze ugyanazt a tampont a másik orrlyukba, és ismételje meg az eljárást. 4. Helyezze vissza a tampont a tartályba, és lássa el megfelelő felirattal. 05548926001-02HU 6 Doc Rev. 2.0

B. A minta transzportja és tárolása A minták transzportjának meg kell felelnie a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak 16. A minták 2 és 25 C között szállíthatóak. A mintákat feldolgozás előtt (a szállítás idejét is beleértve) a következők szerint lehet tárolni. Stuart-folyadékba levett tamponos minták stabilitása 15 és 25 C között legfeljebb 4 nap, 2 és 8 C között legfeljebb 5 nap, -20 C-on legfeljebb 30 nap. Szenes vagy szén nélküli Amies-gélbe levett tamponos minták stabilitása 15 és 25 C között legfeljebb 4 nap. HASZNÁLATI UTASÍTÁS Készülék előkészítése A. A Micro Analysis szoftver (MAS) telepítése A frissítések telepítése során ellenőrizze, hogy a termékhez mellékeltek-e kiegészítő információt. 1. Jelentkezzen be adminisztrátorként a LightCycler vezérlőegységén. 2. Helyezze be a LightCycler MRSA Advanced szoftverszett v1.0 CE CD-t (vagy magasabbat) a LightCycler vezérlőegységének CD-meghajtójába. Megjegyzés: Ha a program telepítője nem indul automatikusan, akkor a MAS manuális telepítésének megkezdéséhez kattintson duplán a LightCycler MRSA Advanced Software Set v1.0 (vagy újabb verziójú) CE CD-n található setup.exe fájlra. 3. Első alkalommal történő telepítés: a. ha a Microsoft Data Access Components 2.8 még nincs telepítve, a MAS beállításának megkezdésekor annak telepítésére vonatkozó figyelmeztetés jelenik meg. A Microsoft Data Access Components 2.8 telepítése kötelező, különben a MAS nem fog megfelelően működni. b. ha a Microsoft.NET keretrendszer 2.0 (x86) még nincs telepítve, a MAS beállításának megkezdésekor annak telepítésére vonatkozó figyelmeztetés jelenik meg. A Microsoft.NET keretrendszer 2.0 (x86) telepítése kötelező, különben a MAS nem fog megfelelően működni. c. ha a Microsoft Windows Installer 3.1 még nincs telepítve, a MAS beállításának megkezdésekor annak telepítésére vonatkozó figyelmeztetés jelenik meg. A Microsoft Windows Installer 3.1 telepítése kötelező, különben a MAS nem fog megfelelően működni. d. ha a Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer még nincs telepítve, a MAS beállításának megkezdésekor annak telepítésére vonatkozó figyelmeztetés jelenik meg. A Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer telepítése kötelező, különben a MAS nem fog megfelelően működni. e. ha a Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) még nincs telepítve, a MAS beállításának megkezdésekor annak telepítésére vonatkozó figyelmeztetés jelenik meg. A Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) telepítése kötelező, különben a MAS nem fog megfelelően működni. 4. Ha újraindítás szükséges, erősítse meg a <Yes> gomb megnyomásával. 05548926001-02HU 7 Doc Rev. 2.0

Megjegyzés: Ne távolítsa el a LightCycler MRSA Advanced szoftverszett CD-t az újraindítás során. 5. Az újraindítás után kövesse a telepítővarázsló utasításait. Nyomja meg a <Next> gombot a MAS telepítésének elindításához. 6. Válassza a <Just Me> lehetőséget, ha csak egy felhasználó fog dolgozni a LightCycler vezérlőegységén, vagy az <Everyone> lehetőséget, ha egynél több felhasználó fog dolgozni a LightCycler vezérlőegységén. 7. A MAS sikeres telepítését erősítse meg a <Close> gomb megnyomásával az <Installation Complete> ablakban. 8. Futtassa az alkalmazást a számítógép munkaasztalának MAS ikonja segítségével. 9. A *.ixo és *.pdf fájlok adatmappája: <C:\Export to MAS> a MAS elindításakor automatikusan létrejön. B. A Micro Analysis szoftver (MAS) telepítésének megerősítése 1. Másolja a keretfájlokat (LightCycler MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.ixo és LightCycler MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.pdf vagy magasabb) a LightCycler MRSA Advanced szoftverszett v1.0 (vagy magasabb) CE CD-ről a <C:\Export to MAS> mappába. 2. Ha a MAS még nincs megnyitva, kattintson duplán a munkaasztal MAS ikonjára, és nyomja meg a <Load> gombot. 3. Válassza ki az MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.ixo (vagy magasabb) fájlt a <C:\Export to MAS> mappában. 4. Nyomja meg a <NO> gombot jelezve, hogy a LightCycler jelentés nem tartalmazza a <User Developed or Modified Test Method> jelzőt. 5. Írja be a tételszámot, a lejárati időt és a laboradatokat az MRSA konfigurációs beállítások ablak megfelelő mezőibe. Advanced Lysis Kit Lot No 11A00000 Expiration Date 12201812 MRSA Advanced Test Lot No 23A00000 Expiration Date 24201812 Egyéni információ Lab Info Roche laboratórium 6. Válassza ki az <MRSA Combined> jelentés típust és erősítse meg az <OK> gombbal. A program automatikusan elemzi a fájlt, és megjeleníti az adatokat. 7. Nyomtassa ki a jelentést. 8. Nyissa meg és nyomtassa ki az MRSA Advanced Proof File v1.0 CE.pdf (vagy magasabb) fájlt (a <C:\Export to MAS> mappában található). 05548926001-02HU 8 Doc Rev. 2.0

