A deramciclane anxiolytikus hatása és hatásmechanizmusa

A deramciclane anxiolytikus hatása és hatásmechanizmusa Doktori tézisek Gacsályi István Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezetı: Dr. Klebovich Imre egyetemi tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Sátory Éva egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Tarnawa István laboratóriumvezetı, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Török Tamás egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Tímár Júlia egyetemi docens, Ph.D. Dr. Bárdos György egyetemi docens, Ph.D. Dr. Székely József egyetemi tanár, D.Sc. Budapest 2008

TARTALOMJEGYZÉK TARTALOMJEGYZÉK... 2 BEVEZETÉS... 3 A szerotonin szerepe a szorongás patomechanizmusában... 3 CÉLKITŐZÉSEK... 5 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 6 Receptorkötıdési-profil meghatározása... 6 Az 5-HT rendszerre gyakorolt hatások vizsgálata... 6 A Perifériás 5-HT hatások vizsgálata... 6 Az 5-HT2A receptor antagonista hatás vizsgálata nyúl mellkasi aorta csíkon... 6 Szerotoninnal kiváltott talpödéma gátlás... 7 Központi idegrendszeri hatások... 7 DOI-val kiváltott fejrázás (head twitch) gátlása patkányokon... 7 A Szorongásoldó hatás vizsgálata... 8 Vogel féle ivási konfliktus teszt... 8 Golyótemetés teszt... 8 Fény-sötét teszt (light-dark teszt)... 8 A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás mérése egereken... 9 EREDMÉNYEK... 9 Receptorkötıdési-profil meghatározása... 9 Az 5-HT rendszerre gyakorolt hatások vizsgálata... 10 A perifériás 5-HT hatások vizsgálata... 10 Az 5-HT2A receptor antagonista hatás vizsgálata nyúl mellkasi aorta csíkon... 10 Szerotoninnal kiváltott talpödéma gátlás... 10 Központi idegrendszeri hatások... 11 A DOI-val kiváltott fejrázás (head twitch) gátlása patkányokon... 11 Szorongásoldó hatás... 12 Vogel-féle ivási konfliktus teszt... 12 Golyótemetés teszt... 13 Fény-sötét teszt (light-dark teszt)... 13 A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás mérése egereken... 14 KÖVETKEZTETÉSEK... 16 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE... 17 A disszertáció alapját képezı közlemények jegyzéke... 17 Egyéb közlemények jegyzéke... 18 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 20

BEVEZETÉS A félelem és a szorongás része az életünknek. Minden olyan esetben, amikor (jó)létünket vélt vagy valósnak ítélt veszély fenyegeti, félelemnek nevezett alarmállapotot élünk át. Fenyegetettséget élünk át akkor is, ha változást követelı igényekkel találjuk magunkat szemben. Ezeket a vélt vagy valós veszélyeket nevezzük stresszoroknak. Mindennapi életünk során számos különbözı típusú stresszorral találkozunk, pl. váratlan események, tartós élethelyzet változások (pl. házasság), krónikus problémák (pl. szegénység, betegség) vagy traumák (pl. katasztrófák, erıszak, verbális erıszak). A szorongás normális esetben egy természetes adaptációs reakció, azonban patológiássá is válhat, és így akadályozhat a stresszorokkal való megküzdésben. Szélsıséges esetben még testi tüneteket is okozhat (pl. gyomorfekély). A szorongásos zavarokra jellemzıek a tüneti átfedések, és gyakran kombinálódnak egymással. A szerotonin szerepe a szorongás patomechanizmusában A szerotonin rendszer szerepe az emocionális állapotok regulációjában régóta feltételezett. Az ismert 16 emlıs receptor közül szinte mindegyik receptor szerepét több kutatási eredmény is alátámasztja a szorongásban vagy a stresszben (Lucki, 1996). Mindezzel együtt az 5-HT rendszer szerepe a szorongásban, a hatalmas mennyiségő hozzáférhetı adat alapján, ellentmondásos. Nincs egyetértés abban, hogy az 5-HT rendszer aktivációja növeli, vagy csökkenti a szorongást, és fordítva, az 5-HT transzmisszió gátlása csökkenti, vagy növeli a szorongást és/vagy a stressz-válaszokat. Ennek okai lehetnek módszertaniak, de adódhatnak abból, hogy a rendkívül komplex mőködéső 5-HT rendszert és kölcsönhatásait más rendszerekkel még mindig csak felületesen ismerjük. A legelsınek felfedezett és 1986-ban törzskönyvezett 5-HT 1A parciális agonista buspiron esetében pl., találunk bizonyítékot arra, hogy szorongásoldó (Weissmann és mtsai, 1984), de arra vonatkozólag is van adat, hogy anxiogénnek bizonyult (Collinson és mtsai, 1997). A diszkrepancia okai nem ismertek; lehetséges magyarázatok a vizsgálatokban alkalmazott különbözı állatartási körülmények, valamint a buspiron rövid ideig tartó kortikoszteron szint emelı hatása (Haller és mtsai, 2000). Az ellentmondásos eredmények igazak a további szerotonin receptorokra ható molekulák esetében is. Az 5-HT 2C/2B agonista m-klorofenilpiperazin (mcpp) emberben szorongást kelt, és pánik reakciót okoz más neuropszichiátriai tünetekkel (Charney és mtsai, 1987), és állatkísérletekben is anxiogén 3

