PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológiai Doktori Iskola Szinaptikus átrendezıdés, mint az epilepszia kialakulásának mechanizmusa - Elektrofiziológiai és fotostimulációs mérések patkány epilepszia modellben PhD értekezés Molnár Péter PÉCS, 2010
PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológiai Doktori Iskola Szinaptikus átrendezıdés, mint az epilepszia kialakulásának mechanizmusa - Elektrofiziológiai és fotostimulációs mérések patkány epilepszia modellben PhD értekezés Molnár Péter Konzulens: Dr. Hernádi István Ph.D. PÉCS, 2010
TARTALOMJEGYZÉK 1 ÖSSZEFOGLALÁS 1 2 BEVEZETÉS 3 2.1 Epilepszia 3 2.2 Temporális lebeny epilepszia 4 2.3 Állatmodellek az epilepszia kutatásában 8 2.4 Egyszeri pilokarpin kezelés által kiváltott státusz epileptikusz krónikus hatásai - Temporális lebeny epilepszia modell 10 2.5 A moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában mint a spontán visszatérő epileptikus rohamok egy lehetséges oka 19 2.6 Az újonnan született szemcsesejtek szerepe az epilepszia kialakulásában 23 2.7 Növekedési faktorok megváltozott expressziójának a szerepe az epilepszia kialakulásában 24 2.8 A moharostok által kibocsátott cink feltételezett szerepe 25 2.9 Moharost sarjadzás vizsgálatának technikai módszerei 27 3 PROBLÉMAFELVETÉS, CÉLKITŐZÉSEK 32 4 MÓDSZEREK 33 4.1 Pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz 33 4.2 Szövettani eljárások 33 4.3 Extracelluláris elektrofiziológiai mérések 34 4.4 Patch clamp mérések elektromos stimulálással 35 4.5 Fotostimuláció 36 4.6 Külsőleg adott cink direkt hatásának a mérése GABA A és NMDA receptorokon 37 4.7 Cink hatásának mérése a spontán mini gátló posztszinaptikus áramokra (mipsc) 37 4.8 Moharostokból felszabaduló cink hatásának mérése a GABA A receptor mediálta áramokra 38 4.9 cgaba hatásának mérése a monoszinaptikus IPSC-re 39 4.10 CaEDTA (cink kelátor) hatása a moharost és a perforáns pálya ingerléssel kiváltott EPSC NMDA receptor mediálta komponensére 39 5 EREDMÉNYEK 40 5.1 Sejtpusztulás, moharost sarjadzás és spontán epileptikus rohamok a pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz után 40 5.2 A moharost sarjadzás során létrejövő moharost szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok funkcionális jellemzése 43 5.3 A moharostok által tartalmazott és szinaptikusan kibocsátott cink hatása a szemcsesejtek excitabilitására 57 6 EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE 70 6.1 Szemcsesejt szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok egészséges és epileptikus állatokban 70 6.2 Szemcsesejt szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok AMPA és NMDA receptor mediálta komponense 76 i
6.3 GABAerg gátlás epilepsziában 77 6.4 A moharostokból szinaptikusan ürülő cink szerepe epilepsziában 78 6.5 Összegzés 83 7 SUMMARY 85 8 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 86 9 IRODALOM 87 10 SAJÁT PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK 99 10.1 A PhD disszertáció témájául szolgáló referált közlemények 99 10.2 A PhD disszertáció témájául szolgáló konferencia összefogalók 99 10.3 Egyéb referált közlemények 100 10.4 Egyéb konferencia összefoglalók 103 ii
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACSF: AMPA: BDNF: BrdU: cgaba: cglutamát D-AP5: DG: DNQX: EEG: EC: EPSC: GABA: GDNF: HC: HEPES: IPSC: MES: MTLE: NBQX: NGF: NMDA: NT-3: PTZ: QX-314: SAS: SE: TLE: TPEN: UV: Artificial Cerebrospinal Fluid α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate Brain-derived neurotrophic factor Bromodeoxyuridine γ-aminobutyrate, α-carboxy-2-nitrobenzyl ester γ-(cnb-caged) L-glutamát D-2-amino-5-phosphonopentanoate Gyrus Dentatus 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione Electro-Encefalogramm Entorhinális Cortex Excitátoros Posztszinaptikus Áram γ-aminobutyric acid Glial cell-derived neurotrophic factor Hippocampus 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Gátló Posztszinaptikus Áram Maximális Elektrosokk Mediális Temporális Lebeny Epilepszia 2,3-dihydroxy-6- nitro-7-sulfamyl-benzo(f)quinoxaline Nerve growth factor N-methyl-D-aspartic acid Neurotrophin-3 Pentilentetrazol (N-ethyl lidocaine) chloride Hosszantartó amygdala stimuláció Státusz Epileptikusz Temporális Lebeny Epilepszia N,N,N9,N9-tetrakis(2-pyridyl-methyl)ethylenediamine Ultraibolya iii
1 ÖSSZEFOGLALÁS A temporális lebeny epilepszia a felnıttkorban leggyakrabban elıforduló epilepsziás tünetegyüttes, a felnıtt lakosság majdnem 1%-át érinti. A betegek közel kétharmadánál figyelhetı meg hippokampális lézió (hippokampalis sclerosis). A hippokampális lézió gyakorlatilag a hippokampusz minden területét (különösen a CA1, a CA3 és a gyrus dentatus hilus területeket) érintheti. Ebben a dolgozatban a hippokampusz gyrus dentatus hilus területein bekövetkezı változásokra, ezeknek a változásoknak az epilepszia kifejlıdésében betöltött szerepének tisztázására koncentráltunk.. A temporális lebeny epilepsziát egy állatmodellben vizsgáltuk. Ebben a modellben pilokarpin adásával státusz epileptikuszt váltottunk ki felnıtt patkányokban. A státusz epileptikusz hasonló változásokat idéz elı az agyban, mint amilyet humán temporális lebeny epilepsziában leírtak. Ezek a változások egy csendes periódus után spontán komplex parciális rohamok megjelenéséhez vezetnek. A hippokampális lézió többféleképpen vezethet az epileptikus állapot kialakulásához, ezek egyike a moharost sarjadzás jelensége. A moharost sarjadzás folyamán a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek axonjai terebélyesednek és megjelennek a gyrus dentatus belsı molekuláris rétegében, ahol excitátoros szinapszisokat alkotnak magukkal a szemcsesejtekkel. Ezzel egy pozitív visszacsatolás jöhet létre, amely magyarázatot adhat a gyrus dentatus lecsökkent ellenállóképességére epileptikus szinkronizált aktivitással szemben. Normális esetben a gyrus dentatust a hippokampusz kapuırzıjének tekintik, mivel különlegesen magas a küszöbe szinkronizált aktivitással szemben. Ez annak köszönhetı, hogy a gyrus dentatusban nagyon erıs a feed-back és feedforward gátlás, valamint nincs pozitív excitátoros visszacsatolás. A temporális lebeny epilepszia kifejlıdése során ez drasztikusan megváltozik: egyrészt a mohasejtek pusztulása miatt a feed-forward / feed-back gátlás meggyengül (bár kompenzáló mechanizmusok ezt ellensúlyozzák) másrészt a direkt moharost szemcsesejt monoszinaptikus stimuláló kapcsolatok kialakulásával létrejön az a pozitív visszacsatolás, ami az epileptikus aktivitás generálásához szükséges. Ez a pozitív visszacsatolás hasonló ahhoz, amely normál esetben is megfigyelhetı a CA1 és CA3 területén, és ami miatt ezek a területek hajlamosak az epileptikus aktivitás generálására. A moharost sarjadzás során azonban nem csak epileptogén, hanem antiepileptogén folyamatok is lejátszódhatnak Ilyen például GABAerg interneuronok fokozott beidegzése a moharost kollaterálisok által. 1
