Tejsav észterek előállítása ionos folyadékban végzett enzimkatalitikus észterezéssel Lactic acid ester production by enzymatic esterification in ionic liquids Andreja Dobaj 1, Bányai Tamás 2, Major Brigitta 2, Gubicza László 2 1 University of Maribor, Faculty of Chemistry and Chemical Engineering, Laboratory for separation processes and product design, Smetanova ulica 17, 2000 Maribor, Slovenia 2 Pannon Egyetem, Műszaki Kémiai Kutatóintézet 8200 Veszprém, Egyetem u. 10 Summary Room temperature ionic liquids have been recognized as possible environmentally benign reaction media which will be used in the future as solvent for also biochemical reactions. They have low vapor pressure, good thermal stability and the ability to alter many of their properties by changing the anions and cations. They are not volatile, inflammable, that is the reason why these media start to replace the traditional organic solvents as reaction media. In enzymatic reactions it was established that enzymes can display their effects not only in water and organic solvents but in ionic liquids, as well. Activity, stability and enantioselectivity of the enzyme can be enhanced by ionic liquids. They can be reused very easily, without purifying the enzyme, because the enzyme remains in the ionic liquid phase in case of two phase systems. Lactic acid is a starting compound in many field of chemical industry. Environmentally friendly solvents can be produced by esterification of lactic acid, which procedure may be used for the separation of the lactic acid from other organic acids, too. Applying microwave heating is a new line in different organic synthesis. Ionic liquids can convert the microwave energy to heat with very high efficiency. They can be heated with low energy without evaporation or decomposition. Our experiments for the enzymatic production of butyl lactate were carried out in ionic liquids with microwave heating. It is known from the literature that reaction rates using microwave heating are higher than those with conventional heating. In our experiments the effect of reaction temperature on the reaction rate was investigated. Increasing the reaction temperature reaction rate increased till 60 C, but higher temperature did not effected any increase in reaction rate. Water content of the reaction mixture was also analyzed. In every case at first the initial water amount was enhanced till a maximum level, and after that it started to decrease. The reason of this phenomenon may be that at the beginning of the reaction the monomeric acid content of the lactic acid mixture is rapidly converted to ester. This part of the reaction was represented by the increasing water content. When the free lactic acid content decreased, the conversion of the dimer to monomer became the dominant reaction, which reaction is a water reducing process. The monomeric lactic acid produced converts to ester, that is the reason why higher than 100% yield was achieved during some reaction. Bevezetés Az ionos folyadékok olyan szerves sók, melyek alacsony olvadásponttal rendelkeznek. Ez rendszerint kevesebb, mint 100 C, és általában 300-400 C-ig folyékony halmazállapotúak maradnak. Csak ionokból épülnek fel, semleges molekulákat nem tartalmaznak. Jellemző rájuk, hogy nem illékonyak, nem tűzveszélyesek, kiváló a termikus és kémiai stabilitásuk. Alkalmazásukkal egyrészt kiküszöbölhető a nagy mennyiségű vegyipari szennyvíz keletkezése, kezelése, tisztítása, másrészt elkerülhető a hagyományos szerves oldószerek használatakor keletkező oldószerelegyek regenerálása, jelentős mennyiségű hőenergiát igénylő desztillálása. A hagyományos oldószerektől eltérően, amelyek molekuláris folyadékként jellemezhetők, az ionos folyadékok ionokból állnak. Jóllehet számos ionos folyadék már évtizedek óta ismert, csak az elmúlt néhány évben kerültek a figyelem középpontjába mint a jövőben alkalmazandó, korszerű, környezetbarát reakcióközegek. Ennek a legfőbb oka igen kicsi gőznyomásuk, hőmérsékleti stabilitásuk, valamint az, hogy a kation és az anion megfelelő módosításával széles körben változtathatók bizonyos tulajdonságaik, mint a polaritás, hidrofób jelleg valamint más oldószerekkel való elegyedés. Ezen utóbbi tulajdonságuk alapján az ionos folyadékok tervezhető oldószerek, amelyek sok helyen kiszoríthatják a hagyományos szerves oldószereket. Az ionos folyadékokat felépítő