jellegő hatásokat produkál (Kennet és mtsai 1989). A szintén szerotonin aktivitást fokozó szelektív szerotonin visszavétel gátlók azonban anxiolytikus hatásúak emberben és kísérleti állatmodellekben is (Bagdy, 1998). Ugyanakkor rendelkezésre állnak olyan eredmények is amelyekben az SSRI-k szorongáskeltınek bizonyultak (Dekeyne és mtsai, 2000; Overstreet és mtsai, 2000). További evidenciák állnak rendelkezésre az 5-HT rendszer szorongásban betöltött szerepérıl az 5-HT 1A receptor génkiütött egereken elvégzett vizsgálatokból. Három független csoport írt le vizsgálatokat a szorongó típusú génkiütött és vad típusú egerek összehasonlításával három különbözı genetikai hátteret felhasználva (Gingrich és mtsai, 2001). Az elvégzett vizsgálatok szerint az 5-HT 1A génkiütött egerek szorongásos tüneteket mutattak, nem csak a viselkedési tesztekben, hanem a vegetatív idegrendszer szintjén is (Pattij és mtsai, 2002). Az 5-HT 2A/2C receptorok szerepe az 5HT 1A receptorok után a leginkább kutatott terület, és a mai napig az 5-HT 2C antagonisták, mint anxiolytikumok, alternatív terápiás lehetıséget ígérnek a benzodiazepinekkel szemben. Az akut 5-HT 2C/1B agonista mcpp adagolás szorongáskeltı hatású mind emberben, mind pedig rágcsálókban (Charney és mtsai, 1987). A korai, nem szelektív 5-HT 2C antagonistákkal (methysergide, metergoline) és a szelektív 5-HT 2A/2C antagonista ritanserinnel végzett vizsgálatok szerint az mcpp szorongáskeltı hatása az 5-HT 2C agonista hatásának következménye (Kalus és mtsai, 1990; Piggot és mtsai, 1991; Seibyl és mtsai, 1991). Az MK-212 jelő 5-HT 2C agonista a hippocampus ventrális részébe adott mikroinjekciója után az emelt keresztlabirintus-teszten szintén szorongásra jellemzı viselkedést tapasztaltak (Alves és mtsai, 2004). Számos experimentális és klinikai vizsgálat bizonyítja, hogy az 5-HT 2C antagonisták az agonisták anxiogén hatásával szemben szorongásoldó hatással rendelkeznek. A humán fázis II. vizsgálatokig eljutott ritanserin szorongásoldónak bizonyult generalizált szorongás betegségben, és állatkísérletben is anxiolytikus hatással rendelkezett (Ceulemans és mtsai, 1985; Meert és mtsai, 1989). Kennett és munkatársai bizonyították négy nem szelektív 5- HT 2C antagonista (mianserin, 1-NP, ICI-169369, LY 53857) esetében a szorongásoldó hatást Geller-Seifter modellben (Kennett és mtsai, 1994). Az 1990-es évek végétıl egyre több és egyre szelektívebb 5-HT 2C antagonista fejlesztése indult el, és bizonyult anxiolytikus hatásúnak a szorongás kísérletes állatmodelljeiben. Ezek a molekulák fıként a GlaxoSmithKline Gyógyszergyárban kerültek kifejlesztésre. A fıbb képviselıik az SB-200646, az SB-24084 és az SB-243213 (Kennett és mtsai, 1994; Martin és mtsai, 2002; Wood és mtsai, 2001). 4

