4. DNS amplifikációs protokollok a PowerPlex ESX 17 rendszer használatával A felhasználó által biztosítandó eszközök és anyagok GeneAmp PCR System 9700 vagy 2720 PCR készülék (Applied Biosystems) mikrocentrifuga 0,2 ml-es MicroAmp reakciócső vagy MicroAmp optikai 96-lyukú reakciólemez (Applied Biosystems) 1,5 ml-es mikrocentrifuga cső aeroszol-rezisztens pipettahegy (lásd 9.F rész) A rutineljárás során 25 µl reakciótérfogatban 0,5 ng DNS templátból indul az amplifikálás az alábbi protokollban részletezett módon. A PowerPlex ESX 17 rendszer a GeneAmp PCR System 9700 PCR készülékkel történő használatra optimalizált. A GeneAmp PCR System 2720 PCR készülékhez való amplifikációs protokollt is mellékeljük. 4.A. Az amplifikációs reakció összeállítása A keresztszennyezés elkerülése érdekében erősen javasolt kesztyű és aeroszolrezisztens pipettahegyek használata. A pre-amplifikációs és poszt-amplifikációs reagenseket tartsa külön helyiségekben. Az amplifikációs reakciót egy, erre a célra fenntartott helyiségben állítsa össze. Az amplifikációs reakciókat csak az erre a célra fenntartott eszközök, fogyóeszközök és anyagok használatával állítsa össze. A 9947A DNS koncentrációjának meghatározása a 260 nm-en mért abszorbancia alapján történt. Ezen kontroll DNS más módszerekkel, mint például qpcr-ral történő mennyiségi meghatározása eltérő értéket eredményezhet. Minden amplifikációhoz készítsen friss DNS hígítást. Ne tároljon hígított (pl. 0,25 ng/µl vagy alacsonyabb koncentrációjú) DNS-t. A sejtvonalból származó 9947A DNS allélikus, valamint STR lókuszok közötti kiegyensúlyozatlanságot mutat. Ne használjon sejtvonalból származó DNS-t érzékenységi tesztre. Az érzékenységi tesztekhez használandó DNS-t használat előtt egy éjszakán át tárolja 4 C-on.! A sikeres amplifikáció alapos, gondos előkészítést igényel. Az amplifikációs problémák elhárításával kapcsolatos útmutató a 7.A részben található. 1. Várjon, míg a következő komponensek teljesen fel nem olvadnak: PowerPlex ESX 5X Master Mix, PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix, 9947A DNS, és amplifikációs minőségű víz. Megjegyzés: Használat előtt centrifugálja röviden a csöveket, hogy tartalmuk a cső alján összegyűljön, majd 15 másodpercig vortexelje a reagenseket. Az első centrifugálás után ne centrifugálja újra a 10X Primer Pair Mix-et, mivel az ismételt centrifugálás következtében a primerek összekoncentrálódhatnak a cső alján. 2. Határozza meg az összemérendő reakciók számát. Számítsa bele a pozitív és negatív kontroll reakciókat is. A pipettázási hiba kompenzálására számítson hozzá további 1 vagy 2 reakciót. Ez ugyan további kis mennyiséget használ minden reagensből, viszont garantálja, hogy a PCR amplifikációs keverék mennyisége elegendő lesz valamennyi mintához. Garantálja továbbá, hogy minden reakció ugyanazt az összetételű PCR amplifikációs keveréket tartalmazza. Oldal 2
3. Helyezzen minden reakcióhoz egy tiszta, 0,2 ml-es reakciócsövet egy állványba és lássa el azokat a megfelelő felirattal. Alternatív megoldásként használható megfelelően feliratozott MicroAmp reakciólemez is. 4. Egy steril, 1,5 ml-es csőbe mérje össze az 1. táblázatban felsorolt reagenseket. Az 1. táblázat a komponensek egy reakcióhoz szükséges térfogatát jelzi. A 9.D részben található egy, az egyes komponensek PCR amplifikációs mixhez szükséges mennyiségeinek kiszámítására szolgáló munkalap (5. táblázat). 1. táblázat. PCR amplifikációs keverék a PowerPlex ESX 17 rendszerhez. Egy reakcióra PCR amplifikációs keverék komponens 1 számított térfogat Víz, amplifikációs minőségű 25,0 µl végső térfogatra PowerPlex ESX 5X Master Mix 5,0 µl PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix 2,5 µl templát DNS (0,5 ng) 2,3 max. 17,5 µl teljes reakciótérfogat 25 µl 1Először adjon amplifikációs minőségű vizet a reakciócsőbe, majd PowerPlex ESX 5X Master Mix és PowerPlex ESX 17 10X Primer Pair Mix reagenseket. A templát DNS-t a 6. pontban kell hozzáadni. 