A GLOMUS CAROTICUM KLORID ÁRAMAINAK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA

A GLOMUS CAROTICUM KLORID ÁRAMAINAK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA Dr. Molnár Zoltán doktori értekezése Témavezető: Dr. Spät András Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Élettani Intézet Budapest 2004 Molekuláris Orvostudományok Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Celluláris és Molekuláris Élettan Doktori Program Szigorlati bizottság: Elnök: Dr. Faragó Anna Tagok: Dr. Szalay Katalin Dr. Molnár Miklós Az értekezés opponensei: Dr. Kecskeméti Valéria Dr. Csernoch László

Tartalomjegyzék BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR 1. A glomus caroticum anatómiája és működése 1.1. A glomus caroticum makroszkópos anatómiája 1.2. A glomus caroticum mikroszkópos anatómiája 1.3. Az artériás oxigén és szén-dioxid parciális nyomás (P a O 2, P a CO 2 ) és az artériás ph érzékelése 1.3.1. Általános szempontok 1.3.2. A hipoxia-érzékelés sejtszintű mechanizmusa 1.3.3. A hiperkapnia/acidózis érzékelése 1.4. A glomus caroticum érzékenysége egyéb ingerekkel szemben 2. A kemoreceptor sejt Cl áramai 2.1. A befelé-egyenirányító, ClC-2-szerű Cl áram 2.2. A duzzadás-aktivált Cl áram 2.3. A maxi Cl áram 3. Módszertani bevezetés 3.1. Patch-clamp teljes-sejt (whole-cell) felállás 3.2. Mikro-fluorimetriás módon mért [Ca 2+ ] c és ph c CÉLKITŰZÉSEK MÓDSZEREK Sejtizolálás A [Ca 2+ ] c mérése A ph c mérése A mérőkamra és a mikroszkóp leírása Patch-clamp mérések Oldatok Az adatok kezelése és a kiértékeléshez használt statisztikai módszerek 2

EREDMÉNYEK A duzzadás-aktivált Cl áram jelenléte a kultúrában A ClC-2-szerű Cl áram Az ozmotikus változás hatása a nyugalmi [Ca 2+ ] c -ra A Ca 2+ -elvonás és a nifedipin hatása a hipozmózis-indukált Ca 2+ -jelre A nifluminsav hatása A CO 2 /HCO 3 puffer szerepe A ClC-2-szerű Cl áram szerepe a ph-háztartás szabályozásában MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 1. Az ozmotikus változások hatása a nyugalmi [Ca 2+ ] c -ra 1.1. A kemoreceptor sejt ozmotikus érzékenységének jelentősége 1.2. A hipozmózis-indukált Ca 2+ jel 1.2.1. Az extracelluláris Ca 2+ és a Ca 2+ csatornák szerepe 1.2.2. A duzzadás-aktivált Cl csatorna szerepe a Ca 2+ jel létrehozásában 1.2.3. A Cl -mediált depolarizáció 2. A ClC-2-szerű Cl áram szerepe a nyugalmi ph c kialakításában 3

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR 1. A glomus caroticum anatómiája és működése A Bevezetés első részében rövid áttekintő képet kívánok nyújtani a glomus caroticumról, valamint ismertetem a hipoxia, hiperkapnia és acidózis érzékelés ma legátalánosabban elfogadott mechanizmusait. 1.1. A glomus caroticum makroszkópos anatómiája A glomus caroticum az arteria carotis interna és externa közötti kötőszövetes állományban, a ganglion cervicale superius szomszédságában elhelyezkedő páros szerv. Mérete emberben 0,5-1 cm, míg patkányban 0,5-1 mm. Artériás vérellátását az arteria carotis communisból származó egy, esetleg több, apró, közvetlen ág látja el, míg vénás elvezetését a szerv felszínén kialakuló vénás fonatból induló egy, ill. több kis véna biztosítja, melyek a vena jugularis internába ömlenek. A szerv viscerosensoros beidegzését a IX. agyideg (n. glossopharyngeus) apró ága, a ramus sinus caroticus vagy sinus-ideg látja el. A ramus sinus caroticus viszonylag könnyen preparálható és az idegről elvezethető akciós potenciálok frekvenciájának mérésével in vivo vizsgálható a szerv működése. Az afferens idegen haladó ingerület a ganglion petrosumon keresztül a n. glossophyaringeus zsigeri érzőmagvába fut be, ahonnan további átkapcsolódások után jut el az információ a nyúltvelő és híd területén található légzőközpontba. A glomus caroticum nem csak afferens, hanem efferens, szimpatikus beidegzést is kap: a szerv közvetlen szomszédságában elhelyezkedő ganglion cervicale superiusból származó postganglionáris rostok az ereket és a sejtfészkeket is beidegzik. 1.2. A glomus caroticum mikroszkópos anatómiája Fénymikroszkópos átmetszeti képen jól látható a szerv vékony, kötőszövetes fala, az igen dús kapilláris hálózat és a parenhímában helyet foglaló számos sejtsziget. A szigetekben találhatóak a neuronális eredetű kemoszenzitív sejtek, melyeket szokás I- es típusú, fő vagy kemoreceptor sejteknek hívni. A sejtszigetek széli részén helyezkednek el a gliális eredetű II-es típusú, más néven támasztó- vagy melléksejtek. A szigeten belül a kemoreceptor sejtek száma általában meghaladja a támasztósejtek 4

számát, az arány kb. 5:1 a kemoreceptor sejtek javára. A kemoreceptor sejtek általában jól elkülöníthetőek a támasztósejtektől, mert míg az előzőek 10-12 µm nagyságú, szabályos, kerek maggal és granulált citoplazmával rendelkeznek, az utóbbiak magja rendszerint elnyúlt, diszkoid alakú és citoplazmájuk sem tartalmaz granulumokat. Elektronmikroszkópos képen a kemoreceptor sejtek a szekretoros sejtekre jellemző képet mutatják: igen jól fejlett endoplazmatikus retikulummal és a citoplazma jelentős részét kitöltő, neurotranszmitter tartalmú dense-core testekkel rendelkeznek. Ezek legnagyobb mennyiségben katecholamin származékokat, dopamint és noradrenalint tartalmaznak. A sejtek katecholaminerg jellegét támasztja alá a neurotranszmitter szintézisért felelős enzimek (tirozin-hidroxiláz, DOPA-dekarboxiláz és a dopamin-béta-hidroxiláz) jelenléte is. A glomus caroticum átmetszeti fénymikroszkópos képén igen feltűnő a dús kapilláris hálózat. Ennek a dús kapilláris hálózatnak köszönhető a szerv kiugróan magas vérellátása (kb. 1500 ml/perc/100 g szövet), mely biztosítja, hogy a kemoreceptor sejtek körüli interstíciális térben az oxigén és a szén-dioxid parciális nyomása (P O2, P CO2 ) ill. a ph a glomus caroticum pillanatnyi metabolizmusától független paraméterek legyenek. A kapillárisok nagyobb része fenesztrált endotheliummal rendelkező I-es típusú kapilláris, a többi szintén fenesztrált, II-es típusú. A sejtszigetekkel közvetlen kapcsolatba ( 0,5-3 µm) csak az I-es típusú kapilláris kerül. A mikroszkópos viszonyokat szemlélteti a 1. ábra. 5

