A doktori értekezés tézisei Szteroid gyógyszeranyagok tisztaságvizsgálata kromatográfiás technikákkal Bagócsi Boglárka Kémia Doktori Iskola Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia Témavezető: Egyetemi konzulens: Ferencziné Dr. Fodor Katalin (Richter Gedeon Nyrt.) Horváthné Dr. Otta Klára (ELTE TTK) Richter Gedeon Nyrt. Budapest, 2007
1. CÉLKITŰZÉSEK A Richter Gedeon Nyrt. hagyományos termékpalettáján a szteroidok vegyületcsoportja igen fontos szerepet játszik. Felhasználják fogamzásgátló, hormonpótló készítményekben, de hatóanyag formában is exportálják ezeket a vegyületeket. A szteroidokon belül különös fontosságúak a norszteroidok, amelyeken az alapváznál eggyel kevesebb metil-csoport van. Ezeket soklépéses szintézissel állítják elő azonos kiindulási anyagokból, a technológiai folyamat elágazásával különböző végtermékek keletkeznek. Így a közös kiindulási anyagok folytán ezeknek a szteroidoknak a szennyezésprofilja összefügg. Munkám célja a szteroid totálszintézis fontosabb vegyületeinek (melyek ismertebb termékei a nandrolon-dekanoát, noretiszteron, allilösztrenol) részletes tanulmányozása volt a következő szempontok szerint: - Az egyes technológiai lépések követésével a közös szennyezések és prekurzoraik felderítése a különböző szteroidokban, analógiák keresése. - Olyan tisztaságvizsgálati módszerek kidolgozása, amelyek lehetővé teszik az UVelnyelést nem mutató szteroid-szennyezők kimutatását, amelyek az UV-detektálást alkalmazó HPLC-módszerrel észrevétlenek maradnak. A planár-kromatográfiás módszerek (VRK, OPLC) speciális előhívó reagensek alkalmazásával ezt lehetővé teszik. - Különböző előhívó reagensek használatának optimalizálása és összehasonlítása. - Olyan gyors ellenőrző módszerek kidolgozása, amelyek alkalmasak a reakcióelegyek és köztitermékek vizsgálatára is. - Különböző kromatográfiás vizsgálati módszerek teljesítményjellemzőinek összehasonlítása. - Szűrővizsgálati rendszer kidolgozása esetleges keresztszennyezések azonosítására. 2. KÍSÉRLETI MÓDSZEREK ÉS KÉSZÜLÉKEK A VRK-módszerek minden esetben telített normálkamrás kifejlesztések voltak 22 x 22 x 12 cm-es Desaga kamrában. A normál kamrás és az OPLC futtatásokhoz alufólia hordozóra felvitt normálszemcsés (Merck Art. No. 5554) és finomszemcsés (Merck Art. No. 5548) szilikagél szorbenst (20x20 cm Kieselgel 60 F 254 ) használtam. Az OPLC 2
kifejlesztéseket P-OPLC BS 50 rétegkromatográffal végeztem. Az OPLC futtatáshoz szükséges rétegszélezést az OPLC-NIT Ltd. végezte. Minden esetben 300 μl kiindulási gyors eluenstérfogatot és 50 bar külső nyomást alkalmaztam. A szorbensek előhívó reagenssel való bepermetezésére motoros, Merck gyártmányú permetezőt használtam (Merck Art. No. 8540). A hevítésüket pedig Camag sütőlapon (TLC Plate Heater III) végeztem. A kromatogramok dokumentálására Camag VideoStore 2 készüléket használtam, a videodenzitometriás értékelésre pedig a Camag VideoScan szoftvert. A 366 nm-es fényben rögzített képek esetében UV-2A, valamint CC-30Y jelzésű színszűrőt használtam. A videodenzitometriás értékelésnél a VideoScan szoftver beépített szűrői közül a zöldet használtam. A norszteroid-szintézissel kapcsolatos vizsgálatok közül a nandrolon esetében VRK, OPLC, HPLC és GC méréseket végeztünk. A VRK-mérésnél pontfelvitelt alkalmaztam, n-hexán etil-acetát 1+2 (V/V) elegy volt a mozgó fázis és 15 cm a kifejlesztési távolság. Az OPLC-mérésnél 8 mm-es sávban vittem fel a vizsgálandó vegyületeket a szorbensre, ciklohexán etil-acetát kloroform 50+25+25 (V/V) eleggyel, valamint 2000-3000-4000 μl többszörös kifejlesztéssel dolgoztam, az egyes kifejlesztések között 5-5 perc szobahőmérsékletű levegőárammal szárítva a kromatogramot. A HPLC-módszernél 3,5 μm-es C18-as állófázist (Eclipse XDB, 150 x 3,0 mm) használtunk és