Nanoszerkezetek és biomarkerek a gyógyítás szolgálatában Dékány Imre MTA r.tagja MTA SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoport SZTE AK rvosi Vegytani Intézet Szeged, Dóm tér 8.
Tartalmi összefoglaló - SPR 2D technológia alkalmazása az adszorpció kvantitativ mérésére: aminosavak és proteinek - Hatóanyagok és toxikius molekulák megkötése funkcioanlizált Au felületeken - Au nanorészecskék lipid membránokban - Au plazmonikus csatolás biomolekulákkal - Hatóanyagok nanokapszulázása
Normalized absorbance Au és Ag nanorészecskék optikai tulajdonságai Surface plasmon resonance (SPR) These phenomena occur when electromagnetic field interacts with conduction band electrons and induces the coherent oscillation of electrons. E H 1 transverse oscillation (TSP) longitudinal oscillation (LSP) 0.75 0.5 0.25 Ag TSP : λ max1 = 385 420 nm ~ 1/r Au TSP : λ max1 = 500 550 nm ~ 1/r 0 300 400 500 600 700 800 Wavelength (nm) Plasmon bands of spherical gold and silver nanoparticles 3
Az SPR mérés kísérleti elrendezése The prism coupling (Kretschmannconfiguration) in SPR technique Schematic representation of Kretschmann-configuration
Specific adsorbed amount (nmol/cm 2 ) Specific adsorbed amount (nmol/cm 2 ) SPR mérések és adszorpciós izotermák 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 0,6 0,5 Dopamine (b) 0,5 Dopamine (b) 0,4 0,4 0,3 0,2 0,1 Ibuprofen (a) 0,3 0,2 0,1 0 Ibuprofen (a) 0 2 4 6 8 10 0 25 50 75 100 125 c (mm) t (min) The plasmonic curves of adsorption of (a) ibuprofen and (b) dopamine on gold surface at different concentrations (0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm 3 aqueous solutions) The adsorption isotherm of (a) ibuprofen and (b) dopamine from aqueous solution on gold surface
Adszorpció és felületi orientáció
Specific adsorbed amount (nmol/cm 2 ) 1,2 SPR mérések: Au-cisztein- ibuprofen rendszer 1 0,8 0,6 Gold 0,4 0,2 0.5 mm 1mM 2mM 4mM 6mM 10mM Ibuprofen L-cysteine 0.5 1 2 4 6 10mM 0 90 140 190 240 290 340 t (min) The plasmonic curves of adsorption of ibuprofen on L-cysteine functionalized gold surface from aqueous solutions ( at 0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm 3 concentrations )
Table 1. The monolayer adsorption capacities (G mono ) and molecular cross section areas (a) on gold surface for different bioconjugated systems as obtained from adsorption isotherms Molecules on gold surface Monolayer capacity, Γ m. /nmol cm 2 Eq. (5) Cross sectional area, a m. /nm 2 Eq. (6) a m /a m,calc Calculated cross sectional area * a m,calc /nm 2 Surface orientation L-Cysteine 0.325 0.513 1.425 0.360 parallel L-Glutathion 0.135 1.234 1.505 0.820 parallel Ibuprofen 0.330 0.505 0.789 0.640 parallel Dopamine 0.860 0.194 0.359 0.540 perpendicular Molecules on functionali sed gold surface Adsorptio ncapacity, Γ m. /nmol cm 2 Eq. (5) Cross sectional area, a m. /nm 2 Eq. (6) a m /a m,calc Calculated cross section area, *a m,calc /nm 2 Surface orientation L-Cyst- Ibuprofen L-Glut- Ibuprofen L-Cyst- Dopamine L-Glut- Dopamine 0.325 0.513 0.801 0.640 parallel 0.180 0.926 1.447 0.640 parallel 0.640 0.260 0.481 0.540 perpendicular 0.580 0.287 0.531 0.540 perpendicular
Arany nanoszenzorok aflatoxinok kimutatására
A, - UV-Vis plazmonikus spektrumok 1.50 1.25 Aminodextran reduced AuNPs NaBH4 reduced AuSHbCD nanodispersion 1.00 Dl= 20 nm 0.75 0.50 0.25 0.00 350 450 550 650 750 850 l, nm The changes of plasmon bands of aminoldextran reduced gold nanodispersion and AuSHbCD gold nanodispersions(164 mg/ml; 0.5 mm Au) registered by UV-Vis spectroscopy.