A moharost sarjadzás nem csak a pozitív visszacsatolás létrehozásán keresztül befolyásolhatja a gyrus dentatus excitabilitását. A moharostok nagy koncentrációban tartalmaznak cinket, amely szinaptikusan, aktivitásfüggıen ürül a glutamát neurotranszmitterrel együtt. A cinknek összetett hatása van a szinaptikus transzmisszióra a gyrus dentatusban: egyrészt a GABA A receptorokat gátolja, ez epileptogén hatás; másrészt az NMDA receptorokat is gátolja, ez antiepileptogén hatás. Temporális lebeny epilepsziában azt is leírták, hogy a GABA A receptorok cink érzékenysége megnövekedik, vagyis a cink epileptogén hatása fokozottan érvényesülhet. Ebben a kísérletsorozatban a moharost sarjadzás funkcionális következményeit vizsgáltuk elektrofiziológiai, fotostimulációs, farmakológiai és hisztológiai módszerekkel a pilokarpin kiváltotta temporális lebeny epilepszia modellben, patkányokban. Hisztológiai módszereket alkalmazva megállapítottuk, hogy a caudális (ventrális) hippokampusz gyrus dentatus molekuláris rétegében még egészséges állatokban is megfigyelhetık cinket tartalmazó moharostok, bár csak nagyon kis számban. Elektrofiziológiai és fotostimulációs méréseink ezzel összhangban bizonyították, hogy epileptikus tüneteket nem mutató állatokban is létrejönnek szemcsesejt szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok, de csak alacsony valószínőséggel. Moharost sarjadzás során epileptikus állatokban ezeknek a kapcsolatoknak a valószínősége drasztikusan megnı. Epileptikus állatokban a moharost - szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok fiziológiai valamint farmakológiai tulajdonságai ugyanolyanok, mint kontroll állatokban, valamint nagyon hasonlóak a moharost CA3 piramissejt kapcsolatokhoz. Kísérleti rendszerünkben nem láttuk annak semmi nyomát, hogy a moharostokból szinaptikusan ürülı cinknek bármilyen hatása lenne a posztszinaptikus GABA A receptorokra a szemcsesejteken. Ezzel szemben megállapítottuk, hogy a moharostokból ürülı cink gátolja a posztszinaptikus NMDA receptorokat, vagyis valószínőleg antiepileptogén hatású. Ezek a vizsgálatok jelentısen kiterjesztették ismereteinket a moharost sarjadzás jelenségével kapcsolatban, megerısítették azt a feltételezést, hogy ennek a folyamatnak az eredményeként funkcionális pozitív visszacsatolás jön létre a gyrus dentatusban amely hozzájárulhat a temporális lebeny epilepszia kialakulásához. Vizsgálataink hozzájárultak a moharostok által szinaptikusan ürített cink epilepsziában betöltött szerepének korrekt értelmezéséhez, valamint olyan kísérlet-technikai fejlesztéseket eredményeztek, amelyek megkönnyítik ezeknek a folyamatoknak a késıbbi tanulmányozását. 2
2 BEVEZETÉS 2.1 Epilepszia Epilepszia az agyi infarktus után a leggyakrabban elıforduló neurológiai betegség, a lakosság 0,5 3% - át érinti (Loscher, 2002; Orbán-Kis és mtsai., 2008). Az epilepsziát, mint betegséget az ismétlıdı, spontán jelentkezı epilepsziás rohamok jellemzik. Mindhárom jellemzı megállapítása szükséges az epilepszia diagnózisához (Janszky és Szőcs, 2002). Tüneteit és okait tekintve az epilepszia nem kezelhetı egységes betegségként, bár a különféle epilepsziás tünetegyütteseknek van számos közös sajátossága, mint például az epileptiform elektroenkefalogram (EEG) megjelenése, valamint a visszatérı, többé-kevésbé azonos formában zajló, hirtelen kezdıdı és végzıdı rohamok (Orbán-Kis és mtsai., 2008). Az epilepszia kialakulásának oka valamilyen agyi rendellenesség (metabolikus, neurokémiai, anatómiai vagy fiziológiai), amelynek eredményeként nagyszámú idegsejt kórosan túlfokozott szinkronizált aktivációja jön léte (Fisher és mtsai., 2005). Az epilepsziás tünetegyütteseket sokféleképpen csoportosíthatjuk: eredet szerint (örökletesek, vagy szerzett agykárosodás következtében alakultak ki); klinikai tüneteik alapján; az EEG alapján, az epileptikus fókusz lokalizációja alapján vagy az elsı roham jelentkezésének idıpontja szerint; 1. ábra). 1. ábra. Az epilepsziás tünetegyüttesek kétdimenziós osztályozása (Halász, 1997). Az epilepsziás rohamokat megkülönböztethetjük az alapján, hogy az agy egészére (generalizált), vagy annak csak egy részére (parciális vagy fokális) terjed ki. A parciális rohamokat tovább csoportosíthatjuk annak alapján, hogy öntudatvesztéssel járnak-e 3
(komplex parciális roham), vagy sem (egyszerő parciális roham). A generalizált rohamokat fı tüneteik alapján különböztetjük meg (absence, myoklónusos, klónusos, tónusos, tónusosklónusos rohamok), ezek mindegyike tudatvesztéssel jár. Az epilepsziát kiváltó ok lehet idiopathikus (valószínőleg genetikai, de nem ismerjük), szimptomatikus (ismert agysérülés, vagy betegség), és kriptogenikus (feltételezett lézió). Az idiopathikus epileptikus szindrómák gyakran jelentkeznek gyerekkorban, ilyen például a gyerekkori vagy ifjúkori absence epilepszia, de ezek a kor elıhaladtával gyakran maguktól elmúlnak. Az epilepszia gyógyszeres kezelése részben megoldott, a betegek 75-80%-a elıbb vagy utóbb rohammentessé válik a megfelelı antiepileptikumok hatására. A gyógyszerrezisztens betegek 30-40%-nál mőtéti kezelés szünteti meg a rohamokat (Cascino, 1994; Janszky és Szőcs, 2002). A gyógyszeres kezelés viszonylagos hatékonysága bizonyos értelemben félrevezetı, ugyanis a gyógyszerek nem az epilepszia okát szüntetik meg, hanem csak a tüneteit, vagyis a betegek hosszú ideig, gyakran életük végéig kezelésre szorulnak. Az epileptikus roham bármikori visszatérésének lehetısége, valamint a gyógyszerek súlyos mellékhatásai jelentısen rontják a betegek életminıségét. Az oki kezelés fı akadálya egyrészt az epilepsziás tünetegyüttesek rendkívül széles köre (1. ábra), másrészt az a tény hogy évszázados kutatás után az epileptikus rohamok kialakulásának okait még mindig nem ismerjük elegendı részletességgel (Orbán-Kis és mtsai., 2008). Az 1. táblázat jobb oldala foglalja össze az epilepszia kezelésére leggyakrabban használt vegyületek klinikai hatékonyságát különféle epilepsziás tünetegyüttesekben. 2.2 Temporális lebeny epilepszia Temporális lebeny epilepszia (TLE) a leggyakoribb és talán legjelentısebb parciális epilepsziás tünetegyüttes (Halász és Fogarasi, 2006). A TLE definíciója egyrészt magában foglalja, hogy a pacemaker és/vagy szimptomatogén zóna a temporális lebenyben van, másrészt azt, hogy az epilepszia kialakulásának oka ismert (vagy legalábbis feltételezett). Vagyis a TLE definíció nem csak lokalizációra utal, hanem megjelöli a patomechanizmust és a kórlefolyást is. A TLE klinikai jellemzıit a 2. ábra összegzi. 4