Az 5-HT 3 receptor antagonisták kutatása is úgy indult, hogy ezen molekulák potenciális szorongásoldó szerek lesznek. A vizsgálatok elırehaladtával azonban bebizonyosodott, hogy szorongásoldóként nem válnak be, azonban a citosztatikumok kiváltotta hányást rendkívül hatékonyan gátolják. Ma hatékony gyógyszerekként (pl. ondansetron) az onkológiai terápia fontos részei (Wolf, 2000). A legutoljára azonosított 5-HT 6 és 5-HT 7 receptoroknak is feltételezik a szerepét a szorongásban. Yoshioka és munkatársai kondicionált félelmi reakciókkal 5-HT felszabadulást váltottak ki patkány frontális kéregben, valamint megdermedés reakciót (freezing) észleltek. Az 5-HT felszabadulás gátolható volt 5-HT 6 antisense oligonucleotiddal, a megdermedés reakció azonban nem (Yoshioka és mtsai, 1998). Az 5-HT 7 receptor szerepét inkább depresszióban feltételezik, azonban szorongásban is lehet szerepe, ugyanis pl. a szelektív 5- HT 7 antagonista SB-269970 hatékonynak bizonyult a Vogel féle ivási konfliktus tesztben, az emelt kereszt-labirintus teszten, valamint a 4 terület (four plate) teszten (Wesolowska és mtsai, 2006). A fent bemutatottak alapján látható, hogy sem a szorongás terápiája, sem az 5-HT rendszer szerepe nem kellıen tisztázott a szorongásban. Ebbıl következıen minden új és szorongásos zavarban hatékony 5-HT rendszeren keresztül ható farmakon közelebb vihet mind a szorongás patomechanizmusának megismeréséshez, mind pedig az 5-HT rendszer szerepének tisztázásához. CÉLKITŐZÉSEK A deramciclane az EGIS Gyógyszergyárban szintetizált originális molekula. A deramciclane az EGIS Nyrt-ben folyó szerotonin projekt keretében került kiemelésre. A deramciclane terápiás hatásának és hatásmechanizmusának megismeréséhez az alábbi vizsgálatok elvégzését tartottuk szükségesnek: 1. A deramciclane receptorprofiljának feltérképezése különös tekintettel az 5-HT receptorokra. 2. Az 5-HT rendszerre gyakorolt hatás további bizonyítása in vitro és in vivo módszerekkel. 3. A perifériás és a központi idegrendszeri 5-HT hatások összehasonlítása. 5

4. A deramciclane esetében kimutatott 5-HT hatás természetének (agonista, antagonista) vizsgálata in vitro és in vivo módszerekkel. 5. A deramciclane szorongásoldó potenciáljának vizsgálata 3 különbözı kísérletes szorongás modellben. 6. A deramciclane spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatásának vizsgálata egereken, abból a célból, hogy megismerjük a deramciclane szedatív potenciálját. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Az állatkísérleteket az Állatvédelmi Törvénynek (1998. évi XXVIII. törvény), valamint a nemzetközi elıírások betartásával végeztük. Receptorkötıdési-profil meghatározása Vizsgálatainkban patkány, tengerimalac és sertés izolált agyakat használtunk. Minden kísérletben az agyak meghatározott részébıl vagy az egész agyból nyert membrán preparátumot készítettünk (patkány agykéreg α 1 ; α 2 ; β receptorok, patkány teljes agy GABA A ; benzodiazepin receptorok; patkány striatum D 2 ; 5-HT 1B receptorok, patkány frontális kéreg 5-HT 1A ; 5-HT 2A receptorok, tengerimalac kisagy H 1 receptorok, tengerimalac agykéreg CCK B receptorok, sertés choroid plexus 5-HT 2C receptorok). A fehérjetartalom meghatározásához Bradford módszerét (Bradford, 1976) használtuk. Az emberi klónozott receptorokat a következı sejtvonalakon mértük: 5-HT 7 CHO sejtek, 5-HT 6 HEK sejtek, CCK A NIH-3T3 sejtek. Az 5-HT rendszerre gyakorolt hatások vizsgálata A Perifériás 5-HT hatások vizsgálata Az 5-HT 2A receptor antagonista hatás vizsgálata nyúl mellkasi aorta csíkon Hím, újzélandi fehér nyulakat használtunk kísérleteinkben. Az aortaív utáni szakaszból egy 30 mm hosszú spirális alakú mellkasi aorta darabot kimetszettünk, majd Krebs oldatba helyeztünk. A szöveteket 1 g erıvel feszítettük elı, és 37 C-on 90 percig inkubáltuk. A 6

szövetek oxigenizálását és a fiziológiás ph-t, karbogén gázzal való átbuborékoltatással biztosítottuk. A deramciclane esetében az alábbi koncentrációkat használtuk: 5x10-6, 10-6, 5x10-7, 10-7, 5x10-8, 10-8, 10-9 M. A referensként használt vegyületek a következı koncentrációban adagoltuk: ritanserin: 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, ketanserin: 10-7, 10-8, 5x10-9, 10-9, mianserin: 10-6, 10-7, 5x10-8, 3x10-8, 10-8, 10-9 M. A vegyület növekvı koncentrációinak 5-HT választ gátló hatásaiból IC 50 értéket határoztunk meg nem lineáris regresszió számítás segítségével (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA). Szerotoninnal kiváltott talpödéma gátlás A kísérletekhez Wistar törzstenyészetbıl származó patkányokat használtunk. Csoportonként hat állatnak gyomorszondán keresztül 30 ml/kg térfogatban csapvizet adtunk. A vizsgálandó anyagokat, illetve a vivıszert egy óra múlva szintén orálisan adagoltuk 10 ml/kg volumenben. Újabb egy óra elteltével a jobb hátsó láb plantáris felszínébe 0,1 ml 30 µg/ml koncentrációjú fiziológiás sóoldatban oldott szerotonint fecskendeztünk. A jobb hátsó láb térfogatát a gyulladáskeltı beadása elıtt és utána 30 perccel pletizmométerrel határoztuk meg. A vegyülettel kezelt csoport lábtérfogat növekedését a kontroll csoport változásához viszonyítva értékeltük. A statisztikai értékelés ANOVA-t követıen Dunnett-teszttel történt (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA). Az ID 50 érték meghatározását lineáris regresszió analízis segítségével végeztük. Központi idegrendszeri hatások DOI-val kiváltott fejrázás (head twitch) gátlása patkányokon Vizsgálatainkban Wistar patkányokat használtunk, csoportonként 10 állatot. A deramciclanet (1.0, 3.0, 10.0 mg/kg), a ritanserint (1.0, 3.0, 10.0 mg/kg ) és a vivıanyagot (0,4 % metil cellulóz oldat) 60 perccel a DOI kezelés elıtt adagoltuk szájon át (p.o.). 5 perccel a DOI kezelést követıen kezdtük számolni a fejrázások ( head twitch ) számát. A fejrázások számlálása 30 percig tartott. A statisztikai feldolgozás egyszempontos variancia analízis segítségével történt. A csoportok közötti szignifikancia meghatározására Dunnett-tesztet használtunk (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA). 7

