PCR Vannay Ádám 2011
Definíció A PCR során a DNS/cDNS egy relatív kis darabkáját sokszorozzuk meg.
Miért, illetve mire jó a PCR? Egyszerű Nagyon érzékeny Olcsó Klónozás Genotipizálás (szekvenálás, RFLP, allélspecifikus PCR) mrns expresszió meghatározása (real time RT-PCR)
Mi történik a PCR során 0. 1. 2.
Kiindulási minta: DNS; mrns/cdns FR: A gének két végén elhelyezkedő, RNS-re át nem íródó DNS szakasz. Ez a DNS régió tartalmazza a gének promoterét. UTR: az mrns fehérjére át nem íródó szakasza. DNS mrns/cdns Fehérje
DNS, Plazmid, RNS izolálás Tiszta felület: DNS, RNS, Pazmid mentes, DNáz, RNáz - mentes felület és eszközök. Kesztyű, maszk, sapka, köpeny γ - és UV-besugárzás és rekombináns hő-instabil dupla szálú DNS specifikus DNase 43944 DNase AWAY Decontamination Reagent for DNA - Sigma-Aldrich RNaseZap RNase Decontamination Solution - Ambion
DNS, Plazmid, RNS izolálás
Reverz Transzkripció Puffer (5X) - 4 µl dntp (10mM) - 1 µl DTT (0,1M) - 2 µl Oligo dt (0,5 µg/ µl) - 1 µl 42 C, 50 min RNA 1 µg - 10 µl RNase inh (40 U/ml) - 1 µl H 2 O - 20 µl-ig
Hagyományos PCR Alacsony szenzitivitás Kis dinamikus tartomány Kis feloldóképesség Nem automatizálható Toxikus nyersanyagok (ethidium bromid)
Hagyományos PCR Puffer (10x) - 5µl dntp mix (2,5 mm) - 5µl MgCl 2 - (25mM )- 5µl Enzim - 0,5 µl S primer (10pmol/µl) - 1µl AS Primer (10pmol/µl) - 1µl DNS - 1µl H 2 O - 50 µl-ig Beállítandó 20-35 ciklus 95 C 95 C 5 min 15 sec 72 C 95 C 50 C 30 sec 7 min 15 sec 4 C
Taq Polimeráz
Hagyományos PCR Kiértékelés 1) Futtatás, emésztés, szekvenálás 2) Denzitometrálás
Real Time PCR Real-time PCR során a reakció során keletkező fluoreszcenciát detektáljuk. A PCR termékek detektálhatóvá válásának ciklusa arányos a kiindulási mintában lévő templát DNS mennyiségével.
Real Time PCR Nincs post PCR procedura, komputerizált kiértékelés Nagyon gyors (25 min) Nagy dinamikus tartomány Sokkal érzékenyebb (1000 x kevesebb RNS-ből) Reprodukálhatóbb Real time monitorizálás Melting analízis
Real Time PCR Enzim mix - 10 µl S primer - 1 µl AS Primer - 1µl DNS - 1µl H 2 O - 20 µl-ig 95 C 95 C 5 min 5 sec 50 C 5 sec 72 C 10 sec 95 C 10 sec 45 C 10 sec 4 C
Real Time PCR Enzimek: extenzió 60 vagy 72 C, 5 exonuclease vagy Sybr green
Real Time PCR Jelölések Hydrolízis próba (TaqMan) Hibridizációs próba (FRET) DNS kötő festékek (Sybr Green)
Real Time PCR Hidrolízis próba: A próba egy riporter és egy quencher a riporter fluorescenciáját elnyelő fluorochrommal konjugált. Az amplifikáció során Taq polimeráz hidrolizálja a próbát. Ez azt eredményezi, hogy a próba riporter és quencher fluorochromja szeparálódik egymástól és a fluoreszcens jel detektálhatóvá válik.
Hibridizációs próba (FRET) Real Time PCR Az egyik próba a 3 végén egy donor a másik az 5 végén egy akceptor fluorochrommal jelölt. Amikor a fluorochromok elég közel kerülnek egymáshoz (1-5 nukleotid) a donor fluorochrom által emittált fény excitálja az akceptort ami aztán fluorescens fényt emittál.