anionok és kationok száma igen nagy, ráadásul ezek tetszőlegesen kombinálhatóak egymással, így szinte korlátlan számban állíthatóak elő. Az ionos folyadékok alkalmazhatóak szerves szintézisekben, biokatalízisben, elektrokémiában, folyadékkromatográfiában, gázkromatográfiában, kapilláris elektroforézisben, desztillációban és végül, de nem utolsó sorban folyadék-folyadék extrakcióknál. Mivel az ionos folyadékok száma nagy variálhatóságuk miatt óriási, ezért nem egyesével, hanem típusokra bontva tanulmányozták a szerkezetük és a biológiai hatásuk közötti összefüggéseket. Ezen információk alapján következtetéseket vontak le arról, hogy az adott ion-kombináció milyen hatást fejthet ki az élő szervezetekre. Az enzimkatalitikus reakciók területén forradalmi változást jelentett az a felismerés, hogy az enzimek nem csak vízben, hanem ionos folyadékokban is képesek kifejteni hatásukat [1]. Az ionos folyadékok növelhetik az enzim aktivitását, stabilitását és enantioszelektivitását [2]. Nagy előnyük, hogy többszöri alkalommal újra felhasználhatók akár az enzim tisztítása nélkül, mert az enzim az ionos folyadékos fázisban marad, ha kétfázisú rendszerről van szó. Ez nagymértékben csökkenti relatív költségüket egy folyamat során. A termékek kinyerése a hagyományos extrakciós, desztillációs technikák mellett szuperkritikus folyadékok ill. membránok alkalmazásával is lehetséges [3]. Kis molekulasúlyú aroma észterek előállítására széles körben alkalmazza az élelmiszer- gyógyszerés kozmetikaipar a Candida antarctica gombából kinyerhető CALB enzimet [4]. A CALB enzim a biokatalitikus reakciókban leggyakrabban alkalmazott enzimek, a hidrolázok, azon belül is a lipázok családjába tartozik [5]. A tejsav (2-hidroxi-propionsav) megtalálható különböző élelmiszerekben de számos élő szervezet anyagcseréjének közti terméke is. Kis méretű molekula, két különböző funkciós csoporttal hidroxil- és karboxilcsoport ami lehetővé teszi rengeteg különböző kémiai reakcióban való részvételét, ezért a vegyipar számos ágának lehet kiinduló komponense. Polimerizációval politejsav gyártható belőle, ami egy biológiailag lebomló műanyag, kis szénatomszámú alkoholokkal történő észterezésével pedig környezetbarát zöld oldószereket lehet előállítani. Etanollal történő észterezésekor tejsav-etil-észter képződik, mely a természetben is megtalálható aromaanyag és az élelmiszeripar is nagy mennyiségben használja [6]. A tejsav előállítását megnehezíti, hogy nem illékony és nehezen nyerhető ki a fermentléből a többi komponens szerves savak mellől. Tisztítási eljárások közül az észterképzés nagy előnye, hogy képes a különböző szerves savakat a tejsavtól nagy tisztasággal elválasztani, mivel a keletkező, illékony észterek forráspontja eltér, így azok rektifikálással jól szeparálhatók. A szerves szintéziseket jellemzően valamilyen külső hőforrás használatával végzik, amely elég lassú és nem túl hatékony módja a hőközlésnek, ugyanis függ az elegy és a reakcióedény hővezető képességétől. Mikrohullámú hőközlés során az anyag a rá jellemző dielektromos tulajdonságaiból adódóan az elektromos energiát hőenergiává alakítja. Az ionos folyadékok szerkezetükből adódan elsődlegesen jelentős elektromos vezetőképességük miatt a mikrohullámú tér energiáját jó hatásfokkal alakítják át hőenergiává, így viszonylag kis energiával magas hőmérsékletre melegíthetők (100-250 C), anélkül, hogy a bomlanának, vagy párolognának [7]. Tejsav-etil-észter esetében már kísérletek igazolják, hogy a mikrohullámú besugárzással történő észterezés jelentősen csökkenti a reakcióidőt és növeli a hozamot. Mikrohullám és ionos folyadék reakcióközeg együttes alkalmazásával lehetőség nyílik az észterezési reakció magasabb hőmérsékleten történő végrehajtására. Kísérleteinknek több célja is volt. Egyrészt a hőmérséklet emelése, hogy jobban kihasználhatóvá váljanak a mikrohullám adta lehetőségek, illetve minél nagyobb legyen a reakciósebesség. A hőmérséklet emelésének azonban határt szab az etanol alacsony forráspontja. Ebből kifolyólag megvizsgáltuk, hogy nagyobb szénatomszámú alkohollal is végbemegy-e a tejsav észterezése, illetve hogyan alakul a reakció időbeli viselkedése különböző hőmérsékleteken. Továbbá figyelemmel kísértük a víztartalom alakulását a reakcióelegyben, tekintettel arra, hogy inhibítor hatása van az észterképződés folyamatára.