2A DNS templátot nukleázmentes vízben vagy TE -4 pufferben (10mM Tris-HCl [ph 8.0], 0,1mM EDTA) tárolja. Ha a DNS templátot olyan TE pufferben tárolják,melynek kémhatása nem ph 8.0 vagy nagyobb koncentrációban tartalmaz EDTA-t, a hozzáadott DNS mennyisége nem haladhatja meg a végső reakciótérfogat 20%-át. A PCR amplifikáció hatékonyságát és minőségét erősen befolyásolják a ph változásai (a hozzáadott Tris-HCl hatására), a szabad magnézium-koncentráció (az EDTA kelátképző hatása következtében), valamint egyéb PCR inhibítorok hatásai, melyek a templát DNS-eredetétől és az alkalmazott DNS-extrakciós eljárástól függően alacsony koncentrációban jelen lehetnek. 3Az alkalmazott DNS-meghatározási módszertől függően eltérő DNS-koncentráció értékek mérhetőek (13). A DNS-templát itt ajánlott mennyisége a DNS-koncentrációnak a 260 nm-en mért abszorbanciával történt meghatározásán alapul. Erősen javasolt az optimális DNS-mennyiség meghatározása az Ön által használt DNS-mérési módszerrel. 5. 5-10 másodpercig vortexelje a PCR amplifikációs keveréket, majd pipettázza a megfelelő mennyiségeket a reakciócsövekbe. A nem kellően összekevert (vortexelt) PCR amplifikációs keverék gyenge! amplifikációt vagy lókuszok közti inbalanciát eredményezhet. 6. Az egyes mintákhoz tartózó templát DNS-eket (0,5ng) pipettázza a PCR amplifikációs keveréket tartalmazó reakciócsövekbe. 7. A pozitív amplifikációs kontrollhoz hígítsa a 9947A DNS-t úgy, hogy a kiveendő térfogat 1,0 ng DNS-t tartalmazzon. Ezt az 1,0 ng DNS-t tartalmazó térfogatot pipettázza a PCR amplifikációs keveréket tartalmazó reakciócsőbe. 8. A negatív amplifikációs kontrollhoz pipettázzon amplifikációs minőségű vizet (templát DNS helyett) az amplifikációs keveréket tartalmazó PCRcsőbe. Oldal 3
4.B. Amplifikációs program Ez a kézikönyv a PowerPlex ESX 17 rendszernek a GeneAmp PCR System 9700 és 2700 PCR készülékekkel történő használatára vonatkozó protokollokat tartalmaz. Az amplifikáció és a detektálás során használt készülékek eltérhetnek. Az eltérő laboratóriumi készülékek használata esetén szükséges lehet a protokollok, beleértve a ciklusszámok és az injektálási idők optimalizálása. A Promega Corporation által végzett tesztek szerint 0,5 ng tisztított DNS templát amplifikációjához megfelelő a 30 ciklus. 1. Helyezze a PCR-csöveket vagy a MicroAmp reakciólemezt a PCR készülékbe. 2. Válassza ki és futtassa le a javasolt protokollt. A GeneAmp PCR System 9700 és 2720 PCR készülékekhez javasolt protokoll alább található. PCR protokoll 1 96 C, 2 perc, majd: 94 C, 30 másodperc 59 C 2 perc 72 C, 90 másodperc 30 cikluson keresztül, majd: 60 C, 45 perc 4 C állás 1 GeneAmp PCR System 9700 PCR készülék használata esetén a programnak 9600-os hűtési-fűtési (ramp) sebességgel kell futnia. A ramp sebesség a PCR program elindítása után állítható be. Megjelenik a Select Method Options képernyő. A ramp speed pontban válassza a 9600 opciót, és adja meg a reakciótérfogatot. 3. A PCR program befejezése után tárolja a mintákat 20 C-on, fénytől védett dobozban. Megjegyzés: Az amplifikált minták 4 C-on vagy magasabb hőmérsékleten történő tárolása a PCR-termékek degradációjához vezethet. Oldal 4