2. ábra. A temporális lebeny epilepsziás szindróma klinikai jellemzıi (Janszky és Szőcs, 2002). Lokalizáció szerint megkülönböztetünk mediális és laterális TLE szindrómát (Halász és Fogarasi, 2006; Sharma és mtsai., 2007). Felnıtt korban a mediotemporális epilepszia sokkal gyakoribb (az összes epilepsziás eset 50-60%-a ide sorolható), és ez a tünetegyüttes, amelyben a hippokampusz amygdala együttes játszik meghatározó szerepet, valamint a rohamok kiterjedhetnek az egész limbikus rendszerre (3. ábra). 3. ábra. Temporális epilepsziás roham foramen ovale (alsó elvezetésekkel) és skalp elektródákkal regisztrált EEG-képe. Jól látható, hogy a roham a mediotemporális struktúrákból indul, és csak késéssel jelenik meg a felszíni elektródákban (Halász és Fogarasi, 2006). 5
Laterális TLE gyermekkorban gyakoribb és általában fejlıdési rendellenesség vagy daganat okozza. A mediotemporális epilepszia a betegek többségénél visszavezethetı valamilyen elsıdleges agysérülésre / eseményre, mint például gyermekkori lázgörcs, státusz epileptikusz, agyhártyagyulladás, vagy trauma, amely következtében létrejövı funkcionális változások az agyban egy hosszú látens periódus (5-10 év) után a spontán rohamok megjelenéséhez vezetnek (Sharma és mtsai., 2007). A betegek kb. 70-80%-ban figyelhetı meg hippokampális lézió, amelyet általában neuronális degeneráció, asztrogliózis, szemcsesejtek diszperziója, aberráns moharost sarjadzás jellemez (A moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában lévı szemcsesejtek axonjainak az újrarendezıdése; (Babb és mtsai., 1991; Meldrum, 1991; Sloviter, 1994; Sutula és mtsai., 2003). Mivel a hippokampusz egyoldali mőtéti eltávolítása hatékonyan meggátolja a rohamok kialakulását (Spencer, 2002), valamint mivel a betegek nagy részénél megfigyelhetı a hippokampális lézió, ezért általánosan elfogadott az a nézet, hogy a hippokampusz központi szerepet tölt be az epilepsziás rohamok kialakulásában mediotemporális epilepsziában. A hippokampusz központi szerepe elfogadott, de a rohamok kialakulásában szerepet játszó többi agyterület, valamint az azok funkciójában / anatómiájában / fiziológiájában a temporális lebeny epilepszia kialakulása során bekövetkezett változások szerepe a spontán rohamok létrejöttében még ma is erısen vitatott. A 4. ábra az epileptikus rohamok kialakulásában szerepet játszó agyterületeket, azok valószínő funkcióját foglalja össze. Nyilvánvaló, hogy még a legegyszerőbb modellben is több agyterület kölcsönhatására és egy visszacsatolási hurokra van szükség a rohamok kialakulásához. Számos, egymást kiegészítı, de az epilepszia kialakulásához vezetı változások különbözı aspektusait kihangsúlyozó elmélet született a rohamok keletkezési mechanizmusáról mediotemporális epilepsziában (Sharma és mtsai., 2007). Általánosságban ezek az elméletek a hippokampusznak a limbikus rendszerben betöltött különleges szerepét, valamint a rekurrens excitációban és gátlásban bekövetkezı változásokat hangsúlyozzák. Mediotemporális epilepsziában megfigyelt változások: 1) Csökken a GluR2 glutamát receptor alegység expressziója a hippokampuszban, aminek következményeképpen megnövekedhet az ionotróp glutamát receptor Ca 2+ permeabilitása, növekedhet a sejtek excitabilitása, valamint azt is kimutatták, hogy a GluR2 expresszió gátlása sejtpusztulást / degenerációt okoz (Sanchez és mtsai., 2001; Gashia és mtsai., 2007). 2) Megváltozott GABA A subunit expresszió a hippokampuszban, amely csökkent rekurrens gátláshoz vezethet (Poulter és mtsai., 1999; Loup és mtsai., 2000) 3) Moharost 6
sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában, amely egy excitátoros pozitív visszacsatolást hoz létre (Okazaki és mtsai., 1999) 4) A mohasejtek epilepsziában bekövetkezı pusztulása miatt a feed back gátlás kevésbé mőködik a hippokampuszban. A mohasejtek fı bemenetei a moharostok. Mivel a mohasejtek fıleg gátló interneuronokon képeznek excitátoros szinaptikus kapcsolatokat pusztulásuk elviekben csökkenti a feed-back gátlást (csendes kosársejt elmélet) (Lothman, 1992; Sloviter és mtsai., 2003) Késıbbi kísérletekben nem találtak ilyen egyértelmü kapcsolatot a mohasejtek pusztulása és a gyrus dentatus excitabilitása között (Ratzliff és mtsai., 2004). 4. ábra. Mediális temporális lebeny epilepszia (MTLE) funkcionális anatómiájának sematikus vázlata. A: A hagyományos modellben a rohamok az enthorhinális kortexbıl valamint a hippokampusz gyrus dentatusából és CA1 területébıl álló visszacsatolásos (reverberating) hurokban keletkeznek. Egy bizonyos ponton az epileptikus aktivitás átterjed az amigdalára és más határos területekre mielıtt a neokortex bevonásával másodlagos generalizáció jönne létre. B: Újabb eredmények egy alternatív modellt valószínősítenek, amelyben kezdetben számos limbikus terület egymástól függetlenül kölcsönhat egymással. Mivel a középvonali thalamusz magok kölcsönös kapcsolatban állnak mindezekkel a területekkel ezért szerepet játszhatnak a rohamok keletkezésében és szubkortikális szinkronizációs funkciót láthatnak el. A generalizáció történhet a rohamok fokozatos átterjedésével a határos neokortexre vagy a thalamuszon keresztül a neokortex másodlagos bevonásával. DG: gyrus dentatus; EC: entorhinális kortex; HC: hippokampusz (Schwarcz és mtsai., 2002). A mediotemporális epilepszia (MTLE) gyógyszeres kezelése csak részben hatékony, a betegek kb. 30-50%-a rezisztens mindenféle gyógyszeres beavatkozásra. Talán még nagyobb probléma, hogy a kezelés csak tüneti, mivel fı célja az epileptikus rohamok 7