Anyagok és módszerek Enzim: Candida antarctica lipase B, Novozym 435 Novo Nordisk (Bagsvaerd, Dánia) Ionos folyadékok: trihexil-(tetradecil)- foszfónium-dodecilbenzol-szulfonát (Cyphos-202), tributil-tetradecil-foszfónium-dodecilbenzolszulfonát (Cyphos-201), mindkettő IoLiTech GmbH, Németország. Egyéb felhasznált anyagok: (D, L) tejsav 90%- os (Reanal, Magyarország), hexán 96%-os (Scharlau, Spanyolország), etanol abszolút (Spektrum 3D, Magyarország), n-butil-alkohol (Spektrum 3D, Magyarország). GC elemzések: Hewlett Packard 5890 Series II típusú gázkromatográf, kolonna: DB FFAP, fejnyomás: 140kPa, N 2 áramlási sebesség: 12 cm 3 /min, FID detektor. A tejsav etil- illetve butilészter tartalmú, egyfázisú reakcióelegyek elemzésekor 50 μl mintát vettünk, ehhez először 80μl hexánt, majd 5μl vizet adtunk, extraháltuk, majd a hexánnal történő extrakciót még négyszer megismételtük. Az egyesített extraktumot 600 μl térfogatúra hígítottuk hexánnal. Víztartalom mérése: automata Mettler DL 35 Karl-Fischer titrátorral. Hőközlés: Discover típusú mikrohullámú berendezéssel (CEM Corporation, USA), folyamatos kevertetés mellett. Kísérleti módszerek A laboratóriumi tejsav-butil-észter előállítás körülményei: 304 mg (250μl) tejsav elegy (monomer tejsav 53,2 %) tejsavtartalom 2,1 mmol, 644 mg, azaz 14,02 mmol etanol illetve butanol (feleslegben alkalmaztuk), 25 mg Novozym 435 lipáz enzim, 600 mg (0,77 mmol) Cyphos 202 illetve Cyphos 201 ionos folyadék. A reakcióelegyet 5 órán keresztül vizsgáltuk a kiválasztott hőmérsékleten a mikrohullámú berendezésben. A szükséges anyagmennyiségek megállapítása: A korábban, etanollal végzett mérések alapján megállapítottuk, hogy 600 mg ionos folyadék használata elegendő, mert az alkoholt nagy, hétszeres feleslegben alkalmaztuk. Az ionos folyadék így ebben a reakcióban koszolvensként szerepel, ami megvédi az enzimet a kis szénatomszámú alkoholok inhibiciós hatásától és elősegíti az enzim visszanyerését a reakcióelegyből az újrahasznosítási kísérletek során. Az elegy kezdeti víztartalma legnagyobbrészt a felhasznált tejsav elegyből származott (53% monomer tejsav, 26% laktilsav, 14% víz, 7% egyéb oligomer), de a többi kiindulási anyag is tartalmazott kis mennyiségű vizet. Együttes víztartalmukat a kiindulási reakcióelegy víztartalmának mérésével határoztuk meg. A mikrohullámú készülék ismertetése: Az általunk használt CEM Discover berendezés reaktortere egy henger alakú kezelőtér, melybe illeszkedik a reakcióelegyet tartalmazó vastag falú üveg mérőedény. Ide a henger palástján lévő réseken keresztül jut be a mikrohullámú energia. Ez a kialakítás teszi lehetővé, hogy a közölt energia homogén módon oszoljon el, és egyenletesen melegítse a mintát. A kezelőtér alján történik a hőmérséklet mérése egy infravörös hőmérő rendszerrel, így a mintánk aktuális hőmérsékletéről folyamatosan kapunk adatot. A fűtéshez használni kívánt mikrohullámú teljesítmény, a hőmérséklet, az idő az elindított program megszakítása nélkül is módosítható. A tapasztalat azt mutatta, hogy 60, de különösen 70 ºC-on megnő a rendszer tehetetlensége a hirtelen beavatkozásokkal szemben, ezért igyekeztünk a fűtési teljesítményt minél pontosabban beállítani, fontosnak tartottuk, hogy a lehető legrövidebb idő alatt elérje mintánk a kijelölt hőmérsékletet. Ügyelni kellett arra, hogy a hőmérséklet szinten tartásához jelentősen kevesebb energia is elegendő volt, mint a felfűtéshez. 1. ábra: A CEM Discover típusú mikrohullámú készülék fényképe