A, - A, - UV-Vis mérések B 1 -aflatoxin CH 3 Hydrophobic S-H group substituted g-cyclodextrin Attachment of Aflatoxin B1 molecules to cyclodextrin modified gold surface and b- cyclodextrin on gold crystal surface (111). 0.45 0.3 0.15 AuSHb CD naodispersion l max = 539 nm 1.7-3.4-8.-3 ng/ml AfB2 350 500 650 800 l, nm The changes of plasmon bands of AuSHbCD gold nanodispersions (164 mg/ml; 0.5 mm Au) added AfB1 (in concentration range 3-33 ng/ml AfB1 and 1.7-8.3 ng/ml AfB2) to the solution are also registered by UV-Vis spectroscopy in dilute acetonitril solution. 1 0.75 0.5 0.25 0 AuSHbCD naodispersion l max = 539 nm 350 500 650 800 l, nm 548-549- 550 nm 3-13 - 33 ng/ml AfB1 0.2 0.15 0.1 0.05 0
Adsorbed amount Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) Wavelength Adsorption Desorption SPR mérések AfB1 molekulával n S t(otal adsorbed amount) = n S phys + n S chem Reversible Weak physical interactions 6 Irreversible Strong physical or chemical interactions 5 4 Adsorption Desorption Time 3 AfB1: 0.4 ng/cm 2 (0.167-32 ng/ml) 2 1) Aflatoxin B1 (AfB1) molecules 1 H 3 C H 3 C H 3 C Au layer (50 nm) Glass surface 0 0 20 40 60 80 100 120 Time (min) Fig. 7. Results of SPR measurements: AfB1 solution (0.167-32ng/ml) to gold surface.
Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) 2) SH modified bcd (bcd-sh) molecules 200 Adsorbed amount (ng/cm 2) Au layer (50 nm) Glass surface 150 100 8 7 6 50 0 0 1 2 3 c SHbCD, mg/ml 5 4 SH-b -CD: 169 ng/cm 2 (0.5-3 mg/ml) 3) AfB1 to bcd-sh covered surface 3 2 1 0 0 40 80 120 160 Time (min) Au layer (50 nm) Glass surface Fig. 8. Results of SPR measurements: bcd-sh (0.5-3 mg/ml) to gold surface.
Adsorbed amount (ng/cm 2 ) Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) 4) 5) AfB1 molecules attach to bcdsholes of AuNPs with bcd-sh (bcdaunps) bcdaunps AuNP Au layer (50 nm) Glass surface 100 80 H 3C Au nanodispersion: 87 ng/cm 2 AuNP Au layer (50 nm) H 3C Glass surface 60 H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C 40 100 80 60 40 20 0 0.00 5.00 10.00 c Au (ng/cm 2 ) 20 0 AuSHb CD: 0-10 ng/cm 2 0 50 100 150 200 250 300 Time (min) Results of SPR measurements: AuSHbCD gold nanodispersions (0-10 ng/ml Au).
Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) AfB1 molecules attach to bcdsholes of bcdaunps H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C Adsorbed amount (ng/cm 2 ) ) 5) AuNP H 3C H 3C H 3C H 3C Au layer (50 nm) Glass surface 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 AuSHb CD: 35 ng/cm 2 10 (3.28 mg/ml) 20 AfB1: 16.3 ng/cm 2 (1-60 pg/ml) 15 0 100 200 300 Time (min) 5 0 0 0.02 0.04 0.06 c AfB1 (ng/cm 3 ) Fig. 11. Results of SPR measurements: in first step Au nanodisperson and after added AfB1 (in concentration range 0-32 ng/ml AfB1) in dilute acetonitril solution.