5. A készülék beállítása és minta-előkészítés 5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával A felhasználó által biztosítandó anyagok: 95 C szárazblokkos inkubátor, vízfürdő vagy PCR-készülék jégkása vagy jeges vízfürdő 96 lyukú lemezekkel kompatibilis centrifuga aeroszol-rezisztens pipettahegyek 3500/3500xL kapilláris array, 36 cm 96 lyukú lemezekhez lemeztartó és aljzat (normál) (Applied Biosystems Kat.sz. 4410228) POP-4 polimer tasakban az Applied Biosystems 3500 vagy 3500xL készülékekhez Genetic Analyzer anód puffer tartály katód puffer tartály kondicionáló reagens tasak az Applied Biosystems 3500 vagy 3500xL készülékekhez Genetic Analyzer MicroAmp optikai 96 lyukú reakciólemez és szeptumok Hi-Di formamid (Applied Biosystems Kat.sz. 4311320) PowerPlex 5-Dye Matrix standardok, 3100/3130 (Kat.sz. DG4700)!! A formamid minősége nagyon fontos. Használjon Hi-Di formamidot. A formamidot alikvotokban 20 C-on fagyasztva tárolja. Az ismételt lefagyasztásfelolvasztás vagy a hosszú távú 4 C-on történő tárolás a formamid bomlását okozhatja. A rossz minőségű formamid olyan ionokat tartalmazhat, melyek az injektálás során versengenek a DNS-sel, ami alacsonyabb csúcsmagassághoz és csökkent érzékenységhez vezet. A hosszabb befecskendezési idő nem biztos, hogy növeli a jelet. A formamid irritáló, teratogén anyag: kerülje belégzését és a bőrrel történő érintkezést. Olvassa el a vegyszeren található figyelmeztető címkét, és a megfelelő elővigyázatossággal használja az anyagot. A formamiddal végzett munka során mindig viseljen gumikesztyűt és védőszemüveget. Mintaelőkészítés 1. Az alábbiak szerint készítse elő a mintafelviteli koktélt CC5 Internal Lane Standard 500 és Hi-Di formamid összekeverésével: [(1,0 μl CC5 ILS 500) (injektálások száma)] + [(10,0 μl Hi-Di formamid) (injektálások száma)] Megjegyzés: A méretstandard csúcsok intenzitásának beállításához a mintafelviteli koktélban lévő belső standard térfogata megduplázható. A formamid mennyiségét tartsa 10,0 μl-en, és a 3. lépésben a lyukakhoz hozzáadott térfogatokat igazítsa a megváltozott belső standard térfogatnak megfelelően. 2. 10-15 másodpercig vortexelve keverje össze az elegyet. 3. Pipettázzon 11 μl formamid/belső standard keveréket minden lyukba. Oldal 5
5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával (folytatás) 4. Adjon hozzá 1 μl amplifikált mintát (vagy 1 μl allélikus létra keveréket). A lyukakat fedje a megfelelő szeptumokkal. Megjegyzés: A készülék detektálási határai változóak lehetnek; ezért szükség lehet az injektálási idő, az injektálási feszültség vagy a mintafelviteli koktéllal összekevert termék mennyiségének növelésére vagy csökkentésére. Ha a futtatási modulban szeretné módosítani az injektálási időt vagy a feszültséget, válassza az adatgyűjtő szoftverben lévő Library menüből az Instrument Protocol opciót. Ha a csúcsmagasságok a kívántnál magasabbak, a kívánt jelintenzitás elérése érdekében használjon kevesebb DNS-templátot az amplifikációs reakciókban vagy csökkentse a ciklusok számát 2-4 ciklussal. 5. A légbuborékok eltávolítása érdekében centrifugálja a lemezt rövid ideig. 6. A mintákat denaturálja 95 C-on 3 percig, majd azonnal hűtse le jégkásán vagy jeges vízfürdőben szintén 3 percig. A mintákat csak a készülékre történő felvitelüket közvetlenül megelőzően denaturálja. Oldal 6
A készülék előkészítése A készülék karbantartási menetrendjével, a kapilláris array, a pufferek és a polimer tasak használatával, valamint a térbeli kalibráció végrehajtásával kapcsolatos utasításokat megtalálja az Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében. A mintákat az Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében leírtaknak megfelelően analizálhatja. 1. Nyissa meg a 3500 Data Collection szoftvert. A műszer vezérlőképernyője elindul (2. ábra). Gondoskodjon arról, hogy a fogyóeszköz információk (Consumables Information) és a karbantartási értesítések (Maintenance Notifications) elfogadhatóak legyenek. A fűtőblokk hőmérsékletét állítsa 60 C-ra, majd az előfűtés elindításához válassza a Start Pre-Heat opciót legalább 30 perccel az első injektálás előtt. 2. ábra. A műszer vezérlőképernyője ( Dashboard ). Oldal 7
