Doktori (PhD) értekezés tézisei TERMÉSZETES NÖVEKEDÉSSZABÁLYOZÓ ANYAGOK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA A NÖVÉNYI SZÖVETTENYÉSZTÉSBEN Írta: Tantos Ágnes Témavezetõ: Dr Horváth Gábor A Biológiai Tudományok Doktora Dr. Lukács Noémi A Biológiai Tudományok Kandidátusa Szent István Egyetem, Kertészettudományi Kar Molekuláris Növénybiológia Tanszék Budapest 2002
A munka elõzményei és a kitûzött célok A XX. század második felére a mikroszaporítás világgazdasági jelentõségre tett szert a növénytermesztésben. Számos olyan fajról, fajtáról tudunk, melyek szaporítóanyag-elõállítását szinte kizárólag ezzel a módszerrel oldják meg. Maga a szövettenyésztés kiváló lehetõséget nyújt nem csak a gyors és biztonságos növényszaporításra, hanem a növények különbözõ életfolyamatainak tanulmányozására is. Ebben a munkában elsõsorban a nehezen szaporítható fás szárú növények mikroszaporításának megkönnyítésével foglalkoztunk, és olyan anyagokat kerestünk, melyekrõl feltételezhetõ volt, hogy alkalmazhatóak lesznek ezen a téren. Három különbözõ jellegû anyagot vontunk be a vizsgálatokba. (i) A triakontanol (TRIA) egy hosszú, nyílt szénláncú alkohol, amely a növények epikutikuláris viaszanyagaiban fordul elõ, és sok vizsgálatban bizonyította, hogy kedvezõen hat a növények növekedésére. (ii) Két, különbözõ algafajt tartalmazó, kereskedelemben is kapható készítmény növényi növekedésre kifejtett hatását vizsgáltuk. (iii) A putreszcin (Put) az egész élõvilágban elterjedt, nagyon sokféle folyamatban szerepet játszó, elsõsorban szignálmolekulaként számon tartott anyag. A szövettenyésztés ideális módszernek tûnt arra, hogy ezeknek az anyagoknak az élettani hatásait alaposabban megismerhessük, valamint, hogy a kereskedelmi mikroszaporítás számára alternatív növekedésszabályozó anyagokat ajánlhassunk. A munka megkezdésekor a következõ célokat tûztük ki: Megvizsgálni a fent említett növekedésszabályozó anyagok (triakontanol, mikroalgák és putreszcin) használhatóságát a növényi szövettenyésztés során Kiválasztani a pozitív hatást mutató anyagokat, s megállapítani ezek optimális koncentráció-tartományát Megvizsgálni a hatékony növekedésszabályozók által a növények fotoszintetikus aktivitására és endogén poliamin szintjére gyakorolt hatását, mert az irodalmi adatok alapján várható volt, hogy a kiválasztott anyagok jelentõsen befolyásolják ezeket a paramétereket Megvizsgálni két-két, egymástól eltérõ szaporodási és gyökeresedési jellegzetességeket mutató alma és cseresznye alanyfajta reakcióját a kiegészítésként alkalmazott növekedésszabályozókra Összehasonlítani a két-két alanyfajta endogén poliamin tartalmát és nyomon követni a poliaminszint változását a gyökeresedés folyamatában Anyag és módszer Táptalajok A növények szaporítása MS (Murashige-Skoog) alapú táptalajon történt, a fajnak, fajtának megfelelõ hormon-kiegészítéssel. A különbözõ táptalajok hormon összetételét az 1. és a 2. táblázatok tartalmazzák. A táptalajok ph-ját minden esetben 5,7 és 5,9 közötti értékre állítottuk be. Az alma gyökeresedése nem volt kielégítõ a hagyományos gyökereztetési módszerrel, ezért bizonyos esetekben indolvajsavas sokk-kezelést alkalmaztunk. Ennek során a hajtásokat 10 mg IVS /l koncentrációjú folyékony táptalajba állítottuk 24 órára, majd hormonmentes, szilárd táptalajra helyeztük õket. 1
1. táblázat: A szaporító táptalajok összetétele Alaptáptalaj BAP (mg/l) KIN (mg/l) Növényfajok és -fajták MS 0,25 vagy 0,5 - JT-E, B9-L, Prob, Colt MS 0,5 - citromfû MS - 2 szegfû, spárga 2. táblázat: A gyökereztetõ táptalajok összetétele Táptalaj IVS (mg/l) Növényfajok- és fajták MS 0 Citromfû, szegfû, burgonya, spárga 0,5 MS Elõkezelés, 10 JT-E, B9-L MS 0,5 vagy 1 Prob, Colt A táptalajokat autoklávozás elõtt töltöttük üvegekbe, melyeknek térfogata 200, illetve 400 ml volt. Az üvegekbe töltött táptalajokat 120 C-on húsz percig autoklávoztuk, majd hagytuk megszilárdulni és 2-3 nap elteltével használtuk