1. ábra. A glomus caroticum mikroszkópos anatómiája és az izolált kemoreceptor sejt A, Nyúl glomus caroticumból készült félvékony metszet. A képen megfigyelhető a számos sejtfészek vagy cluster (nyílhegyek), a bő erezettség (kapillárisok (c) és vénák (v)) és egy idegrost köteg (nf) (a vonalhossz 50 µm, Gonzalez és munkatársaitól [50]). B, Sejtfészek kemoreceptor sejtekkel (cc), támasztó sejtekkel (sc). A sejtfészek bal-felső pólusánál egy mielinhüvelyes idegrost (mnf) látható (a lépték 10 µm, Gonzalez és munkatársaitól [50]). Jobb oldalon patkány glomus caroticumból (általunk) készített sejttenyészet konfokális mikroszkóppal készült képe a sejtizolálást követően 24 órával. A képen egy több sejtből álló sejtfészek (C) és egy egyedülálló kemoreceptor sejt látható (D), a lépték 10 µm. A sejtmag kerekded, a sejt alakja poligonális, apró nyúlványokkal. 1.3. Az artériás oxigén és szén-dioxid parciális nyomás (P a O 2, P a CO 2 ) és az artériás ph érzékelése 1.3.1. Általános szempontok A P a O 2 és a ph csökkenése, valamint a P a CO 2 növekedése a citoplazmatikus Ca 2+ koncentráció ([Ca 2+ ] c ) emelkedéséhez vezet. A Ca 2+ jel a neurotranszmittert tartalmazó szekréciós granulumok plazmamembránnal történő fúzióját és a transzmitter leadását 6

hozza létre, aminek a hatására a sejteket beidegző sinus-idegen jól mérhető akcióspotenciál frekvencianövekedés jön létre. Az ingerület ezt követően a központi idegrendszerbe jut, melynek eredményeképpen létrejön a szervezeti válasz. A glomus caroticum légzés- és keringésszabályozásban betöltött szerepére nem térek ki, az összefüggésekkel kapcsolatban utalnék az Élettan tankönyv megfelelő fejezeteire [44,49]. Az ingerre létrejövő Ca 2+ jel származási helye sokáig képezte vita tárgyát a kemoreceptor sejt irodalmában. Kezdetben többen feltételezték, hogy a Ca 2+ válasz létrehozásában szerepe lehet az intracelluláris Ca 2+ raktáraknak [12,37], ma azonban úgy tartjuk, hogy a fiziológiás ingerre létrejövő [Ca 2+ ] c emelkedés [17,19,127] és dopamin felszabadulás [9,42,84] külső Ca 2+ jelentététől függő folyamat. 1.3.2. A hipoxia-érzékelés sejtszintű mechanizmusa A hipoxia-érzékelés folyamatában kulcsszerepet játszanak a kemoreceptor sejt K + és Ca 2+ csatornái, melyeket az 1. és 2. táblázat szemléltet. Áram/csatorna Aktiváció Gátlószer Faj I K + >-40 mv 4-AP, TEA, P O2, ph Nyúl [48,71,73,79,86] >-30 mv 4-AP, TEA, P O2 Macska [30] >-50 mv TEA, 4-AP Patkány [72] I K(Ca) (maxi) >-20 mv (100 nm Ca 2+ ) ChTx, IbTx, TEA, P O2, ph Patkány [96] I K(leak) Feszültség-független Ba 2+ (mm), Zn 2+, kinidin, Patkány [15,16,23] (TASK?) bupivakain, P O2, ph I K(hypoxic) >-20 mv P O2 Patkány [133] I K(HERG) >-70 mv Ba 2+ (mm), dofetilid Nyúl [86] 1. táblázat. A kemoreceptor sejtek K + áramai Módosítva Prabhakartól [99], kiegészítve [23] és [94] referenciák alapján. 7

Áram Gátlószer Faj L-típusú Dihydropyridinek, Cd 2+, Co 2+ Nyúl [72,79,84,87], Patkány [43,95,96,111] N-típusú ω-conotoxin GVIA/MVIIC, Cd 2+, Co 2+ Nyúl [87,121], Patkány [43,95,111] P/Qtípusú ω-agatoxin, ω-conotoxin MVIIC, Cd 2+, Co 2+ Nyúl [87,121] R-típusú Cd 2+, Co 2+ (toxin rezisztens) Nyúl [87,121] 2. táblázat. A kemoreceptor sejtek Ca 2+ áramai Módosítva Prabhakar [99] után Az irodalomban általánosan elfogadott, hogy a hipoxia a membrán depolarizációját hozza létre, ami a magas-küszöbű feszültség-függő Ca 2+ csatornák aktivációjához vezet. Ezt az elképzelést támogatják azok a megfigyelések, melyekben a szervetlen (Co 2+, Cd 2+ ) és szerves (nisoldipin, nitrendipin, nifedipin) L-típusú Ca 2+ csatorna gátlószerek a hipoxiára létrejövő Ca 2+ -jelet gátolták [19,84]. A feltételezett depolarizációt később Buckler és Vaughan-Jones elektrofiziológiai módszerekkel bizonyította [19]. A depolarizációért legtöbben különböző K + csatornák hipoxiára létrejövő gátlását teszik felelőssé. A hipoxia-mediált K + konduktancia csökkenést elsőként Lopez-Barneo és munkatársai írták le [71], mely megfigyelést később számos munkacsoport igazolt [15,16,23,56,72,73,79,86,96]. A kezdetben leírt hipoxia érzékeny K + konduktanciák (feszültség- és Ca 2+ -függő K + áramok) aktivációja azonban csak 40-50 mv-nál magasabb membránpotenciál értékek mellett következik be. A kemoreceptor sejtek nyugalmi membránpotenciál értéke azonban 50-60 mv, így nehezen képzelhető el, hogy ezek a csatornák lennének a hipoxiára létrejövő kezdeti depolarizációért felelősek. A vártnak megfelelően, a fenti csatornák gátlószerei (tetraetil-ammónium (TEA), charybdotoxin) nem befolyásolták a nyugalmi membránpotenciált és a funkcionális vizsgálatok sem igazolták szerepüket: nem befolyásolták sem a sejt nyugalmi [Ca 2+ ] c -t [15], sem a sinus-ideg nyugalmi frekvenciáját [27]. Intenzív kutatás indult tehát olyan konduktanciák azonosításának irányában, melyek a nemcsak érzékenyek a hipoxiára, de a nyugalmi membránpotenciál érték mellett is kimutathatóak. Két ilyen K + áramot is találtak: nyúlban Overholt [86], 8

patkányban pedig Buckler [15,16,23] jellemezte a konduktanciákat. A nyúl kemoreceptor sejten kimutatott HERG-szerű K + áram elektrofiziológiai karakterisztikája alapján 70 mv-nál pozitívabb potenciálokon aktív (lásd 1. táblázat), így elméletileg részt vesz a nyugalmi membránpotenciál beállításában. Az áram funkcionális jelentőségét a csatorna gátlószerével előidézett depolarizáció és [Ca 2+ ] c emelkedés igazolta [86]. Bár a tanulmányban a csatorna oxigén-érzékenységét nem vizsgálták, ismert, hogy a reaktív szabadgyökök képesek aktiválni a HERG csatornát [123]. A szerzők maguk is azt valószínűsítik, hogy a hipoxiára létrejövő szabadgyök szint csökkenés vezetne csatornák zárásához és a depolarizációhoz. A patkányban leírt TASK (TWIK-related acid-sensitive K + )-szerű K + áram [15,16,23] lineáris feszültség-áram összefüggéssel rendelkezik, így a csatorna a nyugalmi potenciálérték mellett is vezet, és a csatornán keresztül un. háttér (background, leak) konduktancia mérhető. Az áramot Ba 2+ -mal, Zn 2+ -kel, bupivacainnal és quinidinnel lehetett gátolni, míg az inhalációs narkotikum halothán az áramot aktiválta. A cell-attached ( sejt-érintett mód, az a patch-clamp felállás, melyben a seal kialakulása után nem szakítjuk át a membránt) egy-csatornás (single channel) mérések alapján a konduktanciát 14 ps-nek találták ( 150 mm [K + ], mindkét oldalon); a csatorna nyitási valószínűsége hipoxiára és bupivacainra csökkent, míg halothánra nőtt. A makro- és mikroszkópos áram ezen biofizikai és farmakológia tulajdonságai igen jól egyeznek a 1997-ben megklónozott két-pórusú TASK-1 csatornán keresztül mérhető árammal [68,91]. A konduktanciáért felelős TASK-1 csatorna mrns-ének jelenléte a kemoreceptor sejtben in situ hirbidizációs technikával nyert megerősítést, majd később a csatorna-fehérjét is kimutatták immuncitokémiai módszerekkel [134]. Bár a csatorna funkcionális szerepének pontosabb feltérképezése még számos vizsgálatot igényel, eddig megismert tulajdonságai alapján úgy tűnik, hogy ez a K + csatorna a felelős az oxigén-érzékeny háttéráramért a patkány kemoreceptor sejtben. 1.3.3. A hiperkapnia/acidózis érzékelése A hiperkapniának és az acidózisnak három lehetséges kombinációját különítjük el, a respiratorikus vagy hiperkapniás acidózist (P a CO 2, ph ), a metabolikus vagy izokapniás acidózist (P a CO 2, ph ) és az izohidriás hiperkapniát (P a CO 2, ph ). A hiperkapnia és acidózis érzékelés egy alfejezetben történő tárgyalását az indokolja, hogy 9