A Szorongásoldó hatás vizsgálata Vogel féle ivási konfliktus teszt Long-Evans patkányokat 48 órán át szomjaztattunk, illetve 24 órán át éheztettünk a kísérletet megelızıen, minimum 8 állatot csoportonként. A vizsgálandó illetve vivıanyagokat az állatok per orálisan kapták, 60 perccel a mérés elıtt. Az anxiolytikus hatást 8 mérıhelyes készülékben (LIKOSYS, Experimetria, Budapest) mértük, Vogel módosított módszere alapján (Vogel és mtsai, 1971) vizsgáltuk. Minden 20. nyalást követıen a készülék az itatócsövön keresztül 2.0 ma erısségő áramütést bocsátott ki 1 másodperc idıtartamig. Az 5 perces mérés alatt azt regisztráltuk, hogy az állatok hány darab áramütést hajlandók elfogadni azért, hogy szomjukat csillapítsák. Az anyaghatást a tolerált áramütésszám %-os növekedésével fejeztük ki. Az átlagot, a szórást, a standard hibát, a %-os hatást és a csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját (ANOVA után Dunnett-teszt) számítógépes program segítségével számoltuk ki (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA). Golyótemetés teszt A golyótemetést, 5 cm vastagon főrészporral töltött plexi dobozokban (10 db) mértük, Broekkamp és mtsai módszere szerint (Broekkamp és mtsai, 1986). A főrészpor tetejére 24 db 1 cm átmérıjő üveggolyót helyeztünk. A vizsgálatban a vizsgált anyagok következı dózisait adagoltuk: deramciclane: 0,3; 1,0; 3,0; 10,0; 30,0 mg/kg p.o., diazepam: 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 mg/kg p.o., ritanserin: 1,0; 3,0; 10,0 mg/kg p.o. A vizsgálandó vagy vivıanyaggal történt p.o. kezelés után egy órával a soros csoport állatait a mérıdobozokba helyeztük, majd 15 perc múlva kiemeltük ıket. Dobozonként megszámláltuk azokat a golyókat, amelyek legalább 2/3 részben be voltak fedve az átszitált főrészporral. A %-os hatásokból a dózishatás összefüggések alapján lineáris regresszióval ID 50 értéket számoltunk. A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját (ANOVA után Dunnett-teszt) számítógépes program segítségével számoltuk ki (GraphPAD Prism 4.0, GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA). Fény-sötét teszt (light-dark teszt) A fény-sötét aktivitást 6 csatornás Animal Activity Collecting System (modell 2012, Rhema Labortechnik, Germany) készülék segítségével mértük. A mérıhelyek két térrészre voltak osztva, egy zárt, kicsi sötét félre, és egy nyitott, erısen megvilágított nagyobb részre. A két 8