fel. Triakontanol A kísérletek során négyféle TRIA koncentrációval dolgoztunk, melyek a következõk voltak: 2, 5, 10 és 20 µg/l, ami 4,5; 11,4; 22,8 és 45,6 nm koncentrációnak felel meg. Triakontanol törzsoldat készítése: 2 mg triakontanolt 1,5 ml kloroformban oldottunk fel, melyet desztillált vízzel hígítottunk enyhe melegítés közben. Ezután 2 csepp Tween 20-at adtunk az elegyhez, melyet desztillált vízzel 400 ml végtérfogatra töltöttünk fel. A TRIA hõstabil ezért autoklávozás elõtt adagoltuk a kísérleti táptalajokhoz. Mikroalga készítmények Kelpak: Az Ecklonia maxima algakivonatából készül. 0,5, 1,0, 1,5 és 2,0 mg/l koncentrációban adtuk a táptalajhoz. Maxicrop: Az Ascophyllum nodosum alga kivonata a kísérleti táptalajokba 0,6, 0,9 és 1,2 mg/l mennyiséget adagoltunk. A táptalajok készítésének menete: A liofilizált algából analitikai mérlegen lemért pontos mennyiséget autoklávozás után adtuk a még folyékony táptalajhoz. A táptalajokat DEP (dietilpirokarbonát) hozzáadásával sterilizáltuk. A táptalajokat 20-30 percig rázattuk, amíg a DEP olajszerû cseppjei teljesen el nem tûntek. 2
Putreszcin A putreszcint steril szûréssel adagoltuk az autoklávozott táptalajba. Az alkalmazott kísérleti koncentrációk 0,5, 1, 1,5 és 2 mg/l Put voltak. Ezek a koncentrációk 3,1; 6,2; 9,3; és 12,4 µm töménységnek felelnek meg. A nevelés körülményei A 200 ml-es üvegekbe 5, a 400 ml-es üvegekbe 10 inokulumot helyeztünk Minden kezelést legalább 5 (a kisebb üvegbõl), illetve legalább 3 üveg képviselt. Az inokulumok a citromfû, a burgonya és a szegfû esetében hormonmentes táptalajon fenntartott tenyészetbõl származó egy nóduszt tartalmazó hajtásdarabok, illetve hajtáscsúcsok voltak. Az alma és a cseresznye esetében 0,5, illetve 0,25 mg/l BAP tartalmú szaporító táptalajon nevelt tenyészetbõl származó hajtáscsúcsokat használtunk. A növényeket a környezettõl elszigetelt helyiségben neveltük, ahol a hõmérséklet 22 ± 2 C, a fotoperiódus 16/8 óra, a fényintenzitás pedig 157 µm/m2/s volt. A kísérleteket 4-6 hetes nevelési periódus végén értékeltük, kivéve az endogén poliamin tartalom méréseket, melyek esetében ezen a mintavételi idõponton kívül a gyökeresedést indukáló kezeléstõl számított elsõ, hetedik, kilencedik és huszonnyolcadik napon szedtünk mintát a növényekbõl. A vizsgált tulajdonságok Mértük a növények növekedésére és fejlõdésére jellemzõ tulajdonságokat (hajtás-, levél-, gyökér- és sarjszám, a hajtások, sarjak és gyökerek hossza, valamint a növények friss és száraz tömege), fotoszintetikus jellemzõiket (fotoszintetikus pigment tartalom, fluorszcencia indukciós kinetika) és bizonyos esetekben az endogén poliamin tartalmukat. Fotoszintetikus pigment tartalom mérés A klorofill tartalom meghatározásához ARNON (1949) két hullámhossz módszerét használtuk. Az összklorofill (kla+klb) tartalmat az alábbi képlet alapján számoltuk: kl(a+b) µg/g fr.súly = (8,02 A663 + 20,2 A644) V/w, ahol A: az adott hullámhosszon mért abszorbció V: az oldat térfogata w: a felhasznált levél tömege A karotinoid tartalom kiszámítása a következõ képlet alapján történt: kar µg/g fr.súly = 5,01 A480 V/w, ahol A: az adott hullámhosszon mért abszorbció V: az oldat térfogata w: a felhasznált levél tömege 3
A fotoszintetikus aktivitás vizsgálata A növények fotoszintetikus aktivitását fluoreszcencia indukciós mérésekkel határoztuk meg (Lichtentaler és Rinderle, 1988). Az indukciós görbe alakulásából következtethetünk a fotoszintetikus elektrontranszport lánc mûködésére. A vizsgálatokhoz Plant Efficiency Analyzer (PEA) hordozható fluoreszcencia mérõ készüléket (Hansatech Ltd., King s Lynn, UK) használtunk. A mérési adatokat PEA Analyzer nevû számítógépes programmal (Hansatech Ltd.) értékeltük ki. Endogén poliamin tartalom meghatározás A növények endogén poliamin szintjét Kátai et al. (1998) módszerével határoztuk meg. A minták poliamin tartalmát OPLC méréssel határoztuk meg Az adatok statisztikai értékelése Minden