az uralkodó irodalmi álláspont szerint, ezen ingerek jelátvitelében az első lépés közös: az inger hatására a citoplazmatikus ph (ph c ) csökkenése jön létre. A ph c központi szerepére az a korai megfigyelés hívta fel a figyelmet, hogy a membránpermeábilis szénsav-anhidráz gátló acetazolamid a respiratorikus acidózisra adott sinus-idegi válasz létrejöttét jelentősen késleltette [52]. A CO 2 szénsavvá alakulása a sejten belül, majd a képződött H 2 CO 3 disszociációja H + -ra és HCO 3 -ra tehát a sejtaktiváció fontos lépése. Kimutatták továbbá, hogy a glomus caroticum aktiválható mitokondriális szétkapcsoló ágensekkel [83] és gyenge savakkal [102], amelyek a ph c csökkenését okozzák. A metabólikus és respiratórikus acidózisra, ill. a hiperkapniára létrejövő sinus-idegi frekvenciafokozódás mintázata továbbá jól egyezik az ingerek által létrehozott ph c csökkenés jellegével [22], ami szintén ph c központi szerepére utal. A sejt ph c -ja a külső ph változásaira igen érzékeny: a kemoreceptor sejt estében a külső ph (ph o ) egy egységnyi csökkenése a ph c 0,6-0,7 egységnyi csökkenését okozza [21,132], míg emlős szív- és harántcsíkolt-izomsejtben [1,128], ill. hátsógyöki neuronokban [126] ez az érték mindössze 0,2-0,3 egységnyi. Látható, hogy a ph c a ph o változásait szorosan követi ebben a sejtben, ami a ph c jelátvitelben betöltött szerepére utal. A jelátvitel következő lépése ph c csökkenésre létrejövő [Ca 2+ ] c emelkedés, amely a ma uralkodó álláspont szerint a belső acidózis által kiváltott membrándepolarizáció és feszültségfüggő Ca 2+ csatorna aktiváció következménye [17,18,55,96,105-107,122]. A depolarizációért, a hipoxia jelátvitelhez hasonlóan, a K + konduktancia csökkenését teszik felelőssé. Elsőként a kemoreceptor sejt viszonylag nagy amplitúdójú, könnyen mérhető K + áramairól mutatták ki a ph-érzékenységet (feszültség-függő és feszültség/ca 2+ -függő K + áramok, lásd 1. táblázat) [93,96,114]. Bár a K + konduktancia enyhe gátlása is elég lenne a depolarizáció létrehozásához, mivel a kemoreceptor sejt más sejtekhez képest nagy nyugalmi bemeneti ellenállással (input rezisztenciával) rendelkeznek (R input > 1 GΩ és U = IR), a kezdetben leírt sav-érzékeny áramokkal szemben hasonló kritikák fogalmazódtak meg, mint a hipoxia-érzékeny feszültség-aktivált K + áramokkal szemben (lásd előző alfejezet). A korábban bemutatott, TASK-szerű háttéráram vizsgálata során leírták [23], hogy az acidózis a konduktancia csökkenéséhez vezet, így valószínűleg, ez az áram a felelős az acidózisra/hiperkapniára létrejövő kezdeti depolarizációért. A patkány kemoreceptor sejtben tehát, a TASK-szerű háttéráram a hipoxia- és acidózis/hiperkapnia-érzékelésében egyaránt szerepet játszik. 10

1.4. A glomus caroticum érzékenysége egyéb ingerekkel szemben Bár a glomus caroticum elsődleges feladatának az előzőekben ismertetett ingerek percepcióját tekintik, a szerv érzékeny még a hiperkalémiára, a hipertermiára, a glükóz koncentráció és az ozmolalitás változására is. A munkavégzést kísérő hiperventilláció létrehozásáért központi idegrendszeri mechanizmusok és a perifériás kemoreceptorok aktivációja együttesen felelős. A munkavégzéskor az izmokból kilépő K + az artériás [K + ] növekedését eredményezi [69] és számos tanulmányban bizonyították, hogy a glomus caroticumot a csekély mértékű extracelluláris [K + ] emelkedés aktiválja [8,9,70,78]. A mai irodalmi álláspont szerint a munkavégzést kísérő fokozott alveoláris percventilláció emelkedés második, lassú komponenséért döntően a K + által kiváltott glomus caroticum aktiváció a felelős [92]. A glomus caroticum működését a glükóz koncentráció is befolyásolja és a szerv talán részt vesz a glükóz-háztartásban [3,65]. A szerv szintjén kimutatható érzékenység celluláris szinten is megfigyelhető, mint arról egy közelmúltban megjelent tanulmányban beszámoltak [89]. A hipertermiára bekövetkező glomus caroticum aktivációt is kimutatták már [2,38,41,47]. A jelenségnek szerepe lehet a lázra kialakuló hiperventillációban, valamint az emlősök hipertermia elleni védekező mechanizmusában: a holttér-ventilláció növekedésében (lihegés). A szerv ozmotikus érzékenységét eddig két tanulmányban vizsgálták [46,47], melyekben egymásnak ellentmondó hatásokról számolnak be. Az egyik szerint az ozmolalitás csökkenése gátolja, a másik szerint fokozza a sinus-idegen mérhető akciós potenciál frekvenciát. 2. A kemoreceptor sejt Cl konduktanciái Az előző fejezetből kitűnik, hogy a ma uralkodó elképzelések szerint a kemopercepció elsősorban K + és Ca 2+ csatornákon keresztül valósul meg. Egyes megfigyelések azonban arra engednek következtetni, hogy a Cl és anion konduktanciák szintén részt vesznek a sejt jelátvitelében. Ilyen megfigyelés például, hogy a 4,4- diisotiocianostilbén-2,2'-diszulfonsav (DIDS), ami a Cl -HCO 3 antiporter és egyes Cl 11