megszüntetése, valamint az ezekbıl adódó másodlagos sérülések megakadályozása (Halász, 1997; Halász és Fogarasi, 2006; Loscher és Schmidt, 2006; Nehlig, 2007). A MTLE elsı ajánlott gyógyszere még mindig a karbamazepin (Halász és Fogarasi, 2006), egy nátrium csatorna blokkoló, amelynek csatorna blokkoló hatékonysága függ az idegsejtek membránpotenciáljától (depolarizált sejtekre magasabb), vagyis a normális neuronális aktivitást viszonylag nem befolyásolja, de a fokozott (kóros) aktivitást hatékonyan gátolja. Ha a karbamazepin egy betegnél nem bizonyul hatékonynak, egy másik antiepileptikummal kell kiegészíteni, ami sok esetben a clobazam, egy benzodiazepin származék (növeli az agyi gátló GABAerg transzmissziót). Ha ez sem hatékony, számos más antiepileptikumot ki lehet próbálni, de a siker esélye minden próbálkozással egyre kisebbé válik. Az új fejlesztéső antiepileptikumok legfıbb elınye a jelentısen kisebb mellékhatások. A 3. táblázat utolsó oszlopa illusztrálja a MTLE kezelésére leggyakrabban használt gyógyszerek hatékonyságát. A gyógyszeres kezelés sikertelensége után a mőtéti beavatkozás következhet, ami MTLE esetén talán a leghatásosabb, akár 80-85%-os is lehet. A mőtéti kezelés tulajdonképpen a roham kialakulásában központi szerepet játszó visszacsatolásos hurok megszakítását szolgálja és általában elülsı temporális lobectomiát vagy amygdalo-hippocampectomiát foglal magába (Halász és Fogarasi, 2006). 2.3 Állatmodellek az epilepszia kutatásában A minél relevánsabb és magasabb prediktív értékő állatmodellek kialakítása központi jelentıségő az epilepszia (és a farmakológiai) kutatás számára. Egy ideális állatmodell nem csak a betegség tüneteit reprodukálja, de annak okát, kialakulásának mechanizmusát is. Emellett magas a prediktív értéke, vagyis helyesen jósolja meg a vegyületek klinikai hatékonyságát (Ribak és mtsai., 1998; Hosford, 1999; Orbán-Kis és mtsai., 2008). A klinikában használt antiepileptikumok döntı többségét akut epilepszia tesztekre alapozva fejlesztették ki. Egy akut epilepszia tesztben valamilyen behatással (ez lehet kémiai, pld. pentilentetrazol (PTZ) adminisztráció vagy maximális elektrosokk (MES) teszt) epilepsziás rohamot váltanak ki állatokban (legtöbbször egerekben, bár fıemlısökön is tanulmányozták már az epilepszia kialakulását /Ribak 1998/) és a vegyületek hatékonyságát ezen rohamok kivédésén mérik. Nyilvánvaló, hogy ezek a tesztek az epilepsziás állapot kialakulását egyáltalán nem modellezik, s ennek folytán az ezeken a teszteken kifejlesztett gyógyszerek csak tüneti kezelésre alkalmasak (Loscher és Schmidt, 2006). 8
Antikonvulzáns aktivitás Klinikai hatékonyság Állatmodelleken Vegyület MES teszt PTZ teszt Amygdala kindling Parciális rohamok Generalizált rohamok Tónusos- Absence Myoklónusos Klónusos Karbamazepin + NH + + + NH NH Phenytoin + NH + + + NH NH Phenobarbital + + + + + NH + Primidon + + + + + NH + Valporat + + + + + + + Benzodiazepin + + + + + + + Ethosuximid NH + NH NH NH + ± Lamotrigin + NH + + + + + Topiramat + NH + + + ± + Oxcarbazepin + ±? + +?? Felbamat + + + + + ± + Vigabatrin NH + + +? NH NH Tiagabin NH + + + + NH NH Gabapentin ± ± + +? NH NH Levetiracetam NH NH + +??? Zonisamid + + + + + + + NMDA Ant. + + NH NH??? 1. táblázat. A leggyakrabban használt antiepileptikumok állatmodelleken, valamint az epilepszia különbözı típusaiban klinikai vizsgálatokban mért hatékonyságának összehasonlítása. MES: maximális elektrosokk, PTZ: pentilentetrazol, + : hatékony, (±) : részben hatékony, NH: nem hatékony,?: nincs adat (Loscher, 2002). Az idık folyamán számos krónikus epilepszia modellt is kifejlesztettek, amelyek az epilepszia kialakulásának, az agyban bekövetkezett változásoknak különbözı aspektusait emelik ki. A leggyakrabban használt ilyen modell a kindling, ahol a hippokampusz vagy az amygdala elektromos stimulálásával ismétlıdı (egyre könnyebben elıhívható) rohamokat váltanak ki (Sato és mtsai., 1990; Loscher, 2002), valamint a pilokarpinnal vagy kaináttal kiváltott státusz epileptikusz, mely hatására spontán rohamokkal jellemezhetı epileptikus állapot jön létre (Sharma és mtsai., 2007; Curia és mtsai., 2008; Williams és 9
mtsai., 2009). Az 1. táblázat összegzi a klinikumban használt antiepileptikumok hatékonyságát a különbözı akut és krónikus állatmodelleken valamint a különbözı típusú epileptikus tünetegyüttesekben.megfigyelhetı, hogy a krónikus modell (kindling) prediktív értéke nagyon jó a parciális rohamok (MTLE) esetén, megfelelı a generalizált epilepsziák közül a tónusos-klónusos rohamokra és egyáltalán nem megfelelı az absence vagy myoklónusos rohamokra. Ennek az az oka, hogy a kindling, a kainát és a pilokarpin modell elsısorban az elsıdleges neuronális sérülés / státusz epileptikusz után kialakuló temporális lebeny epilepsziát modellezi. Szimptómás epilepszia modellek Elektromos stimulálással kiváltott Kémiai indukcióval kiváltott Idiopátiás epilepszia modellek Spontán mutációk különbözı állatfajokban Indukált mutációk egerekben Kindling Epilepszia az elektromos stimulálással kiváltott státusz epileptikusz után alakul ki Pilokarpin, Kainát modellek Epilepszia a kémiai vegyülettel kiváltott státusz epileptikusz után alakul ki Mutáns állat kiváltható rohamokkal (hang, fény) Mutáns állat spontán rohamokkal Transzgén vagy knock-out egér 2. táblázat. Krónikus epilepszia modellek (Loscher, 2002). Az is megfigyelhetı, hogy az akut modellek prediktív értéke alacsony. Azokra az epilepsziás tünetegyüttesekre, ahol az epilepszia kialakulásának oka pontosan nem ismert, nagyon nehéz okozati állatmodellt kifejleszteni. Ilyen esetekben gyakran a véletlen siet a segítségünkre egy olyan állattörzs azonosításával, amely valamilyen genetikai rendellenesség miatt produkálja a megfelelı tüneteket [ilyen pld. a WAG/Rij modell absence epilepsziára (Coenen és van Luijtelaar, 2003)] vagy pedig fáradtságos munkával az epileptikus tünetegyüttes okát feltételezve genetikai módosításokkal hozunk létre egy megfelelı modellt (Hosford, 1999; Gurbanova és mtsai., 2006; van Luijtelaar és Sitnikova, 10