5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával (folytatás) 2. Egy új készülék protokoll létrehozásához a Library menüben válassza az Instrument Protocol, majd a Create opciót. Használhat előzetesen létrehozott készülék protokollt is. A 3. ábra bemutatja a Promegánál az Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer készüléken használt beállításokat az alkalmazás típusát, a festékkészletet, a kapillárishosszt, a polimert, a futtatási modult és a megfelelő protokoll információkat illetően. Az alapértelmezett beállítások közül csak a festékkészlet beállítása változott.! A készülék protokoll létrehozása során mindenképpen ugyanazt a festékkészletet használja, mint a Promega 5-dye spektrális kalibrálásához. Az ajánlott futtatási idő 1210 másodperc, és használja az alapértelmezett injektálási körülményeket. A futtatási időt és az egyéb készülékbeállítási paramétereket minden laboratóriumban optimalizálni és validálni kell. Olyan nevet használjon, mely jellemzi az adott protokollt. Megjegyzés: Részletesebb információkért olvassa el az Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzer készülékek felhasználói kézikönyvét. 9393TA 3. ábra. A Create New Instrument Protocol ablak Oldal 8
3. A QC protokollhoz használandó új méretstandard létrehozásához lépjen a Library menühöz. Válassza a Size Standards, majd a Create opciót. Használhat előzetesen létrehozott méretstandardot is. A méretstandardnak adjon PPlex_ILS500 vagy más megfelelő nevet. Válassza az Orange festékszínt (Dye Color). A méretstandardokban a fragmentek 60, 65, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 és 500 bázis hosszúságúak. Lásd a 4. ábrát. 9227TA 4. ábra. A Create New Size Standard ablak. Oldal 9
5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával (folytatás) 4. Egy új QC protokoll létrehozásához lépjen a Library menühöz. Válassza a QC Protocols, majd a Create opciót. Használhat előzetesen létrehozott QC protokollt is. Olyan nevet használjon, mely jellemzi az adott protokollt. Válassza a 3. lépésben létrehozott méretstandardot. A QC protokollhoz tartozó beállításoknak az Applied Biosystems 3500 vagy 3500xL Genetic Analyzer készülék PowerPlex ESX 17 rendszeréhez belsőleg validált körülményeken kell alapulnia. Az 5. ábra bemutat egy lehetőséget ezekhez a beállításokhoz. 9228TA 5. ábra. A Create New QC Protocol ablak. Oldal 10
5. Egy új assay létrehozásához lépjen a Library menühöz. Válassza az Assays opciót, majd a Create parancsot. Használhat előzetesen létrehozott assayt is. A Create New Assay ablakban (6. ábra) válassza a 2. lépésben létrehozott készülék protokollt, valamint a 4. lépésben létrehozott QC protokollt. Olyan nevet adjon, amely jellemzi az adott assayt. Válassza az HID alkalmazástípust. Egy lemezen az összes elnevezett mintához szükséges egy assay. 9229TA 6. ábra. A Create New Assay ablak. Oldal 11
5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával (folytatás) 6. Egy új fájlnév konvenció létrehozásához (7. ábra) lépjen a Library menühöz. Válassza a File Name Convention, majd a Create opciót. Használhat előzetesen létrehozott fájlnév konvenciót is. A laboratóriumi gyakorlatnak megfelelően válassza ki a fájlnév tulajdonságait (File Name Attributes), és mentse el egy jellemző néven. 9252TA 7. ábra. A Create New File Name Convention ablak. Oldal 12
7. Egy új eredmény csoport létrehozásához (8. ábra) lépjen a Library menühöz. Válassza a Results Group, majd a Create parancsot. Használhat előzetesen létrehozott eredmény csoportot is. A laboratóriumi gyakorlatnak megfelelően válassza ki az eredmény csoport tulajdonságait (Results Group Attributes), és mentse el egy jellemző néven. 8. Egy új lemez létrehozásához lépjen a Library menühöz, és a Manage menüből válassza a Plates, majd a Create opciót. 9253TA 8. ábra. A Create New Results Group ablak. Oldal 13
