Rövid közlemény (Short Communication) ÁLLATTANI KÖZLEMÉNYEK (2006) 91(2): 153 157. A hazai földikutyák (Spalax leucodon) kromoszóma-vizsgálatának módszertana és elsı eredményei * NÉMETH ATTILA 1, CSORBA GÁBOR 2 és FARKAS JÁNOS 1 1 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Állatrendszertani és Ökológia Tanszék, H 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. E mail: attila.valhor@gmail.com 2 Magyar Természettudományi Múzeum, Állattár, H 1088 Budapest, Baross u. 13. Összefoglalás. A nyugati földikutya (Spalax leucodon) a Kárpát-medencében egykor oly jellemzı füves élıhelyek jellegzetes faja. Az utóbbi évtizedek külföldi eredményei világossá tették, hogy a földikutyaformák (Spalacinae) alcsaládja a fajképzıdés stádiumában van, az eddig egyöntetőnek hitt állományok valójában eltérı kromoszómaszámú, egymással sok esetben szaporodni nem képes populációkból állnak. A különbözı, egymástól elszigetelt populációk kariológiai jellegzetességének megismerése ezért taxonómiai, szisztematikai és konzervációbiológiai szempontból egyaránt fontos. A faj magyaroszági állományaival kapcsolatosan egészen mostanáig nem folytak genetikai kutatások. Ritkaságán és nehéz befoghatóságán túl nehézséget okozott, hogy fokozottan védett fajról lévén szó csak nem invázív mintavételi technikát alkalmazhattunk. Számos próbálkozás után az állatokból laboratóriumban sikeresen tenyészthetı vérmintákat tudtunk venni, és egy új szövettenyésztési módszert használva sikerült megismernünk az elsı adatokat a magyarországi földikutyák kromoszómatípusáról. A Debrecen Józsa közelében található állományból származó egyik példány kromoszómaszáma 2n= 50-nek bizonyult, mely különbözik a határainkhoz közel talált 2n= 48-as kromoszómaszámú szerbiai állományétól. Kulcsszavak: kariotípus, fajképzıdés, Magyarország. A nyugati földikutya (Spalax leucodon NORDMANN, 1840) a földalatti életmódhoz szélsıségesen alkalmazkodott, füves élıhelyekhez kötıdı rágcsáló. A földikutyaformák (Spalacinae) elterjedésének északnyugati határa hazánkban van, ahol a fogyatkozó élıhelyeken (CSORBA 1994) a becslések szerint kevesebb, mint nyolcszáz példány élhet (HORVÁTH & VADNAI 2006). Magyarország szárazföldi gerinceseinek természetvédelmi alapú értékelési rendszerének megállapítása szerint a földikutya hazánk 28. legveszélyeztetettebb szárazföldi gerincese, megelızve például a kékvércsét vagy a kerecsensólymot (BÁLDI et al. 1995). Ugyanez a tanulmány emeli ki, hogy e faj egyáltalán nem kutatott, s még környezeti igényeit sem ismerjük. A földikutya jelenlegi magyarországi helyzetét tekintve nem csak olyan alapismeretek hiányoznak, mint a pontos elterjedési terület, az elıfordulási területeken az állománynagyság, a faj ökológiai igényei, habitat- és mikrohabitat-preferenciája, de genetikai vizsgálatok hiányában a magyarországi földikutyák pontos taxonómiai besorolását sem tud- * Elıadták a szerzık a Magyar Biológiai Társaság Állattani Szakosztályának 946. elıadóülésén, 2006. február 1-jén. 153
NÉMETH A., CSORBA G. & FARKAS J. juk megadni. Az elmúlt harminc évben az Izrael területén végzett kutatások eredményei alapvetıen megváltoztatták a földikutyákkal kapcsolatos tudásunkat. Kiderült, hogy a csoporton belül aktív speciációs folyamatok zajlanak, és az eddig egyöntetőnek hitt állományok valójában eltérı kromoszómaszámú, egymással sok esetben szaporodni nem képes populációkból állnak (NEVO 1961, 1973, 1991, SAVIC & NEVO 1990, SAVIC & SOLDATOVIC 1977). Az eltérı kromoszómatípusok találkozásánál hibridzónák találhatók, melyekben steril állatok vannak. Az eltérı kromoszómaszámú állományokat sok szerzı önálló taxonként kezeli (NEVO et al 1994, NEVO et al 2001, SAVIC & SOLDATOVIC 1974, YÜKSEL & GÜLKAC 2001). Amint Izrael példája mutatja, akár egy Dunántúlnál kisebb területen is lehetséges több különbözı kromoszómatípus egymás mellett élése (NEVO 1973). Így elképzelhetı, hogy még a kismérető hazai állomány is akár több kromoszómatípusba tartozhat. A vizsgálatok elvégzéséhez élvefogó módszerrel (NÉMETH et al., in press) három állományból 5 állatot fogtunk be. Mivel rágcsálók esetében a metafázisú kromoszómák kinyeréséhez rutinszerően elıször élesztı-, majd