DNS-helikáz domének táncrendje A kulcstól a bulldózerig: szárnyas hélix domének funkcionális plaszticitása Kovács Mihály ELTE TTK Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék ELTE-MTA Lendület Motorenzimológiai Kutatócsoport www.mk-lab.org
Motiváció Motorenzim-aktivitások szerepe a DNS-ben kódolt információ karbantartásában Helikáz enzimfunkciók sokasága ATP-hidrolízis transzlokáció szálszétválasztás szálillesztés nukleoprotein lebontás szálvándoroltatás Komplex fehérje-architektúra
Helikáz architektúra Hexamer helikázok (Superfamily 3-6): Egy RecA domén / monomer Oligomerizáció abszolút szükségszerű Monomer helikázok: (Superfamily 1-2) Két RecA domén / monomer Oligomerizáció többletfunkciót hordozhat hexamer helikáz PcrA (SF1 helikáz) RecQ (SF2 helikáz)
Araszoló helikáz-működés Ábra: Berg et al. alapján
RecQ család Archaea E. coli Élesztő Humán
Szárnyas hélix (winged helix, WH) domén Szerkezeti konzervativitás - Funkcionális plaszticitás Szekvencia-specifikus dsdns felismerés ( kulcs -funkció) Transzkripciós faktorok Szekvencia-aspecifikus dsdns tolólapát ( bulldózer -funkció) DNS-helikázok Szálstruktúra-felismerés és specificitás? Fehérje-fehérje kölcsönhatások Interdomén és alegységek közötti
WH domén felépítés Helix-Turn-Helix H L H T H* *felismerő (recognition) hélix WH domén H S H T H* S W1 S W2 β-szálak általában antiparalel W2 hiányozhat CarB (Transzkripciós faktor) Topoizomeráz I (katalitikus funkció) AGT (metilguanin-metiltranszferáz) GH5 (linker hiszton) RPA (ssdns-kötő fehérje) Transzkripciós faktorok (HNF3-γ, E2F4-DP2, Rfx1, Cap/Crp, SmtB) W2 H: helix S: strand L: loop T: turn W: wing (loop) HNF3-γ W1 H*
Felismerő funkciójú DNS-kötési módozatok HNF3-γ típus Fő kölcsönhatás: H* - nagy árok Minor kölcsönhatás: szárny-kis árok HNF-3γ Rfx1 típus Fő kölcsönhatás: szárny - nagy árok Minor kölcsönhatás: H* - kis árok Rfx1
WH szerepe RecQ-helikázokban: a kirajzolódó két csoport WH esszenciális WRN, RecQ1: W1 ék funkció, terminális DNS-bázispár szétválasztása W1 mutációk hatására elvész a szálszétválasztó aktivitás WH nem esszenciális Hel308: WH nem köti a DNS-t, hanem a RecA domént pozicionálja BLM: saját adatok RecQ1 WRN Hel308
WH konformáció-váltás RecQ helikázokban? E. coli RecQ (apo, AMPPNP) Humán RecQ1 (ADP, DNS) WH domén
BLM helikáz anatómiája N-terminális domén Zn 2+ -kötő domén WH domén Teljes (FL) BLM (1417 aa) BLM 1005 BLM 1077 BLM 1290 (kontroll) Teljes (FL) E. coli RecQ RecA domének HRDC domén
ATPase activity (s -1 ) BLM 1005 40 30 20 10 0 Csak a RecA-doméneket tartalmazza Nincs DNS-aktivált ATPáz aktivitása Gyimesi et al (2012) Nucleic Acids Res - 1OYY_BLM_model.pdb
mol P i / mol BLM BLM 1077 RecA + ZnBD domének (nincs WH) DNS-aktivált ATPáz aktivitás, ssdns transzlokáció, processzivitás megmarad 30 25 BLM1290 BLM1290 BLM1077 Transzlokációs sebesség (nt/s) 33 2 40 5 Kötőhely-méret (nt) 14 10 Lépésnagyság (nt/atp) 1.1 0.1 1.2 0.2 20 15 10 BLM1077 5 BLM.m13 ATP+HEP 0 0 2 4 6 8 Time (s)
BLM 1077 : dsdns szálszétválasztás és D-hurok szétválasztás megmarad Unwound strand (%) Disrupted D-loop (%) BLM 1290 - * BLM 1077 - * * BLM 1077 - * * BLM 1077 - * 100 80 BLM1077 100 80 60 BLM1290 60 40 40 20 20 0 0 200 400 600 800 1000 [BLM] (nm) 0 0 5 10 15 20 25 [BLM1077] (nm)
BLM 1077 : Rad51 nukleoprotein lebontás megmarad
D-hurok szétválasztás detektálása DNS szubsztrátok és termékek, natív PAGE
D-hurok szétválasztás Single turnover kinetika FL BLM Koordinált szétválasztás BLM 1077 Koordinálatlan szétválasztás
Összegzés WH domén Szerkezetileg konzervált, funkcionálisan plasztikus DNS-kötésmódok változása, kulcs vs. tolólapát funkció (szekvencia vs. szálstruktúra-specificitás) WH domén RecQ helikázokban Egyes enzimekben szükséges a szálszétválasztáshoz, másokban nem Potenciális domén-mozgás felderítetlen (folyó munkák) WH-mentes BLM helikáz: aktív motor, de bonyolultabb DNS-struktúrák koordinált átalakítására nem képes (folyó munkák) Elágazó DNS-szálak felismerése?
Résztvevők, támogatók Nagy Nikolett 2005- TDK, M.Sc., (Ph.D.) ELTE Sarlós Kata 2006- TDK, M.Sc., (Ph.D.) ELTE, NIH (USA), Univ. of Copenhagen Bibó András 2006- (Ph.D.) BME Dr. Jelinek Balázs 2006-2009 posztdoktor ELTE Dr. Takács Balázs 2006-2011 Ph.D. ELTE Sarankó Hajnalka 2007-2009 M.Sc. ELTE Dr. Gyimesi Máté 2007-2012 posztdoktor ELTE, UC Davis (USA) Harami Gábor 2008- TDK, M.Sc., (Ph.D.) ELTE Gervai Judit 2009- B.Sc., TDK, (M.Sc.) ELTE Molnár Eszter 2009- B.Sc., TDK, (M. Sc.) ELTE Kocsis Zsuzsa 2009- (Ph.D.) ELTE Szabó Judit 2009-2010 B.Sc. ELTE Debasish Roy 2011 M.Sc. ELTE, VIT (India) Ferenczi Veronika 2011- (Ph.D.) ELTE Krajcsi Anikó 2011- asszisztens ELTE Ricardo Pires, Módos Károly, Kellermayer Miklós (Semmelweis Egyetem) Mario Spirek, Lumir Krejci (Masaryk Univ., Brno, Csehország) Keir Neuman (NIH, Bethesda, MD, USA)