csatornák gátlószere, valamint a Cl csatorna gátló antracén-9-karboxy sav (9-AC) csökkenti a sinus-idegről elvezethető akciós potenciálok nyugalmi frekvenciáját [60]. Ezek a gátlószerek nem csak az alapaktivitást befolyásolják, hanem a hipoxiára és hiperkapniára adott választ is csökkentették [60]. Egy másik tanulmányban beszámolnak arról, hogy a Cl csatorna gátló N-fenilantracénsav és a 9-AC az ideg anoxiára adott válaszát és a katecholamin felszabadulást gátolták [88]. Ezeknek a kísérleti eredményeknek az ismeretében kezdtük el vizsgálni a kemoreceptor sejt anion konduktanciáit patch-clamp technikával. 2.1. A befelé-egyenirányító, ClC-2-szerű Cl áram A teljes-sejt felállásban végzett méréseink során leírtunk egy, a kemoreceptor sejten nem ismert, ph-érzékeny befelé-egyenirányító Cl áramot [98]. Az áramot részletesen karakterizáltuk elektrofiziológiai és farmakológiai szempontok szerint, melyek alapján úgy tűnik, hogy az áram a ClC-2 (Cloned Chloride) csatorna expressziójának köszönhető. Kimutattunk tehát egy új Cl áramot a sejten, azt azonban nem tudtuk, hogy mi lehet ennek az áramnak a szerepe a kemoreceptor sejt működésében. A heterológ expressziós rendszerekből származó eredmények alapján jól ismerjük a ClC-2 csatornán keresztül mérhető áram tulajdonságait és viszonylag letisztult képpel rendelkezünk az egyes tulajdonságokért felelős csatornarészekkel kapcsolatban is [61,117,118]. Az eddigi eredmények alapján számos feltételezés látott napvilágot az endogén csatorna funkciójával kapcsolatban, bár a heterológ expressziós rendszerből nyert eredmények, nem mindig állnak összhangban az endogén csatorna tényleges funkciójával. A vizsgálatok szerint az áram szerepet játszhat a Cl egyensúlyi potenciáljának (E Cl ) szabályozásában neuronokban, részt vehet sejttérfogat szabályozási folyamatokban és a transzepiteliális Cl transzportban tüdőben és bélben [61]. A feltételezett funkciók vizsgálatában jelentős előrelépést jelentett a ClC-2 knock-out egértörzs létrehozása [14], mely törzs vizsgálatai azonban nem igazolták a csatorna részvételét sem az érő neuronok E Cl eltolódásában, sem a transzepiteliális transzportban [61]. Más vizsgálatok alapján ma az sem egyértelmű, hogy az endogén ClC-2 áram valóban részt vesz-e a sejttérfogat-szabályozási mechanizmusokban [13,28,45,61]. A knock-out törzs vizsgálataiból származó eredmények arra engednek következtetni, hogy az endogén ClC-2 feladata a vitális sejt-sejt interakciók biztosítása a here Sertolli sejtje 12

és az érő spermatogóniumok között, valamint a retina fotoreceptor sejtje és a pigmenthámsejt közt [14,61]. Az áram kemoreceptor sejtben betöltött szerepére a vizsgálataink során megismert áram-tulajdonságok alapján következtettünk. A feszültség-áram összefüggés alapján az áram félmaximális aktivációja 50 mv körüli, tehát a csatorna a kemoreceptor sejt nyugalmi membránpotenciál értéke mellett aktív, működése háttér Cl konduktanciát tarthat fenn. Tehát az áram egyik feladata így a nyugalmi membránpotenciál (E m ) szabályozása lehet. Az áram 100 mv-on mért amplitúdóját mindössze 15 pa/pf-nak és az un. stacionárius zaj-analízis segítségével becsült egycsatornás konduktanciát is alacsonynak találtuk: joggal merülhet fel a kérdés, hogy mi lehet a szerepe ennek a kis áramnak a nyugalmi E m beállításában. Egy áram E m -re kifejtett hatása azonban függ a sejt bementi ellenállásától is, ami, mint azt korábban említésre került, a kemoreceptor sejt esetében 1 GΩ feletti. Így ennek a konduktanciának a változása, a viszonylag magas bementi ellenállás miatt érdemi hatással lehet a E m -re. Egy háttér anion áram azonban nem csak a nyugalmi E m, hanem a nyugalmi ph c értékének beállításában is részt vehet, hiszen, számos Cl áramról kimutatatták már, hogy működésük befolyásolj a ph c -t [61,67,81,104,112]. Mivel a ph c központi szerepet játszik az acidózis/hiperkapnia jelátvitelében, értékes új információval szolgálhat annak az ismerete, hogy az áram részt vesz-e a sejt ph-háztartásának szabályozásában. 2.2. A duzzadás-aktivált Cl áram A ClC-2-szerű áramon kívül, a sejt patch-clamp vizsgálatai során leírtak más Cl áramot is. A pár évvel ezelőtt kimutatott, duzzadás-aktivált Cl áram az ozmolalitás 60 mosmol/kg-os csökkenésével, valamint a pipettaoldatban alkalmazott camp-vel aktiválható [25]. A kemoreceptor sejt rendelkezik tehát egy sejtduzzadás hatására aktiválódó, enyhén kifelé-egyenirányító, pár száz pikoamperes Cl árammal, ami a vizsgálatok során feltárt elektrofiziológiai és farmakológia tulajdonságai alapján nagy hasonlóságot mutat a más emlős sejteken leírt, térfogat-érzékeny Volume-sensitive Outwardy Rectifying Anion Current-tel (VSOR) vagy más néven Volume-sensitive Organic Osmolyte and Anion Channel (VSOAC) árammal [61,85,118]. A kifeléegyenirányító, duzzadás aktivált Cl áram leírása önmagában nem meglepő, hiszen az eddig vizsgált emlős sejtek többségén kimutatható volt az áram. Az áram jelenétének 13

igazolása és karakterizálása természetesen fontos lépés a kemoreceptor sejt konduktanciáinak feltérképezése terén, de izgalmasabb kérdés talán az, hogy az áram, milyen szerepet tölt be a kemoreceptor sejt működésében. Funkcionális vizsgálatokat azonban a fenti tanulmányban nem végeztek. Más sejtek vizsgálata alapján tudjuk, hogy a VSOR áram részt vesz a sejttérfogat szabályozási folyamatokban [61,85,118]. Mivel a sejttérfogat állandóságának megőrzése minden sejt számára fontos feladat, feltehetően a kemoreceptor sejt estében is ez az áram egyik feladata. Az áram másik funkciója lehetne a hipoxia jelátvitelben való részvétel [25]. Beszámoltak arról ugyanis, hogy hipoxiára a kemoreceptor sejt camp tartalma emelkedik [34,97,131], és mint fent olvasható, az áram aktiválható camp-vel. A camp részvétele azonban ma sem egyértelmű a hipoxia-jelátvitelben [53]. Ahhoz azonban, hogy érdemben nyilatkozhassunk egy Cl konduktancia változás E m -re kifejtett hatásáról, ismernünk kell a töltéshordozó (ha több ionra permeábilis a csatorna, akkor a töltéshordozók) egyensúlyi potenciálját, ill. a membrán permeábilitását az egyes ionokra. A kemoreceptor sejtek citoplazmatikus anionösszetételéről sajnos nem áll rendelkezésünkre megbízható irodalmi adat, így a töltéshordozó Cl egyensúlyi potenciálja sem ismert: nehezen megjósolható tehát, hogy az áram aktivációja hogyan hat a sejtre. Korábbi méréseink felvetették a lehetőségét annak, hogy a kemoreceptor sejtben, -CO 2 /HCO 3 pufferelt oldatok esetén-, a Cl áram depolarizáló áram [98] (a Cl áramot általában a membránpotenicál stabilizálásáért felelős áramként tartjuk számon). A ClC- 2-szerű áram vizsgálatai során ugyanis azt találtuk, hogy a csatorna specifikus gátlószere a sejtek egy részén a nyugalmi E m 10 mv-os hiperpolarizációját okozta. A konduktancia-változás hatását az E m -ra a hagyományos teljes-sejt felállás helyett a sejtérintett módban vizsgáltuk, mely módszer segítségével, változatlan citoplazmatikus ionösszetétel mellett történhettek a mérések. Ismert ugyanis, hogy konvencionális patch-clamp mérések során a pipettában lévő oldat a membrán átszakítása után rövid időn belül bediffundál a sejtbe és meghatározza az citoplazmatikus ionösszetételt, míg a sejt-érintett módban a seal kialakulását követően nem szakítjuk át a membránt, így a sejt belső ionösszetételét sem módosítjuk. A módszer alkalmazásakor az E Cl hűen tükrözi a fiziológiás viszonyokat, és a konvencionális teljes-sejt felállással szemben nem a kísérletező által önkényesen megválasztott érték. A módszer részletes leírását lásd: [58,129]. Sajnos a módszer technikailag nehezen kivitelezhető és a megbízható 14

