PANNON EGYETEM MOLEKULÁRIS- ÉS NANOTECHNOLÓGIÁK DOKTORI ISKOLA MÁGNESES PLGA NANORÉSZECSKÉK ELŐKÉSZÍTÉSE ÉS FELÜLETI MÓDOSÍTÁSA TERMÉSZETES INTERFERON KÉSLELTETETT ÉS CÉLZOTT HATÓANYAG LEADÁSA ÉRDEKÉBEN Ph.D. DOLGOZAT TÉZISEI SZERZŐ: QUAZI TANMINUL HAQUE SHUBHRA TÉMAVEZETŐK: GYENIS JÁNOS DSc PROFESSOR EMERITUS FECZKÓ TIVADAR PhD TUDOMÁNYOS FŐMUNKATÁRS PANNON EGYETEM MŰSZAKI KÉMIAI KUTATÓINTÉZET MAGYARORSZÁG 2014
BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK Az utóbbi két évtizedben a kutatók óriási erőfeszítéseket tettek, hogy a rákos és a vírusos megbetegedések ellen hatásos gyógyszereket fejlesszenek. A rákos megbetegedések megelőzték a szívbetegségeket, és a halálozási listán az első helyre léptek; a rák világszerte a legnagyobb számú áldozatot szedi, becslés szerint 2012-ben 8,2 millióan hunytak el miatta. A Világ Rák Jelentése-2014 75 %-os növekedéssel számol a következő két évtizedben. A Betegség Felügyelő és Megelőző Központ (CDC) a Hepatitis Világnapján kibocsátott legújabb beszámolója szerint világszerte a virális hepatitis a fertőzéses megbetegedések haláleseteinek vezető okozója évente hozzávetőleg 1,4 millió elhunyttal. A legtöbb haláleset a kb. 400 millió krónikus hepatitis B és C vírus fertőzött közül kerül ki. A nanorészecskék (NP-k) szilárd kolloid részecskék 1-150 nm átmérő tartományban, mindazonáltal a mikrokapszulázással kapcsolatban az 1-1000 nm-t általában nano mérettartományként aposztrofálják. Számos NP-alapú gyógyszerhatóanyag leadó és célzó rendszert fejlesztenek. Különösen az 1980-as évek óta a tudósok hatásos gyógyszerhordozókat próbálnak fejleszteni, és az orvosságot célzottan eljuttatni. A gyógyszerhordozó mágneses nanorészecskék/nanokapszulák (NP-k) nagyon biztató eszközei a célzott és nyújtott gyógyszerleadásnak, főleg a rák elleni harcban. Több kórokozó elleni bioaktív molekulát sikeresen kapszuláztak megfelelő mátrixszal annak érdekében, hogy növeljék a bioaktivitását, biológiai elérhetőségét és szabályozott hatóanyagleadásra alkalmazzák. Az olyan betegségek, mint pl. AIDS, rák, tuberkolózis, diabétesz, malária nanogyógyszerei különböző kísérleti fázisban vannak, illetve néhány már kereskedelmi forgalomba került. Valószínűleg ez az oka, hogy a terület az utóbbi években nemcsak példa nélkül álló kutatási növekedésről, hanem rengeteg nanotudománybeli és nanotechnológiai alkalmazásról is tanúságot tett. A terápiás NP technológiák képesek forradalmasítani a gyógyszerfejlesztési eljárást a gyógyszeriparban. Orvosságok nanohordozókkal történő kapszulázása megnöveli a specificitásukat, hatékonyságukat, terápiás hatásukat és a tolerálhatóságukat. A PhD munka célja természetes interferon alfa (IFN- ) gyógyszer késleltetett és célzott hatóanyagleadású készítmény fejlesztése. IFN- -t és szuperparamágneses vas-oxid (Fe 3 O 4 ) NP-ket poli(tejsav-glikolsav) (PLGA) mátrixban együtt kapszuláztak. A PLGA NP-ket megfelelő módszerrel állították elő, és a folyamatváltozók közötti összefüggést vizsgálták annak érdekében, hogy kisméretű NP-ket nyerjenek nagy kapszulázási 2