Real Time PCR SYBR Green A fluoreszcencia mértéke abnormálisan megnő ha a festék dupla szálú DNShez köt.
Real Time PCR Előnyők hátrányok: TaqMan - FRET - Sybr Green TaqMan/FRET könnyű beállítani Sybr Green nehezebb beállítani FRET/ Sybr Green melting analízis TaqMan nincs melting analízis
Real Time PCR Kiértékelés 1) Ellenőrzés futtatás, emésztés, szekvenálás 2) Melting analízis 3) Ct meghatározás
Fluoreszcencia Fluoreszcencia Kiértékelés Melting: ne hidd el! A B Hőmérséklet ( C) Hőmérséklet ( C)
Kiértékelés ciklus (db) ciklus (db) DC T = target referencia = 4 DC T = target referencia = 2 Különbség =DC T - DC T = DDC T DDC T =4-2=2 A különbség 2 2, azaz 4x-es
Egyéb Belső kontroll Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Beta-actin MHC I Cyclophilin mrnas for ribosomal proteins (ribosomal protein, large, P0) 28S or 18S rrna Negatív kontroll (nyersanyagok tisztasága) Pozitív (technikai) kontroll (természetes/mesterséges)
Primer tervezés Primer Length: 18-22 bp. This length is long enough for adequate specificity and short enough for primers to bind easily to the template at the annealing temperature. Primer Melting Temperature (Tm): primers with melting temperatures in the range of 52-58 C generally produce the best results. Primer annealing temperature (Ta): primer melting temperature is the estimate of the DNA-DNA hybrid stability and critical in determining the annealing temperature. Too high Ta will produce insufficient primer-template hybridization resulting in low PCR product yield. Too low Ta may possibly lead to non-specific products caused by a high number of base pair mismatches. Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm(product) 14.9 http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/pcr_primer_design.html
Primer tervezés Szoftverek segítik: DNA star: http://www.dnastar.com/ Primer 3 plus: http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi LightCycler Probe Design2:
Primer tervezés DNS mrns
Primer tervezés asma tgctccagctatgtgtgaagaggaagacagcacagccctggtgtgcgacaatggctctgggctctgtaaggccggcttcgctggtgatgatgctcccagggctgttttcc catccatcgtgggacgtcccagacatcagggagtaatggttggaatgggccaaaaagacagctatgtgggggatgaagcccagagcaagagagggatcctgacgct bactin tgctccagctatggatgacgatatcgctgcgctggtcgtcgacaacggctccggcatgtgcaaagccggcttcgcgggcgacgatgctccccgggctgtattcccctcca tcgtgggccgccctaggcaccagggtgtgatggtgggaatgggtcagaaggactcctatgtgggtgacgaggcccagagcaagagaggtatcctgaccctgaagtacc gactin tgctccagctatggaagaagaaatcgccgcactcgtcattgacaatggctccggcatgtgcaaagccggctttgctggcgacgacgcccccagggccgtgttcccttcca tcgtagggcgcccccgacaccagggcgtcatggtgggcatgggccagaaagactcatacgtgggtgacgaggcccagagcaagaggggtatcctgaccctgaagta
Primer tervezés E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E6a E6b? E8 E1-E5 E7 VEGF 205
Primer tervezés E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E6a E6b? E8 E1-E5 E7 VEGF 205
Primer tervezés E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E1-E5 E6a E6b? E7 E8 VEGF 205 VEGFK/120/188/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza E 5 E 8 E 6a E 7 E 6b VEGFK/144/164/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza E 6a E 8 E 5 E 7 E 6b
Összegzés A PCR egy igen szenzitív módszer egy gén expressziójának vagy mutációjának vizsgálatára. Sarokpontok: A primer tervezésnél fontos, hogy pontosan tudjuk, hogy mit is akarunk detektálni. Helyes enzimválasztás. Körültekintő értékelés.