Az uréter motilitásának ellenőrzése, a körkörös és a hosszanti izomlemezek összehangolása, egy új videomikroszkópos módszer Doktori Tézisek dr. Osman Fares Semmelweis Egyetem Urológiai Klinika és Uroonkológiai Centrum Klinikai Kísérleti Kutató-és Humán Élettani Intézet Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Programvezető: Dr. Romics Imre tanszékvezető egyetemi tanár, az MTA doktora Témavezető: Dr. habil. Nyirády Péter egyetemi docens Hivatalos brálók: Dr. Kelemen Zsolt egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Kiss András: M.D., Ph.D. adjunktus Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Monos Emil M.D., Ph.D., D.M.Sc egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Böszörményi-Nagy Géza M.D., Ph.D. Főorvos Dr. Hamvas Antal M.D., Ph.D. egyetemi docens Budapest 2009
I. Bevezetés Jóllehet, a húgyvezetéket körülvevő simaizmot tekintjük a vizelet továbbításában szerepet játszó aktív elemnek, összehúzódásának szabályozási és szinkronizálási mechanizmusa még nem eléggé ismert. A jelen Ph.D. tézisek első részében áttekintjük jelenlegi ismereteinket az uréter simaizom kontraktilitásának szabályozó mechanizmusáról. A legtöbb, speciálisan az uréter simaizommal foglalkozó irodalmat felsoroltuk. Ennél a pontnál többnyire az uréter izommal végzett kísérleteket kiértékeltük. Ezen irodalmi adatok alapján áttekintő cikket publikáltunk (Osman et al. 2009). A tézisek második részében bemutatjuk saját kísérleteinket, melyekben az uréter összetett mozgásának tanulmányozására új mikrosebészeti- videomikroszkópos eljárást dolgoztunk ki. Ezen újonnan kidolgozott módszer segítségével, az irodalom alapján legelőször, a körkörös és a hosszanti mozgásfázisokat részletesen tudtuk vizsgálni. Ennek eredményének segítségével a hosszanti és a körkörös simaizom összehúzódásnak egy újszerű élettani szerepet tudtuk adni. II. A kísérletek célja Vizsgálataink első célja az volt, hogy válasszuk ki az összes rendelkezésre álló irodalmat, mely az uréter simaizom összehúzódásának szabályozásával foglalkozik és azokat analizáljuk. A második célunk az volt, hogy egy alkalmas kísérleti eljárást találjunk, amellyel in vivo, videomikroszkópia segítségével tanulmányozhatók és értékelhetők az uréterfal mozgásai. Ennek érdekében mikrosebészeti eljárással szabaddá tettük az urétert, annak középső szakaszát elválasztottuk a környező szövetektől egy speciális felépítésű szöveti kamrába helyezve, amely lehetővé tette az uréter szabad mozgását és az uréter aktivitására ismert hatást gyakorló hatóanyagok helyi hatásainak tanulmányozását. A videomikroszlópos eljárás lehetővé tette, hogy előre kijelölt felületi pontok mozgásait kövessük és elemezzük, és értékeljük az összehúzódás fázisait.
III. Módszerek és anyagok III.1. Sebészeti eljárás és szöveti kamra 250-350 g tömegű hím Sprague-Dawley patkányokat altatásban szabályozott hőmérsékletű műtőasztalon rögzítettünk. A vérnyomásváltozások monitorozása céljából kanüláltuk a jobb arteria carotist és a bal nyaki vénán keresztül infúzióban adtuk a hatóanyagokat. A kinyitott hasfalon középvonali bevágást tettünk. A baloldali uréter középső szakaszát gondos mikrosebészeti eljárással megtisztítottuk a környező retroperitoneális zsírszövettől, megkímélve a felületén futó ereket. A kiszabadított uréterszakaszt a laboratóriumunkban kifejlesztett szöveti kamrába helyeztük (1. ábra). A kb. 200 mm3 térfogatú kamrát Braun típusú perfúziós szivattyú segítségével 5 ml/óra sebességgel folyamatosan meleg, oxigénnel dúsított Krebs-Ringer oldattal perfundáltuk. A folyadékfölösleg eltávolítását a keringető szivattyúval azonos sebességre beállított másik szivattyúval (Harvard Apparatus) végeztük. 1. Ábra A patkány uréter in vivo tanulmányozására használt szövet kamra 3 dimenziós képe. 1. Beáramlás helye. 2. Kiáramlás. 3. Az uréter bejövetelének vályúja. 4. A kimenő uréter szakasz vályúja. 5. Üveg alap. 6. Üvegtető. (Osman et al. 2009 szerint).