kísérletet legalább három ismétlésben végeztük, s minden ismétlésben legalább tíz mérést végeztünk kezelésenként. Az adatok statisztikai értékelését az SPSS 7.0 programmal végeztük el, és t-próbát alkalmaztunk. A kísérletekhez felhasznált növények Citromfû (Melissa officinalis L.) Spárga (Asparagus officinalis L.) Burgonya (Solanum tuberosum L.) Szegfû (Dianthus caryophyllus L.) Alma alanyok (Malus domestica L.): Budagovszkij 9 (B9-L) és JT-E Cseresznye alanyok (Cerasus avium Mönch.): Colt és Prob Eredmények Triakontanol A TRIA a citromfû szaporítási fázisában minden jelentõs tulajdonság tekintetében szignifikáns növekedést okozott a kontrollhoz képest. Nem csupán a hajtások számát, de a hajtásonkénti nóduszszámot is megemelte. A nóduszszám emelkedésével nem járt együtt a hajtások erõteljesebb megnyúlása, ami arra vezetett, hogy a triakontanollal kiegészített táptalajon növekedett növények összességében kompaktabb, tömörebb habitusúak voltak a kontroll növényeknél. Ennél a növénynél a 10 µg triakontanol/l bizonyult optimálisnak, mind a hajtások, mind a nóduszok számának szempontjából, ám már a 2 µg /l TRIA koncentrációval is hasonló eredményeket lehetett elérni. A TRIA kedvezõen hatott a növények gyökeresedésére, és már 2 µg/l koncentrációval el lehetett érni a maximális növekedést a gyökerek számában. A legmagasabb alkalmazott koncentráció, a 20 µg/l már nem bizonyult szignifikánsan kedvezõbbnek, mint a kontroll. Néhány növény elágazott a TRIA tartalmú táptalajokon, ami általában nem történik meg hormonmentes táptalajon. 4
A levelek klorofill tartalmára a TRIA drámai hatást fejtett ki a gyökereztetési szakaszban. Már a legalacsonyabb (2 µg/l) TRIA koncentráció is a klorofill tartalom szignifikáns emelkedését eredményezte, ám ez a növekedés a 10 µg/l triakontanollal kiegészített táptalajon nevelt növények esetében elérte a 300 %-ot. A TRIA hatására nem következett be változás sem a fotoszintetikus elektrontranszport lánc mûködésében, sem a karboxilációs kapacitásban. A spárga szaporodására és gyökeresedésére is kedvezõen hatott a TRIA, a szaporítási szakaszban az alacsonyabb koncentrációk voltak optimálisak, míg a gyökereztetésnél a magasabb koncentrációk is pozitívnak bizonyultak. A szegfû nem reagált olyan egyértelmûen a triakontanolra, mint az eddig ismertetett növények. A kontrollhoz képest szignifikánsan magasabb hajtásszámot csak a 10 µg/l TRIA hozzáadásával lehet elérni, s a 20 µg/l TRIA már nem volt képes tovább emelni ezt a hatást. A gyökereztetés során a triakontanol szignifikáns gyökérszám emelkedést eredményezett anélkül, hogy akár a gyökerek, akár a hajtások hosszát jelentõsen befolyásolta volna. A JT-E alma alany szaporodására egyértelmûen kedvezõ hatással volt a triakontanol. Már a legalacsonyabb (2 µg/l) koncentrációban is szignifikánsan magasabb hajtásszámot eredményezett, mint a kontroll. Ez a különbség a magasabb TRIA koncentrációknál is megmaradt és a megemelkedett hajtásszám nem járt együtt a hajtások hosszának csökkenésével. A B9-L alma esetében mind a szaporítás, mind a gyökereztetés sokkal nehezebb, mint a JT-E almáé. 2 µg/l triakontanol alkalmazásával az egy inokulumból fejlõdött hajtások átlagos száma csaknem a kontroll növényekének csaknem kétszeresére nõtt. Ennek ellenére a magasabb koncentrációkkal további szaporodási ráta emelkedést nem tudtunk elérni. A hajtások hossza egyik vizsgált TRIA koncentráció mellett sem tért el jelentõs mértékben a kontrolltól. A gyökereztetés folyamán kétféle módszert is alkalmaztunk. Az elsõ esetben hormonkiegészítés nélkül alkalmaztuk a triakontanolt, míg a másodikban egy 24 órás IVS (indolvajsav) elõkezelés után kerültek a hajtások a TRIA tartalmú táptalajra. Hormonkiegészítés nélkül a JT-E alany hajtásainak gyökeresedése igen gyenge volt, csak a magasabb, 10 és 20 µg/l koncentrációjú TRIA hatására volt elfogadható mértékû gyökeresedés tapasztalható. Az IVS elõkezelés önmagában is igen hatásosnak bizonyult, ám 20 µg/l TRIA hozzáadásával itt is szignifikánsan megemelkedett a gyökeresedés mértéke. 