kiértékeléshez számos feltételnek kell teljesülnie, ezért a méréseket mindössze pár sejten tudtuk megbízhatóan kiértékelni. Az így nyert adatok, ha nem is bizonyítják egyértelműen, hogy a ClC-2-szerű áram a kemoreceptor sejtben depolarizáló áram (mivel az áramgátlás hiperpolarizációt hozott létre), azt mindenestre jelzik, hogy a Cl megoszlás nem feltétlenül a nyugalmi E m értékéből származtatható passzív megoszlás folyamata. A fentiek alapján elképzelhető tehát, hogy a duzzadás-aktivált Cl áram aktivációja is a membrán depolarizációját és a sejt aktivációját hozza létre. Bármi is legyen azonban az áram hatása az E m -re, a konduktancia tényleges szerepe ma sem ismert a kemoreceptor sejt működésében. 2.3. A maxi Cl áram A fenti két Cl áramon kívül a kemoreceptor sejten kimutattak még egy további Cl áramot is. Az áramért, egy meglepően nagy, közel 300 ps-es konduktanciájú Cl csatorna a felelős, amit először egy-csatornás, inside-out felállásban írtak le (szimmetrikus 140 mm Cl ) [115], majd később a makroszkópos konduktanciát is kimutatták [116]. Ennek a közel 300 ps nagyságú egy-csatornás konduktanciának megfelelő makroszkópos áramot (minden valószínűség szerint több na nagyságú) a mi laboratóriumunkban nem sikerült kimutatni és más irodalmi adat sem támasztja alá az áram jelenlétét patkány kemoreceptor sejten. Ennek oka valószínűleg a sejtizoláláshoz felhasznált állatok kora (1-3 nap) és a méréseket megelőző kultúrálási idő (1-2 hét). Ismert tehát két Cl áram a patkány kemoreceptor sejten: a ClC-2-szerű és a duzzadásaktivált Cl áram. Elektrofiziológiai és farmakológia szempontok alapján mindkét áram részleteiben jellemzett és az áramok tulajdonságiból következtethetünk az áramok funkciójára. A sejtműködésben betöltött tényleges szerepük azonban nem ismert, kísérleteinkben ezért igyekeztünk választ adni erre a kérdésre. 15

3. Módszertani bevezetés 3.1. Patch-clamp teljes-sejt (whole-cell) felállás A patch-clamp technika kifejlesztése Erwin Neher és Bert Sakmann nevéhez köthető, akik a 70-es évek közepén számoltak be arról, hogy megfelelő vékonyságúra húzott pipettával megközelítve egy letapasztott sejtet, a sejtmembrán és a pipetta között egy igen nagy elektromos ellenállású kapcsolat, un. giga-seal (GΩ-os ellenállású, pecsétszerű kapcsolat) jön létre [80]. A sejtek ezen tulajdonsága teremti meg a lehetőséget arra, hogy a membrán elektromos tulajdonságait mikroelektródák beszúrása nélkül vizsgálhassuk, ami forradalmi eredményeket hozott a sejtélettan és biofizika területén. A kapcsolat kialakításában másodlagos kémiai kötések vesznek részt, pontos mechanizmusa ma sem ismert. A seal kialakulása után többféle mérési felállás létrehozható; méréseink során mi az ún. teljes-sejt (whole-cell) felállást alkalmaztuk, amit a pipetta vége által befogott membránrész (membrane-patch membrán-folt) átszakítása után érünk el (2A ábra). Ha a pipetta és a membrán közötti ellenállás megfelelő nagyságú (R seal > 10 GΩ), akkor a pipettában és a fürdőben lévő referenciaelektróda között mérhető áram a membrán egészén átfolyó árammal lesz egyenlő (innen a teljes-sejt elnevezés). A felállás elérése után voltage- ill. current-clamp (to clamp rögzíteni) módban végezhetők mérések, attól függően, hogy a feszültség ill. az áram az általunk szabályzott paraméter, melynek függvényében vizsgáljuk a membrán elektromos tulajdonságait. A teljes-sejt felállást jellemző kapcsolási rajzot szemlélteti a 2B ábra. A módszer részletes leírását lásd: [57]; a továbbiakban csak az értekezésben előforduló elektrofiziológiai fogalmakat ismertetem. 16

A I m Pipetta Gigaseal +200 mv Regisztrálás Intracelluláris tér -200 mv Föld (0 mv) Extracelluláris tér +. B R pip R ser E com C pip R seal C m R m E m R ref 2. ábra. Ioncsatornák vizsgálata patch-clamp módszerrel A, a patch-clamp mérés sematikus modellje. A befelé folyó áram irányát egy nyitott kation csatornán keresztüli fehér nyíl jelzi. A pipettában lévő nyilak a sejt-érintett (cellattached) felállásból a teljes-sejt felállásba való átmenetet mutatják. B, A teljes-sejt felállás elektronikai modellje (pip = pipetta, ser = soros, ref = referencia elektród, m = membrán, com = parancs) (Módosításokkal átvéve Dr. Petheő Gábor Doktori Értekezéséből, 2002) 17

áramirány: definíció szerint, teljes-sejt felállásban, a pozitív ionok sejtbe irányuló elmozdulás negatív áramot hoz létre. Ezzel ellentétes töltésű vagy irányú ionmozgás természetesen ellentétes előjelű áramot eredményez. aktiváció, inaktiváció: aktiváció alatt azt a folyamatot értjük, mikor a csatorna a zárt állapotból a nyitott állapotba kerül. Inaktiváció esetén a nyitott (esetleg zárt) csatorna inaktív állapotba kerül, mely a zárt állapothoz hasonlóan nem enged meg ionmozgást, de ebből a konformációból a csatorna közvetlenül nem kerülhet a nyitott konformációba. feszültség protokoll: voltage-clamp mérések során alkalmazott feszültségparancs. Két fő típusa ismert, a step ( lépés) és a ramp ( rámpa) protokoll. Step protokoll alatt a membrán potenciált gyors (ms alatt), általában ismétlődő módon, lépésekben változtatjuk, míg ramp protokoll alatt a potenciálváltoztatást a step protokollhoz képest jóval lassabban, általában állandó sebességgel hajtjuk végre. megfordulásipotenciál: az a potenciál érték, ahol az áram előjelet (irányt) vált. Az értéke, az I x = G x (E m E x ) értelmében egyezik a töltéshordozó egyensúlyi potenciáljával, így a megfordulási-potenciál segít a töltéshordozó azonosításában (amennyiben egyféle ion hozza létre az áramot). folyadék-junkciós potenciál: két különböző ionösszetételű folyadék határfelületének két oldala között mérhető potenciákülönbség. Számottevő értéknél (ha abszolút értéke > 5 mv), érdemes korrekciót alkalmazni, azaz a mért membránpotenciál értékből kivonni a folyadék-junkciós potenciált. egyenirányítás vagy rektifikáció: rektifikációról beszélünk egy makroszkópos áram esetén, ha a feszültség-áram összefüggés a lineáristól eltér (azonos kétoldali töltéshordozó koncentráció mellett). run-down, run-up: az áram nagyságának progresszív, időbeli (általában percek alatti) csökkenése (run-down) vagy növekedése (run-up) (nem összetévesztendő az idő-függő inaktivációval, ami általában ms-ok alatt következik be). Oka lehet citoplazmatikus faktorok kimosódása, a csatorna makromolekuláris környezetének ill. foszforilációs állapotának változása. Ha a run-down vagy run-up kinetikáját jellemezni tudjuk egy függvénnyel, úgy korrekciót alkalmazhatunk rá. 18