víz acetonitril metanol különböző arányú elegyeivel, gradiens programot alkalmazva végeztük az elválasztást. A detektálás 210 és 225 nm-en történt. A gázkromatográfiás mérésnél 270 C-ra termosztált 30 m x 0,25 mm x 1,0 μm film MDN-5S oszlopot használtunk, 20 cm/sec sebességű hélium vivőgázzal és lángionizációs detektálással. A dienoléter esetében VRK és OPLC módszereket használtam. A VRK-vizsgálatnál a pontban felvitt vegyületeket ciklohexán aceton 7+3 (V/V) eleggyel futtattam meg, a kifejlesztési távolság 14 cm volt. Az OPLC-nél 8 mm-es sávban vittem fel a szorbensre az anyagokat, ciklohexán butil-acetát etil-acetát 8+1+1 (V/V) eleggyel, valamint 8000 μl túlfuttatással végeztem az elválasztást. Az ösztradiol-metiléter-acetát esetében OPLC és GC méréseket végeztünk. Az OPLCnél toluol klroform ciklohexán butil-acetát 55+3+40+2 (V/V) eleggyel és 4000-8000 μl kétszeres kifejlesztéssel dolgoztam. A gázkromatográfiás vizsgálatnál 240 C-ra termosztált 30 m x 0,25 mm 0,5 μm fused silica állófázist használtunk, hélium vivőgázt és lángionizációs detektálást 280 C-on. 3
A molon esetében OPLC és HPLC méréseket végeztünk. Az OPLC-mérésnél toluol etil-acetát butil-acetát 8+1+1 (V/V) eleggyel, valamint 8000 μl-es túlfuttatással végeztem a kifejlesztést. A HPLC-módszernél 5 μm-es C18-as állófázist és először metanol víz ecetsav 70+30+0,3 (V/V) elegyet használtunk mozgófázisként, majd az arányt módosítottuk 40+60+0,3 ra (V/V) egy addig ismeretlen szennyezés elválasztása érdekében. A detektálást mindkét esetben 265 nm-en végeztük. A szteroid-eleggyel végzett előhívási kísérletekhez a vizsgált szteroidok 0,02%-os koncentrációjú kloroformos oldatát használtam modellelegyként, amelyből 5 5 μl-t vittem fel finomszemcsés szilikagél szorbensre 5 mm-es sávokban. Eluensként ciklohexán etil-acetát kloroform 3+1+1 (V/V) arányú elegyét használtam, amely a modellelegy valamennyi komponensére megfelelő elválást adott. 400 μl/min eluensáramlási sebességgel és 4200 μl kifejlesztési eluenstérfogattal dolgoztam. A különböző előhívó reagensekkel végzett kimutatási határvizsgálatokhoz különböző koncentrációjú oldatokból 2-5 μl térfogatból vittem fel a szorbensre 0,1 μg és 0,0075 μg tartományban különböző mennyiségű anyagot. A teljesítményjellemzők meghatározásánál az etinil-ösztradiol VRK-mérésénél toluol etanol 9+1 (V/V) eleggyel, 15 cm kifejlesztési távolságot alkalmazva végeztem az analízist. Az OPLC-nél ciklohexán etil-acetát kloroform 3+1+1 (V/V) eleggyel, 7000 μl túlfuttatással választottam el a komponenseket egymástól. A HPLC-mérésnél 5 μm-es, C18-as töltetű oszlopot és víz acetonitril metanol 50+30+20 (V/V) elegyet használtunk, 280 nmes detaktálással. A noretiszteron vizsgálatakor a VRK-módszer mozgó fázisa kloroform aceton 9+1 (V/V) elegy volt. Az OPLC-mérésnél pedig kétlépcsős, izokratikus módszert alkalmaztam: először n-hexánnal, majd közbeiktatott szárítás nélkül butil-acetát kloroform 85+15 (V/V) eleggyel végeztem a kifejlesztést. A HPLC-módszernél 3,0 μm-es, C18-as töltetű állófázist és hatlépcsős gradiens programot használtunk acetonitril víz különböző arányú elegyeivel. A detektálás 242 nm-en történt. A gesztodén OPLC-vizsgálatánál ciklohexán etil-acetát kloroform 3+1+1 (V/V) volt a mozgó fázis, 6500 μl-es túlfuttatással történt a kifejlesztés. HPLC-vel 5 μm-es C18-as töltettel ellátott oszlopot használtunk, valamint mozgó fázisként acetonitril víz elegyeket. A detektálási hullámhossz 210 nm volt. 4