Biomarker Nanorészecske Antitest-2 Antigén-1 Antitest-1 Membránfehérje Foszfolipid kettősréteg
Az animáció kattintásra indul.
12 10 Blokkoló oldat Biotinált foldamer Ab oligomer oldatok 7 6.8 6.6 100 nm Ab oligomer 1 mm 8 6.4 Dl, nm Dl, nm 6 4 2 Streptavidin 6.2 6 140 180 220 260 t, min 0 0 40 80 120 160 200 240 280 t, min Közeg: PBS puffer oldat Áramlási sebesség: 20 ml/perc 500 ml folyadéktérfogatok kerültek beadagolásra 1. Lépés: Streptavidin 10 mm 2. Lépés: BSA 1% oldata 3. Lépés: Biotinált foldamer 20 mm oldata 4. Lépés: Ab oligomer 100 nm 5. Lépés: Ab oligomer 1 mm
A plazmonikus csatolás lehetőségei Schematic figures of the prepared AuNP samples (a) AuNP(Trp), (b) AuNP(CysTrp), (c) AuNP(Lys) and (d) the plasmonic coupling effect
Fluoreszcencia spekrtumok Au-lizozim rendszereken
HRTEM images of the (a) AuNP(CysTrp) and (b) AuNP(Lys) samples with the ratio of m Lys /m Au = 5
XRD mérések (A) XRD pattern of (a) bulk gold, (b) AuNP(cit), (c) AuNP(Lys) and (d) AuNP(Cys) samples (B) The SAXS curve of (a) AuNP(Lys) sample (c Lys =1 mg/ml) and the calculated SAXS curve (GNM fit)
SAXS mérések (A) The SAXS curve of the AuNP(Lys) nanoparticles in Kratky representation (B) calculated pair distance distribution function of the AuNP(Lys) samples m Lys /m Au = 5 (C) the SAXS curves of Porod representation m Au /m Lys = 1:5 (a), 1:15 (b), 1:20 (c)
Langmuir monoréteg vizsgálatok 60 50 DPPC (mn/m) 40 30 20 asolectin Kibron MicroTroughS 10 0 0 2000 4000 6000 8000 A (mm 2 ) Surface pressure area isotherms of the model membrane materials: DPPC and asolectin DPPC: dipalmytoil-phosphatidylcholine pure phospholipid asolectin: mixture of phospholipids and fatty acids
Au nanorészecskék beépülése a lipid membránba 1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air interface
Schematic representation of the nanoparticles penetration into lipid membrane 1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air interface 2. Compression 3. Penetration of functionalized nanoparticles into membrane
A monomolekulás réteg átvitele szilárd felületre Langmuir-Blodgett method Solid supported monolayer membrane with Au NPs incorporated
Au- cisztein beépülése monoréteges membránba Au-cys NPs H 2 N C CH H 2 C - S S S CH2 H 2 N CH C - D, mn/m 5 4 3 2 Asolectin DPPC 30 25 1 (mn/m) 20 15 10 5 Δπ 0 0 1000 2000 3000 4000 time (s) Change in the surface pressure of the monolayer during the incorporation 0 0 10 20 30 40 50 0, mn/m Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure (π 0 ) due to the nanoparticle incorporation
Au - glutation beépülése a monoréteges memránba NH 2 H 2 H H 2 H CH C N C C H C CH2 C CH NH C H 2 C S 4 Au-gsh NPs H 2 H C H C C CH N CH CH2 NH C NH 2 S H 2 C S S C C H H 2 D, mn/m 3 2 DPPC 40 35 1 Asolectin (mn/m) 30 25 20 15 10 5 Δπ 0 0 1000 2000 3000 4000 time (s) Change in the surface pressure of the monolayer during the incorporation 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0, mn/m Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure (π 0 ) due to the nanoparticle incorporation