III.2. Az adatok elemzése Digitalizált képeket rögzítettünk 166,7 ms időközönként. További számítások céljára feljegyeztük a karakterisztikus pontok koordinátáit. Az uréter felszínén futó erek mintázata lehetővé teszi bizonyos karakterisztikus pontok mozgásainak azonosítását (2. ábra). Ezen pontok koordinátái segítségével számítottuk ki az uréterfal mozgásait a különböző irányokban. 2. Ábra Az uréter perisztaltikájának videomikroszkópos vizsgálat: Három fix pontot használtunk a szövetkádban Cal1, Cal2 és Cal3 a kalibrálásra. A 3 legfőbb pont az uréter vasa vasorum hálozatának felületén: AV, BV és CV. A maradék 6 pont A1, A2, B1, B2, C1 és C2 pontok az uréter konturjának szélén az AV, BV és a CV pontoknak megfelelően láthatók. (Osman et al. 2009 szerint). Az uréter felülete karakterisztikus pontjának mozgását a vízszintes síkban, az idő függvényében 3D ábrákkal szemléltetjük (3. ábra). A karakterisztikus pontokhoz tartozó metszeteknél a külső átmérő változásai az idő függvényében főként a gyűrűs izmok hatásának tulajdoníthatók. A két karakterisztikus pont közé eső uréterszakasz axiális rövidülésének időbeli változásai főleg a helyi hosszanti izom hatására következnek be. A karakterisztikus pontok axiális mozgásait hosszabb uréterszakaszhoz tartozó longitudinális izom aktivitása befolyásolja, ezek a szakaszok akár a videomikroszkópos megfigyelés határain kívül is eshetnek. A
periodikus mozgások további elemzését autókorrelációs függvények segítségével végeztük (4. ábra). 3. Ábra Az uréter legfőbb AV pontja mozgásának pályagörbéje a (2. Ábra) szerint: a) a radiális és axiális irány normál állapotban; b) radiális és axiális irány acetilkolin (0.83 _g/min) szisztémás infúziója alatt. (Osman et al. 2009. szerint). IV. Eredmények Ezzel az eljárással lehetővé vált az uréter felület egyes pontjai összetett mozgásának követése a periodikus összehúzódások alatt. A háromdimenziós görbék (3. ábra) axiális és sugárirányban is jellegzetes mozgásokat mutatnak meg. Acetilkolin szisztémás adásakor a frekvencia és az amplitúdó is változott (3. ábra felső és alsó felvétele). Az eljárás lehetőséget nyújt az uréter mozgásainak részletesebb elemzésére is. Az összehúzódások periodicitásának további elemzését lehetett elvégezni autókorrelációs függvények számításával. A 4. ábrán láthatók az urétermozgás változásai szisztémás acetilkolin adásakor. Az alapperiódus 1,8 mp körüli periódusideje acetilkolin infúzió hatására közel 1 mp-re csökkent, ugyanakkor azonban megfigyelhető volt a 6,2 mp periódusidejű komponens határozottabb megjelenése.
4. Ábra A 2. ábrán bemutatott fő, AV pont átmérő változásának autokorrelácós görbéje. A felső panel a kontroll állapotot, míg az alsó panel a szisztémás acetilkolin (0.83 _g/min) infúzió során mért állapotot mutatja. (Osman et al. 2009 szerint). V. Megbeszélés Ezzel az eljárással egymástól elválasztva vizsgálhatók a hosszanti és a kerület mentén fellépő összehúzódási hullámok, és elemezhető azok kölcsönhatása. A kísérleteinkben mért urétermozgások részletes fázisanalízise a 6. ábrán látható. Egy szegmens aktív hosszanti összehúzódása a szomszédos szegmensek passzív kitüremkedését okozza. Véleményünk szerint az uréternek ez a különleges tulajdonsága még nagyobb jelentőséget kölcsönöz a hosszanti izomösszehúzódásoknak, és azoknak a gyűrűs izom-összehúzódásokkal való megfelelő szinkronizálásának. Megfigyeléseink alapján javasoljuk, hogy az uréter rendellenességeinek (vesicoureterális reflux, uréter obstrukció és megaureter) patofiziológiás analízise céljából, továbbá egyes hatóanyagoknak az uréter funkcióira gyakorolt hatásai azonosíthatósága érdekében a vizsgálat ne korlátozódjon a gyűrűs izom frekvenciájára és amplitúdójára, hanem annak tárgya az
egész perisztaltikus összehúzódás-elernyedés ciklussorozat legyen. Az általunk leírt eljárás elsősorban kísérleti célokra tűnik ígéretesnek. 5. Ábra Az uréter ciklikus mozgásának javasolt fázisai: Felső rész: az AV és a CV pontok átmérő változása, az AV és a CV axialis változása és az AV és a CV axiális rövidülés változásának bemutatása a 2. ábra szerint értékelt pontok alapján. A felvételek szisztémás acetilkolin (0.83-g/min) infúzió során készültek. Alsó panel: a felső részen bemutatott uréter ciklikus mozgáspontok 3 dimenziós ábrázolása. Szaggatott piros vonal jelzi az uréter kontúr két legfőbb pontjának axiális változását (Osman et al. 2009 szerint).