A szűrővizsgálatoknál OPLC méréseket végeztem. 5-5 μg-ot vittem fel a szorbensre mind a húsz vizsgált szteroidból, pontfelvitelt alkalmazva. Négy különböző polaritású futtató elegyet használtam, ezek a következők voltak növekvő polaritás szerint: ciklohexán butil-acetát 9+1 (V/V), toluol etil-acetát kloroform 5+1+4 (V/V), ciklohexán etil-acetát kloroform 3+1+1 (V/V) és ciklohexán butil-acetát 1+1 (V/V). 3. ÚJ EREDMÉNYEK A szteroidokat a Richter Gedeon Nyrt.-ben félszintézissel vagy totálszintézissel állítják elő. Az általam vizsgált totálszintézissel készült norszteroid végtermékek főleg fogamzásgátló, hormonpótló, anabolikus készítmények hatóanyagai. Munkám során a norszteroid-szintézis metilsorában keletkező intermedierek szennyezésprofiljának felderítésével foglalkoztam. 1. Gyors tisztaságvizsgálati eljárásokat dolgoztam ki túlnyomásos rétegkromatográfiás módszerrel a nandrolon, a dienoléter, az ösztradiol-metiléter-acetát és a molon (metilszeko-olon) vizsgálatára. A fenti intermedierek esetében értékeltem a más kromatográfiás technikákkal kapott eredményeket is. A nandrolon két fő szennyezését az 5α-4,5-dihidro-nandrolont és a nandrolon Δ 5(10) -izomert csak OPLC-vel sikerült kimutatni egymás mellett. Ez a két közeli szerkezetű molekula VRK-val nem válaszható el egymástól, ultraibolya detektálású HPLC-vel az 5α-4,5-dihidronandrolon nem mutatható ki, GC-vel megfelelően elválaszthatók, de a főkomponens a vizsgálat során Δ 5(10) -izomerre bomlik, így az eredmény nem megbízható. A dienoléter esetében az általam kidolgozott OPLC-eljárással minden ismert szennyezés szelektíven értékelhető, az ösztradiol-metiléter-acetátnál pedig a módszerek kombinációja vezetett eredményre. A molon esetében OPLC-vel elválasztottam a fő szennyezést a főkomponenstől, tisztáztam a fő szennyezés keletkezési körülményeit, és elősegítettem annak azonosítását. 2. Optimalizáltam és összehasonlítottam a szteroidoknál leggyakrabban használt savas előhívó módszereket. A kénsavas, foszformolibdénsavas és foszforsavas reagensek használatát etinil-ösztradiol, dienoléter, noretiszteron, noretiszteron-acetát, noretiszteron-önantát, nandrolon és nandrolon-dekanoát alapanyagok előhívásánál vizsgáltam. Megállapítottam, hogy a rövid ideig magasabb hőmérsékleten történő 5
előhívás általában érzékenyebb, míg az alacsonyabb hőmérsékleten hosszabb ideig történő hevítés stabilabb, robosztusabb előhívást eredményez. 3. Különböző szteroid alapanyagokra kifejlesztett VRK, OPLC és HPLC tisztaságvizsgálati módszerek teljesítőképességét vizsgáltam és hasonlítottam össze. Etinilösztradiol esetében VRK módszerrel 71,5 μm átlagos tányérmagasságot, OPLC módszerrel 24,6 μm, HPLC-vel 19,0 μm átlagos tányérmagasságot kaptam, tehát az OPLC és a HPLC módszer hatékonysága összemérhető, a VRK módszer ettől messze elmaradt. A módszerek elválasztóképessége ennek megfelelően OPLC és HPLC esetében összevethető és megfelelő, míg VRK-val a közeli szerkezetű rokonvegyületek nem választhatók el egymástól. Hasonló tapasztalatokat nyertem noretiszteron, nandrolon és gesztodén esetében is. 4. A szteroidsor tipikus szennyezéseire polaritási sort állítottam fel, és meghatároztam azok relatív retardációs faktorát a főkomponensre vonatkoztatva. 5. Az egy üzem által gyártott szteroidokra olyan szűrővizsgálati módszert dolgoztam ki, amely lehetővé teszi az esetleges keresztszennyezések gyors vizsgálatát és azonosítását az adott vegyületcsoportra. 6. Kifejlesztés nélküli pont-vizsgálati módszert dolgoztam ki, amely a készüléktisztítás során alkalmas lehet a mosás hatékonyságának gyors ellenőrzésére. Munkám tapasztalatai alapján a rétegkromatográfiás technika, elsősorban az OPLC, a hatóságok által javasolt és elvárt HPLC módszer mellett a jövőben is jól használható szteroidok tisztaságvizsgálatára a gyógyszeranalitikában, ezen kívül előzetes vizsgálatként, új anyagok szennyezésprofiljának felderítésére és igazolására, valamint gyors szűrővizsgálatok elvégzésére. 4. KÖZLEMÉNYEK 1. B. Bagócsi, D. Fábián, A. Laukó, M. Mezei, S, Mahó, Z. Végh, and K. Ferenczi-Fodor Comparison of OPLC and other chromatographic methods (TLC, HPLC, and GC) for in-process purity testing of Nandrolone J. Planar Chromatogr. 15 (2002) 252-257 6