20 µg/l TRIA hatására a hajtások gyökeresedése elérte, sõt meg is haladta az IVS elõkezeléssel csupán önmagában elérhetõ arányt. A B9-L alany esetében a gyökeresedés IVS elõkezelés nélkül, csak TRIA hatására nem következett be. IVS elõkezelés hatására a gyökeresedés nagyobb mértékû volt, ám még így is igen gyengének mondható. A 10 és 20 µg/l TRIA hatására szignifikánsan megemelkedett a hajtásonkénti gyökérszám és a gyökeresedési százalék is. A Colt cseresznye szaporodására igen kedvezõ hatással volt a TRIA. A 20 µg/l TRIA és 0,5 mg/l BAP (benzil-amino purin) kombinációjának kivételével minden koncentrációban megemelte a hajtásszámot. Az alacsonyabb (0,25 mg/l) BAP koncentrációval kombinálva a legkedvezõbb eredményt a 2 µg/l TRIA adta, ám a magasabb TRIA koncentrációk is szignifikánsan nagyobb mértékû szaporodáshoz vezettek, mint a BAP önmagában alkalmazva. 0,5 mg/l BAP-pal kiegészített táptalajhoz adagolva a triakontanolt, az 5 µg/l TRIA bizonyult a legkedvezõbbnek. Ebben az esetben a magasabb, 10 és 20 µg/l-es TRIA koncentrációkkal már nem lehetett további hajtásszám növekedést elérni. Mivel ennél a növénynél igen alacsony klorofill tartalma volt a kontroll leveleknek, érdekes volt, hogy a fotoszintetikus apparátus milyen hatásfokkal képes mûködni. Fluoreszcencia indukciós mérésekkel megállapítottuk, hogy a kontroll növények fotoszintetikus kapacitása az egészséges növényekre jellemzõ érték alá csökkent és ehhez képest a triakontanollal kezelt növények fotoszintetikus aktivitása szignifikánsan megemelkedett, megközelítve az egészséges növényekre jellemzõ értékeket. 5
A szaporítási fázisban a Prob esetében a TRIA nem bizonyult olyan hatékonynak, mint a korábban vizsgált növényeknél. Egyik alkalmazott TRIA koncentrációval sem lehetett szignifikáns emelkedést elérni a képzõdött hajtások számában. A Colt gyökereztetésekor 10 µg/l TRIA és 1 mg/l IVS kombinálásával a gyökérszám csaknem háromszoros növekedését lehetett a kontrollhoz képest. A Prob jobban gyökeresedett, mint a Colt, és ezen a jó gyökeresedési eredményen a TRIA is csak kevéssé tudott változtatni. A növények endogén poliamin tartalmát és gyökeresedési hajlamukat érintõ legfontosabb eredményeket a 3. táblázatban foglaltam össze. Mivel a legtöbb szerzõ a putreszcin tartalomban bekövetkezõ változásokat tartja a leglényegesebbnek a gyökeresedés kiváltásában, a putreszcint emeltem ki a poliaminok közül. A táblázatból látható, hogy a nagyobb arányú gyökeresedést minden esetben a putreszcin tartalom erõteljes változásai kísérték. A kezelés utáni elsõ napon általában emelkedés következett be, és ha ez elmaradt, akkor a gyökeresedés is csak gyenge hatásfokkal történt meg. A hetedik napra a putreszcin szintje jelentõsen lecsökkent. A tendenciákban nem tapasztalható jelentõs különbség a kezelt és a kontroll növények között, de a triakontanollal kiegészített táptalajon tapasztalt jobb gyökeresedési eredményekhez minden esetben nagyobb mértékû putreszcin tartalom változások társultak. Jellemzõ, hogy a B9-L almánál, ahol alig volt gyökeresedés, a putreszcin tartalom gyakorlatilag változatlan maradt a kezelés utáni elsõ héten. A kezelést követõ napon tapasztalható emelkedés a putreszcin tartalomban a Colt fajtánál elmaradt, ez valószínûleg a növényekben mért nagyon magas eredeti poliamin tartalomnak köszönhetõ. 3. táblázat: A növények putreszcin tartalmának változása és a gyökeresedés mértékének összefüggése triakontanol távollétében, illetve triakontanol jelentétében Fajta B9-L JT-E Prob Colt TRIA A putreszcin-tartalom változása Gyökeresedés 0-1 nap 1-7 nap + + + + +++ ++ + +++ + + +++ Jelmagyarázat: TRIA + / triakontanol mellett / távollétében emelkedés közepes mértékû emelkedés nagymértékû emelkedés csökkenés közepes mértékû csökkenés nagymértékû csökkenés nincs változás Gyökeresedés - nincs gyökeresedés Gyökeresedés + gyenge gyökeresedés Gyökeresedés +++ erõteljes gyökeresedés 6
