1b. FEHÉRJÉK TRANSZPORTJA A MEMBRÁNONOKBA ÉS A SEJTSZERVECSKÉK BELSEJÉBE ÁLTALÁNOS DIA 1 Fő fehérje transzport útvonalak Egy tipikus emlős sejt közel 10,000 féle fehérjét tartalmaz (a test pedig összesen 100,000 félét). A különféle fehérjék kb. fele a sejtmembránba épül be vagy kiválasztódik (szekretálódik). Sok hormon receptor és transzporter protein a plazma membránhoz szállítódik, más fehérjék, pl. az RNS polimeráz és DNS polimeráz a sejtmagba transzportálódnak, míg az extracelluláris mátrix komponensei a sejtfelszínre kerülnek, a hormonok és az emésztő enzimek pedig kiválasztódnak. A fehérjetranszport 3 fő típusát különböztetjük meg: (1) membránokba vagy a membránokon keresztül (mitokondrium, kloroplasztisz, peroxiszóma) történő transzport (2) transzport hólyagok (vezikulumok) általi szállítás (ER, Golgi, lizoszóma, sejtfelszín, endoszóma) (3) a magpóruson keresztül történő fehérje transzport (sejtmagba, vagy sejtmagból) Az 1A DIÁ-n a (2)-es típusú útvonala szekretoros, a másik kettőt pedig nem-szekretotos útvonalaknak nevezzük. Az újonnan szintetizált fehérjék szállítását a rendeltetési hely felé a fehérjék célbajuttatásának (angolul: protein targeting vagy protein sorting) nevezzük, mely két alapvetően különböző mechanizmust foglal magában. A nem szekretoros útvonal során a fehérjék egyedileg szállítódnak, míg a szekretoros útvonal a fehérjék nagy tömegben való szállítását teszi lehetővé. Mindkét esetben szignál szekvenciák határozzák meg a szállítás célpontját. Az egyedileg szállított fehérjék maguk tartalmazzák ezt a szignált, míg a szekretoros útvonal esetén ez a szignál vezikulumok felszínén található. Mindkét esetben a transzport infrastruktúráját a mikrotubulusok alkotják, a szállítás pedig a motorfehérjék segítségével megy végbe (ezek felismerik a szállítandó fehérjéket). 1 DIA 1C (A) A nem-szekretoros útvonal során egy fehérje egy sejtszervecske (organellum) membránjába vagy a belső üregébe kerül (lumen) kerül. A membrán proteinek esetén a célbajuttatás a lipid kettős rétegbe való beépüléshez vezet, míg a vízoldékony fehérjék esetében, a fehérje a sejtszervecske belsejébe kerül. Ebben a folyamatban a riboszómákon keletkezett fehérjék (1) vagy a citoplazmában maradnak ha nincs szignál szekvenciájuk; (2), vagy mitokondriumba (3), a kloroplasztiszba (4), a peroxiszómába (5) ill. a sejtmagba (6) szállítódnak. DIA 1C (B) A szekretoros útvonal azokra a fehérjékre jellemző, amelyek az durva-felszínű ER membránba integrálódnak, vagy azért mert az ER membránja vagy lumene a végcéljuk, vagy csak átmenetileg tartózkodnak ebben a sejtszervecskében. Ebben az útvonalban a fehérjék mozgásának iránya a következő lehet: az újonnan képződött fehérje (1) a durva-felszínű ER felé irányítódik (2), majd innen a Golgiba (3), innen pedig a plazma membránba (4a), vagy a lizoszómákba (4b) kerülnek, vagy kiválasztódnak a sejtből (nincs ábrázolva). Az ER-ba való irányítás során a fehérjék szintézise még folyamatban van. A Golgi, a lizoszómák ill. a citoplazma membrán felé való szállítás a transzport vezikulumokban (szállító hólyagocskákban) történik. A vezikulumok membrán lefűződéssel válnak le a donor (küldő) sejtszervecskékről, majd membránfúzió révén ürítik a tartalmukat a cél-organellumokba. A szekretoros útvonal során képződött fehérjéket szekretoros proteineknek nevezzük. Megjegyzés: az ER-ba való transzport célja kettős lehet: az ER lehet a fehérje transzport végcélja, vagy csak átmeneti állomása. Azok a fehérjék, amelyek végleges helye az ER, szintén a szekretoros útvonalra
