A Miskolci Egyetem Közleménye, A sorozat, Bányászat, 77. kötet (2009) MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK A HAKÁNYI GYÓGYFÜRDŐ SZÁRMAZÓ KÉNES VIZEK BAKTÉRIUMKÖZÖSSÉGEIN KARSZTKÚTJAIBÓL Miseta Roland, Palatinszky Márton, Makk Judit, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea ELTE, Természettudományi Kar, Mikrobiológiai Tanszék 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány I/C. Kivonat A harkányi, mattyi és büdöstapolcai kénes vízbázisok bakteriális közösségszerkezetét és szezonális dinamikáját klónkönyvtárak elemzésével, illetve denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) segítségével vizsgáltuk 2006-2008 között. A DGGE vizsgálatok eredményei a karsztvízbázis területi és szezonális változásaira mutattak rá. A klónkönyvtárak elemzése során főként kén- és szulfidoxidáló, illetve szulfátredukáló baktérium taxonokat azonosítottunk a klónok szekvencia analízise alapján. A langyos vizű kutak klónkönyvtárainak közös képviselői epszilon-proteobaktérium klónok, Thiobacillus sp., Desulfocapsa sp., valamint Thiothrix spp. képviselői voltak. A termálkút baktériumközössége, amely jelentősen eltért a többi közösségtől, főként a nem kénbaktérium Denitratisoma sp. filotípussal rokon klónokkal volt jellemezhető, de kis számban termofil kénbaktériumokhoz hasonló szekvenciákat is azonosítottunk. Absract Bacterial communities from the sulfúrous aquifers in the fields of Harkány, Büdöstapolca and Matty were investigated by cultivation independent molecular cloning and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) methods between 2006 and 2008. The DGGE profiles of the bacterial communities originated from the wells of lukewarm waters showed seasonal similarities and were highly different from the thermal well. From the four clone libraries mainly sulfur- and sulfideoxidizing and sulfate-reducing bacteria were identified by sequence analyses. Common members of the clone libraries of the lukewarm water samples belonged to e-proteobacteria, Thiobacillus sp., Desulfocapsa sp. and Thiothrix spp., while the dominant clones of the thermal water were affiliated with the non-sulfur bacterium Denitratisoma sp., however some sequences closely related to thermophilic sulfurbacteria were also found. 1. Bevezetés A Harkányi Gyógyfürdő Zrt. tulajdonában lévő harkányi, büdöstapolcai és mattyi vízbázisokra telepített termelőkutaból gyűjtött vízminták 201
Miseta Roland, Palatinszky Márton, Makk Judit, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea baktériumközösségeit tenyésztéstől független molekuláris biológiai módszerekkel vizsgáltuk abból a célból, hogy betekintést nyeljünk a lokális kén-körforgalomban is résztvevő közösségek összetételébe és változásaiba. 2. Anyagok, módszerek A karsztkutakból 2006 és 2008 között szezonális mintavételezést végeztünk. A langyos vizű Büdöstapolcai l-es és Il-es kút (BT1, BT2), a Matty-kút (M), valamint a VI. sz. termálkút (T6) vízmintáinak szűréssel tömörített biomasszájából mikroszkopikus felvételeket készítettünk, illetve a közösségi DNS kivonását követően a 16S rrns génszakaszt univerzális bakteriális primerekkel PCR segítségével szaporítottuk fel. A bakteriális közösségszerkezetek összehasonlítását és a változásokat denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) segítségével vizsgáltuk. A filogenetikai diverzitás feltárását klónkönyvtárak elemzésével végeztük el. A klónkönyvtárak adatai alapján a baktériumközösségekre törzsfejlődési hasonlóságokon alapuló filogenetikai dendrogramot szerkesztettünk, mely