Biofunkcionalizált Au NR beépülése a DPPC membránba Penetration of the biofunctionalized Au NPs into the different model membranes at different compactnesses ( eg. initial surface pressures) D, mn/m 5 Au-cys Rod AR 2.8 4 3 2 1 Au-gsh 10 nm Au-cys 15 nm Au-gsh 15 nm Au-cys 10 nm increase in surface pressure means the penetration of the particles into the membrane composition and initial surface pressure have marked influence on the penetrated amount 0 0 10 20 30 40 50 60 70 0, mn/m
Biofunkcionalizált Au NR és a phospholipid monoréteg DPPC Air Aqueous subphase ph 7.4 - P - P - P - P - P N + N + N + N + N + Au nanoparticles CH C H 2 N H 2 C S S Au - CH C H 2 N H 2 C S S Au - and DPPC zwitterionic form S CH2 CH C H 2 N - S CH2 CH C H 2 N -
TEM image of the 10 nm spherical Au NPs anduv-vis absorbance spectra of different sized, bioconjugated Au NPs.
TEM image of the Au nanorods, UV-Vis absorbance spectra of the aqueous dispersions of the Au NRs.
Maximum insertion pressure (MIP) and synergy values obtained for the different sized, shaped, surface functionalized nanoparticles with DPPC membrane.
Zn-Au plazmonikus csatolás
Au és Zn nanohibrid filmek Schematic representation of the sample Schematic representation of the sample Zn (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers Au nanoparticles d=10 nm spray coating technique quartz Zn (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers Au film - 47 nm thickness SPR substrate glass layer numbers: 0, 1, 2 spacer layers between Au and Zn layer numbers: 0, 1, 2, 3, 4, 6
integrated intensity (a.u.) PL intensity (a.u.) PL intensity (a.u.) Au-Zn nanoszerkezetek fotolumineszcenciája Au NPs based samples Visible emission 100 exc.: 350 nm Zn Au/Zn 80 Au/SA1/Zn Au/SA2/Zn 30 20 UV emission Zn Au/Zn Au/SA1/Zn Au/SA2/Zn 60 40 20 0 300 400 500 600 700 800 900 wavelength (nm) 10 0 exc.: 350 nm 370 380 390 400 410 wavelength (nm) l max (nm) 558 556 554 wavelength Zn on quartz 552 0 1 2 3 4 5 distance (nm) 100 90 80 70 60 50 40 Zn on quartz intensity 30 0 1 2 3 4 5 distance (nm)
Mag-héj kompozitok Gyógyszermolekula Negatív töltésű polimer Mag Pozitív töltésű polimer Hatóanyag leadás
Absorbance BSA maggal előállított mag-héj kompozitok Amid I ( C=) Amid II ( CN, NH) BSA/IBU/PSS/Chit Random coil Random coil BSA/IBU/PSS b sheet 1642 cm -1 1639 cm -1 1649 cm -1 1648 cm -1 BSA/IBU Random coil b sheet BSA b sheet 1650 1600 1550 1500 Wavenumber (cm -1 ) -helix BSA/IBU/PSS/Chit TEM képe BSA, BSA/IBU, BSA/IBU/PSS valamint a BSA/IBU/PSS/Chit infravörös spektruma, valamint a másodlagos szerkezet változása az amid I sáv eltolódása alapján BSA/IBU/PSS/Chit fénymikroszkópos képe
Hatóanyag leadás vizsgálata IBUPRFEN meghatározása: BSA mag jelenlétében: 264 nm, 272 nm Szilika mag jelenlétében: 222 nm, 264 nm, 272 nm Mérés: Foszfát pufferben (PBS, ph=7,4) HANSN cellavertikális diffúzió cella Két kamrából áll: donor and receiving (fogadó) chambers Membrán :Dialysis tubing cellulose membrane Cella térfogata: 4ml, de a pontos térfogatot meg kell határozni Keverés sebességet állandó értéken kell tartani a mérés során.