VI. Következtetések Az urétermozgásoknak az általunk kidolgozott eljárással feltárható mechanizmusa fontos új ismereteket adhat ahhoz, hogy megértsük gyógyszerek hatásait az uréter funkcióira, valamint megértsük az uréter funkció kóros állapotait. Eljárást dolgoztunk ki a patkány uréter összehúzódásainak elemzésére, amely eljárás pontossága nagyobb, mint más, jelenleg ismert eljárásé. Előzetes tapasztalataink szerint a hosszanti simaizmok összehúzódásainak hozzájárulása a vizeletadagok továbbításához jelentősebb, mint azt a korábbi ismeretek alapján gondolni lehetett. Saját Publikációk Listája 1. Fares Osman, György L Nádasy, Emil Monos, Péter Nyírády, Imre Romics: (2009) A novel videomicroscopic technique for studying rat ureteral peristalsis. World J Urol 27: 265-270. IF: 2.699 2. Fares Osman, Imre Romics, Péter Nyírády, Emil Monos, György L Nádasy: (2009) Ureteral motility. Acta Physiologica Hungarica, 96(4): 407 426. IF: 0.491 Az értekezéssel kapcsolatos abstractok 1. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Szeged, Hungary, 2006. Június 7-9). A new videomicroscopic method to study in vivo ureter movements of anesthetized rats. A Magyar Élettani Társaság (MÉT) LXX. Program. Előadások és poszterek összefoglalói P55 2. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Siófok, Hungary, 2-4 November 2006). A new videomicroscopic method to study the ureteral movements in vivo in anesthetized rats. Poster delivered at the conference of the Hungarian Urological Society. 3. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Tenerife, Spain, 10-13 December 2006). A new videomicroscopic method to study the ureteral peristaltic contractions in vivo in anesthetized rats. Oral and Poster presentation delivered at
the 5th European Urological Winter Escape Meeting. (An EU-ACME accredited conference) 4. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Zagreb, Croatia, 26-27 Oct 2007). Measurement and analysis of ureteral perystaltic movements in anesthetized rats using a novel videomicroscopic technique. EAU 7th Central European meeting. (An EU-ACME accredited conference) 5. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Budapest, Hungarz 22-23 February 2008). Measurement and analysis of ureteral peristalitic movemens in anesthetized rats using a novel videomicroscopic technique. 19. Füvészkerti Urológus Napok Urofarsang. 6. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Budapest, 10-11 April 2008). A novel videomicroscopic technique for studying rat ureteral peristalsis in vivo. Semmelweis Egyetem PHD Tudományos Napok. 7. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Debrecen, Hungary, 2008. June. 4-6). A novel method for measurement and analysis of ureteral peristalsis in anesthetized rats. A Magyar Kisérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a Magyar Élettani Társaság LXXII. Program. Előadás és poszter összefoglalók. P. 256. 8. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Warsaw, Poland, May 21-24, 2008). A novel videomicroscopic method for studying ureteral peristalsis in vivo in anesthetized rats. The 43. Congress of the European Society for Surgical Research, 9. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Warsaw, Poland, 24-25 October 2008). A novel method to measure and analyze ureteral peristalsis in anesthetized rats. EAU 8th Central European Meeting. (An EU-ACME accreddited conference) 10. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Lublin, Poland, 11-13 September 2008). Measuring and analyzing rat ureteral peristalsis using a novel technique. 24th Congress of Polish Physiological Society. 11. Osman F, Nádasy GL, Monos E, Nyírády P, Romics I: (Budapest, Hungary 19-21 November 2009). Physiology of the ureter. XVIII. International Semmelweis Symposium, New trends, innovations & technology in urology.