9. Bizonyosodjon meg arról, hogy a kinyomtatott MAS jelentés és a kinyomtatott PDF ugyanazokat az eredményeket tartalmazza. Amennyiben nem, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével műszaki segítségért. A. A Micro Analysis szoftver (MAS) eltávolítása 1. Jelentkezzen be adminisztrátorként a LightCycler vezérlőegységén. 2. Nyomja meg a <Start> gombot a LightCycler vezérlőegységének tálcáján. 3. Válassza a <Start> / <Control Panel> / <Add/Remove Programs> lehetőséget a Windows munkaasztal bal alsó sarkában. 4. Megjelenik az aktuálisan telepített programok listája, itt kattintson a <MAS> lehetőségre. 5. Válassza ki a <Remove> lehetőséget, és erősítse meg a <Yes> gomb megnyomásával. Megjegyzés: Az MSS CD tartalmaz egy eltávolító és egy javító funkciót. Az eltávolító funkció is használható a leírt eljárásra. A javító funkció a Micro Analysis szoftver sérült vagy hiányzó fájljainak helyreállítására használható. D. A LightCycler MRSA Advanced makrók telepítése 1. Telepítse a *.lckit makrókat: LightCycler MRSA Advanced MCC makró v1.0 (MRSA MCC_04484355001A_1.0.Ickit) vagy magasabb és LightCycler MRSA Advanced makró v1.0 CE (MRSA_05352894190_1.0. Ickit) vagy magasabb a LightCycler MRSA Advanced szoftverszett v 1.0 (vagy magasabb) CE CD-ről. 2. Kérjük, tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvében a Roche makró végrehajtása fejezetet. E. Színkompenzációs eljárás a LightCycler 2.0 készülékkel együttes használatra való LightCycler Multicolor Compensation Set használatával Végezze el a következő lépéseket, ha új színkompenzációs fájlt szeretne létrehozni, vagy egy lejártat helyettesíteni. 1. Olvassza ki az 1, 2, 3 és 5 jelű csöveket, óvatosan keverje meg és röviden pörgesse le azokat. 2. A 2. cső tartalmának 3-szoros hígításához keverje össze: a. A 2. csőben levő 10 µl oldatot b. 20 µl puffert a LYS csőből, üveggyöngyök átvitele nélkül 3. Pipettázzon minden komponensből 10 µl-t a LightCycler külön kapillárisaiba (20 µl). a. 1. kapilláris: 1. cső b. 2. kapilláris: E2 hígítási lépés c. 3. kapilláris: 3. cső d. 4. kapilláris: 5. cső Megjegyzés: A futtatás végeztével semmisítse meg a 2. cső hígított tartalmát. 4. Pipettázzon 10 µl puffert a LYS jelű csőből (üveggyöngyök átvitele nélkül) minden egyes kapillárisba a teljes 20 µl-es térfogat eléréséhez. 5. A kupakozó eszköz segítségével zárja le dugóval a kapillárisokat. 05548926001-02HU 9 Doc Rev. 2.0

6. Centrifugálja a kapillárisokat a LC mintatárcsa-centrifuga 2.0, illetve standard centrifuga és centrifuga-adapterek segítségével. A csöveknek a következő pozíciókat kell elfoglalniuk a mintatárcsában: a. 1. mintatárcsa-pozíció: CCB (1. cső) b. 2. mintatárcsa-pozíció: CC530 (2. cső) c. 3. mintatárcsa-pozíció: CC610 (3. cső) d. 4. mintatárcsa-pozíció: CC670 (5. cső) Megjegyzés: Ne csökkentse a térfogatot az egyes kapillárisokban. 7. Vigye át a LightCycler mintatárcsát a LightCycler 2.0 készülékbe. Ha hagyományos centrifugát használt, tegye át a kapillárisokat az E6 lépésben leírt módon a LightCycler mintatárcsába. Megjegyzés: Ne változtassa meg a reagensek sorrendjét a tárcsában. 8. Indítsa és mentse el a színkompenzációs eljárást (Color Compensation Experiment, CCE). a. Az MRSA Advanced makró használatához kérjük, tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvében a Roche makró végrehajtása fejezetet. Megjegyzés: Ne használja az <assay lot number> mezőt. Ha szeretné a vizsgálat tételszámát hozzáadni az eljáráshoz, szúrja be az adatot a mintaszerkesztő megfelelő mezőjébe. 9. A futtatás validálása b. Mentse el a futtatást egy rövid, egyedi név segítségével (pl. MRSA_CCE_ÉÉHHNN-xx, É=év, H=hónap, N=nap, xx=futtatás száma). c. A futtatás befejezését követően automatikusan létrejön egy jelentés. d. Nyomtassa ki a jelentést. A jelentésen nem szerepel, hogy az MCC futtatása sikeres (érvényes) volt-e. Az MCC-futtatás érvényessége csak az MCC futtatása utáni első MRSA Advanced-futtatás során állapítható meg. a. Ha a LightCycler Multicolor Compensation Set jelentése jelzőt kap (pl. <User Developed or Modified Test Method>), a futtatás érvénytelen. Ismételje meg a futtatást. b. Ha a LightCycler Multicolor Compensation Set jelentése nem kap jelzőt, folytassa a következő lépéssel. Megjegyzés: Ha a LightCycler MRSA Advanced Test során a negatív kontroll (NC) vagy az MRSA (+) C következetesen érvénytelen, előfordulhat, hogy hibás a LightCycler színkompenzációs fájl. Ismételje meg a színkompenzációs futtatást vagy vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével műszaki segítségért. 05548926001-02HU 10 Doc Rev. 2.0