térfelet 5 x 5 cm-es kapu kötötte össze. Az állatok aktivitását a készülék az állatok mozgása által okozott mágneses térerısség megváltozásával mérte. A vizsgálatban a vizsgált anyagok következı dózisait adagoltuk: deramciclane 0,3; 1,0; 3,0 mg/kg ip., diazepam 0,3; 1,.0; 3.0 mg/kg ip. A vizsgálandó vagy vivıanyaggal (0,4 % metil cellulóz) kezelt állatokat ip. kezelés után 20 perccel a mérıhelyekre helyeztük, majd 8 percen keresztül regisztráltuk az állatok aktivitását. Az átlagot, a szórást, a standard hibát, és a csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját (ANOVA után Dunnett-teszt) számítógépes program segítségével számoltuk ki (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA). A nyitott, megvilágított térfélre történı átlépések számának szignifikáns növekedését tekintettük anxiolytikus hatásnak. A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás mérése egereken A spontán motilitásra gyakorolt hatást 10 mérıhelyes (csatornás) "Digitál moti-méter" típusú készülékkel (a készüléket az EGIS Gyógyszergyárban gyártották) végeztük. A vizsgált anyagok következı dózisait adagoltuk: deramciclane: 12,5; 25,0; 50,0; 100,0; 150,0 mg/kg p.o., diazepam: 1,0; 3,0; 10,0; 30,0 mg/kg p.o., ritanserin: 12,5; 25,0; 50,0 mg/kg p.o. A vivıanyag 0.4 %-os metil cellulóz volt. Az állatok mozgását mérıhelyenként három párhuzamos infravörös fénysugár megszakítása jelezte, amit a készülék regisztrált. A vizsgálandó ill. a vivıanyag per os adagolása után 1 óra múlva helyeztük a készülékbe az állatokat, és 30 percen keresztül regisztráltuk az infravörös fénysugár-megszakítások számát. A %-os hatásokból a dózishatás összefüggések alapján lineáris regresszió módszerével ID 50 értéket számoltunk. A csoportok közötti különbségek statisztikai szignifikanciáját (ANOVA, Dunnett-teszt) számítógépes program segítségével határoztuk meg (GraphPAD Prism 4.0 GraphPad Software Incorporation, San Diego, USA). EREDMÉNYEK Receptorkötıdési-profil meghatározása Eredményeink szerint a deramciclane legerısebb kötıdést az 5-HT 2 receptorcsalád receptorjai közül az 5-HT 2A (11 nm) és az 5-HT 2C (8,7 nm) receptorokhoz mutatta. Közepes erısségő kötıdést mutatott a σ 1 (52 nm), az 5-HT 6 (70 nm), az 5-HT 7 (105 nm) és D 2 (113 nm) receptorokhoz (1. táblázat). Alacsony, biológiailag nem számottevı affinítást mutatott (K i >1000 nm, ezért a táblázatban külön nincs feltüntetve) a következı receptorokhoz: α 1, α 2, β 1, D 1, 5-HT 1A, benzodiazepine, GABA A, CCK A, CCK B, H 1. 9

1. táblázat. A deramciclane affinitása különbözı agyi receptorokhoz. Receptor K i (nm)±se 5-HT 2C 8,7±0,7 5-HT 2A 11±1,5 σ 1 52±8,0 5-HT 6 70±0,9 5-HT 7 105±3,16 D 2 113±10,0 Az 5-HT rendszerre gyakorolt hatások vizsgálata A perifériás 5-HT hatások vizsgálata Az 5-HT2A receptor antagonista hatás vizsgálata nyúl mellkasi aorta csíkon Mindhárom általunk vizsgált vegyület hatékonyan gátolta az 5-HT szubmaximális dózisával kiváltott kontrakciókat a nyúl mellkasi aorta csíkon. Izolált szervi kísérleteinkben a deramciclane gátló hatása egy nagyságrenddel elmaradt a mianserin, és két nagyságrenddel gyengébbnek bizonyult, mint a ketanserin és ritanserin hatása (2. táblázat). 2. táblázat. A deramciclane és a referens molekulák hatása szerotoninnal kiváltott kontrakciókra nyúl mellkasi aorta preparátumon. Vegyület IC 50 (M) n Deramciclane 4,2x10-7 3 Ketanserin 3,5x10-9 3 Ritanserin 5,5x10-9 3 Mianserine 2,1x10-8 3 Szerotoninnal kiváltott talpödéma gátlás Mind a deramciclane, mind pedig a ritanserin dózisfüggıen gátolta a szerotoninnal kiváltott talpödémát patkányokon (1. ábra). A ritanserin esetében a statisztikailag szignifikáns hatás (minimum hatékony dózis) 2 nagyságrenddel alacsonyabb dózisban (1,0 mg/kg p.o.) jelentkezett, mint a deramciclane beadása után (30,0 mg/kg p.o., 1. ábra). 10

lábtérfogat növekedés (ml) 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 * kontroll 10 30 100 kontroll 0,3 1 3 10 deramciclane mg/kg po. ritanserin mg/kg po. 1. ábra. A deramciclane és a referens ritanserin hatása a szerotoninnal kiváltott talpödémára patkányokon. Központi idegrendszeri hatások A DOI-val kiváltott fejrázás (head twitch) gátlása patkányokon A deramciclane a ritanserinnel azonos nagyságrendben, dózisfüggıen gátolta a DOI-val kiváltott fejrázásokat. A hatás minden vizsgált dózisban (1,0 3,0 10,0 mg/kg p.o.), mindkét vegyület esetében statisztikailag szignifikánsnak bizonyult (p<0,05 Dunnett-teszt, 2. ábra). 30 # # # # Fejrázások száma 20 10 0 kontroll 0.5 1,0 3,0 10,0 m g/kg kontroll 0,5 1,0 3,0 10,0 m g/kg D O I ip. D O I ip. deramciclane po. ritanserin po. 2. ábra. A deramciclane és a referens ritanserin hatása a DOI-val kiváltott fejrázási reakcióra. 11