kerülnek, mivel, rendszerint a Golgi készülékbe transzportálódnak, ahol poszt-transzlációs módosításokon (pl. glükoziláció) mennek keresztül, majd visszakerülnek az ER-ba. Minden mrns a citoplazmás riboszómákon kezd el szintetizálódni, de a szekretoros útvonal fehérjéit leolvasó riboszómák az ER-hoz vándorolnak, s ott folytatják a transzlációt. Az ER-hez való transzportot a fehérjéken lévő ER szignál szekvenciák határozzák meg. Azt az információt, amely meghatározza, hogy hová kerüljön egy protein, egy az N-terminálison elhelyezkedő 20-50 aminosavat tartalmazó aminosav szekvencia hordozza, melyet szignál szekvenciának nevezünk (a szignál szekvenciát nem tartalmazó fehérjék a citoplazmában maradnak). Minden sejtszervecske tartalmaz olyan receptorokat, amelyek felismerik a szignál szekvenciákat pontosabban a szignál szekvenciákhoz kapcsolódó szignál felismerő részecskéket (SRP; signal recognition particle), így biztosítván, hogy a fehérje megfelelő helyre kerüljön. Amint egy szignál szekvenciát tartalmazó fehérje kapcsolatba lép (az SRP-n keresztül) a megfelelő receptorral, a fehérje egy ún. transzlokációs csatornába kerül, amely lehetővé teszi a membránon való áthaladást. Ezt követően, bizonyos típusú fehérjék a membránban maradnak, mások pedig tovább szállítódnak a sejtszervecske valamilyen szub-kompartmenjébe, mely folyamathoz más szignál szekvenciák és receptorok is szükségesek. A szignál szekvenciákat - a feladatuk elvégzését követően - egy specifikus proteáz (szignál peptidáz) eltávolítja a fehérjéből. 2 TRANSZPORT AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUMBA A szekretoros proteinek transzlokációja az ER membránon át A szekretoros proteinek a citoszólban lévő riboszómákon kezdenek el szintetizálódni. Ezt követően, a fehérje N-terminálisán elhelyezkedő 16-30 aminosavból álló szignál peptid (= szignál szekvencia) egy specifikus SRP-hez kapcsolódik, ami az ER membránja felé irányítja a riboszómákat, ahol megkezdődik a még szintetizálódó fehérjék ER membránon keresztüli transzlokációja (áthelyeződése). A különböző szekretoros proteinek szignál szekvenciája egy vagy több pozitív töltésű aminosavat tartalmaz, mely 6-12 hidrofób aminosavval határos, de egyébként más hasonlósággal nem rendelkeznek. A legtöbb szekretoros protein szignál szekvenciája levágódik még azelőtt, hogy a fehérje transzlációja befejeződött volna, ezért az érett fehérjék zöme nem tartalmaz az ER felismeréséhez szükséges szignál szekvenciát. A célba juttatás (targeting) két kulcskomponense a (1) szignál-felismerő részecske (SRP) és az SRP-t felismerő (2) SRP receptor, mely az ER membránban helyezkedik el. Az SRP egy citoplazmás ribonukleoprotein (egy 300 nukleotidból álló RNS-ből és 6 fehérje alegységből álló komplex), amely átmenetileg kapcsolódik a képződő fehérje ER szignál szekvenciájához, a riboszóma nagy alegységéhez, és az SRP receptorhoz (= szignál szekvencia receptor). Az SRP és az SRP receptor nem csupán a fehérje és az ER membrán kölcsönhatását segítik, hanem engedélyezik a fehérjeszintézis elongációját is, de csak az ER membrán jelenlétében (tehát, az SRP szabályozza a transzlációt). Végső soron, az SRP és az SRP receptor funkciója a fehérjéket szintetizálódó riboszómák ER membránhoz való szállítása. A riboszóma és a képződő