10. Színkompenzációs objektum (Color Compensation Object, CCO) létrehozása. a. Aktiválja a Color Compensation vizsgálati módot, és nyomja meg a <save CC object> gombot. b. Hozzon létre egy rövid, egyedi nevet; annak érdekében, hogy a a Micro Analysis szoftver (MAS) egyértelműen tudja azonosítani, a színkompenzációs objektum egyezményes elnevezése: MRSA_CCO_ÉÉHHNN-xx (É=év, H=hónap, N=nap, xx=futtatás száma). c. Ez az objektum a LightCycler MRSA Advanced Test segítségével végzett vizsgálatok további elemzésére szolgál. Minta és kontroll előkészítése A. Minta-előkészítés 1. Minden betegminta számára jelöljön meg megfelelően egy LYS csavarókupakos csövet. Megjegyzés: Ne a kupak tetején jelölje meg a csöveket. 2. Vegye ki a tampont a szállítótartályból. 3. Helyezzen egyetlen tamponfejet egy LYS-csőbe. 4. A tampont a nyelénél fogva tartsa a cső pereméhez közel, eressze bele a cső aljától pár milliméter távolságig, és a nyelet a cső peremének feszítve addig hajlítsa, amíg eltörik. Ollót is használhat a tampon nyelének elvágásához a cső peremének közelében. Az egyes tamponok levágása között törölje tisztára az olló éleit 70%-os etanollal (vagy Microziddal) átitatott ruhával. Megjegyzés: A tampon letörésekor bekövetkező szennyezés kockázatának minimalizálására használjon gézt. Használjon új gézt minden egyes tampon esetében. 5. Zárja le a LYS kupakját szorosan. B. A negatív kontroll előkészítése Megjegyzés: A NC reagenst a vizsgálandó mintákkal egyidőben kell elkészíteni. 1. Minden negatív kontroll számára jelöljön meg megfelelően egy LYS csavarókupakos csövet. Megjegyzés: Ne a kupak tetején jelölje meg a csöveket. 2. Helyezzen egy steril tampont annak szállítótartályába. Az ajánlott tamponok felsorolásáért tanulmányozza az Egyéb szükséges, de nem biztosított anyagok részt. 3. Inkubálja 1 percig szobahőmérsékleten. 4. Vegye ki a tampont a szállítótartályból. 5. Helyezzen egyetlen tamponfejet egy LYS-csőbe. 6. A tampont a nyelénél fogva tartsa a cső pereméhez közel, eressze bele a cső aljától pár milliméter távolságig, és a nyelet a cső peremének feszítve addig hajlítsa, amíg eltörik. Ollót is használhat a tampon nyelének elvágásához a cső peremének közelében. Megjegyzés: A tampon letörésekor bekövetkező szennyezés kockázatának minimalizálására használjon gézt. Zárja le a LYS kupakját szorosan. 05548926001-02HU 11 Doc Rev. 2.0

C. A minta és kontroll előkészítése 1. Szárazfűtőblokkban melegítse a mintákat és negatív kontrollt 95 ± 2 C-on 2 percig. 2. A MagNA Lyser készülékben roncsolja a mintákat és negatív kontrollt 70 másodpercig 5000 rpm fordulatszámon. A felhasználásra vonatkozó részletekért tanulmányozza a MagNA Lyser készülék felhasználói kézikönyvét. 3. Centrifugálja a mintákat és negatív kontrollt szobahőmérsékleten, 8000 20000 x g sebességen 1 percig. Megjegyzés: A feldolgozott minták -15 és -25 C között legfeljebb 30 napig, 2 és 8 C között 6 napig, illetve 15 és 25 C között 1 napig tárolhatóak. Reagens-előkészítés 1. Olvassza ki az MRSA RXNMX és MRSA DETMX és MRSA (+) C reagenst szobahőmérsékleten. Győződjön meg arról, hogy a reagensek teljesen kiolvadtak a használat előtt. 2. Vortexelje az MRSA RXNMX és MRSA DETMX és MRSA (+) C reagenseket 3-5 másodpercig, és röviden pörgesse le centrifugában, hogy az anyag a cső aljában gyűljön össze. 3. Készítse el a master mix munkareagenst egy steril, szilikonos polipropilén mikrocentrifugacsőbe a megfelelő számú vizsgálandó minta és kontroll számára. (Útmutatásért használja az 1. táblázatot.) Megjegyzés: Az előírt térfogatok a negatív és pozitív kontroll 2 reakcióját és egy térfogatfelesleget tartalmaznak, a holt térfogatokat számításba véve és a keverékcsőből a LC kapillárisokba történő pipettázás megkönnyítésére. Megjegyzés: Ha szükséges, használja a Microtube eszközt (VWR P/N 2017-688) vagy ennek megfelelőt az MRSA RXNMX és MRSA DETMX kinyitásának megkönnyítésére. 05548926001-02HU 12 Doc Rev. 2.0