hatékonysággal. Továbbá a véráram makrofágjainak elkerülése érdekében végzett NP felszíni módosítást és az in vitro IFN- kibocsátást vizsgálták. Az IFN- magas költsége miatt a folyamatoptimalizálást és a funkcionalizálást az IFN- helyett humán szérum albumin (HSA) modell gyógyszerrel végezték. Az IFN-ok antivirális és antitumor aktivitással rendelkeznek. A mágneses NP-k képesek a PLGA NP-ket a májba és a lépbe célba juttatni, és használhatók rákfajták kezelésére. Másrészt a mágneses NP-k jelenléte miatt mágneses mező segítségével (külső vagy belső mágnessel) lehetséges valamely testrész célzása, valamint a gyógyszerfelvétel MRI-vel (mágneses rezonancia vizsgálattal) nyomon követhető. KÍSÉRLETI MÓDSZEREK Természetes IFN- -t és szuperparamágneses vas-oxid (Fe 3 O 4 ) NP-ket, az utóbbiak koprecipitációval való előállítása után, együtt kapszuláztak PLGA mátrixban összetett emulziós oldószer elpárologtatásos technikával. Öt folyamatváltozót azonosítottak, melyek leginkább befolyásolták a hidrodinamikai részecskeméretet és/vagy a kapszulázási eljárást. Ezt az öt folyamatváltozót használták statisztikai szoftverrel megvalósított kísérlettervezéshez. A változók: a vas-oxid mennyisége a szerves fázisban a kapszulázáshoz használt PLGA tömegére vonatkoztatva, a PLGA koncentrációja a szerves fázisban, a HSA koncentráció a belső vizes fázisban, a külső vizes/szerves fázis térfogat arány és az ultrahangos kezelés ideje a második emulzifikálás során. 3 (p-1) típusú frakcionális faktoriális kísérlettervezést végeztek a STATISTICA szoftverrel, ahol a p a faktorok (változók) számát jelzi. A NP-k hidrodinamikai méretét dinamikus fényszórás módszerével analizálták. A kolloid részecskék felületi töltését elektroforetikus mobilitás és zeta potenciál meghatározással vizsgálták. A fehérje típusú gyógyszer kapszulázási hatékonyságát közvetetten mikro BCA (bicinchoninic sav) fehérje teszttel határozták meg. A nanorészecskék morfológiáját transzmissziós- és pásztázó elektronmikroszkóppal jellemezték. A nagy modell gyógyszer tartalom és legkisebb kapszula méret eléréséhez szükséges legjobb folyamati körülményeket a GAMS /MINOS szoftverrel számították. A PLGA NP-k felületmódosítására poloxamert használtak a felszín hidrofillé tétele érdekében, mely képes késleltetni azok felismerését a mononukleáris fagocita rendszer által. A szérum fehérje adszorpciót méret, zeta potenciál és fehérje tartalom méréssel illetve izotermális titrációs kalorimetriával vizsgálták mind a felületmódosított, mind a 3
nem módosított PLGA NP-ken. A mágneses PLGA NP-k in vitro IFN-α kibocsátását enzimhez kapcsolt immunszorbens meghatározással elemezték. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1. tézis Természetes interferon alfa (IFN- ) késleltetett és célzott hatóanyagleadása érdekében, IFN- -t és szuperparamágneses vas-oxidot (Fe 3 O 4 ) poli(tejsav-glikolsav) (PLGA) mátrixban mikrokapszuláztam. Az öt legfontosabb eljárási változó (vas-oxid mennyisége a szerves fázisban a PLGA tömegére vonatkoztatva; PLGA koncentráció a szerves fázisban; HSA koncentráció a belső vizes fázisban; a külső vizes fázis/szerves fázis térfogatarány; és az ultrahangos kezelés időtartama a második emulzifikálás során) az átlagos hidrodinamikai részecskeméretre és a kapszulázási hatékonyságra gyakorolt hatását vizsgáltam. A nanorészecskék átlagos hidrodinamikai mérete az eljárási körülményektől függően a 115-329 nm tartományban változott, és leginkább a PLGA koncentráció, azt követően a szonikálás időtartama befolyásolta. A vas-oxid/plga tömegarány, a külső vizes- és a szerves fázis térfogataránya és az utóbbi két faktor lineáris-lineáris kölcsönhatása