Az algakészítmények Az algakészítmények hatását citromfû, burgonya és szegfû növényeken teszteltük. Annak ellenére, hogy az alga, amelybõl a Maxicrop készül az irodalomban mint citokinin tartalmú élõlény szerepel, mind a citromfûnél, mind a burgonyánál elsõsorban a gyökeresedésre hatott kedvezõen. Hatására megemelkedett a gyökerek száma, amivel párhuzamosan hosszuk csökkent. A citromfû esetében 1,5 % Maxicrop bizonyult a legkedvezõbbnek, míg a burgonya esetében az alacsonyabb, 0,6-0,9 % volt a leghatásosabb. A szegfû, valószínûleg nagyobb érzékenysége miatt egyik algakészítményre sem reagált kedvezõen. A Kelpak a citromfû esetében a Maxicrophoz hasonló eredményeket adott, megemelkedett gyökérszámot és enyhén csökkent gyökérhosszat eredményezett, ám a Maxicroppal ellentétben a burgonyánál elsõsorban a szaporodásra hatott kedvezõen. A citromfû gyökeresedésére az 1 %, a burgonya szaporodására azonban az 1,5 % Kelpak volt a legkedvezõbb befolyással. A putreszcin hatása a fás szárú növények gyökeresedésére Hormonmentes táptalajon a putreszcin nem serkentette jelentõs mértékben a JT-E alma alanyok gyökeresedést, még a 2 mg/l putreszcinnel is csupán esetleges volt a hajtások gyökeresedése. 0,5 mg/l IVS-sel kombinálva a magasabb Put koncentrációk ugyan megemelt gyökérszámot eredményeztek, ám ezek a különbségek statisztikailag nem bizonyultak szignifikánsnak. A hajtásonként fejlõdött gyökerek száma ugyan nem változott a putreszcin hatására, ám a meggyökeresedett növények száma megemelkedett, és ebbõl a szempontból az 1 mg/l Put bizonyult a leghatékonyabbnak. Összességében a cseresznyérõl is ugyanaz mondható el, mint az almáról. A külsõleg adagolt putreszcin egyetlen koncentrációban sem eredményezett szignifikánsan jobb gyökeresedést a Prob fajtánál, mint a kontroll. IVS-sel kombinálva ebben az esetben csupán a 0,5 mg/l Put bizonyult jobbnak, mint a 0,5 mg/l IVS önmagában alkalmazva. A gyökeresedési százalék, az almához hasonlóan a Prob növényeknél is megemelkedett. Mindkét növény esetében jellemzõ volt, hogy a hajtások alapi részén a putreszcin hatására erõs kalluszosodás indult meg, mely IVS-sel kombinálva még erõteljesebbnek mutatkozott. Ugyancsak fontos megemlíteni, hogy a gyökeresedés korábbi idõpontban kezdõdött meg a putreszcinnel kiegészített táptalajokon, mint a hormonmentes, illetve csak IVS-t tartalmazókon. Új tudományos eredmények A triakontanol kedvezõ hatással van több lágyszárú és két fás szárú növény növekedésére a mikroszaporítás során. Citkonininekkel kombinálva a triakontanol hatására megemelkedik a szaprodási ráta. A triakontanol önmagában is serkenti a növények gyökeresedését, és auxin jelenlétében jelentõsen megemeli a hormon hatását. Segítségével kiváltható egy nehezen gyökereztethetõ alma alany gyökeresedése. A mikroszaporításban triakontanol nem váltja ki a növények szárazanyag tartalmának növekedését. A triakontanol alkalmazása nagy mértékû növekedést eredményez a növények fotoszintetikus pigment tartalmában és elõsegíti a hatékony fotoszintetikus mûködés fennmaradását a mikroszaporításra jellemzõ stressz körülmények között. A triakontanollal kiegészített táptalajokon a növények endogén poliamin tartalma a kontroll növényekétõl eltérõen alakult a gyökeresedés folyamán. A triakontanollal kiváltható erõteljesebb gyökeresedést minden esetben intenzív poliamin metabolizmus kíséri. 7