Szorongásoldó hatás Vogel-féle ivási konfliktus teszt A deramciclane szignifikánsan gátolta a nyalások számának csökkenését 1,0 mg/kg és 10,0 mg/kg orális kezelést követıen (3. ábra). A diazepam 0,3; 1,0 és 3,0 mg/kg dózisokban volt hatékony (4. ábra). A ritanserin 0,3 és 3,0 mg/kg dózisokban gátolta az elfogadott áramütések számának csökkenését, a hatás azonban nem érte el a statisztikai szignifikancia szintjét (4. ábra). 60 50 áramelfogadások száma 40 30 20 ## 10 0 kontroll áram 0.1 0.3 1 3 10 2 ma/1sec deramciclane mg/kg po. 3. ábra. A deramciclane hatása a nyalások mennyiségére a Vogel-féle ivási konfliktus tesztben. 60 50 áramelfogadások száma 40 30 20 * * * ## 10 ## 0 kontroll áram 0.3 1 3 kontroll áram 0,3 1 3 2mA/1 sec diazepam mg/kg po. 2mA/1 sec ritanserin mg/kg po. 4. ábra. A diazepam és a ritanserin hatása a nyalások számára Vogel-féle ivási konfliktus tesztben. 12

Golyótemetés teszt Mindhárom vizsgált anxiolytikum dózisfüggıen gátolta az egerek golyótemetı viselkedését. A hatás a deramciclane esetében 10,0 és 30,0 mg/kg p.o. dózisokban staisztikailag szignifikánsnak bizonyult (5. ábra). A deramciclane ID 50 értéke ugyanabba a dózistartományba esett, mint a referensként használt diazepam és ritanserin ID 50 értéke (3. táblázat). 20 temetett golyók száma 15 10 5 0 kontroll 0,3 1,0 3,0 10,0 30,0 deramciclane mg/kg po. 5. ábra. A deramciclane hatása egerek golyótemetı viselkedésére. 3. táblázat. Különbözı anxiolytikumok ID 50 értékei golyótemetés teszten Vegyület ID 50 mg/kg p.o. Legnagyobb megfigyelt gátlás (%) Dózisok száma Deramciclane 7,1 74,7 5 Diazepam 3,3 78,1 4 Ritanserin 3,7 76,0 3 Fény-sötét teszt (light-dark teszt) A deramciclane 3,0 mg/kg dózisban sc. adagolás után szignifikánsan növelte az átlépések számát az erısen megvilágított térfélre (6. ábra). A referensként használt diazepam 1,0 m/kg sc. dózisban növelte, 3,0 mg/kg dózisban szignifikánsan csökkentette az átlépési aktivitást (6. ábra). 13

A deramciclane egyik vizsgált dózisban sem befolyásolta az állatok összaktivitás szintjét (7. ábra). A diazepam 3,0 mg/kg dózisban szignifikánsan csökkentette az állatok összaktivitás szintjét (7. ábra). * * * * 3 0 Átlépések száma a világos térfélbe 2 0 1 0 0 kontroll 0,3 1,0 3,0 0,3 1,0 3,0 d e r a m c ic la n e m g /k g s c. d ia z e p a m m g /k g s c. 6. ábra. A deramciclane és a diazepam hatása az erısen megvilágított térfélre történı átlépésekre fény-sötét tesztben. 800 összaktivítás 600 400 200 0 kontroll 0,3 1 3 0,3 1 3 deramciclane mg/kg sc. diazepam mg/kg sc. 7. ábra. A deramciclane és a diazepam hatása az egerek 8 perc alatt mért teljes aktivitására. A spontán motoros aktivitásra gyakorolt hatás mérése egereken A deramciclane az egerek spontán motoros aktivitását dózisfüggıen gátolta. A hatás 25 mg/kg p.o. dózistól statisztikailag szignifikáns (8. ábra). A referensként használt ritanserin a deramciclannal azonos dózistartományban mutatott aktivitást csökkentı hatást ( 4.táblázat). 14

0,1101020304050Motorosaktivitá sgátlás(%) Dó zis(mg/kgp.o.) 1000 infrasugár megszakítások száma 800 600 400 200 0 kontroll 12.5 25 50 100 150 deramciclane mg/kg po. 8. ábra. A deramciclane hatása egerek spontán motoros aktivítására. 4. táblázat. Különbözı anxiolytikumok spontán motoros aktivitás gátló hatásának ID 50 értékei. Vegyület ID 50 mg/kg p.o. legnagyobb megfigyelt gátlás (%) Dózisok száma Deramciclane 31,5 88,3 4 Diazepam 6,9 74,0 4 Ritanserin 27,2 69,3 3 15