1. táblázat A Master mix munkareagens előkészítése Mintaszám MRSA RXNMX térfogat (µl) MRSA DETMX térfogat (µl) Össztérfogat (µl)* 1 40 20 60 2 50 25 75 3 60 30 90 4 70 35 105 5 80 40 120 6 90 45 135 7 100 50 150 8 110 55 165 9 120 60 180 10 130 65 195 11 150 75 225 12 160 80 240 13 170 85 255 14 180 90 270 15 190 95 285 16 200 100 300 17 210 105 315 18 220 110 330 19 230 115 345 20 240 120 360 21 260 130 390 22 270 135 405 23 280 140 420 24 290 145 435 25 300 150 450 26 310 155 465 27 320 160 480 28 330 165 495 29 340 170 510 30 350 175 525 *Tartalmazza a NC, az MRSA (+) C és a holttérfogatot. 05548926001-02HU 13 Doc Rev. 2.0

4. Vortexelje a master mix munkareagenst 3-5 másodpercig, és röviden pörgesse le centrifugában, hogy az anyag a cső aljában gyűljön össze. A master mix munkareagens fénytől védve, 2 és 8 C között legfeljebb 30 napig tárolható. A feldolgozott minta és kontroll előkészítése 1. Helyezze a kívánt számú LightCycler kapillárist a LC tárcsába vagy a centrifuga-adapterekbe. Egy (1) kapilláris szükséges a PC (1. pozíció), 1 kapilláris a feldolgozott NC (2. pozíció), és 1 kapilláris minden egyes feldolgozott minta (3. és további pozíciók) számára. Megjegyzés: A LightCycler kapillárisokat a rezervoár résznél fogja meg. 2. Pipettázzon 15 µl master mix munkareagenst minden kapilláris rezervoárjába. 3. Pipettázzon minden feldolgozott minta tiszta felülúszójából 5 µl-t a megfelelő kapillárisokba (3. és továbbiak). Minden pipettázási lépés után cseréljen hegyet. 4. Pipettázzon 5 µl feldolgozott negatív kontrollt a 2. kapillárisba. Megjegyzés: A feldolgozott minták -15 és -25 C között legfeljebb 30 napig, 2 és 8 C között 6 napig, illetve 15 és 25 C között 1 napig tárolhatóak. Ha fagyasztott feldolgozott mintát használt, olvassza ki szobahőmérsékleten, vortexelje 10 másodpercig, majd centrifugálja le 8000 20000 x g sebességen, szobahőmérsékleten 1 percig. 5. Pipettázzon 5 µl felolvasztott MRSA (+) C reagenst az 1. kapillárisba. 6. A kupakozó eszköz segítségével zárja le dugóval a kapillárisokat. 7. Centrifugálja a kapillárisokat a LC mintatárcsa-centrifuga 2.0, illetve standard centrifuga és centrifuga-adapterek segítségével. 8. Vigye át a LightCycler mintatárcsát a LightCycler 2.0 készülékbe. Megjegyzés: Ha hagyományos centrifugát használt, tegye át a kapillárisokat az 1. lépésben leírt módon a LightCycler mintatárcsába. Megjegyzés: Az amplifikációt azonnal el kell kezdeni, amint a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez adta. Amennyiben ez nem lehetséges, a töltött kapillárisokat fénytől védve, 2 és 8 C között legfeljebb 3 órán át tárolja. LightCycler 2.0 készülék betöltése és működtetése 1. Lépjen be a LightCycler szoftverbe. 2. Indítsa el a LightCycler MRSA Advanced makró v1.0 CE (MRSA_05352894190_1.0.Ickit) vagy magasabb (részletekért tanulmányozza a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyvében a Roche makró végrehajtása fejezetet). Megjegyzés: Ne használja az <assay lot number> mezőt. Ha szeretné a vizsgálat tételszámát hozzáadni a futtatáshoz, szúrja be az adatot a mintaszerkesztő megfelelő mezőjébe. 3. Nevezze el a futtatást egy egyedi azonosítóval. 4. Csökkentse le az alapértelmezett betöltési listát a vizsgálni kívánt mintaszámra. Ha véletlenül túl sok kapillárist törölt, ismételje meg az eljárást a 2. lépéstől. 5. Olvastassa be a vonalkódcímkéket vagy vigye be manuálisan a mintaneveket a mintanévmezőbe, illetve hagyja meg az alapértelmezett beállításokat. A <Run Note> mezőbe is írhat adatokat, ha szükséges. Megjegyzés: Ne módosítsa a pozitív és negatív kontrollok alapértelmezett nevét. 6. Kövesse a képernyőn megjelenő utasításokat, és indítsa el a LightCycler MRSA Advanced Test futtatását. 05548926001-02HU 14 Doc Rev. 2.0