fehérjelánc átkerül az ún. transzlokonra (másnéven transzlokációs csatorna), ami egy 3 fehérje által bélelt csatorna a membránban. A transzláció előrehaladtával a növekvő fehérjelánc a riboszóma nagy alegységéről közvetlenül a transzlokon központi pórusába kerül. A 60S riboszómális alegység úgy helyezkedik el, hogy a növekvő peptidlánc nem kerül érintkezésbe a citoplazmával, és nem kezd kialakulni a 3D-s szerkezete. A transzlokon egy szabályozott csatorna, csak akkor nyílik ki, ha hozzákötődik a riboszóma-fehérje komplex. Az ER lumenében a szignál peptidáz enzim levágja a növekvő polipeptid szignál szekvenciáját. Ez a proteáz egy transzmembrán ER protein, amely a transzlokonhoz kapcsolódik. A szignál szekvencia eltávolítását követően a szintetizálódó fehérjelánc áthalad a transzlokonon keresztül, s az ER lumenébe kerül. A transzlokon addig van nyitott állapotban, amíg a transzláció be nem fejeződik, s a teljes polipeptid lánc át nem kerül az ER lumenébe.
DIA 2 ER szignál szekvencia A fehérjeszintézis során a riboszómákon készülő szignál szekvenciát tartalmazó polipeptidek, még a szintézis befejezése előtt elkezdik transzportjukat az ER-ba. 1. A fehérjeszintézis a citoplazmában kezdődik, majd a durva-felszínű ER-on folytatódik. 2. A polipeptid szignál szekvenciája a szignál felismerő részecskéhez (SRP) kötődik, majd az SRP-t felismeri az ER membrán receptor proteinje (SRP receptor). 3. A SRP leválik, a szignál szekvencia pedig a receptor csatornáján áthalad. 4. Az ER-ban a szignál szekvenciát a szignál peptidáz enzim eltávolítja. 5. A polipeptid lánchosszabbodása (elongáció) folytatódik. 6. A transzláció befejeződik. 7. A riboszóma leválik, a fehérje pedig feltekeredik (kialakul a normál térszerkezete chaperonok segítségével) az ER-ban. Megjegyzés: ez az ábra nem tartalmazza az SR-t és annak receptorát. 3 Az ER-ben képződő fehérjék többsége elhagyja az ER-t (az ER-ben maradást egy 4 aminosavból álló peptid szignál határozza meg: lys-asp-glu-leu). Az ER-ről lefűződő transzport vezikulumok a Golgi felé veszik az útjukat, ahol a szállított fehérjék glükozilálódnak, majd a sejten belüli transzportjukat (sejtmembrán vagy a lizoszómák) további szignál szekvenciák és a glükozilációval kapcsolódott oligoszacharidok határozzák meg. Azok az ER-ba került fehérjék, amelyeknek nincsenek egyéb szignáljai, kiválasztásra kerülnek. Néhány szignál szekvencia-féleség elnevezése: a sejtmagba irányító szignál szekvencia neve NLS (nuclear localization signal); a mitokondriumba irányító szignál: MTS (mitochondrial targeting signal), a sejtmagvacskába az NoLS (nucleolar localization signal) irányít, a CTS (chloroplast transit signal) a kloroplasztiszba, a PTS (peroxisomal targeting signal) pedig a peroxiszómákba irányít. A szignál szekvenciák rendszerint a fehérjék N-terminálisán helyezkednek el, kivéve a PTS2-t, ami a C-terminálison található (de a PTS1 az N-terminálison). A szignál szekvencia egyéb elnevezései: szignál peptid, lokalizációs szignál, targeting szignál és tranzit peptid. Szignál szekvenciának nevezik a szignál peptidet kódoló DNS régiót is. A szignál szekvenciák felfedezéséért Günter Blobel Nobel díjban részesült (1999). Megjegyzés: azoknak a fehérjéknek, melyek NoLS szekvenciákat tartalmaznak, rendelkezniük kell NLSel is a sejtmagba való bejutáshoz. DIA 3 Protein transzport az ER-ba röviden: csak az előző ábrán nem említetteket tárgyaljuk. A