KÖVETKEZTETÉSEK A deramciclane erısen kötıdik az agyi 5-HT 2A, 5-HT 2C receptorokhoz, közepes affinitással rendelkezik az agyi 5-HT 6, 5-HT 7 σ 1 és D 2 receptorokhoz. A deramciclane nem kötıdik az agyi α 1, α 2, β, D 1, 5-HT 1A, benzodiazepine, GABA, CCK A, CCK B és H 1 receptorokhoz. A deramciclane hatékonyan gátolja az 5-HT-val kiváltott és az 5-HT 2A/2C agonista DOI-val kiváltott in vivo viselkedés és fiziológiás válaszokat, alátámasztva a receptorkötési vizsgálatban kapott eredményeket. A deramciclane központi idegrendszeri szerotoninerg hatása legalább egy nagyságrenddel alacsonyabb dózis, vagy koncentráció tartományban jelentkezik, mint a perifériás 5-HT rendszerre gyakorolt hatása. A deramciclane perifériás és központi idegrendszeri 5-HT hatása antagonista jellegő. A deramciclane szorongásoldó hatással rendelkezik három kísérletes szorongás modellben. Felmerül a deramciclane terápiás alkalmazhatósága kényszerbetegségben. A szorongásoldó dózistartományban nem rendelkezik spontán aktivitást befolyásoló hatással. Szorongásoldó hatásának hátterében nagy valószínőséggel az 5-HT 2A/2C receptor antagonista hatása állhat. Nem zárható ki, hogy az 5-HT 6, 5-HT 7 és σ 1 receptornak is szerepe van a deramciclane szorongásoldó hatásában. 16

A deramciclane magas dózisban megjelenı dopamin antagonista hatása a szorongásoldó dózistartományban várhatóan nem okoz kellemetlen mellékhatásokat. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE A disszertáció alapját képezı közlemények jegyzéke 1. Gacsályi I, Gyertyán I. Petıcz L. Budai Z. (1988) Psychopharmacology of a new anxiolytic agent EGYT-3886. Pharm Res Comm, 20: 115-116. 2. Gacsályi I, Gigler G, Szabados T, Kovács A, Vasar E, Lang A, Männisto PT. (1996) Different antagonistic activity of deramciclane (EGIS-3886) on peripheral and central 5-HT 2 receptors. Phar. Pharmacol Lett, 2: 82-85. 3. Gacsályi I, Schmidt É, Gyertyán I, Vasar E, Lang A, Haapalinna A, Fekete M, Hietala J, Syvälahti E, Tuomainen PM, Männisto PT. (1997) Receptor binding profile and anxiolytic type activity of deramciclane (EGIS-3886) in animal models. Drug Dev Res, 40: 333-348 (1997). 4. Détári L, Szentgyörgyi V, Hajnik T, Szénási G, Gacsályi I, Kukorelli T. (1999) Differential EEG effects of the anxiolytic drugs, deramciclane (EGIS-3886) ritanserine and chlordiazepoxide in rats. Psychopharmacol, 142: 318-326. 5. Varga G, Kordas K, Bughardt B, Gacsályi I, Szénási G. (1999) Effect of deramciclane a new 5-HT receptor antagonist, on cholecystokinin-induced changes in rat gastrointestinal function. Eur J Pharmacol, 19: 315-323. 17

Egyéb közlemények jegyzéke 1. Gacsályi I, Petıcz L, Fekete M.I, Bükkfalvi B, Görgényi F, Arató M. (1998) EGYT- 2509 a novel neuroleptic agent without extrapyramidal and endocrine side effects. Pol J Pharmacol Pharm, 40: 613-619. 2. Gyertyán I, Petıcz L, Bajnogel J, Szücs Z, Hegedős M, Gyüre K, Gacsályi I, Krizsán D, Fekete M.I.(1989) Possible involvement of the dopaminergic system in the mode of action of the potential antidepressant trazium esilate. Arzn Forsch (Drug Res.), 39: 775-781. 3. Schuler D, Bakos M, Kardos G, Koos R, Révész T, Somló P, Nagy C, Gacsályi I, Kálmánchey R. (1989) Leukémiából felgyógyult gyerekek neurológiai vizsgálata. Orv Hetil, 30: 1639-1641. 4. Schuler D, Bakos M, Borsi J, Gacsályi I, Kalmanchey R, Kardos G, Koos R, Nagy C, Révész T, Somló P. (1990) Neuropsychologic and CT examinations in leukemic patients surviving 10 or more years. Med Pediatr Oncol, 18: 123-125. 5. Gyertyán I, Petıcz L, Gacsályi I, Fekete M.I.K, Tekes K, Kápolnai L. (1991) Psychopharmacological effects of an imino-thiazolidine derivative antidepressant candidate, EGYT-4201. Drug Dev Res, 22: 385-389. 6. Herjavecz I, Karácsonyi E, Mulbacher S, Radics K, Szilágyi R, Gacsályi I. (1993) Comparative clinical examination of Loderix (setastinum) and astemizole in pollenosis. Ther Hung, 41: 141-145. 7. Bilkei-Gorzo A, Müller G, Gyertyán I, Gacsályi I, Szabados T. (1998) Behavioral studies with a highly emotional mouse strain newly bred in EGIS Pharmaceuticals Ltd. Neurobiol (Bp), 6: 461-462. 18