4.2. Mikro-fluorimetriás módon mért [Ca 2+ ] c és ph c A [Ca 2+ ] c és a ph c mérése fluoreszcens módon történt, mely módszer általános leírását lásd a következő forrásműben és honlapon: [38], www.probes.com/handbook. 3. ábra. Az Indo-1 valamint a karboxi-snarf-1 emisszió spektruma A, az Indo-1 emissziós spektrumának változása a festék környezetében lévő szabad [Ca 2+ ] függvényében. A festék gerjesztése 338 nm-en történt. B, a karboxi-snarf-1 emissziós spektrumának változása a ph függvényében. A gerjesztő fény hullámhossza 534 nm. (az ábrák a www.probes.com oldalról származnak) Az 3A és B ábra a méréseink során használt két fluoreszcens festék, az Indo-1 és a karboxi-snarf-1 emissziós spektrumát mutatja be. Az Indo-1 spektrumán megfigyelhető, hogy 338 nm-es gerjesztő fény mellett a 400 ill. 500 nm-en emittált fény intenzitása jelentős változásokat mutat a festék környezetében lévő [Ca 2+ ] függvényében. A karboxy-snarf esetén, 534 nm-es gerjesztést használva az 580 és 640 nm-en kibocsátott fény intenzitása pedig a festék környezetében lévő ph függvényében mutat jelentős változásokat. Az emissziós hullámhossz párokon a változások ellentétes irányúak, így lehetőség nyílik a festékek un. aránymetrikus (ratiometric) módon történő felhasználására, ami igen jó jel-zaj arányt biztosít és számos mérési műterméket kiküszöböl. Az Indo-1 esetében a 400 és 500 nm-en, a karboxi-snarf-1-nál pedig az 580 és 640 nm-en mért intenzitások hányadosával (R) jellemeztük a sejten belüli [Ca 2+ ]-t és ph-t. A festékek megválasztásánál törekedtünk arra, hogy a felhasznált molekulák disszociációs konstansa a vizsgált paraméter értékének közelében legyen. Az Indo-1 disszociációs konstansa (K d ) citoplazmatikus szerű krisztalloid oldatban 230-250 nm, a karboxi-snarf-1-é 7,5 (ph egység), ami 19

ideálissá teszi a két festéket a kemoreceptor sejt belső [Ca 2+ ] és ph változásainak regisztrálására. A festékek sejtbe juttatása a molekulák acetoxi-metilészter formáinak felhasználásával történt, mely egyszerű megoszlással kerül a külső oldatból a sejtbe. Az citoplazmatikus térbe került festékről ezt követően a sejten belüli aspecifikus észterázok lehasítják az észter-csoportot, így a hidrofillé vált festék az citoplazmatikus térben marad. Az egyes R értékekhez tartozó tényleges [Ca 2+ ] ill. ph értékek a [Ca 2+ ] = ((R R min )/(R max R)) K d ß, ill. a ph = pk a log((r R min )/(R max R)) logß összefüggések segítségével számíthatóak ki, ahol R max és R min a szaturált ill. deszaturált festékhez tartozó R érték, ß pedig a deszaturált és szaturált festék hosszabb hullámhosszához tartozó intenzitásarány. Az irodalomban legáltalánosabban elterjedt, ún. in situ módszer szerint, az R max, R min, ß, és számos esetben a K d meghatározása a sejt permeábilizálásával, majd a festéket deszaturáló ill. szaturáló oldatok alkalmazásával történik. Méréseink során mi is hasonlóan jártunk el, Ca 2+ ionoforként ionomycint, protonoforként pedig nigericint használtunk. 20

CÉLKITŰZÉSEK 1. Tisztázni kívántuk a korábban leírt, duzzadás-aktivált Cl áram szerepét a kemoreceptor sejt működésében. A/ Kezdeti kísérletünkben elektrofiziológiai módszerrel kívántuk igazolni, hogy hipozmózis hatására az általunk izolált kultúrában is aktiválódik az áram. B/ Vizsgálni kívántuk ezt követően, hogy a hipozmózissal előidézett sejtduzzadás hogyan hat a nyugalmi Ca 2+ szintre. C/ Hatékonyság esetén pedig vizsgálni kívántuk a jelenség mögött álló celluláris mechanizmusokat. 2. A ClC-2-szerű Cl áram funkcionális megismeréséért vizsgáltuk az áram szerepét a kemoreceptor sejt ph-háztartásának szabályozásában. 21

MÓDSZEREK Sejtizolálás A kísérletekhez használt kemoreceptor sejteket 10-20 napos Wistar patkányokból nyertük. Izolálásonként 2-3 patkányt 375-600 mg/testsúlykg-os dózisú nátrium-pentobarbitállal altattunk el, majd a mély narkózis beállta után a fejeket a nyaki részekkel együtt levágtuk és 0 C-os 0,9 %-os NaCl oldatba helyeztük. A glomus caroticumokat, eltávolításukat követően 37 C-on 17 percig emésztettük alacsony Ca 2+ - tartalmú (0,2 mm) foszfát-pufferelt oldatban, kollagenáz (2 mg/ml, Type 1, Sigma) és tripszin (2 mg/ml, Difco Laboratories, Detroit, USA) jelenlétében. Ezt követően a szöveti állományt finom csipeszekkel fellazítottuk, majd újabb 5 percig emésztettük. A szuszpenzióból a sejteket centrifugálással ülepítettük (10 perc, 200 g), majd az üledéket az Oldatok részben ismertetett 200-300 µl-nyi médiumban reszuszpendáltuk. Az így nyert sejtszuszpenzióból 25 µl-nyi mennyiségeket poli-d-lizinnel fedett 35 mm-es műanyag Petri csészére (elektrofiziológiai mérésekhez) ill. 22 mm-es üveg fedőlemezre (fluorimetriás mérésekhez) helyeztünk. A Petri csészéket a sejtek letapadásig inkubátorba helyeztük (2 óra, 5% CO 2, 37 C), majd Petri csészénként 2 ml médiummal töltöttük fel. A sejteket 6-36 h elteltével használtuk fel a kísérletekhez. A kemoreceptor sejt elkülönítése a háttérsejtektől részben morfológia jegyek alapján történt, mivel a kemoreceptor sejt fáziskontrasztos képe jellegzetes: erősen fénytörő, 10-15 µm nagyságú, poligonális sejt. A [Ca 2+ ] c mérések előtt tesztingerként hiperkapniás acidózist (20 % CO 2, ph 6,8) alkalmaztunk és csak a megfelelő nagyságú és reverzibilis Ca 2+ választ létrehozó sejteket használtuk a további mérésekhez. Az elektrofiziológia mérések során a morfológiai jegyeken kívül pedig felhasználtuk még a feszültség- és Ca 2+ -függő K + és a feszültség-függő Ca 2+ áram jelenlétét is a sejtek azonosításához. Kísérletek a Semmelweis Egyetem Állatvédelmi és Etikai Bizottságának jóváhagyásával (No.17 3/98), az állatvédelem intézményi és törvényi előírásainak figyelembe vétele mellett történtek. 22