2006; Polack és mtsai., 2007). A 2. táblázat foglalja össze a leggyakrabban használt krónikus epilepszia modelleket. 2.4 Egyszeri pilokarpin kezelés által kiváltott státusz epileptikusz krónikus hatásai - Temporális lebeny epilepszia modell Pilokarpin az acetilkolin muscarin típusú receptorának agonistája. Már korán megfigyelték, hogy kolinerg agonisták, köztük pilokarpin adása epileptikus rohamokat, státusz epileptikuszt vált ki kísérleti állatokban (Turski és mtsai., 1989). Azonban ez a modell a pilokarpin kezelésnek nem az akut, hanem a krónikus hatásai miatt kapott kitüntetett szerepet. Az akut pilokarpin kezelés által kiváltott, elhúzódó generalizált epileptikus roham ugyanis olyan maradandó változásokat / sérüléseket okoz az agyban, amelyek hatására (egy kezdeti tünetmentes szakasz után) krónikus epilepszia alakul ki, melyet az idırıl idıre jelentkezı parciális komplex rohamok jellemeznek (Curia és mtsai., 2008). A patkányban pilokarpinnal kiváltott krónikus epilepsziás állapotot azért tartják a humán temporális lebeny epilepszia (TLE) egyik talán legjobb modelljének, mivel nagymértékben reprodukálja annak nemcsak a fiziológiai és hisztopathológiai tüneteit, de kialakulásának folyamatát is, valamint az antiepileptikus szerek hatékonysága ezen a modellen jól korrelál a vegyületek klinikailag használt dózisaival (3. táblázat; Leite és mtsai., 2002; Loscher, 2002; Curia és mtsai., 2008). A gyógyszerek hatékonysága a kindling modellen is jól korrelál a klinikai dózisokkal, de meg kell jegyezni, hogy a kindling esetén kiváltott rohamokon, míg a pilokarpin esetén spontán rohamokon mérik a vegyületek hatását. Az utóbbi közelebb áll a humán epilepszia modellhez. A humán temporális lebeny epilepsziának a fı jellemzıi, hogy 1) az epileptikus fókusz a limbikus rendszerben található, különösen a hippokampuszban, entorhinális kéregben vagy az amigdalában, 2) az epilepszia kialakulása gyakran valamilyen fizikai sérülésre vezethetı vissza 3) jellemzı egy tünetmentes látens periódus közvetlenül az eredeti sérülés után 4) jelentıs hippokampális szklerózis figyelhetı meg, különösen a szubikulum-ca1 valamint a hilus dentatus területén (Mathern és mtsai., 1996; Morimoto és mtsai., 2004; Curia és mtsai., 2008). 11
Vegyület Kindling Krónikus poszt-státusz epileptikusz modell Parciális Pilokarpin Kainát SAS epilepszia Phenytoin + +?? + Karbamazepin + +? (+) + Phenobarbital + + (+)? + Valporat + + + + + Gabapentin +? +? + Levetiracetam + +?? + Lamotrigin +?? (+) + Ethosuximid NH NH? NH NH 3. táblázat. A leggyakrabban használt antiepileptikumok hatékonysága állatmodelleken, valamint parciális epilepsziában. + : hatékony, (+) : részben hatékony, NH: nem hatékony,?: nincs adat. SAS: hosszantartó amygdala stimuláció (Loscher, 2002). Patkányokban az akut pilokarpin kezeléssel kiváltott státusz epileptikusz konzekvensen, szinte 100%-ban epilepsziához, ismétlıdı rohamokhoz vezet (5. ábra; (Morimoto és mtsai., 2004; Curia és mtsai., 2008). Ezek a rohamok az akut pilokarpin kezelés után néhány hetes késéssel (4-tıl 44 nap, átlag 14,8 ± 3 nap; csendes periódus) jelentkeznek elıször, hasonlóan az agysérülés vagy státusz epileptikusz által kiváltott humán temporális lebeny epilepsziában tapasztalható több éves nyugalmi periódushoz (6. ábra) (Cavalheiro, 1995; Coulter és mtsai., 1996; Arzimanoglou és mtsai., 2002; Leite és mtsai., 2002; Epsztein és mtsai., 2006). 12
5. ábra. Epileptikus rohamok humán mediális temporális lebeny epilepsziában és annak patkány modelljeiben: a megváltozott neuronális fiziológia illusztrálása. A kísérleti állatokban a krónikus epilepsziát vagy kemokonvulzánssokkal (pilokarpin) vagy hosszantartó elektromos stimulációval (kindling) váltották ki. A: Kétoldali EEG mérés a hippokampuszból (LH, RH) és az amigdalából (LA, RA) patkányon (A 1 ) és emberen (A 2 ). Mindkét terület részt vesz a roham indításában, ami egy külsı szinkronizációs terület létét valószínősíti. A humán mérésen megfigyelhetı a bal hemiszféra késıbbi, de regionálisan egyidejő aktivációja. Ez az idıkülönbség nem látható a patkány méréseknél, valószínőleg az agyféltekék közötti erısebb kapcsolat következménye. B: Intracelluláris mérések egészséges és epileptikus patkányok hippokampuszából és amigdalájából. Mindkét agyterületen egy rövid, (0,1 ms) elektromos stimuláció az epileptikus állatokban a neuronok elnyúló depolarizációját és többszörös akciós potenciálokat váltott ki, ami a kontroll állatokban nem volt megfigyelhetı. C: Az entorhinális kérgen végzett intracelluláris mérések szintén elnyújtott depolarizációt és többszörös akciós potenciálokat mutatnak (Schwarcz és mtsai., 2002). Az intraperitoneálisan adott pilokarpin akut hatásait az acetilkolin M1 muszkarin típusú receptorain hatva fejti ki, ugyanis a rohamok és a státusz epileptikusz kifejlıdését az M1 antagonisták gátolják (Cavalheiro és mtsai., 1991; Cavalheiro, 1995), a státusz epileptikusz kifejlıdése után azonban a rohamot már nem lehet kolinerg szerekkel befolyásolni, ilyenkor leginkább glutamát antagonisták vagy GABA agonisták hatásosak. 13
6. ábra. Pilokarpin kezelés akut és krónikus hatásainak idıbeli lefutása. Intraperitoneálisan adott pilokarpin (380 mg/kg) patkányokban státusz epileptikusz kialakulásához, valamint kiterjedt strukturális agykárosodáshoz vezet az akut szakaszban. A csendes szakasz folyamán az EEG és az állatok viselkedése normalizálódik, de ez a szakasz az elsı spontán epileptikus roham megjelenésével végzıdik. A krónikus szakaszra a spontán ismétlıdıen jelentkezı komplex parciális rohamok jellemzık (Cavelheiro, 1991). 2.4.1 Pilokarpin által kiváltott státusz epileptikusz akut hatásai kiterjedt sejtpusztulás a hippokampuszban, amigdalában, thalamuszban, szaglókéregben, neokortexben és a substancia nigrában Egyszeri pilokarpin vagy kainát kezelés hatására patkányokban státusz epileptikusz (SE) alakul ki, amely akár 6-12 órán keresztül is tarthat, és ennek következtében az állatok 30% a is elpusztulhat. Az ezután következı 10-24 órában a roham intenzitása fokozatosan gyengül míg végül is az EEG aktivitás normalizálódik. Az állatok kímélése érdekében krónikus kísérletekben a SE idıtartalmát általában limitálják a generalizált roham kifejlıdése után 3-4 órával phenobarbitál adásával. A hosszantartó státusz epileptikusz jelentıs és számos agyterületre kiterjedı sejtpusztulást okoz az agyban (7. Ábra; (Liu és mtsai., 1994; Du és mtsai., 1995; Houser és Esclapez, 1996; Mello és Covolan, 1996; Fisher és mtsai., 1998; Sankar és mtsai., 1998; Covolan és Mello, 2000; Covolan és mtsai., 2000; Wu és mtsai., 2007; Deshpande és mtsai., 2008). A sejtpusztulás ultrastruktúrális szerkezete hasonló ahhoz, amit embereknél írtak le agysérülést követı epilepsziában (Cavalheiro, 1995). Jellemzı rá a neuronok dendritjeinek és sejttestjeinek duzzadása (swelling), valamint az asztroglia duzzadása. A leginkább érintett agyterületek a hippokampusz, a thalamusz, amygdala, piriform kortex, entorhinal kortex, neocortex, substancia nigra, de még a kisagyban is leírtak jelentıs sejtpusztulást (Correia és mtsai., 1998; Dinocourt és mtsai., 2003; Druga és mtsai., 2005; Faria és mtsai., 2005; Chen és mtsai., 2007). A sejtpusztulás szelektív, bizonyos jól elkülönülı sejttípusokat érint, mint például a mohasejteket a gyrus dentatus hilusában. A pilokarpinnal vagy kaináttal kiváltott SE által okozott sejtpusztulás nagyon hasonló területi mintázatot mutat, bár megfigyeltek 14