riboszómákat, az mrns-t és a képződő fehérjét szállító SRP és az SRP receptor kapcsolódását erősíti a GTP kötődése mind az SRP-hez és az SRP receptorhoz. Ezt követően az SRP receptor közelében lévő zárt transzlokon közelébe kerül a riboszóma a növekvő fehérje lánccal, ami a transzlokon kinyílását eredményezi. Az SRP és az SRP receptor GTP-jének a hidrolízise (GDP-vé alakulása) biztosítja az energiát a polipetid áthaladáshoz a transzlokon központi pórusán, s közben az inaktívvá vált SRP leválik a szignál szekvenciáról. A folyamat további részleteit illetően ld. DIA3. DIA 4 A szignál felismerő részecske szerkezete és alegységeinek funkcióit illetően ld. az ábrát. Egy SRP 6 fehérje alegységből és egy 300 bp hosszúságú kis nem-kódoló RNS-ből (7 SL RNS) áll. Általánosan az ilyen fehérje-rns komplexeket ribonukleo-proteineknek (RNP)-knek nevezzük. A P68/P72 és a P9/P14 alegységek dimereket alkotnak. A fehérje alegységeket gyakran P (pl. P54, P19) helyett SRP -nek nevezik (SRP54, SRP19).
Proteinmódosítás, folding és minőségkontroll az ER-ben A durva felszínű ER felszínén képződő membrán fehérjék és az oldható szekretoros fehérjék 4 fő módosuláson esnek át mielőtt elérik a rendeltetési helyüket: (1) glükoziláció (szénhidrátok hozzáadása és módosítása az ER-ben és a Golgi-ban) (2) diszulfid híd képzése az ER-ben (3) a polipeptid lánc helyes térszerkezetének kialakítása (folding = hajtogatás, tekeredés) és a több alegységből álló proteinek összeszerelődése (4) specifikus proteolitikus vágások az ER-ban, a Golgi-ban és a szekretoros vezikulumokban A durva felszínű ER-ok felszínén képződő fehérjék túlnyomó többségéhez szénhidrátok kapcsolódnak, s így a glükoziláció a legfontosabb poszt-transzlációs módosítás. A glükoproteinek szénhidrát lánca kapcsolódhat a szerin és a treonin hidroxil csoportjához (O-kapcsolt oligoszacharid), vagy az aszparagin amid nitrogénjéhez (N-kapcsolt oligoszacharid). Az O-kapcsolt oligoszacharidok, mint pl. a kollagénhez kapcsolt típusok, csak 1-4 cukor alegységet tartalmaznak, míg a gyakoribb N- kapcsolt oligoszacharidok komplexebbek, több elágazást tartalmaznak az emlős sejtekben. Az N-kapcsolt oligoszacharidok az ER-ben szintetizálódnak, majd kémiailag módosulnak az ER-ban, s főként a Golgi-ban. A diszulfid híd képződés a folding és a multimer fehérjék összeszerelődése a durva felszínű ER-ben történik, csupán helyesen összeszerelt fehérjék transzportálódnak az ER-ből a Golgi komplexbe, majd onnan a végső célállomásra, a nem megfelelően összeszerelt fehérjék szelektíven visszatartódnak az ER-ben. 4 DIA 5 (1) Glükoziláció Az N-kapcsolt oligoszacharidok bioszintézise a durva felszínű ER-ban történik egy előre elkészített oligoszacharid prekurzor (14 alegységből áll) fehérjéhez való hozzáadásával. Ez a prekurzor ugyanaz az állatokban, a növényekben és az egysejtűekben: egy elágazó oligoszacharid, amely 3 glükózt, 9 mannózt, és 2 N-acetilglükózamin molekulát tartalmaz. Ez az elágazó szénhidrát szerkezet módosul az ER-ben és a Golgi-ban. A glükoproteinek oligoszacharidjai különféle funkciót töltenek be: (1) ER-ben való összeszerelődésben (néhány protein esetében); (2) stabilitásban (sok szekretált protein esetében); (3) a sejt adhézióban; (4) más sejtfelszíni molekulák szénhidrát oldalláncai immunválaszt képesek kiváltani. (2) Diszulfid híd (nincs DIA) Mind az intra- és intermolekuláris diszulfid hidak ( S S ; két cisztein által létesített) a