2. B. Bagócsi, G. Rippel, M. Mezei, K. Ferenczi-Fodor OPLC, a method between TLC and HPLC, in purity testing of norethisterone drug substance and tablet J. Planar Chromatogr. 16 (2003) 359-362 Poszterek: 1. B. Bagócsi, G. Rippel, Z. Végh, S. Mahó, K. Ferenczi-Fodor Purity testing of Norethisterone drug substance by personal OPLC Chromatography 2000, Lillafüred, Hungary, June 2000, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 151-156 2. B. Bagócsi, D. Fábián, M. Mezei, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenci-Fodor OPLC and HPLC purity test methods in the quality control of Ethinyl Estradiol drug substance 11th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis May 14-18, 2000, Basel, Switzerland, Abstracts P019, Book of Abstracts pp. 66-67 3. S. Németh, E. Katona-Tóbiás, B. Bagócsi, K. Ferenczi-Fodor, S. Görög New HPLC method for in-process assay of Ethisterone intermediate 9th International Meeting on Recent Developments in Pharmaceutical Analysis (RDPA 01), June 3-8 2001, Lipari, Italy 4. B. Bagócsi, T. Vörös, M. Mezei, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor Fast and economical purity testing of Nestorone drug substance by OPLC Chromatography 2001, Lillafüred, Hungary, June 2001, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 211-215 7
5. B. Bagócsi, A. Laukó, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor The role of OPLC as an in-process test in total-synthesis of norsteroids Part I Chromatography 2003, Budapest, Hungary, June 2003, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 185-189. 6. B. Bagócsi, G. Rippel, M. Mezei, K. Ferenczi-Fodor OPLC, a method between TLC and HPLC, in purity testing of Norethisterone drug substance and tablet Chromatography 2003, Budapest, Hungary, June 2003, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 191-196. 7. B. Bagócsi, A. Laukó, S. Mahó, S. Németh, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor The role of OPLC as an in-process test in total-synthesis of norsteroids Part II 5th Balaton Symposium On high-performance separation methods, Siófok, Hungary, Sept. 2003 8. B. Bagócsi, S. Mahó, Z. Végh, K. Ferenczi-Fodor The role of OPLC as an in-process test in total-synthesis of norsteroids Part III Chromatography 2004, Visegrád, Hungary, May 2004, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 215-219. 9. A. Laukó, B. Bagócsi, K. Ferenczi-Fodor TLC, OPLC and HPLC, complementary methods in pharmaceutical analysis. The case study of Prednisolone Caproate Chromatography 2005, Siófok, Hungary, May 2005, Res. Inst. Medicinal Plants, Budakalász, Hungary, pp. 439-446. 8
Előadások: 1. Bagócsi Boglárka Etinilösztradiol alapanyag tisztaságvizsgálata túlnyomásos rétegkromatográfiával Magyar Kémikusok Egyesülete - Fiatal Kémikusok Előadóülése, 1999. november 23., Budapest 2. Bagócsi Boglárka Nesztoron alapanyag tisztaságvizsgálata OPLC módszerrel Magyar Kémikusok Egyesülete - Fiatal Kémikusok Előadóülése, 2001. november 14., Budapest 3. Kocsis László, Mink János, Ferencziné Fodor Katalin, Bagócsi Boglárka Kromatográfiás vékonyrétegek FTIR és Raman spektroszkópiai vizsgálata 46. Magyar Spektrokémiai Vándorgyűlés, Szeged, 2003. június 30 július 2. 4. Bagócsi Boglárka A túlnyomásos rétegkromatográfia (OPLC) alkalmazása a gyártásközi ellenőrzésben Magyar Kémikusok Egyesülete - Fiatal Kémikusok Előadóülése, 2003. november 25., Budapest 5. Kozma József, Bagócsi Boglárka, Kassai Ferencné, Ferencziné Fodor Katalin Különböző kromatográfiás módszerek szerepe egy gyógyszeralapanyag rokonvegyületeinek vizsgálatában Elválasztástudományi Ankét, 2006. február 23., Budapest 9