5.A. Az amplifikált fragmentek kimutatása Applied Biosystems 3500 és 3500xL Genetic Analyzer készülékek használatával (folytatás) 9. Olyan nevet használjon, mely jellemzi az adott lemezt. A legördülő menüből válassza az HID lemez típust (9. ábra). 9. ábra. Lemeztulajdonságok definiálása. 10. Válassza az Assign Plate Contents opciót (10. ábra). 11. A lyukakhoz rendeljen mintaneveket. 12. A képernyő bal alsó részén, az Assays alatt használja az Add from Library opciót az 5. lépésben vagy előzetesen létrehozott assay kiválasztásához. Klikkeljen az Add to Plate gombra, és zárja be az ablakot. 9255TA 9254TA 10. ábra. Lemeztartalom hozzárendelése. Oldal 14
13. A File Name Convention alatt, a 6. lépésben vagy előzetesen létrehozott fájlnévkonvenció kiválasztásához használja az Add from Library opciót. Klikkeljen az Add to Plate gombra, és zárja be az ablakot. 14. A Results Groups alatt, a 7. lépésben vagy előzetesen létrehozott eredmény csoport kiválasztásához használja az Add from Library opciót. Klikkeljen az Add to Plate gombra, és zárja be az ablakot. 15. Jelölje ki a minta lyukakat, majd pipálja ki az Assays, a File Name Convention és a Results Groups adott mintákra vonatkozó jelölőnégyzeteit. 16. Válassza a Link Plate for Run opciót. 17. Megjelenik a Load Plate ablak. Válassza a Yes lehetőséget. 18. A Run Information ablakban (11. ábra) adjon meg egy futtatási nevet. Válassza a Start Run opciót (nincs feltüntetve). 11. ábra. Futtatási név megadása. Oldal 15
5.B. Az amplifikált fragmentumok kimutatása 2.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott ABI PRISM 3100 vagy 3100-Avant Genetic Analyzer készülékkel vagy 3.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott Applied Biosystems 3130 vagy 3130xl Genetic Analyzer készülékkel.!! A felhasználó által biztosítandó anyagok 95 C-ra fűtött szárazblokkos inkubátor, vízfürdő vagy PCR készülék jégkása vagy jeges vízfürdő 96-lyukú lemezekhez használható centrifuga aeroszol-rezisztens pipettahegyek 3100 vagy 3130 kapilláris array, 36 cm teljesítményoptimalizált polimer 4 (POP-4 ) a 3100 vagy 3130 készülékhez 10X genetic analyzer puffer EDTA-val MicroAmp optikai 96-lyukú reakciólemez és szeptumok Hi-Di formamid (Applied Biosystems Kat.sz. 4311320) PowerPlex 5-Dye Matrix standardok, 3100/3130 (Kat.sz. DG4700) A formamid minősége nagyon fontos. Használjon Hi-Di formamidot. A formamidot alikvotokban, 20 C-on fagyasztva tárolja. Az ismételt lefagyasztásfelolvasztás vagy a hosszú távú, 4 C-on történő tárolás a formamid bomlását okozhatja. A rossz minőségű formamid olyan ionokat tartalmazhat, melyek az injektálás során kompetálnak a DNS-sel, mely alacsonyabb csúcsmagassághoz és csökkent érzékenységhez vezet. A hosszabb befecskendezési idő nem biztos, hogy növeli a jelet. A formamid irritáló, teratogén anyag; kerülje belégzését és a bőrrel történő érintkezést. Olvassa el a vegyszeren található figyelmeztető címkét és a megfelelő elővigyázatossággal használja azt. A formamiddal végzett munka során mindig viseljen gumikesztyűt és védőszemüveget. Minta előkészítés 1. Az alábbiak szerint készítse elő a mintafelviteli koktélt a CC5 Internal Lane Standard 500 és Hi-Di formamid összekeverésével: [(1.0 µl CC5 ILS 500) (injektálások száma)] + [(10.0 µl Hi-Di formamid) (injektálások száma)] Megjegyzés: A méretstandardcsúcsok intenzitásának beállításához a mintafelviteli koktélban lévő belső standard térfogata megduplázható. A formamid mennyiségét tartsa 10,0 μl-en, és a 3. lépésben a lyukakhoz hozzáadott térfogatokat igazítsa a megváltozott belső standard térfogatnak megfelelően. 2. 10-15 másodpercig vortexelve keverje össze az elegyet. 3. Pipettázzon 11 µl formamid/belső standard keveréket minden lyukba. 4. Adjon hozzá 1 µl amplifikált mintát (beleértve a pozitív-negatív kontrollt is) vagy 1 µl PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix-et. Fedje le a lyukakat a megfelelő szeptummal. Megjegyzés: A készülék detektálási határai változók lehetnek; ezért szükség lehet az injektálási idő, az injektálási feszültség vagy a mintafelviteli koktéllal összekevert termék mennyiségének beállítására. Az adatgyűjtő szoftverben a Module Manager -t használja az injektálási idő vagy feszültség futtatási modulban történő módosításához. (Lásd Készülék előkészítése, alább.) Oldal 16