fehérjék harmadlagos- és negyedleges szerkezetét stabilizálják. A diszulfid kötések a durva felszínű ER lumenében képződnek, tehát, csak a szekretoros proteinekben és a membrán fehérjék exoplazmás doménjeiben fordulnak elő. A citoszólikus és organellum fehérjék nem tartalmaznak diszulfid hidakat. A diszulfid híd kialakulását a protein diszulfid izomeráz (PDI) enzim végzi, mely különösen nagy mennyiségben fordul elő a máj és a hasnyálmirigy szekretoros sejtjeiben. A diszulfid híd kialakulása szekvenciálisan történik, tehát, a ciszteinek a képződésük sorrendjében kapcsolódnak össze egymással. Néha, a szekvenciális összekapcsolódás nem megfelelő. Például, a proinzulin 3 diszulfid hídja szekvenciálisan képződik (1 2, 3 4, 5 6 a ciszteinek kötési sorrendje), de az érett fehérje már 1-4, 2-6, és 3 5 sorrendben tartalmazza a ciszteineket. Az újrarendeződést szintén a PDI enzim végzi. DIA 6 (3) Chaperonok és egyéb ER proteinek segítik a fehérjék foldingját és összeszerelését Habár sok denaturált fehérje képes in vitro körülmények között spontán újra kialakítani a natív 3D-s szerkezetét, ez a folyamat több órát vesz igénybe. Az ER-ben képződő membrán fehérjék azonban a keletkezésüket követően néhány perc alatt kialakítják a normális térszerkezetüket. Ezt a folyamatot specifikus ER lumenben előforduló proteinek végzik. A trimer szerkezetű hemagglutinin (HA 0 ) molekula feltekeredését mutatjuk be az ábrán. A BiP (binding immunoglobulin protein), mely egy chaperon, átmenetileg kapcsolódik a képződő fehérjékhez, s ezáltal megakadályozza hibás foldingot és az aggregátumok képződését. A PDI is részt vesz a fehérje stabilitás kialakításában (diszulfid híd kialakítása). Két másik ER protein, a kalnexin és a kalretikulin (ezek ún. lektinek; szénhidrát-kötő fehérjék) szelektíven kötnek bizonyos N-kapcsolt oligoszacharidokat a még nem összeállt vagy rosszul összeállt proteineken, s ezáltal megakadályozza az aggregációjukat. Egy másik fontos proteinfolding katalizátor a peptidil-prolil izomeráz, amely felgyorsítja a peptidil-prolil kötések körüli rotációt. A fenti kölcsönhatások révén kialakult HA 0 monomer egyetlen -hélix segítségével beépül a membránba. A transzmembrán szegmensek kölcsönhatása következtében kialakul a stabil trimer szerkezet. Megjegyzések: (1) Az oligoszacharil transzferáz a glükozilációért felelős enzim. (2) A prolin a fehérjelánc görbületeinek kialakulásában kulcsszerepet játszik: a prolin cisz transz konformáció váltását (izomerek) a peptidil-prolil izomeráz enzim katalizálja.
A MEMBRÁN FEHÉRJÉK OSZTÁLYAI DIA 7 Az integráns fehérjék 4 topológiai osztálya A membránfehérjék jellemzője, hogy hány membránba épülő szegmenst tartalmaznak. Egy szegmens 20-25 hidrofób aminosavból áll, s -hélix szerkezetű. Az integráns membrán proteineket 4 topológiai (térszerkezeti) csoportba lehet sorolni. Az I., II. és III. topológiai osztályú fehérjék egyetlen transzmembrán szegmenst tartalmaznak. Az I. típusú proteinek N-terminális vége a lumen belsejében helyezkedik el (a szignál szekvenciája levágódott), a C- terminális része pedig a citoszólba lóg. A II. típusú proteinek esetében fordított a helyzet: az N- terminális a citoszól felé, a C-terminális pedig a lumen belseje felé néz. A III. típusú proteinek az I. típusú fehérjékhez hasonló szerkezetűek, de nincs levágható szignál szekvenciájuk. A IV. típusú fehérjék többszörös membrán-átszelő szegmenst tartalmaz (az ábra egy G protein-kapcsolt receptort mutat be: e receptor család jellemzője a 7 transzmembrán szegmensből álló szerkezet). 