Eredmények és értékelésük Első lépésben a megfelelő ionos folyadékot, mint reakcióközeget kellett kiválasztani. A korábban megvizsgált 20 ionos folyadék közül 7 olyan volt, melyben végbement a tejsav észterezése etanollal. Ebből ötnél ugyanaz az észterhozam képződött enzim használatával és anélkül is, egy esetben enzim nélkül nem ment végbe a reakció, míg a Cyphos 201 csak kismértékben katalizálta a folyamatot, így erre esett a választás. Az észterhozam alakulásában a következőket tapasztaltuk: mikrohullámú hőközlés esetén gyorsabban ment végbe az észterképződés, mint rázatott lombikos kísérlet során azonos hőmérsékleten [8]. Mikrohullámú kísérleteink során a hőmérséklet emelésével nőtt a termékképződés sebessége, ez látható a 2. ábrán bemutatott grafikonon. 5 víztartalom 4,5 (m/m %) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 idő (h) 0 0 1 2 3 4 5 6 3. ábra: A reakcióelegy víztartalmának változása az idő függvényében a 40 C-on végzett reakció során A növekvő vízmennyiség a monomer tejsav észterré való átalakulását jelezte, kezdetben ez volt a domináns folyamat. Az idő előrehaladtával, ahogy fogyott a monomer tejsav, úgy kezdett előtérbe kerülni a lassúbb folyamat, mely során a dimer forma alakult át monomerré, mely vízfogyasztó reakció, ezt jelezte a víztartalom csökkenése. Ezt a folyamatot mutatja be a 4. ábra. A dimer formából képződött monomer tejsav elreagálva tovább növelte az észter mennyiségét, ez magyarázza a 2. ábrán látható 100% fölötti hozamot a 60 és 70 Con végzett reakciók esetén. 2. ábra: A tejsav-butil-észter képződés sebessége különböző hőmérsékleteken A 60 és a 70 C on végzett kísérlet esetében azonban közel azonos eredményt kaptunk, ami azt jelzi, hogy 60 C-nál magasabb hőmérséklet már nem gyorsítja a reakció lefutását. Megfigyeléseink során megállapítottuk, hogy a víztartalom a kezdetihez képest eleinte nőtt, majd elért egy maximális értéket, amely után csökkenni kezdett. 4. ábra: Az észtrehozam és a víztartalom alakulása az idő előrehaladtával 40 C-on A reakcióelegy víztartalmának változása is igazodott az észterképződés vonatkozásában megfigyelt hőmérsékletfüggéshez, magasabb hőmérsékleten hamarabb lezajlott a víztartalom növekedése majd csökkenése. Összefoglalás Konklúzióként elmondhatjuk, hogy ionos folyadékban mikrohullámú hőközléssel sikeresen hajtottunk végre észterezési reakciót, megvizsgálva
a hőmérséklet emelésének függvényében az észterképződés sebességét illetve a víztartalom alakulását. Megállapítottuk, hogy a hőmérséklet emelése 60 C-ig kedvezően hat a reakciósebesség alakulására, ennél magasabb hőmérséklet alkalmazása azonban nem gyorsítja tovább a reakciót. Irodalomjegyzék [1] Kirchner, G., Schollar, M. P., Klibanov, A. M. J. Am. Chem. Soc., 107, 7072-7076, (1985) [2] Yang Z., Pan W. (2005) Enzyme Microb. Tech. 37, 19-28. [3] Bélafi-Bakó, K., Dörmö N., Ulbert O., Gubicza L. (2002) Desalination 149, 267-268. [4] Sharma R., Chisti Y., Banerjee U.C. (2001) Biotechnol. Adv. 19, 627-662. [5] Houde A., Kademi A., Leblanc D. (2004) Appl. Biochem. Biotech. 118, 155-170. [6] Datta, R., Henry M., J. Chem. Technol. Biot., 81, 1119-1129, (2006) [7] Wakai C., Oleinikova A., M.OTT, Weingartner, H., J. Phys. Chem. B. 109 (36). 17028-30 (2005). [8] Major B., Vrasalovic Presecki A., Kelemenné Horváth I., Vass A., Gubicza L., MKN 2008, Proceedings, 127-131.