Az algakészítmények kedvezõen hatnak a citromfû és a burgonya növekedésére és gyökeresedésére. Az algakészítményekkel kiegészített táptalajon nevelt növények nagyobb hatásfokkal akklimatizálhatók. Külsõleg adagolt putreszcin hatására fás szárú növényeknél megemelkedik a gyökeresedési százalék, de a hajtásonként fejlõdött gyökerek számára csak gyenge hatása van. Következtetések és javaslatok A triakontanol élettani hatásai A triakontanol eredményesen használható az általunk vizsgált növények mikroszaporításában. Önmagában alkalmazva inkább a gyökeresedésre, a gyökerek fejlõdésére van hatással, ám különbözõ citokininekkel kombinálva a szaporodást is jelentõs mértékben serkenti. Egyértelmûen kimutatható volt a növények friss tömegére, fotoszintetikus teljesítményére és általános produkciójára gyakorolt kedvezõ hatása. Kimutatták, hogy a triakontanol hatására több, fotoszintézishez kapcsolódó gén átíródása serkentõdik, míg tizenöt más, stresszválasszal összefüggésbe hozott gén kifejezõdése gátlódik. Ez utóbbiak között az abszicinsav szintézisével, általános stresszválaszokkal, valamint a sebzéssel kapcsolatos géneket találtak. A fotoszintetikus széndioxid fixáláshoz kapcsolódó és a PSII fehérjéinek szintéziséért felelõs gének átíródása megemelkedett. Mindez magyarázhatja az általunk tapasztalt jelenségeket. A már említett irodalmi adatok és saját eredményeim alapján javaslom a triakontanol kipróbálását fotoautotróf mikroszaporítási rendszerekben is, mert várható, hogy javítani fogja ennek a módszernek a hatékonyságát. A mi vizsgálatainkban egyetlen esetben sem volt hatása a TRIA-nak a növények relatív szárazanyag tartalmára. Ennek a jelenségnek az lehet a magyarázata, hogy a növények a mikroszaporítás különleges körülményei között megváltozott élettani sajátosságokat mutatnak, és a szabadföldi körülményekhez képest lényegesen nagyobb mennyiségû vizet halmoznak fel a szervezetükben. A triakontanol minden vizsgált növényfaj- és fajta esetében elõsegítette a növények in vitro gyökeresedését. Az esetek többségében a magasabb, 10 és 20 µg/l TRIA koncentrációk bizonyultak optimálisnak. Ha a triakontanolt auxinnal kiegészített táptalajhoz adagoltuk, magasabb gyökérszámot lehetett elérni a két anyagot kombinálásával, itt azonban az optimális koncentráció tartomány az alacsonyabb, 2 és 5 µg TRIA/l koncentrációk felé tolódott el. Ez arra enged következtetni, hogy a triakontanol és az auxin szinergista hatást fejtettek ki. Mindezek arra mutatnak, hogy bár a triakontanol hatással van a növények fejlõdésére, nem egyértelmûen hormon hatású anyaggal van dolgunk. Elképzelhetõ, hogy a TRIA hatására megváltozik a növények poliamin anyagcseréje, ami akkor is elõidézheti a gyökeresedésben bekövetkezõ változásokat, ha magának a triakontanolnak nincsen auxin hatása. Ez a meggondolás indított bennünket a növények poliamin tartalmának vizsgálatára a triakontanollal kiegészített táptalajokon nevelt alma és cseresznye növények esetében. A kapott eredmények azt mutatták, hogy a TRIA tartalmú táptalajon nevelt növények poliamin tartalma a kontroll növényekéhez képest drasztikusan megváltozik. Ez a változás sok esetben nem csupán a poliaminok mennyiségében, hanem az egyes poliaminok közötti arányban is megmutatkozott. Az általunk elvégzett mérésekkel nem állapítható meg minden kétséget kizáróan, hogy ezek a változások a triakontanol közvetlen hatására következtek volna be, azonban a triakontanol hatására bekövetkezett kedvezõbb gyökeresedési eredményekkel korrelálnak. A legtöbb esetben már a kezelést követõ napon jelentõs változásokat tudtunk kimutatni mind a poliaminok mennyiségében, mind azok egymáshoz viszonyított arányában. A gyökeresedés következõ napjaiban a poliaminok mennyisége minden esetben lecsökkent, ami intenzív metabolizmusukra utal. 8
Megfigyelések szerint a gyökérindukciós szakaszt követõen a növények putreszcin tartalma lecsökken, mert vagy degradálódik, vagy továbbalakul. Ennek elmaradása, azaz a magas Put szint fennmaradása okozhatja a rosszabb gyökeresedést egyes növényekben. Az általunk kapott eredmények alapján úgy tûnik, hogy a gyökeresedés kiváltásához erõteljes poliamin metabolizmus szükséges, melyet a TRIA valamely módon képes serkenteni. Ahhoz, hogy a triakontanol és a növények poliamin háztartása közötti szorosabb kapcsolatot megbízhatóan fel lehessen térképezni, további vizsgálatok lennének szükségesnek. Ennek egyik lehetséges módszere a