5 Az I. típusú membrán proteinek esetében 2-, a II. és III. típusú proteineknél 1-, a IV. típusú fehérjéknél pedig változó számú szekvencia határozza meg a membránba való integrációt és a membránban való elhelyezkedés irányultságát (orientációt); ezeket a szekvenciákat topogén szekvenciáknak nevezzük. DIA 8 I. típusú membrán proteinek Minden I. típusú transz-membrán protein tartalmaz egy N- terminális szignál szekvenciát (ER-szignál peptid: az ER-be irányítja a fehérjét) és hidrofób aminosavakból álló -hélixet, ami az ER membránba ágyazódik. Amint a növekvő polipeptid lánc N- terminálisa belép a lumenbe, a szignál szekvencia levágódik. A szekretoros proteinekkel szemben, a polipeptid nem halad tovább a lumen felé, mert egy a fehérje közepén elhelyezkedő, 22 hidrofób aminosavból álló szekvencia megállítja a transzfer folyamatát. Ez a belső topogén szekvencia, lévén hidrofób, képes laterális (oldali) irányban mozogni a transzlokonon át, s így a foszfolipid kettősrétegbe kerül, ahol lehorgonyoz. E kettős funkciója miatt, ezt a 22 aminosavból álló szakaszt stop-transzfer horgony szekvenciának nevezzük. A transzlokáció megszakítását követően a transzláció folytatódik a riboszómákon. A fehérje C-terminálisa a citoszólba kerül. Ezek a fehérjék tehát két topogén szekvenciát tartalmaznak: (1) a szignál szekvencia és (2) a stop-transzfer horgony szekvencia. Megjegyzés: a durva-felszínű ER membránjába beépülő fehérjék ezen típusa tehát nem kerül a Golgiba, hanem ottmarad az eredeti helyén. Más ER fehérjék azonban a szekretoros útvonalon eljutnak a Golgiba, majd visszaszállítódnak az ER-be. DIA 9 II. és III. típusú membrán proteinek, eltérően az I. típusú fehérjéktől, nem rendelkeznek N- terminális ER szignál szekvenciával. Ehelyett, mindkettő tartalmaz egy egyedi belső hidrofób szignálhorgony szekvenciát, amely kettős funkcióval rendelkezik: 1. ER szignál szekvencia (ezt ismeri fel egy SRP) és 2. membrán-kihorgonyzó szekvencia. A II. és III. típusú proteinek ellentétes orientációban helyezkednek el a membránban; ez a különbség a szignál-horgony szekvenciájuk orientációjától függ. (a) A II. típusú fehérjék esetében a szignál-horgony szekvencia úgy irányítja a fehérjeláncot a membránba, hogy az N-terminus a citoszól felé néz. Ez a szekvencia nem vágódik le, és a transzlokonban marad, mialatt a C-terminális régió benyomul az ER lumenébe. A szintézis alatt a szignál-horgony szekvencia laterálisan mozog, s bekerül a foszfolipid rétegbe, ahol membrán horgonyként funkcionál. (b) A III. típusú proteinek esetében, a szignál-horgony szekvencia, mely az N- terminushoz közel helyezkedik el, a növekvő láncot fejjel az ER lumen felé irányítja. A szignál-horgony szekvencia szintén megakadályozza a polipeptid lánc ER lumenben való haladását, s stop-transzfer szekvenciaként funkcionál. A beépülés orientációját meghatározó szignál-horgony szekvenciák egyik sajátossága, hogy a hidrofób szegmens közelében nagy sűrűségben fordulnak elő pozitív töltésű aminosavak, melyek, valamilyen ok miatt, a citoszólban való elhelyezkedést preferálják, s ezáltal meghatározzák a fehérje transzlokonban való orientációját. A II. típusú proteinek szignál-horgony