EREDMÉNYEK Csúcsazonosítás és az eredmény automatikus elemzése: Megjegyzés: Ne kezdje meg az adatelemzést, amíg a LightCycler futtatása zajlik. A T M manuális analízise kézi vezérlést igényel két automatikusan alkalmazott T M -elemző modulban. Az abszolút kvantifikációs modulok ebben a vizsgálatban nem használhatóak. Az olvadási csúcs ablakban a kiválasztott grafikonok valamennyi görbéje megjelenik. Mindegyik analízismodul T M sávja az MRSA Advanced makróban előzetesen meg van határozva. Jelző létrehozása nélkül is lehetséges egy T M sávot kijelölni, illetve törölni. Minden analízismodul alapvonala a következő táblázatnak megfelelően az MRSA Advanced makróban előre meg van határozva, amit tilos törölni, illetve megváltoztatni. Ha véletlenül módosította, írja be a helyes értékeket a 2. táblázat alapján. 2. táblázat Alapvonalértékek CH 610 CH 670 Alapvonalértékek 0,085 0,100 Megjegyzés: Ne módosítsa az alábbi beállításokat: <Channel>, <Color Compensation>, <Program>, <Method>, <Show Shoulders>, <Peak Area> vagy <Peak Width>. A csúcsok, mint alapvonal feletti maximumok vannak definiálva. A vállak nem számítanak csúcsnak. Példák tipikus pozitív kontroll (1. grafikon, 610. csatorna) és belső kontroll (2. grafikon, 670. csatorna) csúcsokra és vállas csúcsra (3. grafikon): 1. grafikon 2. grafikon 05548926001-02HU 15 Doc Rev. 2.0

3. grafikon A T M sávok beállítása: 1. A futtatás befejezése után a vizsgálati varázsló kiírja az <Analyses have been created> üzenetet. 2. Vigye az üzenetablakot a képernyő aljára, hogy lássa a T M - és alapvonalértékeket (ne nyomja meg a <Finish> gombot). 3. Kattintson a T M -elemzés 610 analízismodulra, így megjelenik egy áttekintés minden kijelzett pozícióról. 4. Vegye le a grafikont megjelenítő ablak méretét az ablak bal kezelősávjának jobbra csúsztatásával; a Baseline, TM1 és Height1 oszlopok így láthatóvá válnak. Megjegyzés: Több, mint egy pozíció kiválasztásakor az elsőként kiválasztott kapilláris beállításai jelennek meg. Megjegyzés: A sávok közti váltás valamennyi aktivált és kiválasztott kapillárist érinti. 5. Kattintson a pozitív kontroll (#PC#) pozícióra annak kiválasztásához. 6. Ha a T M -sáv nem a csúcsmaximumoknál (az alapvonal fölött) helyezkedik el, mozgassa azt a csúcsmaximumokra, a megadott T M -tartományokra fókuszálva (lásd 3. táblázat). 7. Ha nincsenek alapvonal feletti csúcsok, hagyja a T M -sávot az alapértelmezett pozícióban. Győződjön meg arról, hogy a sávok nem egy jelenlévő csúcs meredekségét jelölik-e (pl. a megadott T M -tartományon kívül). 8. Győződjön meg arról, hogy a minta értékei megjelentek-e a TM1 és Height1 oszlopokban (bármilyen érték). Ha nem látható érték (üres mező), helyezze vissza a T M -sávot a csúcsmaximumokra, így már meg kell, hogy jelenjenek az értékek a TM1 és Height1 oszlopokban. 3. táblázat Megadott T M -tartományok MRSA (CH 610) Belső kontroll (CH 670) Alacsony T M ( C) Magas T M ( C) 57,00 62,00 57,00 62,00 Megjegyzés: A csúcs nélküli minták (pl. negatív kontroll) esetében az automatikus kiértékelés a legmagasabb háttérértékű csúcsra fog beállni. Ebben az esetben az előre meghatározott alapvonal lehet, hogy nem jelenik meg. Ha szeretné láthatóvá tenni az alapvonalat, jelölje ki ezt a kapilláris-pozíciót a pozitív kontrollal együtt. Megjegyzés: A megadott T M -tartományon kívül eső megjelölt csúcsok meg fognak jelenni a MAS-jelentésben. 05548926001-02HU 16 Doc Rev. 2.0

9. Folytassa a további pozíciók (kontrollok és minták) csúcsdetektálását az 5-8. lépésekben leírtaknak megfelelően. 10. Kattintson a T M -elemzés 670 analízismodulra. 11. Folytassa a további pozíciók (kontrollok és minták) csúcsdetektálását az 4-8. lépésekben leírtaknak megfelelően. T M -elemzés befejezése: 1. Mozgassa a vizsgálati varázslót vissza a képernyő közepére, és nyomja meg a <Finish> gombot. 2. A program automatikusan létrehoz és kinyomtat egy LightCycler jelentést. 3. Ellenőrizze a LightCycler jelentésen az esetleges jelzőket, és hogy a <run state: complete> üzenet megjelent-e. Ha jelzők vagy egyéb hibaüzenetek láthatóak, tanulmányozza a Minőség-ellenőrzés és az Eredmények értékelése részeket. 4. A futtatást a program automatikusan elmenti. Megjegyzés: Ha az felhasználó a LightCycler szoftver bármelyik mintamezőjében a mentés után megváltoztatta a nevet, mindenképpen frissítse az adatállományt az Abs Quant 610 és Abs Quant 670 ikonok kiválasztásával és rákattintással. A LightCycler jelentés ismételt kinyomtatása. 5. Exportálja az *.ixo fájlt a <File> \ <Export> lehetőségre kattintva a <C:\Export to MAS> mappába. Eredmény automatikus elemzése a Micro Analysis szoftver (MAS) segítségével: 1. Kattintson kétszer a számítógép munkaasztalának MAS ikonjára, és nyomja meg a <Start> gombot. 2. Válassza ki az elemezni kívánt futtatást a <C:\Export to MAS> mappából, és töltse be az *.ixo fájlt. 3. Válaszoljon a Does the LightCycler report contain the flag <User Developed or Modified Test Method>? kérdésre a LightCycler jelentésnek megfelelően. 4. Olvassa be vagy vigye be manuálisan az Advanced Lysis Kit és LightCycler MRSA Advanced Test mellé tartozó tételszámot és lejárati dátumot. 5. Ha kívánja, írja be a személyes információkat (pl. felhasználó neve). Megjegyzés: A program ettől a ponttól a MAS-ba legutóbb beírt információt fogja használni. 6. Válassza ki a kívánt jelentésformátumot (táblázat, csoportosított vagy kombinált). 7. A *.ixo fájlt a program automatikusan feldolgozza, és az adatokat a választott jelentésformátumban megjeleníti. 8. Nyomtassa ki a MAS-jelentést és/vagy exportálja *.pdf fájlként. 05548926001-02HU 17 Doc Rev. 2.0

EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE 1. Az eredményeket a LightCycler szoftver automatikusan kiszámolja a mért fluoreszcens jel és a beépített számítási algoritmus alapján, és megjeleníti a Micro Analysis szoftver (MAS) segítségével. 2. A futtatás, kontrollok és minta validálását a MAS automatikusan elvégzi. Megjegyzés: Jelzők és megjegyzések jelenhetnek meg a RUN STATUS, CONTROLS STATUS és SAMPLE STATUS állapotokkal kapcsolatban. A felhasználónak ellenőriznie kell, hogy a kinyomtatott MAS jelentés bármelyik mezője tartalmaz-e jelzőket vagy megjegyzéseket. 3. Ha a futtatás érvényes, az eredményeket az alábbiak szerint kell értékelni: CH 610 eredmény (MRSA) POZITÍV CH 670 eredmény (IC) POZITÍV vagy NEGATÍV MRSA eredmény NEGATÍV NEGATÍV NEGATÍV POZITÍV Megjegyzés DETECTED - NOT DETECTED IC not detected - Magyarázat A minta pozitív MRSA DNS-re. MRSA nazális kolonizáció feltételezhető. Érvénytelen eredmény. Ismételje meg a PCReljárást frissen kiolvasztott feldolgozott mintával vagy új mintával. A minta negatív MRSA DNS-re. MRSA nazális kolonizáció nem valószínű. A MAS a pozitív kontrollra, negatív kontrollra és mintaeredményre vonatkozó további megjegyzéseket jelenthet: Megjegyzés Peak(s) outside Target T M range Peak(s) outside IC T M range Magyarázat Amplikon detektálható a megadott MRSA T M -tartományon kívül Amplikon detektálható a megadott IC T M -tartományon kívül Ha a MAS Peak(s) outside Target T M range megjegyzést jelenít meg egy olyan mintára, amely vagy Not Detected / Valid, vagy Invalid / Invalid ( MRSA Result és Status oszlopok a MASeredményben), akkor a mintát valószínűsíthetően MRSA DNS-re pozitívnak kell értékelni. Gyűjtsön másik mintát (vagy használja a megmaradt tampont egy duplafejű tamponról), és végezze el újra a vizsgálatot egy alternatív eljárással, például tenyésztéssel, hogy meghatározza a beteg nazális kolonizációs státuszát. Ha a mintaeredmény Detected / Valid ( MRSA Result és Status oszlopok a MAS-eredményben), és amelynél a MAS Peak(s) outside Target T M range megjegyzést jelenít meg, akkor a mintát MRSA DNS-re pozitívnak kell értékelni (MRSA nazális kolonizáció feltételezhető). Ezeknek a megjegyzéseknek a jelenléte a MAS-eredmény Controls Status oszlopában nem változtatja meg a Controls Status vagy a Run Status MAS által létrehozott, MAS-eredményen is megjelenő értelmezését. 05548926001-02HU 18 Doc Rev. 2.0

4. A MAS a következő jelzőket jelezheti ki: Jelző Megjegyzések Magyarázat Állapot Javító intézkedés Invalid macro version User Developed or Modified Test Method Lysis Kit expired MRSA Test expired File could not be loaded CCO expired on YYMMDD 1 - CCO NAME MULTIPLE CCO USED - - - - - Nem a megfelelő makrót alkalmazta A lehetséges okokat a LightCycler 2.0 készülék Felhasználói kézikönyve ismerteti (pl. makró alapértelmezett beállításainak módosítása). A LightCycler Advanced Lysis Kit lejárt A LightCycler MRSA Advanced Test lejárt A színkompenzációs fájl hat hónapnál régebbi. A színkompenzációs objektum neve helytelen Az analízismodulok eltérő színkompenzációs fájlokat alkalmaztak Run Run Run Run Run Run Run Ismételje meg az eljárást. Keresse meg a megfelelő makrót a LightCycler szoftverben és/vagy az MRSA Advanced szoftverszettben. Ha további jelzők is megjelennek, tanulmányozza a megfelelő jelzőhöz tartozó javító beavatkozást. Ha nem jelent meg további jelző, ismételje meg az eljárást. Ha ez a jelző következetesen megjelenik, kérjük, hívja a helyi Roche szervizt. Ismételje meg az eljárást nem lejárt reagensekkel. Ismételje meg az eljárást nem lejárt reagensekkel. Végezzen el egy új színkompenzációs eljárást, és hozzon létre egy új színkompenzációs objektumot. Ismételje meg az eljárást, amelyet a lejárt CCO-val végzett. Végezzen el egy új színkompenzációs eljárást, és hozzon létre egy új színkompenzációs objektumot az ebben a dokumentum megadott egyezményes elnevezésnek megfelelően. Ismételje meg az eljárást, amelyet az érvénytelen CCO-val végzett. Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és válassza ki a helyes színkompenzációs objektumot. Mentse el és nyomtassa ki a LightCycler jelentést, és exportálja újból. 05548926001-02HU 19 Doc Rev. 2.0