poliamin szintézis gátlók alkalmazása, mellyel eldönthetõ lenne, hogy a triakontanol a poliaminok szintézisének befolyásolásán keresztül fejti-e ki a hatását. Lehetséges továbbá a poliamin oxidázok aktivitásának mérését célzó vizsgálatok elvégzése, valamint a triakontanol hatására az etilén termelésben bekövetkezõ változások mérése is. Az algakészítmények hatása a növények fejlõdésére Az algakészítmények alkalmazhatóságát vizsgálva megállapíthatjuk, hogy rendelkeznek növekedést serkentõ hatással, habár ez a hatás nem egyezik meg erõsségében az általánosan használt egyéb citokinin készítményekével. A Maxicroppal kiegészített táptalajokon nevelt citromfû növények jobban növekedtek, nagyobb számú, de rövidebb gyökeret fejlesztettek. A Maxicrop hatására még azokon a táptalajokon is szignifikáns emelkedés volt mérhetõ a klorofill tartalomban, ahol a növények egyéb tulajdonságaiban nem volt erõteljes pozitív változás megfigyelhetõ. A burgonyán végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a Maxicrop egyetlen koncentrációban sem volt jelentõs hatással a növények növekedésére. Ennél a növénynél valószínûleg magasabb Maxicrop koncentráció alkalmazásával lehetne látványosabb eredményeket produkálni. A szegfû - a burgonyával ellentétben - már az általunk vizsgált magasabb koncentrációkra is egyértelmû növekedésgátlással reagált. Ennek az oka minden valószínûség szerint a növények eltérõ érzékenységében keresendõ. A Kelpak az elvárásoknak megfelelõen elsõsorban a növények gyökeresedését serkentette. A vizsgált növények közül a citromfû reagált a legkedvezõbben és a szegfûnél bizonyult a legkevésbé kedvezõnek a Kelpak alkalmazása. A citromfûnél szignifikánsan magasabb klorofill tartalom, gyökérszám és friss tömeg volt megfigyelhetõ, és a gyökérszám emelkedésével párhuzamosan csökkent a gyökerek hossza. A gyökér hossznövekedését az emelkedõ koncentrációk egyre nagyobb mértékben gátolták, ami egyértelmûen jelzi, hogy a gyökérhossz csökkenése a Kelpakban található anyagok hatására következett be. Mivel a szegfû a magasabb Kelpak tartalomra minden növekedési paraméterben jelentõs romlással reagált, valószínû, hogy ez a növény sokkal alacsonyabb koncentrációkra érzékeny, mint a többi. Fontos, hogy a szegfû, mely kifejezetten hajlamos a hiperhidratációra, a Kelpak tartalmú táptalajon normális hajtásokat fejlesztett. A burgonyával végzett kísérletekben a gyökérszám változatlan maradt, míg a gyökerek hosszában emelkedés volt megfigyelhetõ. Ez a burgonya magasabb érzékenységi küszöbére utal. Mindezek alapján nem lehetett egyetlen olyan koncentrációt kiválasztani, mely egyértelmûen kedvezõen hatott volna valamennyi vizsgált növény növekedési folyamataira. Ennek oka lehet az, hogy maguk a növekedésszabályozó anyagok olyan koncentrációban voltak jelen, melyek egyes növényeknél nem érték el, másoknál pedig meghaladták az adott növény számára optimális mértéket. Nem hanyagolható el az sem, hogy a mikroalga kivonatok a növényi hormonokon kívül más anyagokat is tartalmaznak, melyek megváltoztathatják a táptalaj sókoncentrációját és maguknak a hormonoknak a felvehetõségét, illetve hatását. Elképzelhetõ, hogy ez egy olyan magas sótartalmú táptalajon, mint az MS, egyes növények esetében növekedésgátláshoz és a növények gyengébb teljesítményéhez vezethet. 9
Jelen kísérletekben csupán hormonmentes közegben kísérleteztünk a tengeri algakivonatokkal, mert elsõsorban az volt a célunk, hogy az önmagukban kifejtett hormonhatás milyenségét és erõsségét vizsgáljuk. A kapott eredmények alapján a további vizsgálatok feltétlenül javasolhatóak, hiszen érdemes lenne megvizsgálni, hogy alacsonyabb sókoncentrációjú táptalajon hogyan reagálnak a növények az adott készítményre, valamint azt is, hogy az általánosan alkalmazott növényi hormonokkal milyen kölcsönhatásba lépnek. A putreszcin hatása a fás szárú növények gyökeresedésére Vizsgálatainkban a külsõleg adagolt a putreszcin nem bizonyult