8. Szabados T, Gigler G, Gyertyán I, Gacsályi I, Lévay G. (1999) Duration of action of GYKI 52466 and its analogues in antiepileptic, anti-ischemic and muscle relaxant tests, Neurobiol (Bp.), 7: 87-88. 9. Szabados T, Gigler G, Gyertyán I, Gacsályi I, Lévay G. (2001) Comparison of anticonvulsive and acute neuroprotective activity of three 2,3-benzodiazepine compounds, GYKI 52466, GYKI 53405, and GYKI 53655. Brain Res Bull, 55: 387-391. 10. Leveleki Cs, Kompagne H, Gacsályi I, Barkóczy J, Schmidt É, Pallagi K, Hársing L, Lévay Gy. (2002) Új atípusos antipszichotikumok anxiolitikus hatással. Neuropsychopharmacol Hung, 4: 147-153. 11. Bózsing D, Simonek I, Simig G. Jakóczi I, Gacsályi I, Lévay G, Tihanyi K, Schmidt E. (2002) Synthesis and evaluation of 5-HT (2A) and 5-HT (2C) receptor binding affinities of novel pyrimidine derivatives.bioorg Med Chem Lett, 4: 3097-3099. 12. Hársing LG Jr, Gacsályi I, Szabó G, Schmidt E, Sziray N, Sebban C, Tesolin-Decros B, Matyus P, Egyed A, Spedding M, Levay G. (2003) The gyline transporter-1 inhibitors NFPS and Org 24461: a pharmacological study. Pharmacol Biochem Behav, 74: 811-825. 13. Kovács A, Gacsályi I, Wellmann J, Scmidt E, Szőcs Z, Dubreuil V, Nicolas JP, Boutin J, Bozsing D, Egyed A, Tihanyi K, Spedding M, Szénasi G. (2003) Effects of EGIS-7625, a selective and competitive 5-HT 2B receptor antagonist. Cardiovasc Drugs Ther, 17: 427-434. 14. Jakus R, Graf M, Ando RD, Balogh B, Gacsályi I, Lévay G, Kántor S, Bagdy G. (2004) Effect of two noncompetitive AMPA receptor anatgonists GYKI 52466 on vigilance, behavior and spike-wave discharges in genetic rat model of abscence epilepsy. Brain Res, 22: 236-244. 19

15. Hársing LG Jr, Jurányi Z, Gacsályi I, Tapolcsányi P, Czompa A, Mátyus P. (2006) Glycine transporter type-1 and its inhibitors. Curr Med Chem, 13: 1017-1444. 16. Gigler G, Móricz K, Ágoston M, Simó A, Albert M, Benedek A, Kapus G, Kertész Sz, Végh M, Barkóczy J, Markó B, Szabo G, Matucz E, Gacsályi I, Lévay Gy, Hársing L.G.,Jr., Szénasi G. (2007) Neuroprotective and anticonvulsant effects of EGIS-8332, a non-competitive AMPA receptor antagonist, in a range of animal models. British J Pharmacol, 152: 151-160. 17. Kapus G, Gacsályi I, Végh M, Kompagne H, Hegedős E, Leveleki Cs, Hársing G L, Bilkei G A, Lévay Gy. (2007) Antagonism of AMPA receptors produces anxiolyticlike behavior in rodents: effects of GYKI 52466 and its novel analogues. Submitted to Psychopharmacology, (2007). KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ez a dolgozat több mint 10 év kutatómunkám erdményeképpen készülhetett el. Köszönettel tartozom mindazon vezetıimnek és munkatársaimnak, akik lehetıvé tették számomra azon ritka lehetıség megvalósulását, hogy egy magyar originális molekula fázis III vizsgálatokig eljusson. Külön köszönettel tartozom Dr. Orbán Istvánnak az EGIS Nyrt 2006 januárjában elhunyt vezérigazgatójának, aki mind emberi mind pedig szakmai támogatásával motiválta eredményeim bemutatását. Kiemelt köszönet illeti Dr. Klebovich Imrét, témavezetımet, akinek a szakmain kívül az emberi támogatása is elengedhetetlen segítséget nyújtott. Szeretném megköszönni dr. Blaskó Gábornak, Dr. Simig Gyulának, és Dr. Hársing Lászlónak a támogatását és baráti bíztatását. A disszertáció létrejöttéhez elengedhetetlen segítséget nyújtottak közvetlen munkatársaim, Gigler Gábor, Dr. Móricz Krisztina, Kompagne Hajnalka, dr. Lévay György, és dr. Szénási Gábor, ezért köszöm nekik. Köszönettel tartozom továbbá az EGIS Gyógyszergyár Farmakológia 2 laboratóriuma minden dolgozójának, és az itt név szerint nem megemlített társszerzıknek. Végül, de nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani feleségemnek Schmidt Évának a szakmai tanácsokért, és családomnak kitartó türelmükért és megértésükért. 20