a reprezentáns klónok és a hozzájuk legközelebbi rokon taxonok leszármazási kapcsolatait mutatja be. 3. Eredmények Az összehasonlító dendrogram alapján elmondható, hogy a négy kútból ősszel vett minták baktériumközösségei nagymértékben eltértek a tavaszi és nyári közösségeitől (1. ábra). Bár az ugyanazon mintavételi helyeken vett tavaszi és nyári minták hasonlítottak egymáshoz, a legnagyobb hasonlóságot mégis az őszi BT1 és BT2 minták közösségei mutatták közel 75 %-os azonossággal, ami az őszi idényben a két kút nagyon hasonló faj összetételére utal. A termálkútból származó vízminták baktériumközösségei mind a három idényben jelentősen eltértek a langyosvizű kutak baktérium-összetételétől, a legnagyobb eltérést az összes közösségtől a novemberi T6 minta baktériumközössége mutatta. A DGGE vizsgálatok eredményei a mintavételi területek közti különbségek mellett, az egyes területeken lezajló szezonális változásokra is rámutattak. A közösségszerkezetek térbeli eltéréseit a kútvizek eltérő fizikai-kémiai jellemzőihez történő adaptációval magyarázhatjuk, míg feltételezzük, hogy a szezonális dinamikát egyéb fizikokémiai változások, illetve a kutak vízhozamában bekövetkező eltérések idézhetik elő. 202
Molekuláris biológiai vizsgálatok a Hakártyi Gyógyfiirdő karsztkútjaiból származó kénes vizek. T6 M IK>V nov BT2 nov BT1 nov BT: ana BT: api BT1 sua BT1 api M aus M ápr To míg T6 api 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1. ábra A mintázott termelőkutak vizéből származó baktériumközösségek A mintákból készített klónkönyvtárak elemzése során azonosított baktérium taxonok több mint kétharmada anyagcseréjét tekintve obligát vagy fakultatív kén-oxidáló, szulfid-oxidáló, illetve szulfátredukáló baktérium volt (1. táblázat). A kénbaktériumokkal rokon DNS-szekvenciák többségét a langyosvizű büdöstapolcai kutak (BT1, BT2) vízmintáiból tudtuk azonosítani, míg a nem kénbaktériumokkal rokon szekvenciák többségét főleg a szintén langyosvizű mattyi kút mintából, illetve a termálkút mintából tudtuk kimutatni. A klónok összesítése alapján a négy termelőkút baktériumközösségét 34 %-ban az epszilonproteobaktériumok osztályába tartozó klónok, 20 %-ban szulfátredukáló baktériumok, 5 %-ban szulfid-oxidáló fonalas Thiothrix fajok adták és 10 %-ban egyéb kénbaktériumok alkották, míg a nem kénbaktériumok aránya összességében kb. egyharmad volt. 203
Miseta Roland, Palatinszky Márton, Makk Judit, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea 1. táblázat A klónkönyvtárakból azonosított baktérium taxonok és csoportosításuk Kénbaktériumok Klónok száma Nem kénbaktériumok Klónok száma Klónkönyvtár Klónkônyvtár Epsilon-Proteobacterium clone 64 Desulfocapsa sp. 36 Thiothrix fructosivorans 7 BTl BT2 Denitratisoma sp. 35 T6 BT2 Sterolibacterium sp. 3 BTl M Lysobacter brunescens 3 M Sulfuricurvum sp. 5 BTl Calditerrivibrio nitroreducens 3 T6 Thiobacillus sp. 5 BTl M Methyloversatilis universalis 2 BTl Trichlorobacter thiogenes 4 Beta-Proteobacterium clone 2 BT2 Desulfomicrobium thermophilum 4 T6 Lysobacter sp. 2 M Thiothrix unzii 4 BT2 Alpha-Proteobacterium clone 2 M Thiovirga sulfuroxydans 4 Clostridiales bacterium clone 2 T6 Chlorobi bacterium clone 4 T6 Synthropus sp. 1 T6 BT2 M Caulobacteraceae bacterium clone 1 M Sulfurovum sp. 2 Thermodesulfobacteriaceae sp clone 2 T6 Sphingopyxis taejonensis 1 M Thermodesulforhabdus sp. 1 M Sphingopyxis macrogoltabida 1 M Desulfobacterium sp. 1 BT2 Acidovorax facilis 1 M Desulfopita aestaurii 1 BT2 Rhodobacter vinaykumaraii 1 BTl Limnobacter thiooxydans 1 BTl Methylobaclerium radiotolerans 1 T6 Sulfurihydrogenibium azorense 1 T6 Geothrix fermentans 1 BTl Niastella sp. 1 M Sphingobacteriales sp. 1 M Pseudoxanthomonas mexicana 1 M összesen 146 Összesen 65 204