Release % t (min) Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára 80 70 60 50 BSA/IBU BSA/IBU/PSS BSA/IBU/PSS/Chit First-order Rate Model R 2 =0,9097 k d =0,0051s -1 40 30 20 10 0 First-order Rate Model R 2 =0,9823 k d =0,0016s -1 First-order Rate Model R 2 =0,9822 k d =0,0017s -1 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Mezopórusos szilika maggal előállított mag-héj kompozitok 1547 cm -1 1452 cm -1 1170 cm -1 1065 cm -1 1054 cm -1 1069 cm -1 1712 cm -1 Abszorbancia C= N-H CH 2 as S 3 - s S 3 - as Si- C-C (benzol vázrezgése) SIL/IBU/PEI/PSS Si--Si 437 cm -1 440 cm -1 440 cm-1 448 cm -1 SIL/IBU/PEI SIL/IBU 1051 cm -1 s Si-H as Si- SIL SIL/IBU/PEI TEM képe 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Hullámszám (cm -1 ) A szilika, valamint a mag-héj kompozitok infravörös spektruma A szilanol csoportok, valamint az ibuprofen karboxil csoportjai közt létrejött H- kötések a szilika pórusaiban
Release rate % Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára 80 70 60 50 SIL/IBU SIL/IBU/PEI SIL/IBU/PEI/PSS First-order Rate Model R 2 =0,9846 k d =0,0024s -1 40 30 20 10 0 First-order Rate Model R 2 =0,9854 k d =0,001s -1 First-order Rate Model R 2 =0,9902 k d =0,0014s -1 0 100 200 300 400 500 600 t (min)
Hollow spheres előállítása biokompatibilis poliszacharidokból kitozán, alginát - biokompatibilis, biodegradábilis, -alkalmazhatóságát széleskörűen vizsgálják hatóanyagok és vakcinák szállítására nyálkahártyán keresztül CaC 3 -nem toxikus, -mérete és morfológiája szabályozható, -könnyen eltávolítható, CMC -összekapcsolódik a Ca + ionokkal, ezáltal szabályozza a képződő CaC 3 részecskék méretét, -úgy viselkedik mint egy ragasztó, összefogja a nanorészecskéket egymással és gömb alakú mikrorészecskéket formál. (a) Kitozán, (b) Na-alginát és (c) karboximetil-cellulóz (CMC) szerkezeti képlete
Kitozán alginát hollow spheres előállítása CaC 3 (CMC) templát + kitozán NaCl közeg, ph=5 + alginát NaCl közeg, ph=5 + n (kitozán, alginát) + EDTA +Glutáraldehid
CaC 3 (CMC) + n 0.05% kitozán (0.5M NaCl, ph=5) 0.1% alginát(0.5m NaCl, ph=5) CaC 3 (CMC) templát (Fénymikroszkópos felvétel) CaC 3 (CMC)-(chit-alg) 3 (TEM felvétel) CaC 3 (CMC )-(chit-alg) 3
+ Rhodamin B + 1% Glutáraldehid + 0.2M EDTA CaC 3 (CMC)/(Chit-Alg) 3 Rhodamin B fénymikroszkópos felvétele (chit-alg) 3 hollow spheres fénymikroszkópos felvétele
Munkatársak MTA-SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoport Juhászné Dr. Csapó Edit Dr. Majzik Andrea Juhász Ádám Dr. Benkő Mária Garabné Ábrahám Nóra Varga Viktória Dr. Janovák László Tallóssy Szabolcs Szalmáné Ménesi Judit Veres Ágnes Dr. Sebők Dániel Varga Noémi