is fontos méret befolyásoló szereppel bírt. (Kapcsolódó saját publikációk: [3]) 2. tézis A vizsgált nanorészecskék kapszulázási hatékonysága az eljárási körülmények függvényében a 18-97 % tartományban változott. Az öt fontos változó közül a PLGA koncentrációja és a HSA koncentráció a belső vizes fázisban, továbbá ezek kereszthatása bírt a legerősebb befolyással a kapszulázási hatékonyságra. A magnetit jelenléte csak kissé befolyásolta a HSA kapszulázást a PLGA nanorészecskékbe, míg a külső vizes/szerves fázis térfogat arány és az ultrahangos emulzifikálás nem mutatott szignifikáns hatást a kapszulázási hatékonyságra (Kapcsolódó saját publikációk: [4,5]) 3. tézis Az egzakt matematikai eszközökkel (GAMS TM /MINOS) kivitelezett optimalizálás lehetővé tette, hogy az optimális folyamat körülményeket megtaláljam ahhoz, hogy magas 4
kapszulázási hatékonyság mellett relatíve kisméretű nanorészecskéket állítsak elő. Az eredmények azt mutatták, hogy a legkisebb lehetséges átlagos részecskeméret alacsony polimer koncentrációnál, nagy diszpergálási energiánál (elegendő szonikálási idő), illetve alacsony vizes fázis/szerves fázis térfogat aránynál érhető el. A legjobb körülmények között 155 nm átlagméretű HSA-t tartalmazó nanorészecskéket sikerült előállítanom 92,3 %-os kapszulázási hatékonysággal. (Kapcsolódó saját publikációk: [4]) 4. tézis A PLGA nanorészecskék megfelelő felületi módosítását poloxamer triblokk kopolimerrel (Pluronic F68, PF68) végeztem annak érdekében, hogy az élettartamuk a véráramban megnövekedjen. Méret és zeta potenciál mérések, fehérje adszorpciós vizsgálat és izotermális titrációs kalorimetria igazolták a nanorészecskék hatékony felületi módosítását. (Kapcsolódó saját publikációk: [1,2]) 5. tézis In vitro IFN- leadási vizsgálatot enzimhez kapcsolt immunszorbens meghatározással végeztem. Feltételeztem, hogy az IFN- a részecskékből felszabadult, és folyamatosan lebomlott mind a nanorészecskékben és a folyadék fázisban, ezáltal csökkent a koncentrációja a pufferben. Így az interferon aktuális koncentrációját a folyadék fázisban ennek a három folyamatnak a sebessége és a kiindulási viszonyok határozzák meg. Feltételeztem, hogy az interferon lebomlása első rendű reakció kinetikával írható le. A nanorészecskékben lejátszódó lebomlás sebességi állandójára hasonló értéket kaptam a felületmódosított és a nem módosított nanorészecskék esetén. A szilárd fázisú lebomlási sebességek számottevően alacsonyabbak, mint a folyadék fázisban tapasztaltak. A felületmódosított részecskék IFN kibocsátási sebessége lényegesen alacsonyabb, mint a nem módosított részecskéké, amit a sokkal alacsonyabb kezdeti felszabadulással együtt főképpen a poloxamer borítás miatt fellépő még inkább elnyújtott kibocsátási hatásnak tulajdonítok. 5
KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE BÍRÁLT FOLYÓIRATCIKKEK [1] Quazi T. H. Shubhra, Judit Tóth, János Gyenis, Tivadar Feczkó (2014). Surface Modification of HSA Containing Magnetic PLGA Nanoparticles by Poloxamer to Decrease Plasma Protein Adsorption. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Published online on 22 July, doi: 10.1016/j.colsurfb.2014.07.025. (IF 2013 : 4.287) [2] Quazi T. H. Shubhra, Judit Tóth, János Gyenis, Tivadar Feczkó (2014). Poloxamers for surface modification of hydrophobic drug carriers and their effects on drug delivery, Polymer Reviews, 54(1): 112-138. (IF 2013 : 6.593) [3] Quazi T. H. Shubhra, Andrea F. Kardos, Tivadar Feczkó, Hana Mackova, Daniel Horák, Judit Tóth, György Dósa, János Gyenis (2014). Co-encapsulation of human serum albumin and superparamagnetic iron oxide in PLGA nanoparticles: Part I. Effect of process variables on the mean size. Journal of Microencapsulation, 31(2): 147-155. (IF: 1.878) [4] Quazi T. H. Shubhra, Tivadar Feczkó, Andrea F. Kardos, Judit Tóth, Hana Mackova, Daniel Horak, György Dósa, János Gyenis (2014). Co-encapsulation of human serum albumin and superparamagnetic iron oxide in PLGA nanoparticles: Part II. Effect of process variables on protein model drug encapsulation efficiency. Journal of Microencapsulation, 31(2): 156-165. (IF 2013 : 1.878) [5] Quazi T. H. Shubhra, Hana Macková, Andrea F. Kardos, Daniel Horák, Judit Tóth, János Gyenis, Tivadar Feczkó (2013). Encapsulation of human serum albumin in submicrometer magnetic poly(lactide-co-glycolide) particles as a model system for targeted drug delivery. e-polymers, 13 (1): 310 318. (IF 2013 : 0.330) KONFERENCIAKIADVÁNYBAN MEGJELENŐ CIKKEK ÉS ELŐADÁS ÖSSZEFOGLALÓK [6] Q. T. H. Shubhra, T. Feczkó and J. Gyenis. Surface Modification of PLGA Nanoparticles Co-encapsulating Model Drug and Magnetic Nanoparticles to Prolong Life Time in the Bloodstream. The 7th World Congress on Particle Technology, May 19-22, 2014, Beijing, China (Abstract has been accepted). 6
[7] Shubhra Q.T.H., Feczkó T. and Gyenis J. Preparation, Optimization And Surface Modification Of Magnetic PLGA Nanoparticles Loaded With Model Drug. XXI International Conference on Bioencapsulation, August 28-30, 2013, Berlin, Germany. [8] Q.T.H. Shubhra, T. Feczkó, J. Gyenis. Optimization Of Process Variables And Surface Modification Of Model Drug Loaded Magnetic PLGA Nanoparticles. 44th IUPAC World Chemistry Congress, August 11-16, 2013, Istanbul, Turkey, published electronically. [9] Quazi T. H. Shubhra, Tivadar Feczkó, János Gyenis. Surface Modification Of Model Drug Loaded Magnetic PLGA Nanoparticles To Prolong Life Time In The Blood Stream. Particles 2013 conference, August 3-6, 2013, Ohio, USA, pages. [10] Quazi T. H. Shubhra, Andrea F. Kardos, Tivadar Feczkó, János Gyenis. Coencapsulation of superparamagneticiron oxide and human serum albumin in PLGA nanoparticles: Effect of process variables on the mean size and encapsulation efficiency. Materials Today Virtual Conference: Nanotechnology; 11-13 December, 2012. Poster published online. (http://view6.workcast.net/?cpak=9984479751519192&pak=6530323 889924159). [11] Q.T.H. Shubhra, A.F. Kardos, T. Feczkó, J. Gyenis. Effect Of Process Variables On Size And Encapsulation Efficiency Of Model Drug Loaded Magnetic PLGA Nanoparticles. NanoDDS'12 conference; 2012 December 6-7, Atlantic City, NJ, USA, page 151-152. [12] Q.T.H. Shubhra, A.F. Kardos, T. Feczkó, J. Gyenis. Effect Of Process Variables On Size And Encapsulation Efficiency Of Model Drug Loaded Magnetic PLGA Nanoparticles. Drug Delivery Australia (DDA) conference; 2012 November 26-27; Melbourne, Australia, page 157. [13] Quazi T. H. Shubhra, Tivadar Feczkó, János Gyenis, Andrea F. Kardos. Coencapsulation of a model drug and magnetic nanoparticles. Conference of Chemical Engineering (MKN 12); 2012 April 24-26; Veszprem, Hungary, page 112 (ISBN 978-615- 5044-54-0). 7