Molekuláris biológiai vizsgálatok a Hakártyi Gyógyfiirdő karsztkútjaiból származó kénes vizek. 4. Következtetések Az obligát és fakultatív kemolitotróf anyagcseréjű kénbaktériumokkal nagy szekvencia hasonlóságot mutató klónok domináns jelenléte arra utal, hogy a vizsgált harkányi termelőkutakra jellemző karbonátos, kénes langyos- és termálvizeket a speciális környezeti feltételekhez adaptálódott, szezonálisan változó és a kén körforgalmában résztvevő mikróbaközösségek jellemezik. A kutak vizében előforduló közös taxonok ellenére baktériumközösségeikben jelentős térbeli és időbeni inhomogenitás figyelhető meg. 5. Köszönetnyilvánítás A kutatást a Harkányi Gyógyfürdő Zrt. támogatta. Irodalomjegyzék Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research., 25: 3389-3402. Aguiar, P., Beveridge,T. J., Reysenbach, A. L.2004. Sulfurihydrogenibium azorense, sp. nov., a thermophilic hydrogen-oxidizing microaerophile from terrestrial hot springs in the Azores. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 33-39. Bak, F. Widdel, F. 1986. Anaerobic degradation of indolic compounds by sulfate-reducing enrichment cultures, and description of Desulfobacterium indolicum gen. nov., sp. nov. Archives of Microbiol, 146: 170-176. Chen, M. Y. Tsay, S. S., Chen,K. Y. Shi,Y. C. Lin,Y. T., Lin, G. H. 2002. Pseudoxanthomonas taiwanensis sp. nov., a novel thermophilic, N 2 0-producing species isolated from hot springs. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52: 2155-2161. Christensen, P.,Cook, F.D. 1978. Lysobacter, a new genus of nonfruiting, gliding bacteria with a high base ratio. International Journal of Systematic and Evolutionary Bacteriology, 28: 367-393. Coates, J. D., Ellis, J. D., Gaw, C. V., Lovley, D. R.1999. Geothrix fermantans gen. nov. sp. nov., a novel Fe(III)-reducing bacterium from a hydrocarbon-contamined aquifer. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 49: 1615-1622. Elshahed, M.S., Senko, J.M., Najar, F.Z., Kenton, S.M., Roe, B.A., Dewers, T.A., Spear, J.R., Krumholz, L.R. 2003. Bacterial diversity and sulfur cycling in a mesophilic sulfide-rich spring. Applied and Environmental Microbiology, 69: 5609-5621. 205
Miseta Roland, Palatinszky Márton, Makk Judit, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea Engel, A. S. Porter, M..L., Stern, L. A. 2004. Quinlan, S., Bennett, P. C.: Bacterial diversity and ecosystem function of filamentous microbial mats from aphotic (cave) sulfidic springs dominated by chemolithoautotrophic,j?psilonproteobacteria" FEMS Microbiology Ecology, 51: 31-53. Fahrbach, M., Kuever, J., Meinke, R., Kämpfer, P., Hollender, J. 2006. Denitratisoma oestradiolicum gen. nov., sp. nov., a 17ß-oestradiol-degrading, denitrifying betaproteobacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 1547-1552. Finster, K., Liesack, W. Thamdrup, B. 1998. Elemental sulfur and thiosulfate disproportionation by Desulfocapsa sulfoxigens sp. nov., a new anaerobic bacterium isolated from marine surface sediment. Applied and Environmental Microbiology, 64: 119-125. Green, P. N. Bousfield, I. J. 1983. Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylobacterium radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb. nov. corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 33: 875-877. Howarth, R., Unz, R. F., Seviour, E. M., Seviour, R. J., Blackall, L. L., Pickup, R. W., Jones, J. G., Yaguchi, J. Head, I. M. 1999. Phylogenese relationships of filamentous sulfur bacteria (Thiothrix spp. and Eikelboom type 02 IN bacteria) isolated from wastewater-treatmentplants and description of Thiothrix eikelboomi sp. nov., Thiothrix urtzii sp. nov., Thiothrix fructosivorans sp. nov. and Thiothrix defluvii sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 49: 1817-1827. lino, T. Nakagawa, T. Koji, M., Harayama, S., Suzuki, K. 2008. Calditerrivibrio nitroreducens gen. nov., sp. nov., a thermophilic, nitrate-reducing bacterium isolated from a terrestrial hot spring in Japan. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58: 1675-1679. Imhoff, J. F. 2003. Phylogenetic taxonomy of the family Chlorobiaceae on the basis of 16S rrna and fmo (Fenna-Matthews-Olson protein) gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53: 941-951. Imhoff, J. F. Caumette, P. 2004. Recommended standards for the description of new species of anoxygenic phototrophic bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 1415-1421. Inagaki, F., Takai, K., Nealson, H. K., Horikoshi, K. 2004. Sulfurovum lithotrophicum gen. nov., sp. nov., a novel sulfiir-oxidizing chemolithoautotroph within the E- Proteobacteria isolated from Okinawa Trough hydrothermal sediments. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 1477-1482. Kalyuzhnaya, M. G., De Marco, P., Bowerman, S., Pacheco, C. C., Lara, J. C., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. 2006. Methyloversatilis universalis gen. nov., sp. nov., a novel taxon within the Betaproteobacteria represented by three methylotrophic isolates International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 2517-2522. 206
Molekuláris biológiai vizsgálatok a Hakártyi Gyógyfiirdő karsztkútjaiból származó kénes vizek. Kodama, Y. Watanabe, K. 2004. Sulfuricurvum kujiense gen. nov. sp. nov., a facultatively anaerobic, chemolithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium isolated from an underground crude-oil storage cavity. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 2297-2300. Lee, J-S., Kook, S-Y. Yoon, J-H., Takeuchi, M, Pyun, Y-R., Park, Y-H. 2001. Sphingomonas aquatilis sp. nov., Sphingomonas koreensis sp. nov. and Sphingomonas taejonensis sp. nov., yellow-pigmented bacteria isolated from natural mineral water. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 1491-1498. Moissl, C., Rudolph, C. Huber, R. 2002. Natural communities of novel Archaea and Bacteria with a string-of-pearls-like morphology: Molecular analysis of the bacterial patterns. Applied and Environmental Microbiology, 68: 933-937. Moussard, H., L'Haridon, S., Tindall, B. J., Banta, A., Schumann, P., Stackebrandt, E. Reysenbach, A. L., Jeanthon, C. 2004. Thermodesulfatator indicus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic chemolithoautotrophic sulfate-reducing bacterium isolated from the Central Indian Ridge. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 227-233. Poindexter, S., Jeanne, L., Cohen-Bazire, G. 1964. The fine structure of stalked bacteria belonging to the family Caulobacteriaceae. The Journal of Cell Biology, 23: 587 607. Reysenbach, A. L., Hamamura, N., Podar, M., Griffiths, E., Ferreira, S., Hochstein, R. Heidelberg, J., Johnson, J., Mead, D., Pohorille, A., Sarmiento, M., Schweighofer, K., Seshadri, R., Voytek M.A. 2009. Complete and draft genome sequences of six members of the Aquificales. The Journal of Bacteriology, 6: 1992-1993. Schneider, K., Culver, D.C. 2004. Estimating subterranean species richness using intensive sampling and rarefaction curves in a high density cave region in West Virginia. Journal of Cave and Karst Studies, 66: 39-45. Sievert, S.M., Kuever, J.: Desulfacinum hydrothermale sp. nov., a thermophilic, sulfatereducing bacterium from geothermally heated sediments near Milos Island (Greece). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50: 1239 1246. Spring, S., Kampfer, P., Schleifer, K. H.: Limnobacter thiooxydans gen. nov., sp. nov., a novel thiosulfate-oxidizing bacterium isolated from freshwater lake sediment. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 1463-1470. Srinivas, T. N. R., Anil Kumar, P., Sasikala, Ch., Ramana, Ch. V. Imhoff, J. F.: Rhodobacter vinaykumarii sp. nov., a marine phototrophic alphaproteobacterium from tidal waters, and emended description of the genus Rhodobacter. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57: 1984-1987. Suzuki, D., Ueki, A., Amaishi, A., Ueki, K. 2007. Desulfopila aestuarii gen. nov., sp. nov., a Gram-negative, rod-like, sulfate-reducing bacterium isolated from an estuarine sediment in Japan. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57: 520-526. 207
Miseta Roland, Palatinszky Márton, Makk Judit, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea Takeuchi, M., Hamana, K.,Hiraishi, A. 2001. Proposal of the genus Sphingomonas sensu stricto and three new genera, Sphingobium, Novosphingobium and Sphingopyxis, on the basis of phylogenetic and chemotaxonomic analyses. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 1405-1417. Tarlera, S., Denner, E. B. 2003. Sterolibacterium denitrificans gen. nov., sp. nov., a novel cholesterol-oxidizing, denitrifying member of the ß-Proteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 53: 1085-1091. Thevenieau, F, Fardeau, M. L, Ollivier, B, Joulian, C, Baena, S. 2007. Desulfomicrobium thermophilum sp. nov., a novel thermophilic sulphate-reducing bacterium isolated from a terrestrial hot spring in Colombia. Extremophiles, 2: 295-303. Tsukasa, I., Kenichi, S., Isao, Y., Yoshinobu, N., Satoshi, O. 2005. Thiovirga sulfuroxydans gen. nov., sp. nov., a chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacterium isolated from a microaerobic waste-water biofilm. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55: 1059-1064. Wever, H. D., Cole, J. R. Fettig, M. R., Hogan, D. A., Tiedje, J. M. 2000. Reductive dehalogenation of trichloroacetic acid by Trichlorobacter thiogenes gen. nov., sp. nov. Applied and Environmental Microbiology, 66: 2297-2301. Weon, Kim, B-Y Yoo, S-H. Lee, S-Y., Kwon, S-W., Go S-J., Stackebrandt, E. 2006. Niastella koreensis gen. nov., sp. nov. and Niastella yeongjuensis sp. nov., novel members of the phylum Bacteroidetes, isolated from soil cultivated with Korean ginseng. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56: 1777-1782. Willems, A., Falsen, E., Pot, B., E. Jantzen, B. Hoste, P. Van Damme, M. Gillis, K. Kersters, J. De Ley 1990. Acidovorax, a new genus for Pseudomonas facilis, Pseudomonas delafieldii, E. Falsen (EF) Group 13, EF Group 16, and several clinical isolates, with the species Acidovorax facilis comb, nov., Acidovorax delafieldii comb, nov., and Acidovorax temperans sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 40: 384-398. Wood, A. P, Kelly, D. P. 1985 Physiological characteristics of a new thermophilic obligately chemolithotrophic Thiobacillus species, Thiobacillus tepidarius. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 35: 434-437. 208