5. Szükség esetén röviden centrifugálja le a lemezt a légbuborékok eltávolítása érdekében. 6. Denaturálja a mintákat 95 C-on 3 percig, majd azonnal helyezze jégkására vagy jeges vízfürdőbe 3 percre. A mintákat közvetlenül a készülékbe történő behelyezés előtt denaturálja. Készülék előkészítése A tisztítással, a kapilláris array előkészítésével, a kalibráció elvégzésével és a polimer hozzáadásával kapcsolatos utasításokat a készülék felhasználói kézikönyve tartalmazza. A mintákat a 2.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott ABI PRISM 3100 vagy 3100-Avant Genetic Analyzer vagy 3.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott Applied Biosystems 3130 vagy 3130xl Genetic Analyzer készülékhez mellékelt felhasználói kézikönyvben leírt módon analizálja, az alábbi kivételekkel: 1. A Module Manager-ben válassza a New opciót. A Type legördülő listából válassza a Regular opciót, majd a Template legördülő listában a HIDFragmentAnalysis36_POP4 opciót. Győződjön meg róla, hogy a befecskendezési idő 5 másodperc, a befecskendezési feszültség 3 kv és a futtatási idő 1500 másodperc. Adjon jól beazonosítható nevet a futtatási modulnak, majd válassza az OK -t. Megjegyzés: A készülékek érzékenysége eltérhet. Az injektálási idő és feszültség a Module Manager-ben beállítható. Az injektálási idő javasolt tartománya 3-22 másodperc, a befecskendezési feszültségé 1-3 kv. 2. A Protocol Manager-ben válassza a New opciót. Adjon nevet a protokollnak. A Type legördülő listából válassza a Regular opciót, majd a Run Module legördülő listából válassza ki azt a futási modult, melyet a megelőző lépésben létrehozott. Végül a dye-set legördülő listában jelölje ki a G5 -t. Kattintson az OK -ra. 3. A Plate Manager modulban hozzon létre új lemez rekordot, a készülék felhasználói kézikönyvében leírtak szerint. A megjelenő párbeszédablakban az Application legördülő listában jelölje ki a GeneMapper Generic pontot, majd válassza ki a megfelelő lemez típust (96-lyukú). Töltse ki a tulajdonos és az operátor ablakokat, majd kattintson az OK pontra. Megjegyzés: Ha a mintaadatok automatikus analízise szükséges, az ezzel kapcsolatos útmutatás a felhasználói kézikönyvben található. Oldal 17
5.B. Az amplifikált fragmentumok kimutatása 2.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott ABI PRISM 3100 vagy 3100-Avant Genetic Analyzer készülékkel vagy 3.0 verziójú Data Collection szoftverrel ellátott Applied Biosystems 3130 vagy 3130xl Genetic Analyzer készülékkel (folytatás) 4. A GeneMapper lemez bejegyzésnél a megfelelő rubrikákban adja meg a mintaneveket. Gördítse jobbra az ablakot. A Results group 1 oszlopban válassza ki a kívánt eredmény csoportot. Az Instrument Protocol 1 oszlopban válassza ki a 2. lépésben létrehozott protokollt. Ellenőrizze, hogy ez az információ minden olyan sorban szerepeljen, mely mintanevet tartalmaz. Kattintson az OK -ra. Megjegyzés: Új eredmény csoport létrehozásához kattintson a New pontra az eredmény csoport oszlop legördülő menüjében. Válassza a General fület, majd adjon meg egy nevet. Válassza az Analysis fület, majd kattintson a GeneMapper Generic opcióra az Analysis type legördülő listában. 5. Helyezze a mintákat a készülékbe, és zárja be a készülék ajtaját. 6. A spektrum ablakban válassza a G5 festékkészletet és ellenőrizze, hogy az aktív festékkészlet a PowerPlex 5-festék rendszerhez generált fájl. Nagyon fontos, hogy a megfelelő G5 spektrumot válassza a PowerPlex! 