szignifikáns különbségeket is, elsısorban a sejtpusztulás mértékében és idıbeli lefutásában (7. ábra; Covolan és Mello, 2000). 7. ábra. Ezüst impregnációs technikával (Gallyas féle módszer, sérült neuronok festıdnek, de nem mindegyik pusztul el) láthatóvá tett sérült idegsejtek az agy különbözı területein pilokarpinnal vagy kaináttal kiváltott státusz epileptikusz után. A, B, C, D: Sejtpusztulás idıbeli lefutása a hippokampuszban. 2,5 órával a státusz epileptikusz (SE) kiváltása után erıs festıdés figyelhetı meg a gyrus dentatusban (DG) és a hilusban, gyengébb festıdés a CA1-ben és a CA3-strátum oriensben. 8 órával SE után erıs festıdés a CA1-ben és a CA3a piramissejt rétegben valamint a gyrus dentatusban. 24 órával SE után festıdés a CA1, CA3a és DG területeken. 48 órával a SE után már csak gyenge festıdés figyelhetı meg a DG hilusában. E, F, G, H, I, J: Pilokarpin és kainát által indukált SE kiváltotta sejtpusztulás területi eloszlása patkány agyban 8 órával a SE után. Sematikus diagramm. E, F: 2,6 mm-re; G, H: 3,25 mm-re; I, J: 5,65 mm-re a Bregmától kaudálisan. Fekete szín jelöli az erısen, szürke a közepesen és világosszürke a gyengén festıdött területeket (Covolan és Mello, 2000). Ez a hasonlóság a különbözı mechanizmussal kiváltott SE következményeiben, valamint az a tény, hogy SE nélkül pilokarpin nem okoz agykárosodást azt sugallják, hogy az agykárosodás elsıdleges oka maga a SE és nem a kiváltására alkalmazott kemokonvulzáns. Covolan és munkatársai (2006) megmutatták, hogy az elsı státusz epileptikuszt követı újabb SE rohamok már nem járnak további jelentıs sejtpusztulással vagy azért mivel az elsı roham során az arra hajlamos sejtek már elpusztultak, vagy pedig azért, mivel az elsı SE után olyan folyamatok játszódnak le az agyban amelyek gátolják a további 15
sejtpusztulást az epileptikus rohamok során (Gorter és mtsai., 2003; Covolan és Mello, 2006). Más szerzık azt állapították meg, hogy a rekurrens epilepsziás rohamok további sejtpusztulást okoznak (összhangban az epilepszia progresszív természetével), bár messze nem olyan mértékőt, mint az elsı SE (Mello és Covolan, 1996). 2.4.2 A csendes szakasz szerepe neuronális változások, szinaptikus reorganizáció, amely során krónikus epilepszia alakul ki A státusz epileptikusz lezajlása után a csendes szakaszban (~ 14 nap; 6. ábra) a pilokarpinnal kezelt állatok általában normális viselkedést és EEG aktivitást mutatnak. Ez a szakasz azonban egyáltalán nem eseménymentes, ekkor történnek azok a változások az agyban amik végül is a krónikus epileptikus állapot kialakulásához vezetnek (Curia és mtsai., 2008). Mivel még most sem tudjuk pontosan, hogy ezek közül az események közül melyik jelentıs az epilepszia kialakulása szempontjából, mindegyik jelenség intenzív kutatás tárgya. A pilokarpin által kiváltott sejtpusztulás szelektív, bizonyos sejttípusok szinte teljesen eltőnnek; például a mohasejtek a gyrus dentatus hilusában szinte mind elpusztulnak a hosszan tartó státusz epileptikusz eredményeként. A mohasejtek fontos szerepet játszanak feed-back gátlásban a hippokampuszban, mivel fı bemenetüket a moharostok képezik, bár kismértékben kaphatnak beidegzést a perforáns pálya felıl is (feltételezett feed-forward gátlásban betöltött szerep; Amaral és mtsai., 2007). Mivel a mohasejtek fıleg gátló interneuronokon képeznek excitátoros synaptikus kapcsolatokat, pusztulásuk csökkenti a feed-back (és talán a feed-forward) gátlást (Lothman, 1992; Sloviter és mtsai., 2003; Ratzliff és mtsai., 2004). Meglepı, hogy a központi idegrenszer képes hiányukat szinte teljesen kompenzálni (Silva és Mello, 2000; Santhakumar és mtsai., 2005; Kang és mtsai., 2006). Egyes szerzık szerint (Stief és mtsai., 2007) SE a túlélı GABAerg interneuronok morfológiájában is permanens változást okoz a hippokampuszban, de ezeknek a változásoknak a funkcionális hatásai nem ismertek. A csendes szakasz folyamán zajlik le a moharost sarjadzás jelensége, ahol a szemcsesejtek axonjai rekurrens kollaterálisokat növesztenek és egy pozitív visszacsatolási hurkot hoznak létre azáltal, hogy önmagukkal szinaptikus kapcsolatokat létesítenek (Tauck és Nadler, 1985; Mello és mtsai., 1993; Okazaki és mtsai., 1995; Molnar és Nadler, 1999; Okazaki és mtsai., 1999; Scharfman és mtsai., 2003). Ilyen szinaptikus átrendezıdést más agyterületeken is megfigyeltek, például a hippokampusz CA1 (Esclapez és mtsai., 1999; Lehmann és mtsai., 2000; Lehmann és mtsai., 2001) és CA3 (Siddiqui és Joseph, 2005) 16
területén (8. ábra), a thalamuszban (Drummen és mtsai., 1999), a neokortexben (Sanabria és mtsai., 2002), és a kisagyban (Faria és mtsai., 2005). 8. ábra. Aberráns szinaptikus kapcsolatok létrejötte a hippokampuszban a krónikus epilepszia kifejlıdése folyamán. Sematikus, egyszerősített ábra. A kísérletben fluoreszcens festékkel feltöltött axonok növekedését követték. A moharost sarjadzáson kívül megfigyelhetı a CA3 retrográd innervációja a CA1 irányából, visszacsatolás létrejötte a CA1-ben, a CA1 sejtek retrográd innervációja a subiculum felıl valamint a megnövekedett kapcsolat a gyrus dentatus és a subiculum között (szaggatott vonal). (Lehmann és mtsai., 2001) alapján módosítva. Az ábrán nem szerepel a nem epileptikus állatokban is megfigyelhetı CA3 DG / Hilus kapcsolat, a Subiculum EC kapcsolat, valamint a Subicularis Complex, amely újabb eredmények szerint jelentıs szerepet tölt be az epileptikus rohamok kialakulásában. A szinaptikus pályák átrendezıdésének megfigyelését nehezíti, hogy általában, a moharostok kivételével, amelyek cinket tartalmaznak és ezért Timm-féle festési eljárással jól megjeleníthetık, nincs rájuk könnyen végrehajtható specifikus festési eljárás. Az sem világos, hogy a szinaptikus átrendezıdésnek mi a szerepe az epilepszia kifejlıdésében és fenntartásában, ugyanis az új pályák, attól függıen, hogy milyen sejten végzıdnek, egyaránt erısíthetik a serkentı, valamint a gátló mechanizmusokat a különbözı agyterületeken. 17