colchicin-injekcióval kezelt példányok csontvelejét használják fel (mely természetesen az állat pusztulásával jár), a mi esetünkben fokozottan védett fajról lévén szó teljesen más, nem invázív technikát kellett találni. Élı, osztódóképes sejtek kinyerésére a vérvételt találtuk megfelelı módszernek, amire azonban nem volt a földikutyákra gyakorlatban is kipróbált eljárás. A szokásos, rágcsálókon alkalmazott vérvételi helyek (fülvéna, farokvéna, szemzug) azonban fizikailag nem lelhetık fel a fajon (nincs fülkagyló, a farok néhány mm hosszúságú csupán, szemét bır fedi). További probléma, hogy kismennyiségő vérbıl történı kariotípus-meghatározásra rágcsálók körében nincs kidolgozott eljárás. Megoldásként a vena saphena lateralisból, illetve a körömágyból történı vérvétel merült fel. A beavatkozások állatorvosi közremőködést, fertıtlenítést és helyi érzéstelenítést igényelnek. Az állatok tömege 130 210 g között mozog, ezért a levehetı vér mennyiségét körülbelül 1 ml-ben (3 4 csepp) határoztuk meg. A laborvizsgálatok során lymphocitasejtek tenyészetébıl próbáltunk kromoszóma-preparátumokat készíteni. Minden mintából 4 5 eltérı tenyészet indult a megfelelı módszer kidolgozása érdekében. Ezt a munkát az Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet Baromfitenyésztési és Genetikai kutatócsoportjának munkatársaival szoros együttmőködésben végeztük el. Számos különbözı médiummal történt próbálkozás után az alábbi módszer bizonyult eredményesnek: a lymphocitasejteket 1ml kultúrába tettük, mely RPMI 1640 médiumból állt és 20% FCS-t tartalmazott. A tenyésztéshez phytohemaglutinint és pookweed mitogént használtunk. A tenyésztés befejezéséhez a kultúrák colcemiddel (100 µg/ml) voltak kezelve, a hipotonizálást 0,075 M KCl oldattal végeztük. A metafázisú kromoszómák preparálása a továbbiakban a standard citogenetikai technikáknak megfelelıen történt. A vérvétel során egyetlen állat sem sérült vagy betegedett meg. Minden megfogott állattól sikerült levenni 3 4 csepp vért, majd ezt követıen egy héten belül egészségesen visszaengedtük ıket ugyanabba a járatrendszerbe, melybıl megfogtuk. A laborvizsgálatok során számtalan sikertelen kísérletet követıen egy populáció kromoszómaszámát sikerült megállapítani: a Debrecen Józsa közelében, a Tócó patak árterületén fekvı Nagylegelın élı földikutyák kromoszómaszáma 2n= 50 (1. ábra). A többi populációból származó mintát a megfelelı módszer kidolgozásához használtuk fel, ill. egy részük még feldolgozás alatt van. Az ország ismert földikutya-állományainak összehasonlító kariológiai elemzése egy késıbbi publikáció tárgya. 154
FÖLDIKUTYA GENETIKAI VIZSGÁLATA 1. ábra. A debrecen-józsai földikutya-populáció kromoszómái. Figure 1. Kromosomes of Spalax leucodon from the Debrecen-Józsa population. Magyarország határaihoz legközelebb a Vajdaságban végeztek kromoszómavizsgálatokat jugoszláv kutatók az 1970-es évek elején. A magyar határ közelében 2n= 48-as kromoszómaszámú állományokat találtak, amit Nannospalax (= Spalax) leucodon hungaricus-nak határoztak (SOLDATOVIC & SAVIC 1983). A józsai állomány ettıl különbözik, ami azt jelenti, hogy a Kárpát-medence térségében is eltérı kromoszómatípusok élnek egymás mellett, és a megvizsgált hazai földikutyák taxonómiailag nem azonosak a szomszéd országokban élıkkel. Így kihalásukkal nem csak a hazai faunából tőnne el egy faj, hanem egyedülálló evolúciós egység tőnne el végleg Földünkrıl. Köszönetnyilvánítás. Hálás köszönet illeti CZABÁN DÁVIDot a terepi munkákban, MOLNÁR VIKTORt és SÓS ENDRÉt a vérvételekben, PURGER JENİt a nehezen hozzáférhetı irodalmak beszerzésében, HIDAS ANDRÁSt és RÉVAI TAMÁSt pedig a laborvizsgálatok során nyújtott segítségükért. A kéziratot PURGER JENİ és HORVÁTH RÓBERT lektorok tanácsai alapján dolgoztuk át. A szükséges engedélyeket a OKTVF Hatósági Irodája és a Hortobágyi Nemzeti Park Igazgatósága biztosította. A kutatást a Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal támogatta. 155