5-festék rendszerhez. Ha nem a PowerPlex 5-festék rendszer az aktív festékkészlet, keresse meg a PowerPlex 5-festék spektrumot a G5 festékkészlethez tartozó kalibrációs listában (List of Calibrations for Dye Set G5) és kattintson a Set pontra. 7. A futástervezőnél keresse meg a 3. és 4. pontban létrehozott lemez bejegyzést és kattintson egyszer a névre a kiemeléshez. 8. A lemez bejegyzés kiemelése után kattintson az autosamplerben lévő, az amplifikált mintákat tartalmazó lemeznek megfelelő lemez grafikára. 9. Ha a lemez bejegyzést a lemezhez társította a rendszer, a lemez grafikája sárgáról zöldre vált, és a zöld színű Run Instrument nyíl aktívvá válik. 10. Kattintson az eszközlistán lévő zöld Run Instrument nyílra és indítsa el a minta futtatást. 11. Kövesse az elektroforézist az adatgyűjtő szoftver futási, megtekintő, array vagy kapilláris ablakában. Minden injektálás kb. 40 percig tart. Oldal 18
5.C. Az amplifikált fragmentum detektálása az ABI PRISM 310 Genetic Analyzer készülékkel!! A felhasználó által biztosítandó anyagok 95 C-os szárazblokkos inkubátor, vízfürdő vagy PCR készülék jégkása vagy jeges vízfürdő 310-es kapilláris, 47 cm 50 µm teljesítményoptimalizált polimer 4 (POP-4 ) 10X genetic analyzer puffer EDTA-val mintacsövek és szeptumok aeroszol-rezisztens pipettahegyek Hi-Di formamid (Applied Biosystems Kat.sz. 4311320) PowerPlex 5-Dye Matrix standardok, 310 (Kat.sz. DG4600) A formamid minősége nagyon fontos. Használjon Hi-Di formamidot. A formamidot alikvotokban, 20 C-on fagyasztva tárolja. Az ismételt lefagyasztásifelolvasztási ciklusok vagy a hosszú távú, 4 C-on történő tárolás a formamid bomlását okozhatják. A rossz minőségű formamid ionokat tartalmazhat, melyek a befecskendezés során kompetíciót jelentenek a DNS számára, mely alacsonyabb csúcsmagasságokhoz és csökkent érzékenységhez vezet. A hosszabb befecskendezési idő nem biztos, hogy növeli a jelet. A formamid irritáló, teratogén anyag; kerülje belégzését és a bőrrel történő érintkezést. Olvassa el a vegyszeren található figyelmeztető címkét és a megfelelő elővigyázatossággal használja azt. A formamiddal végzett munka során mindig viseljen gumikesztyűt és védőszemüveget. Minta előkészítés 1. Az alábbiak szerint készítse elő a mintafelviteli koktélt a CC5 Internal Lane Standard 500 standard és Hi-Di formamid összekeverésével: [(1.0 µl CC5 ILS 500) (befecskendezések száma)] + [(24.0 µl Hi-Di formamid) (befecskendezések száma)] Megjegyzés: A méretstandard csúcsok intenzitásának beállításához a mintafelviteli koktélban lévő belső standard térfogata megduplázható. Ha a csúcsmagasságok túl nagyok, ajánlott a felviteli koktél tartalmának megváltoztatása 0,5 µl CC5 ILS 500-ra és 24,5 µl Hi-Di formamidra. 2. 10-15 másodpercig vortexelve keverje össze az elegyet. 3. Keverjen össze 25,0 µl előkészített mintafelviteli koktélt és 1,0 µl amplifikált mintát (vagy 1 µl PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix-et). Megjegyzés: A készülék detektálási határai változóak lehetnek; ezért szükség lehet az injektálási idő, az injektálási feszültség vagy a mintafelviteli koktéllal összekevert termék mennyiségének növelésére vagy csökkentésére. Az adatgyűjtő szoftverben a "Module Manager"-t használja az injektálási idő vagy feszültség futtatási modulban történő módosításához. (Lásd Készülék előkészítése, alább.) 4. Szükség esetén röviden centrifugálja a csöveket a légbuborékok eltávolítása érdekében. Oldal 19