Jelző Megjegyzések Magyarázat Állapot Javító intézkedés NO CCO USED LCS VERSION BASELINE NC PC NC NAME PC NAME - - - NC: Target peak(s) detected NC: IC not detected PC: PC not detected - - Az analízismodulokból egy vagy több színkompenzációs fájl hiányzik. Nem megfelelő LightCycler szoftververziót alkalmaztak az eljáráshoz Lehetséges, hogy az alapvonalértékeket véletlenül módosították. Amplikon(ok) detektálható(ak) az MRSA negatív kontroll T M - tartományban. A negatív kontrollnál nem detektálható IC Nem detektálható MRSA target A negatív kontroll alapértelmezett neve megváltozott A pozitív kontroll alapértelmezett neve megváltozott 1 A MAS a reagens lejáratára 30 nappal előbb figyelmeztet. Run Run Run Controls Controls Controls Controls Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és válassza ki a helyes színkompenzációs objektumot. Mentse el és nyomtassa ki a LightCycler jelentést, és exportálja újból. Nyissa meg a LightCycler szoftvert és ellenőrizze, hogy a verziószám megfelelő-e. Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és javítsa ki az alapvonal értékeket a 2. táblázat szerint. Mentse el, nyomtassa ki és exportálja újból a LightCycler jelentést. lásd a Minőségellenőrzés részt lásd a Minőségellenőrzés részt Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és írja be a #NC#-t. Mentse el és nyomtassa ki a LightCycler jelentést és exportálja újból. Nyissa meg az eredeti *.ixo fájlt a LightCycler szoftverben, és írja be a #PC#-t. Mentse el és nyomtassa ki a LightCycler jelentést és exportálja újból. 05548926001-02HU 20 Doc Rev. 2.0

MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS 1. A LightCycler MRSA Advanced Test belső kontrollt (IC) tartalmaz. A IC reagenst a minta gátlásának szabályozására és a reagens sértetlenségének ellenőrzésére tervezték. a. Belső kontroll (IC) Az IC pozitív kell, hogy legyen valamennyi MRSA negatív mintában és a negatív kontrollban (NC) is. Ha az IC egy negatív mintában negatív, a minta nem érvényes, és a PCR eljárást frissen kiolvasztott feldolgozott mintával meg kell ismételni. Ha az IC az NC reagensben negatív lesz, az egész futtatás érvénytelen, és fagyasztott feldolgozott mintákkal vagy új mintákkal meg kell ismételni. Ha a megismételt futtatás a fagyasztott feldolgozott mintából szintén érvénytelen, lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. Az IC eredmény nincs figyelembe véve az MRSA pozitív minták és az érvényes pozitív kontroll esetében, mivel az MRSA amplifikáció konkurálhat ezzel a kontrollal. 2. Minden futtatás során legalább 1 pozitív kontrollt és 1 NC reagenst kell feldolgozni. A pozitív kontroll a reagens hibájának ellenőrzésére szolgál. A NC a reagens vagy környezeti MRSA DNS szennyeződés kimutatására használatos. Az amplifikációs reagens tartalmaz egy enzimet, amely megakadályozza az MRSA amplikonokkal való szennyeződést. A LightCycler szoftver automatikusan meghatározza mindkét kontroll helyzetét a készülékben. a. Negatív kontroll (NC) Az NC-nel negatívnak kell lennie, ugyanakkor annak belső kontrollja pozitív. Ha az NC nem felel meg ezeknek a feltételeknek, az egész futtatás érvénytelen, és fagyasztott feldolgozott mintákkal vagy új mintákkal meg kell ismételni. Ha a megismételt futtatás szintén érvénytelen, lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. b. Pozitív kontroll (PC) A PC-nek pozitívnak kell lennie (pozitív vagy negatív IC-vel). Ha a PC nem felel meg ennek a feltételnek, az egész futtatás érvénytelen, és fagyasztott feldolgozott mintával vagy új mintával meg kell ismételni. Ha a megismételt futtatás szintén érvénytelen, lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. 3. A Micro Analysis szoftver (MAS) a futtatás során jelzőket és megjegyzéseket hozhat létre. A kezelő személynek ellenőriznie kell a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. Kontroll Negatív kontroll CH 610 eredmény (MRSA) NEGATÍV POZITÍV NEGATÍV POZITÍV CH 670 eredmény (IC) POZITÍV POZITÍV vagy NEGATÍV NEGATÍV POZITÍV vagy NEGATÍV Magyarázat Érvényes futás, beavatkozásra nincs szükség. Érvénytelen futás, futtasson új mintákat. Érvénytelen futás, ismételje meg a futtatást fagyasztott feldolgozott mintákkal (vagy új mintákkal). Ha a megismételt futtatás a fagyasztott feldolgozott mintából szintén érvénytelen, lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. Érvényes futás, beavatkozásra nincs szükség. Pozitív kontroll NEGATÍV POZITÍV vagy NEGATÍV Érvénytelen futás, ismételje meg a futtatást fagyasztott feldolgozott mintákkal (vagy új mintákkal). Ha a megismételt futtatás a fagyasztott feldolgozott mintából szintén érvénytelen, lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. 05548926001-02HU 21 Doc Rev. 2.0