hatásosnak a növények gyökereztetésekor. Hormonkiegészítés nélkül nem lehetett jobb gyökeresedési tulajdonságokat elérni vele, bár a gyökeresedési százalékot valamelyest megemelte. IVS-sel kombinálva elõsegítette a hajtások meggyökeresedését, mindazonáltal szignifikáns különbséget sem a gyökerek számában, sem a gyökerek hosszában nem kaptunk. Feltételezések szerint a külsõleg adagolt poliaminokat a növények nem metabolizálják azonos módon az endogén poliaminokkal. Talán ez a magyarázata annak, hogy bár a poliaminok feltétlenül szükségesek a gyökérindukcióhoz, az exogén poliamin adagolás nem serkenti a gyökerek képzõdését. Az, hogy a putreszcin és IVS együttes alkalmazásakor megemelkedett a gyökeresedési százalék, és a hajtások gyökérszáma, arra utal, hogy az auxin és a poliaminok között szinergisztikus kapcsolat van. Az is lehetséges, hogy a poliaminok hírvivõ molekula szerepét töltik be az auxin hatás kiváltásában, amivel inkább magyarázhatóak az általunk megfigyelt jelenségek. A putreszcin és az IVS együttes alkalmazásával eszerint azért lehetett nagyobb mértékû gyökeresedést elérni, mint az IVS-sel önmagában, mert a megemelkedett putreszcin mennyiség hatékonyabb jelérzékelést tett lehetõvé, megemelve ezzel az azonos IVS mennyiségre adott válasz nagyságát. Érdekes volna megvizsgálni az endogén poliamin szint változását ebben a kísérleti rendszerben is, mert így részletesebb információkat kaphatnánk a gyökeresedés folyamatának szabályozásáról. Irodalomjegyzék Arnon, D. (1949) Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenol oxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol. 24:1 Kátai, Gy., Tyihák, E., Minicsovics, E., Sárdi, É., Kérályné Véghely Zs. (1998) A személyi túlnyomásos rétegkromatográf analitikai alkalmazási lehetõségei biológiai minták vizsgálatánál. Magy. Kém. Foly. 104(7): 277-287 Lichtentaler, H.K., Rinderle, U. (1988) The role of chlorophyll fluorescence in the detection of stress condition in plants. CRC Crit. Rev. An. Chem., Vol 19, Suppl. 1. p.: ssi S29-S85 10
A dolgozat témájához kapcsolódó publikációk Tantos, Á., Mészáros, A., Horváth, G., Farkas, T. (1999) The effect of triacontanol on icropropagation of Melissa officinalis L. Plant Cell Rep. 19: 88-91 Kissimon, J., Tantos, Á., Mészáros, A., Jámbor-Benczúr, E., Horváth, G. (1999) Alterations in growth parameters, pigment content and photosynthetic functions under the stress conditions of in vitro culture. Z. Naturforsch. 54c: 834-839 Tantos, Á., Mészáros, A., Farkas, T., Szalai, J., Horváth, G. (2001) Triacontanol supported micropropagation of woody plants. Plant Cell Rep. 20: 16-21 Tantos, Á., Mészáros, A., Farkas, T., Kissimon, J., Horváth, G. (2000) A triakontanol mint természetes növekedésszabályozó néhány kertészeti növény mikroszaporításában. Lippay János Tud. Ülésszak, 2000, nov. 6-7.: 178-179 Mészáros, A., Tantos, Á., Kissimon, J., Jámbor-Benczúr, E., Horváth, G. (1998) Triacontanol as a potential growht regulator in tissue cultures. IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture, Jerusalem, Israel. Proceedings pp. 94 Kissimon, J., Tantos, Á., Mészáros, A., Jámbor-Benczúr, E., Horváth, G. (1998) Alteration in photosynthetic functions under different in vitro culture conditions. Int. Workshop on Stress Synergism in Plants, Abiotic and Biotic Stress in Photosynthesis. Tata, Hungary, aug. 23-26. Program and abstracts: pp 48 Tantos, Á., Mészáros, A., Farkas, T., Kissimon, J., Horváth, G. (2000) Triacontanol supported micropropagation of horticultural plants. 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Budapest, Hungary. Abstracts, Plant Physiol, Biochem. 38 (Suppl.): p. s256 Mészáros, A., Tantos, Á., Örsi, B., Ördög, V. (2001) Groth promoting effects of microalgal extracts in the micropropagation of horticultural plants. Symp. on Microalgae and Seaweed Products in Plant/Soil Systems. Mosonmagyaróvár, Hungary, jun. 20-22. Book of Abstracts pp55 11