A [Ca 2+ ] c mérése A sejteket 45-60 percig töltöttük 2 µm Indo-1 acetoxi-metil-észtert (2 µm, TefLabs, Austin, TX, USA) tartalmazó médiumban 37 C-on, 5 % CO 2 jelenlétében. Az inkubációt követően a fedőlemezeket a mérőkamrába helyeztük, ahol 10 percen át többször átmostuk a mérések alatt használt bikarbonát-pufferelt módosított Tyrode oldattal. A festék gerjesztése 355 nm-en történt, míg a 400 nm és 500 nm-en emittált fényt ((F 400 ) és (F 500 )) 0,5 s-os gyűjtési periódusonként alakítottunk elektromos jellé 2 fotoelektron-sokszorozó segítségével (model 712, PTI). Az F 400 és F 500 arányát (R) a mintavételt követően számoltuk ki a 10 Hz-en digitalizált jelekből (Digidata 1200-as interfész és AT számítógép). Bár a kalibráció segítségével módunkban állt az adatok kifejezése [Ca 2+ ] c -ban, az adatokat mégsem alakítottuk át rutinszerűen [Ca 2+ ] c értékekké. Ismert ugyanis, hogy az in vitro meghatározott K d -t a sejten belül számos tényező befolyásolhatja (pl. hőmérséklet, viszkozitás, ph) [5,130], ezért az adatokat döntően R értékben kifejezve ismertetjük és a statisztikai kiértékeléshez is legtöbbször az R értékeket használtuk fel. A kezdeti [Ca 2+ ] c mérések eredményeit ismertetjük abszolút [Ca 2+ ] értékekben is, hogy megkönnyítsük a más munkacsoportok eredményeivel történő összevetést. A kalibráció során in situ határoztuk meg az R min R max és a β értékét [17]. Az R min meghatározásához a töltött sejteket 1 órán át Ca 2+ -mentes HEPES-pufferelt oldatban tartottuk 10 mm EGTA és 10 µm ionomycin jelenlétében, majd az R min felvétele után meghatároztuk az R max -ot, amit az EGTA elvonásával és a [Ca 2+ ] 2,5 mm-ra emelésével értünk el. Az R min -t 1.00 ± 0.03-nek, R max -ot 8.24 ± 0.24-nak találtuk, míg a β 4.29 ± 0.05 volt. A [Ca 2+ ] c -t a K d β ((R - R min )/(R max - R)) képlet alapján számítottuk ki, 250 nm-os, becsült K d érték mellett [51]. A festékből származó jel mindkét csatornán jóval meghaladta a sejtek autofluoreszcenciájából származó jelet, ezért az auto-fluoreszcenciára korrekciót nem alkalmaztunk. 23

A ph c mérése A ph c mérése karboxi-snarf-1 festékkel történt, szintén aránymetrikus módon. A sejteket bikarbonát-pufferelt módosított Tyrode oldatban töltöttük a festék acetoxi-metil-észter formájával (10 µm, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 15 percig 26-28 C-on, 5% CO 2 mellett. Az excitáció 540 nm-en történt, az emittált fényt 580 ill. 640 nm-en gyűjtöttük. Az intenzitások hányadosát az un. standard nigericin technikával alakítottuk át abszolút ph c értékekké [124], mely során az 5,5; 7,5 ill. 9,5 ph értékű oldatok segítségével határoztuk meg az R min, R max, logß és a sejten belüli pk a nagyságát. A nigericinnel való kontamináció elkerülésének érdekében [101] a kalibráció alatt egy új mérőkamrát használtunk és a nigericint nem a perfúziós rendszeren keresztül, hanem közvetlenül a kamrába adagoltuk. Patch-clamp mérések A patch-clamp mérések alatt RK-400 típusú (Biologic Science Instruments, Claix, Franciaország) patch-clamp erősítőt használtunk. A pipettákat P-87-es húzóval (Sutter Instrument Co., USA) állítottuk elő boroszilkát üvegcsövekből (1B120F-4; World Precision Instruments, USA), melyek ellenállása 5 9 MΩ volt. Az áramjelek mintavételezése Cl áramok esetén 2 khz-en, Ca 2+ áramok esetén 8 khz-en történet, egy Digidata 1200-as interfész segítségével (Axon Instruments), míg a szűrést egy 1 khz-es ( 3 db), 5-pólusú Bessel-szűrővel végeztük. A mintavételezést és adattárolást pclamp 6, míg az analízist pclamp 8.0 program (Axon Instruments) segítségével végeztük el PC/AT számítógépen. A földelést Ag/AgCl elektróddal biztosítottuk. A sejtek kapacitását 4,7 ± 1 pf-nak találtuk (n = 29) és minden esetben a mérés közben kompenzáltuk az erősítőbe épített áramkörrel. Sem a csurgó-áramra, sem a soros hibára nem kompenzáltuk az eredményeket. Az oldatok közötti junkciós-potenciál nem haladta meg a ±4 mv-ot, így erre sem korrigáltuk az ismertetett adatokat. A Ca 2+ áramok esetében gyakran tapasztaltuk az áram kismértékű csökkenését (run-down), melynek értéke 3,3 ± 0.7 % / 90 s (n = 9) volt és ez esetben sem alkalmaztunk korrekciót. 24

A mikroszkóp és a mérőkamra leírása A méréseink alatt egy inverz mikroszkópot használtunk (Diaphot 300, Nikon, Tokyo, Japán), melyet fluorimetriás mérések alatt egy UV fényt átengedő, százszoros nagyítású, olaj-immerziós objektívvel láttunk el (NA 1,3, Nikon), míg a patch-clamp mérések alatt egy negyvenszeres nagyítású, egyszerű objektívet használtunk (Nikon). A fluorimetriás mérések során CO 2 /HCO 3 pufferelt oldatokat használtunk. A fedőlemezt egy kb. 2 ml végtérfogatú plexi kamra aljához rögzítettük, melyet a mikroszkóp tárgyasztalán helyeztünk el. A fedőlemezt a mérésekkor kb. 100 µl folyadék fedte, mely fölött 20% O 2, 5 ill. 20 % CO 2 és 75 ill. 60 % N 2 tartalmú, vízgőzzel telített gáz folyamatos áramlását hoztuk létre. Az oldatok cseréjét 40 s alatt hajtottuk végre 1 ml új oldat bejuttatásával, miközben a túlfolyó oldatot egy vízlégszivattyú segítségével eltávolítottuk. A mérések során alkalmazott oldatokat mérések előtt a kívánt ph eléréséhez szükséges gázzal ekvilibráltuk és a mérések alatt zárt fecskendőkben tároltuk. A patch-clamp mérések szobalevegőn, Hepes pufferelt oldatok felhasználásával történtek. Az alkalmazott oldatok a fedőlemezen lévő sejtek közvetlen környezetébe juttattuk egy gravitáció által hajtott, 5 kifolyócsöves perfúziós rendszer segítségével. A kifolyócső 0,1 mm távolságra helyezkedett el a vizsgált sejttől. Oldatok A tenyésztő oldat: Dulbecco s MEM (GibcoBRL) és Ham F-12 (GibcoBRL) 1:1 arányú keveréke, melyet hővel inaktivált fötális szarvasmarha szérummal (10 %, Protein GMK, Gödöllő), 100 IU/ml penicillinnel, 100 µg/ml streptomycinnel és 84 U/l inzulinnal (GibcoBRL) egészítettünk ki. A fluoreszcens mérések alatt alkalmazott módosított, bikarbonát-pufferolt Tyrode-oldat összetétele (mm): 92 NaCl, 23 NaHCO 3, 4,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1 MgCl 2, 11 glükóz, ekvilibrálva a következő összetételű gázzal: 5% CO 2, 20% O 2, 75% N 2. Az oldat mért ozmolalitása 249 ± 2 mosmol/kg, az ekvilibrálást követő ph-ja 7,40 ± 0,02 volt. A kívánt ozmolalitást ezt követően szacharóz hozzáadásával állítottuk be (275, 285, 300 vagy 350 mosmol/kg). Kontroll értéknek a 300 mosmol/kg-t tekintettük. Az ozmolalitás méréséhez fagyáspont csökkenésen alapuló ozmométert használtunk (MicroOsmometer 3MO, Advanced Instruments, Norwood, MA, USA). A 25