Státusz epileptikusz hatására drasztikus módon felgyorsul a neurogenezis a hippokampusz gyrus dentatus területén (Parent és mtsai., 2006; Curia és mtsai., 2008) (9. és 10. Ábrák). Sokáig azt tartották, hogy a neuronok a felnıtt központi idegrendszerben nem újulnak meg, új neuronok egy bizonyos kor után már nem születnek. A gyrus dentatus az egyik olyan agyterület, ahol neuronális progenitorsejtekbıl még képzıdnek neuronok, de ez a folyamat olyan lassú, hogy jelentıségét az idegrendszer regenerációjában sokáig vitatták. 9. ábra. Neurogenezis és neuron vándorlás a hippokampuszban pilokarpinnal kiváltott SE után. Az újonnan született szemcsesejteket bromodeoxyuridine (BrdU) nel jelölték. A-F: Gyrus dentatuson keresztül futó koronális szekciók pilokarpinnal kezelt (B, D, F) és kontroll állatok (A, C, E) esetén. BrdU adminisztráció a pilokarpin kezelés utáni 7. napon történt; a metszeteket a 9.,14. és 35. napon készítették. Jól megfigyelhetı a neurogenezis felgyorsulása a SE után, valamint az újonnan született sejtek aberráns vándorlása a hilusban. Pilokarpinnal kezelt állatokban az újonnan született szemcsesejtek a hilusba vándorolnak. G, H: A hilusban megfigyelhetı új szemcsesejtek száma kontroll és epileptikus állatokban kétféle módszerrel megfestve (BrdU és Prox-1 expresszió; (Parent és mtsai., 2006). Annak a felfedezése, hogy sérülés (pld. SE) után ez a folyamat drasztikusan felgyorsul, új lehetıségeket nyitott meg az idegrendszer regenerációs képességének gyógyszeres fokozásához. A SE hatására újonnan született szemcsesejtek fiziológiai szerepe intenzív kutatás tárgya (Parent és mtsai., 1997; Parent és mtsai., 1999; Covolan és mtsai., 2000; Scharfman és mtsai., 2000; Parent, 2002; Radley és Jacobs, 2003; Overstreet- Wadiche és mtsai., 2006; Parent és mtsai., 2006; Pierce és mtsai., 2007; Scharfman és mtsai., 2007; Shapiro és mtsai., 2007). Egyrészt hiperexcitabilitásuk, aberráns elhelyezkedésük és szinaptikus kapcsolataik miatt hozzájárulhatnak az epileptikus rohamok 18
kialakulásához, másrészt bizonyos mértékben átvehetik az elpusztult mohasejtek szerepét a rekurrens / feed-forward gátlás folyamatában. 10. ábra. Epileptikus roham által kiváltott neuro- és gliagenezis patkány hippokampuszban. Az új sejtek a gyrus dentatus szemcsesejt rétegének (dgc) hilus felé esı oldalán (1) születnek és normál esetben a szemcsesejt rétegbe vándorolnak. Pilokarpinnal kiváltott SE után megnövekedett számú szemcsesejt születik, amelyeknek többsége a szemcsesejt réteg belsı oldalán marad és aberráns axonokat küld a szemcsesejt réteg másik oldalára. Más részük aberráns módon kivándorol a hilusba (2). A másik terület az agyban, ahol új sejtek születnek az agykamra (LV) alatt helyezkedik el (3). SE után ezek a sejtek is aberráns módon vándorolnak a CA1 és CA3 területére (4) és nagy valószínőséggel asztrocitává vagy oligodendrocitává differenciálódnak (Parent, 2002). Más kutatók szerint az újonnan született szemcsesejtek szerepe kevésbé jelentıs az epilepszia kialakulásában, egyrészt mivel a szemcsesejtek száma inkább csökken mint növekszik a betegség elırehaladása során, másrészt a szemcsesejtréteg kiszélesedését inkább a reelin hiánya, mintsem az új szemcsesejtek okozzák (Haas és Frotscher, 2009). 2.5 A moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában mint a spontán visszatérı epileptikus rohamok egy lehetséges oka Talán a legnyilvánvalóbb anatómiai változás az agyban, ami humán mediotemporális epilepsziában, valamint annak krónikus állatmodelljeiben (pilokarpin, kainát) megfigyelhetı: a moharost sarjadzás jelensége a hippokampusz gyrus dentatus területén. A pilokarpin modellben a szemcsesejtek axonjai a státusz epileptikuszt követı néhány nap után drámai módon megnövekednek és nagy számban jelennek meg a gyrus dentatus 19
molekuláris rétegében, ahol normális esetben nagyon kevés található belılük (11. ábra; (Golarai és Sutula, 1996b; Wuarin és Dudek, 1996; Okazaki és mtsai., 1999; Blasco-Ibanez és mtsai., 2000). A moharost sarjadzás megfigyelését nagyon megkönnyíti, hogy ezen az agyterületen csak a szemcsesejtek axonjai tartalmaznak cinket, amit Timm-féle festéssel kitőnıen ki lehet mutatni. 11. ábra. Moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában. Fekete: normális szemcsesejt, a szemcsesejt axonja a CA3 piramissejtekkel képez szinaptikus kapcsolatokat. Axon kollaterálisai a gyrus dentatus hilusában interneuronokat idegeznek be. Piros: epileptikus állatból származó szemcsesejt, melynek axonja visszatér a gyrus dentatus molekuláris rétegének belsı harmadába és ott képez szinaptikus kapcsolatokat más szemcsesejtekkel. ML: molekuláris réteg, GCL: szemcsesejt réteg, DH: dentát hilus, DG: gyrus dentatus, CA3: CA3 terület, PCL: piramissejt réteg (Koyama és Ikegaya, 2004). A hippokampusz központi szerepet játszik az epileptikus rohamok kialakulásában mediotemporális epilepsziában (Barbarosie és Avoli, 1997). Ezt EEG mérések, a hippokampális jellegzetes lézió megjelenése valamint a mőtéti beavatkozások sikere egyértelmően jelzik. Az epileptikus rohamok keletkezésére, átterjedésére a limbikus rendszerre és esetleges generalizációjára több elmélet született (4. ábra). Ezekben az elméletekben központi szerepet foglal el a hippokampusz sajátságos szerkezete. (Nagyon) Leegyszerősítve: az információ (neuronális aktivitás) egy irányban, sejtrétegrıl sejtrétegre terjed a hippokampuszban, a gyrus dentatus - CA3 CA1 triszinaptikus jól definiálható pályán keresztül (8. ábra). Az aktivitás a hippokampuszról a szubikulumon keresztül az entorhinális kortexre terjed, ahonnan a perforáns pálya (a hippokampusz fı 20