NÉMETH A., CSORBA G. & FARKAS J. Irodalom BÁLDI A., CSORBA G. & KORSÓS Z. (1995): Magyarország szárazföldi gerinceseinek természetvédelmi szempontú értékelési rendszere. Magyar Természettudományi Múzeum, Budapest, 59 pp. CSORBA G. (1994): A földikutya múltja és jelene Magyarországon. II. Kelet-Magyarországi Erdı-, Vad- és Halgazdálkodási, Természetvédelmi Konferencia, Elıadások és poszterek összefoglalója. pp. 288 291. HORVÁTH R. & VADNAI R. (2006): A földikutya. Szabolcs-Szatmár-Beregi Természet- és Környezetvédelmi Kulturális Értékırzı Alapítvány, Fehérgyarmat, 20 pp. NÉMETH A., CSORBA G. & FARKAS J. (in press): Egy fokozottan védett emlıs (nyugati földikutya (Nannospalax leucodon)) csapdázásának lehetıségei. Természetvédelmi Közlemények 13. NEVO E. (1961): Observations on Israeli populations of the mole rat, Spalax ehrenbergi Nehring1898. Mammalia 25: 127 144. NEVO E. (1973): Variation and evolution in the subterranean mole rat, Spalax. Israel Journal of Zoology 22: 207 208. NEVO E. (1991): The subterranean mole rats (Spalax ehrenbergi superspecies) in Israel as an evolutionary model of active speciation and adaptive radiation. Israel Journal of Zoology 37: 174 175. NEVO E., FĐLĐPPUCCĐ M.G. & BEĐLES A. (1994): Genetic polimorphisms in subterranean mammals (Spalax ehrenbergi superspecies) in the Near East revisited: patterns and theory. Heredity 72: 465 487. NEVO E., IVANĐTSKAYA E. & BEĐLES A. (2001): Adaptive radiation of blind subterranean mole rats: naming and revisiting the four sibling species of the Spalax ehrenbergi superspecies in Israel: Spalax galili (2n=52), S. golani (2n=54), S. carmeli (2n=58) and S. judaei (2n=60). Bachkhuys Publishers, Leiden, 195 pp. SAVIC I. & NEVO E. (1990): The Spalacidae: Evolutionary history, speciation, and population biology. In: NEVO E. & REIG A. O. (eds): Evolution of subterranean mammals at the organismal and molecular levels. Alan R. Liss, New York, pp. 129 153. SAVIC I. & SOLDATOVIC B. (1974): Die Verbreitung der Karyotypen der Blindmaus Spalax (Mesospalax) in Jugoslawien.Arhiv Bioloskih Nauka 26: 115 122. SAVIC I. & SOLDATOVIC B. (1977): Contribution to the study of ecogeographic distribution and evolution of chromosomal forms of the Spalacinae from the Balkan Peninsula. Arhiv Bioloskih Nauka 29: 141 156. SOLDATOVIC B. & SAVIC I. (1983): New data on distribution of the representatives of the genus Nannospalax Palmer, 1903, in SR Serbia. Proceedings of the Second Symposium on Fauna of SR Serbia, pp. 171 174. YÜKSEL E. & GÜLKAC M. D. (2001): The cytogenetical comparisons of Spalax (Rodentia: Spalacidae) populations from Middle Kizilirmak Basin, Turkey. Turkish Journal of Biology 25: 17 24. 156
FÖLDIKUTYA GENETIKAI VIZSGÁLATA First results and methodology of the karyology of the strictly protected Hungarian Lesser Blind Mole Rat (Spalax leucodon) ATTILA NÉMETH, GÁBOR CSORBA & JÁNOS FARKAS Hungary is at the northwestern limit of the lesser blind mole rat s distribution area. As foreign research proved it active speciation process is under way in the Spalacinae subfamily. So far, many populations were found to be characterised by different chromosomal numbers. The investigated populations could not breed with each other. The knowledge of the karyological features of these populations is therefore essential for taxonomic, systematic as well as conservation biological aspects. Until very recently we have hardly had any information about the genetics of Hungarian mole-rats. Beside the rarity of the species and the difficulties of trapping, the less invasive sampling technique must be used due to the strictly protected status of the species. After a year of extensive field work we caught several live specimens with different capturing methods, managed to take blood samples without harming the animals and found a novel way of determining the karyotype from 0.5 ml of blood. The first successfully determined chromosome number, 2n= 50 found in the Debrecen-Józsa population differs from the nearest population of mole rats with known karyotype (2n= 48) in Serbia adjacent to the Hungarian border. Our previous results proved the possibility that Spalax leucodon is represented by at least two chromosomal types in the Carpathian Basin which may represent different evolutionary units and separate taxa. Keywords: chromosomes, karyotypes, speciation, Hungary. 157