5.C. Az amplifikált fragmentum detektálása az ABI PRISM 310 Genetic Analyzer készülékkel (folytatás) 5. Denaturálja a mintákat és a létrát 95 C-on 3 percig melegítve, majd azonnal helyezze jégkására vagy jeges vízfürdőbe 3 percre. A mintákat közvetlenül az injektálás előtt denaturálja. 6. A reakciócsöveket állítsa össze a megfelelő automata mintaadagoló tálcán. 7. Helyezze az autosampler tálcát a készülékbe, és zárja be a készülék ajtaját. Készülék előkészítése A pumpa blokk tisztításával, a kapilláris készülékbe helyezésével, az autosampler kalibrálásával és a polimer fecskendőbe adásával kapcsolatos utasításokat a készülék használati útmutatója tartalmazza. 1. Nyissa meg az ABI PRISM 310 adatgyűjtő szoftvert. 2. Az ABI PRISM 310 Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében leírtak szerint készítsen elő egy GeneScan mintalapot. Adja meg a megfelelő mintainformációt a Sample Info oszlopban. A PowerPlex ESX 17 Allelic Ladder Mix markert tartalmazó sorokban a fluoreszcein, JOE, TMR-ET, CXR-ET és CC5 festékekhez a ladder szót írja be a Sample Info oszlopba. Ezt az információt meg kell adni ahhoz, hogy az adatokat a PowerTyper ESX 17 makró segítségével sikeresen analizálni lehessen. 3. Hozzon létre egy új GeneScan injektálási listát. A legördülő menüből válassza ki a megfelelő mintalapot. 4. A legördülő menüből válassza ki a GS STR POP4 (1 ml) G5 modult. Állítsa 3 másodpercre az injektálási időt és 28 percre a futási időt. A további beállításokat hagyja változatlanul:! Inj. Secs: 3 Inj. kv: 15,0 Run kv: 15,0 Run C: 60 Run Time: 28 Szükség lehet az injektálási idő egyes készülékekhez történő optimalizálására. A 0,5 ng templát DNS-t tartalmazó mintákhoz 2 5 másodperc injektálási idő javasolt. Megjegyzés: A fragmentumok migrációja kismértékű eltérést mutathat hosszú ABI PRISM 310 Genetic Analyzer futások során. Ez a hőmérséklet vagy az oszlop változásának lehet a következménye. Nagyszámú minta analízise során a minták pontos genotipizálását segítheti, ha a futtatás során többször, különböző időpontokban allélikus létrát injektálunk. 5. Válassza ki a megfelelő mátrix fájlt. Oldal 20
6. Adatelemzés 6. Az adatok automatikus analíziséhez jelölje be az auto analyze jelölőnégyzetet, valamint a megfelelő analízis paramétereket és méretstandardot. Az opciókkal kapcsolatos specifikus információk az ABI PRISM 310 Genetic Analyzer felhasználói kézikönyvében találhatóak. 7. A mintatálca betöltése és az ajtó bezárása után a Run segítségével indítsa el a kapilláris elektroforézis rendszert. 8. Kövesse az elektroforézis folyamatát a raw data és a status ablakokban. Minden mintánál kb. 35 percet vesz igénybe a pumpálás, a minta injektálása és az elektroforézise. 6.A. PowerPlex ESX Panel, Bin és Stutter sorozatok GeneMapper ID-X 1.2 verziójú szoftverrel A PowerPlex ESX 17 rendszerrel generált adatok analízésének megkönnyítése érdekében létrehoztunk panel és bin fájlokat, ezzel lehetővé téve a genotípusok automatikus hozzárendelését a GeneMapper ID-X szoftver használatával. Javasoljuk, hogy a felhasználók az Applied Biosystems által biztosított oktatáson ismerkedjenek meg a GeneMapper ID-X szoftver megfelelő üzemeltetésével. Megjegyzés: Az itt említett panel és bin sorozatok kompatibilisek a GeneMapper ID-X szoftver korábbi verzióival is. Első lépések 1. A PowerPlex ESX 17 rendszerhez a megfelelő panel, bin és stutter fájlok letölthetők az alábbi webhelyről: www.promega.com/geneticidtools/panels_bins/ 2. Adja meg kapcsolati információit, és válassza a GeneMapper ID-X opciót. Válassza a Submit opciót. 3. Mentse a PowerPlex_ESX_Panels_IDX_vX.x.txt, PowerPlex_ESX_Bins_IDX_vX.x.txt és a PowerPlex_ESX_Stutter_IDX_vX.x.txt fájlokat (az X.x a panel és bin fájlok legutóbbi verzióira vonatkozik) a számítógépére, és jegyezze meg a fájlok helyét. A panel, bin és stutter fájlok importálása 1. Nyissa meg a GeneMapper ID-X szoftvert. 2. Válassza a Tools, majd a Panel Manager opciót. 3. Jelölje ki a Panel Manager ikont a bal felső navigációs panelen. 4. Válassza a File, majd az Import Panels opciót. 5. Lépjen az Első lépések részben letöltött panel fájlhoz. Jelölje ki a fájlt, majd válassza az Import opciót. 6. A navigácós panelen jelölje ki azt a PowerPlex ESX mappát, melyet az imént importált az 5-ös lépésben. Oldal 21