bemenete) zárja be a visszacsatolásos hurkot. Ennek a pozitív visszacsatolásnak a megléte teszi lehetıvé az epilepsziás rohamok kialakulását és továbbterjedését. Normális esetben azonban nem alakul ki epileptikus aktivitás (a sejtek kóros szinkronizációja). Elektrofiziológiai tulajdonságai alapján a gyrus dentatust tartják a hippokampusz kapuırzıjének (Lothman és mtsai., 1992; Koyama és Ikegaya, 2004). In vivo és in vitro mérések bizonyítják, hogy normál esetben nagyon nehéz epileptikus aktivitást kiváltani a gyrus dentatusban (5. ábra), amit elsısorban az erıs negatív feed-back (Ribak és Peterson, 1991; Acsady és mtsai., 1998) és feed-forward gátlás jelenléte, valamint az excitációs pozitív visszacsatolás (ami pedig jellemzı a hippokampusz más területeire lásd CA1, CA3; (Miles és mtsai., 1984; Traub és mtsai., 1984; Traub és mtsai., 1987; Pan és Stringer, 1996) hiánya magyaráz. A 12. ábra illusztrálja a hippokampusz gyrus dentatusának felépítését, valamint annak a neuronális hálózatnak az elemeit és összeköttetéseit, amelyek ezt a feed-back, feed-forward gátlást, valamint a szinkronizált epileptikus aktivitással szembeni ellenállását biztosítják. Normális esetben a szemcsesejtek a gyrus dentatusban csak lassan, 0,1-1 Hz frekvenciával tüzelnek és szinkronizáció csak akkor következik be, ha az aktivitás ami a perforáns pályán keresztül érkezik az entorhinális kéregbıl abnormálisan magas (Jung és Mcnaughton, 1993; Pan és Stringer, 1996). Státusz epileptikusz hatására a gyrus dentatusban jelentıs anatómiai és fiziológiai változások zajlanak le, amelyek meggyengítik az epileptikus aktivitás terjedésével szembeni ellenállását (5. ábra). A mohasejtek pusztulása jelentısen megváltoztatja a feed-back és a feed forward gátlást a gyrus dentatusban, bár a GABAerg gátlás csökkenése egyáltalán nem olyan nagy mértékő, mint amilyet elméleti meggondolások alapján várnánk (Isokawa, 1996; Magloczky és Freund, 2005). Valószínőleg kompenzációs mechanizmusok kapcsolódnak be, mint amilyen a GABA receptorok expressziójának megnövekedése (Houser és Esclapez, 1996; Fritschy és mtsai., 1999), a GABAerg interneuronok axonjainak sarjadzása (Davenport és mtsai., 1990; Bausch, 2005) valamint a GABAerg interneuronok beidegzése a kiterebélyesedett moharostok által (Ribak és Peterson, 1991; Blasco-Ibanez és mtsai., 2000). 21
12. ábra. A gyrus dentatus neuronális hálózata epilepsziában. A szemcsesejtek a fı bemenetüket a perforáns pályán keresztül kapják. A perforáns pálya az interneuronokat is stimulálja (az excitátoros mohasejteket és a gátló kosár sejteket), ezzel egy feed-forward gátló hurkot hoz létre. A kosársejtek gátolják a szemcsesejtek mőködését, a mohasejtek a kosársejteket stimulálják, ezzel erısítik a feed-forward gátlást. A szemcsesejtek axonjai a hilusban ágaznak el és szintén az interneuronokat stimulálják, ezzel egy hatékony feed-back gátlást hoznak létre. Epilepsziában ez a hálózat jelentısen átalakul. A moharost sarjadzás során a szemcsesejtek axonjai visszafordulnak a gyrus dentatusban és önmagukkal (szomszédos szemcsesejtekkel) képeznek serkentı kapcsolatot, ezzel létrehoznak egy pozitív visszacsatolást, ami elısegítheti a szinkronizált epileptikus aktivitás kialakulását és tovaterjedését (Sharma és mtsai., 2007). Ezzel párhuzamosan a gyrus dentatusban a moharost sarjadzás létrehozza azt a pozitív visszacsatolást, ami számos kutató szerint magyarázatot adhat a gyrus dentatus epileptikus aktivitással szembeni ellenállásának meggyengülésére (12. ábra; Cronin és mtsai., 1992; Patrylo és Dudek, 1998; Hardison és mtsai., 2000). Kísérletek bizonyították, hogy a moharost sarjadzás során kiterebélyesedett szemcsesejt-axonok szinaptikus kapcsolatokat létesítenek a szemcsesejtekkel (ez hozza létre a pozitív visszacsatolást) de ezzel egyidejüleg gátló interneuronokkal is (Ribak, 1985; Ribak és Peterson, 1991; Kotti és mtsai., 1997; Ribak és Dashtipour, 2002; Sharma és mtsai., 2007). Elektrofiziológiai kísérletek azt is bizonyították, hogy a létrejött szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok funkcionálisak és excitátorosak (Molnar és Nadler, 1999; Scharfman és mtsai., 2003). A moharost sarjadzás kialakulása a státusz epileptikusz után ( a csendes periódusban ) egybeesik a spontán rohamok megjelenésével. Ezen tények ellenére a moharost sarjadzás, 22
mint a mediotemporális epilepszia elsıdleges oka ma is erısen vitatott (Morimoto és mtsai., 2004). Egyrészt megmutatták, hogy ha cyclohexamiddel meggátolják a moharost sarjadzást akkor is kialakulhatnak epileptikus rohamok (Longo és Mello, 1997; Longo és Mello, 1998), másrészt még az epileptikus hippokampuszban is, ahol a moharost sarjadzás jelentıs, nehezen váltható ki epileptikus neuronális aktivitás in vitro. Valószínőleg a moharost sarjadzás csak egy (bár jelentıs) azok közül a mechanizmusok közül amik lehetıvé teszik az epileptikus rohamok keletkezését és terjedését mediotemporális epilepsziában. A moharost sarjadzás pontos kiváltó oka nem ismert (Curia és mtsai., 2008). Egyes feltételezések szerint a mohasejtek pusztulásával a moharostok rekurrens ágai elveszítik célsejtjeiket és a moharost sarjadzás folyamán más célt keresnek maguknak. Ennek ellentmond az a megfigyelés, hogy a kindling modellben sejtpusztulás nélkül is létrejön moharost sarjadzás. Más elméletek szerint az epileptikus aktivitás bizonyos növekedési faktorok (NGF, BDNF, NT-3, TGF) valamint axon vezérlı molekulák (ephrinek, szemaforinok) fokozott termelıdését / átrendezıdését okozza, ami hozzájárulhat a moharost sarjadzás serkentéséhez (Morimoto és mtsai., 2004). 2.6 Az újonnan született szemcsesejtek szerepe az epilepszia kialakulásában A moharost sarjadzáson kívül talán a legmeglepıbb felfedezés az epilepszia kutatásban a 90-es évek végén született, amikor megfigyelték, hogy a pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz után a neurogenezis drasztikusan felgyorsul a gyrus dentatusban (9. és 10. Ábrák; (Parent és mtsai., 1997; Covolan és mtsai., 2000; Scharfman és mtsai., 2007; Shapiro és mtsai., 2007; Shapiro és mtsai., 2008). A felfedezés azért is volt jelentıs, mivel bár neurogenezist korábban is megfigyeltek az agy egyes területein, ami magába foglalta a gyrus dentatust, de funkciója és esetleges regulációja ismeretlen volt. Egy olyan folyamat megismerése ahol az agy sérülése / neuronális pusztulás egy valószínőleg javító folyamatot az elpusztult sejtek pótlását indítja el elméleti és gyakorlati szempontból is nagyon nagy jelentıségő volt. Késıbb az epileptikus rohamok hatását a neurogenezisre embereken is igazolták (Parent és mtsai., 2006), bár ez a kérdés még mindíg vitatott. Azt is megállapították, hogy a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek abnormális diszperziója, amit korábban is a mediotemporális epilepszia egyik jellegzetességének tartottak, az újonnan született szemcsesejtek aberráns vándorlásának a következménye. Az újonnan született szemcsesejtek epilepsziában betöltött szerepe vitatott. Elméleti elvárások szerint a hilusba vándorolt újonnan született szemcsesejtek az elpusztult mohasejtek szerepét vehetnék át, 23