4. Külső pozitív kontroll (EPC) A MicroBioLogics KWIK-STIK MRSA pozitív kontroll (P/N: 0158ROCHE) a LightCycler MRSA Advanced Test betanítására, szakmai ellenőrzésére és külső minőségi kontrollként alkalmazható. Pozitív kontrollként egy RE2 típusú reprezentatív MRSA-törzs használatos. Az RE3 és RE7 típusú reprezentatív MRSA-törzs, amennyiben rendelkezésre áll, kiegészítő külső pozitív kontrollként alkalmazható a nem közvetlenül szabályzott vizsgálati primerek és próbák ellenőrzésére. A külső kontrollok a helyi, állami és szövetségi akkreditáló szervezeteknek megfelelően használhatóak. A tampon előkészítéséhez kövesse a KWIK-STIK felhasználási útmutatóját, de ne tegye a tampont a tápközegre. A tampon nedves anyaggal történő átitatása után kövesse a LightCycler MRSA Advanced Test felhasználási útmutatójának tamponos minta előkészítésére és vizsgálatára vonatkozó utasításait. Megjegyzés: A mai napig 5 SCCmec típust (I V) különítettek el, valamint ezen SCCmec típusoknak számos variánsát írták le 5. A LightCycler MRSA Advanced Test egy olyan egyedi kimutatási rendszeren alapul, amely az SCCmec kazetta orfx génhez csatlakozó jobb végének (right extremity, RE) környezetében különböző génszekvenciákkal rendelkező MRSA-törzseket képes kimutatni. A különböző, LightCycler MRSA Advanced Test segítségével kimutatható RE típusok elnevezése RE2, RE3 és RE7 (bejegyzett nevezéktan). ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK 1. Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a LightCycler MRSA Advanced Test primerei és/vagy próbái által lefedett bakteriális genom régióiban lévő mutációk következtében a baktérium kimutatása sikertelen lesz. A ritka, SCCmec kazetta genetikai variánsát hordozó MRSA-törzsalakok a LightCycler MRSA Advanced Test pozitív eredményéhez vezethetnek. 2. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen. 3. A vizsgálatot csak humán nazális minta használatára validálták. 4. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik. 5. A LightCycler MRSA Advanced reakciómixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor az MRSA (+) C reagensből vagy klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen felhasználási útmutatóban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. 6. A terméket csak képzett személy használhatja. 7. Ez a termék kizárólag a LightCycler 2.0 készülékkel használható együtt. 05548926001-02HU 22 Doc Rev. 2.0

TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK Zavarást okozó anyagok Egyes anyagok zavarhatják az MRSA kimutatását a LightCycler MRSA Advanced Test során és érvénytelen eredményhez vezethetnek, ilyenek a tampon tartályából a líziscsőbe átvitt vér, nagy mennyiségű orrváladék/nyálka, illetve nagy mennyiségű szenes gél. Az alábbi exogén anyagok (lásd 4. táblázat), melyek decongestansok összetevői és orrszárazság és/vagy -irritáció ellen használatos anyagok, nem mutattak zavaró hatást az MRSA kimutatásában a LightCycler MRSA Advanced Test során. 4. táblázat Exogén anyagok interferenciájának vizsgálata a LightCycler MRSA Advanced Test esetén Márkanév InfectoPyoderm Turixin Bepanthen orrkenőcs Accumed 12 órás orrspray Otriven Hatóanyag Mupirocin 20 mg/g (antibiotikum) Mupirocin-kálcium 21,5 mg/g (antibiotikum) Dexpanthenol 50 mg/g (B5-provitamin) Oxymetazoline hydrochloride 0,05% (decongestans) Xylometazoline 0,1 % (decongestans) NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS A. Analitikai érzékenység A LightCycler MRSA Advanced Test analitikai érzékenységét 3 olyan MRSA-törzs segítségével határozták meg, amelyek három RE-típusának kimutatása a vizsgálat célpontja (a jobb széli SCCmec/orfX kapcsolódás (RE) 2., 3. és 7. típusai). Meghatározták ezen törzsek tenyészeteinek mennyiségét, tampononként 100-400 telepképző egységre (CFU) hígították, és felitatták előzetesen különböző tápközegekbe merített tamponokra. Minden LOD érték körüli hígítást legalább 60 ismétlésben vizsgáltak. A kimutathatósági határ minden egyes törzstípus és tampontípus esetében az a legalacsonyabb számú CFU/tampon érték, amely 95%-os konfidenciával adott pozitív eredményt. 5. táblázat Kimutathatósági határ (LOD) minden, különböző tampontípussal vizsgált MRSA RE-típus esetében MRSA-típusok Tampontípusok 1 RE2 RE3 RE7 Stuart-folyadék transzportmédium 240 cfu/tampon 140 cfu/tampon 240 cfu/tampon Szén nélküli Amies-gél transzportmédium 180 cfu/tampon 224 cfu/tampon 240 cfu/tampon Szenes Amies-gél transzportmédium 240 cfu/tampon 224 cfu/tampon 240 cfu/tampon 1 Az ajánlott tamponok és azonosítási számuk részletes felsorolásáért tanulmányozza az Egyéb szükséges, de nem biztosított anyagok részt. 05548926001-02HU 23 Doc Rev. 2.0