tesztingerként alkalmazott hiperkapniás acidózist az ekvilibráláshoz használt gáz CO 2 tartalmának emelésével idéztük elő (20 % CO 2 ), ami a ph-t 6,80 ± 0,02-re csökkentette. A [Ca 2+ ] kalibráció estén használt bikarbonát-pufferelt Tyrode-oldat összetétele a következő volt (mm): 117 NaCl, 23 NaHCO 3, 4,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1 MgCl 2, 11 glükóz, ekvilibrálva a következő összetételű gázzal: 5% CO 2, 20% O 2, 75% N 2. A ph kalibrálás alatt használt oldatok a következő összetételűek voltak (mm): 140 KCl, 1 MgCl 2 és vagy 20 MES (ph 5,5) vagy 10 Hepes (ph 7,4) vagy 10 mm etanol-amin (ph 9,5). A Ca 2+ áramok mérésekor használt pipettaoldat a következő összetételű volt (mm): 10 (TEA)Cl, 110 CsCl, 0,5 CaCl 2, 2 BAPTA (számított szabad [Ca 2+ ] ~ 100 nm (Max Chelator)), 4 Na 2 ATP, 0,3 Na 2 GTP, 5 nátrium-foszfokreatinin, 5 MgCl 2, 10 Hepes (ph = 7,3, CsOH-dal beállítva). A fürdőoldat pedig, szintén mm-ban megadva: 122 NaCl, 10 (TEA)Cl, 4,5 CsCl, 2,5 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 glükóz, 10 Hepes (ph 7,4, NaOH-dal beállítva). A Cl áramok esetében használt pipettaoldat a következő anyagokat tartalmazta (mm): 132 CsCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 11 EGTA, 2 Na 2 ATP, 11 Hepes (ph 7,3, CsOH-dal beállítva; ozmolalitás: 309 mosmol/kg; számított szabad [Ca 2+ ] ~ 10 nm (Max Chelator)). A fürdőoldat összetétele a következő volt (mm): 70 NaCl, 45 (TEA)Cl, 5 CsCl, 6 MgCl 2, 0,2 CaCl 2, 5 Hepes, 50 vagy 0 szacharóz (ph 7,4; NaOH-dal beállítva; ozmolalitás 310 mosmol/kg az izozmotikus oldat és 260 mosmol/kg a hipozmotikus oldat esetében). A mérések 28 ± 2 C-on történtek. A vegyszereket minden esetben a Sigma cégtől származtak, amennyiben más vállalattól származik az alkalmazott vegyszer, úgy azt a szövegben jelöltük. Az adatok kezelése és a kiértékeléshez használt statisztikai módszerek Az adatokat, mint átlagok ± S.E.M. közöljük, valamint minden eredmény estében megadjuk az elemszámot (n) is. A közölt eredmények legalább két független izolálással nyert preparátumból származnak. A Ca 2+ -mérések estében 5 sejten (66-ból) a [Ca 2+ ] c monoton, lassú emelkedését tapasztaltuk, ami feltehetően az UV tartományú gerjesztő fény által előidézett sejtkárosodásnak tudható be. Ezeket a sejteket kizártuk az értékelésből. A nifluminsav a sejtek közel negyedénél a [Ca 2+ ] c fenntartott emelkedését idézte elő, mely sejteket szintén kizártunk az értékelésből. 26

A statisztikai kiértékelésekhez ANOVA-t és egymintás Student-féle t-próbát alkalmaztunk. Az ANOVA esetében a post hoc összehasonlításokhoz Tukey-féle Honest Significant Difference próbát használtunk. A különbséget szignifikánsnak tekintettük, ha a P < 0,05. 27

EREDMÉNYEK A duzzadás-aktivált Cl áram jelenléte a kultúránkban A duzzadás-aktivált Cl áram funkcionális vizsgálata előtt bizonyosságot kívántunk szerezni arról, hogy az általunk izolált sejtkultúrában is jelen van a korábban leírt térfogatérzékeny áram. Mint azt a Bevezetés -ben található 1. és 2. táblázat mutatja, a különböző munkacsoportok által vizsgált kemoreceptor sejtek eltérő csatornamintázattal rendelkezhetnek. Az eltérésért az izoláláshoz felhasznált állat kora és fajtája, ill. a különböző kultúrálási körülmények lehetnek a felelősek. A teljes-sejt felállásban végzett mérések során az oldatösszetevők megválasztásával gátoltuk a K + áramokat (Cs +, TEA) és minimalizáltuk a Ca 2+ áramokat (emelt [Mg 2+ ] és csökkentett [Ca 2+ ]). A Módszerek részben jelölt oldatösszetevők esetén az E Cl értékét 1 mv-nak számítottuk. A mérések során 0 mv-os tartófeszültségről 15 s-ként léptünk 100 mv-ra, majd 2 s után, 60 mv-ig tartó ramp-pel depolarizáltuk a membránt, 2 s alatt (4A ábra, felső panel). A fürdőoldat ozmotikus koncentrációjának csökkenése (310 mosmol/kg-ról 260 mosmol/kg-ra) a 17 vizsgált sejtből 15 esetében egy enyhén kifelé-egyenirányító áram megjelenéséhez vezetett (4A ábra, középső panel). Az áram a feszültség-lépésre azonnal aktiválódott és nem mutatott időfüggő inaktivációt a feszültség-lépés alatt. Maximális amplitúdóját (283 ± 61 pa; n = 14) a hipozmótikus oldat alkalmazását követően 3,5 ± 0,5 perc (n = 14) múlva érte el, amit a sejtek felében az áram spontán run-down-ja követett. Az áram ramp alatt mért megfordulási potenciálja (1 ± 2 mv, n = 15) egyezett az adott oldatösszetevők esetén számolt E Cl -lal és a vizsgált feszültségtartományban a nifluminsav (300 µm) az áram gyakorlatilag teljes gátlását okozta (n = 9, 4A ábra, alsó panel és 4B ábra). A 4B ábrán a hiperpolarizáló lépés kezdeti szakaszán mért áramamplitúdót ábrázoltuk az idő függvényében. Jól megfigyelhető, hogy az áram aktiválódása az inger alkalmazását követő rövid időn belül megkezdődik. Az áram általunk vizsgált, fent bemutatott paraméterei nagyfokú egyezést mutatnak a korábban leírt árammal [25] és bizonyítják, hogy az ozmolalitás csökkenése a mi kultúránkban is egy több száz pa nagyságú Cl áram megjelenéséhez vezet. 28

A 0 100 60 0 mv B 0 260 mosmol/kg nifluminsav 310 mosmol/kg I (pa) -200 260 mosmol/kg -400 200 400 t (s) 260 mosmol/kg nifluminsav 260 mosmol/kg 400 pa 500 ms 4. ábra. A duzzadás-akitvált Cl áram Az A ábra felső részén a feszültség-protokoll látható. A 0 mv-os tartófeszültségről 15 másodpercenként 100 mv-ra léptünk, majd 2 s múlva egy lassú, 2 s-os rampet alkalmaztunk +60 mv-ig. Az ábra középső részén a kontroll (310 mosmol/kg) oldat ozmolalitásának csökkentése (260 mosmol/kg, hipo) után kialakuló áram figyelhető meg. Az alsó részen a hipozmózisra aktiválódott áram közel teljes gátlása figyelhető meg a nifluminsav (300 µm) hatására. B, a duzzadás-aktivált áram aktivációja az inger (260 mosmol/kg, hipo) alkalmazását követően. A hiperpolarizáló lépés kezdeti részén (40-60 ms) mért áramot ábrázoltuk az idő függvényében, mivel a tesztlépés korai részén mért áram még nem tartalmazza a lassan aktiválódó ClC-2-szerű áramot. Számos esetben tapasztaltuk, hogy még izozmotikus körülmények között, nem sokkal a membrán-patch átszakítása után aktiválódott az áram. A csatorna izozmotikus körülmények közötti aktiválódásának pontos oka nem ismert, feltehetően a membránpatch beszakításakor jelentkező mechanikai behatás áll a jelenség mögött. 29