szekvenciákhoz képest az N-terminális oldalon tartalmazzák a pozitív töltésű aminosavakat, míg a III. típusúak a C-terminálisuk felé. Megjegyzés: az ábrán csak a II. típusú fehérjéket mutatjuk be. DIA 10 IV. típusú membrán proteinek: többszörös belső topogén szekvenciák A IV. típusú proteinek 2 altípusba sorolhatóak, attól függően, hogy az N-terminálisuk a citoszólba vagy az exoplazmás térbe (ER: lumenbe; plazma membrán: extracelluláris térbe) nyúlik. Ezt az N-terminálishoz legközelebb elhelyezkedő hidrofób szegmens és az ezt határoló szekvenciák töltése határozza meg. Ha egy IV. típusú protein páros számú transzmembrán -hélixet tartalmaz, akkor mind az N- és a C-terminus a membrán ugyanazon oldalán fog elhelyezkedni. Ellenben, ha a protein páratlan számú transzmembrán szegmenst tartalmaz, a két vég a membrán ellenkező oldalán fog elhelyezkedni. Mindkét típus tartalmaz belső stop transzfer horgony (STA) és szignál horgony (SA) szekvenciákat. IV-A típusú proteinek: N-terminus a citoszólban Ebbe a típusba tartoznak pl. a különféle glükóz transzporterek és a legtöbb ioncsatorna. Ezeknél a proteineknél az N-terminálishoz legközelebbi hidrofób szegmens a citoszól felé orientálja az N- terminálist (mint a belső szignál-horgony szekvencia a II. típusú fehérjéknél). A transzláció során a láncnövekedés folytatódik egészen a 2. hidrofób -hélix képződéséig, ami megakadályozza a transzlokonon keresztül való további haladást (hasonlóan az I. típusú fehérjék stop-transzfer szekvenciáihoz). Az első két transzmembrán szegmens szintézisét követően a fehérje mindkét vége a citoszólban helyezkedik el, míg a köztük lévő hurok az ER lumenében. A C-terminus tovább növekszik a citoszólban (mint az I. és III. típusú fehérjéknél). A 3. -hélix egy másik szignál-horgony szekvenciaként funkcionál, míg a 4. -hélix egy stop-transzfer szekvencia szerepét tölti be. 6 IV-B típusú proteinek: N-terminus az exoplazmás térben A G-protein-kapcsolt receptorok családja alkotja a IV-B típusú proteinek legnépesebb csoportját. Ezek a proteinek 7 transzmembrán -hélixet tartalmaznak, az N-terminálisuk az exoplazmás térbe (lumen vagy extracelluláris tér) irányul, s az N-terminusokhoz legközelebb eső -hélixet egy pozitív töltésű aminosavakból álló szekvencia követi (hasonlóan a III. típusú fehérjékhez). Ez azt eredményezi, hogy az első -hélix a növekvő polipetid lánc N-terminálisa az ER lumenbe kerül. A lánc növekedésével, a váltakozó szignál-horgony és stoptranszfer szekvenciák segítségével, a fehérje beépül a membránba. DIA 11 Egy foszfolipid horgony bizonyos sejtfelszíni proteineket kipányváz a membránban Néhány sejt-felszíni molekula nem hidrofób aminosavak által horgonyzódik a sejtmembránba, hanem kovalensen kötött amfipatikus molekulák által; ilyen pl. a glükozil-foszfatidil-inozitol (GPI). Ezek a fehérjék - hasonlóan az I. típusú fehérjékhez - az ER membránba épülnek be. A folyamatot az N-terminális szignál szekvencia és belső stop-transzfer horgony szekvencia irányítják. A transzamináz enzim (ER membránban helyezkedik el) azonban eltávolítja az eredeti stop-transzfer horgony szekvenciát (ezzel együtt a C- terminális szekvenciákat is) és a maradék fehérjét elszállítja egy GPI horgonyhoz. A citoszólba nyúló domén eltávolítása pl. azzal a következménnyel jár, hogy a GPI-hez kötött fehérjék könnyen mozoghatnak a membránban. Ezzel szemben sok olyan protein, amely transzmembrán -hélixekkel rögzül a membránban, immobilizálódik (mozgásképtelenné válik), mert a citoszólba nyúló C-terminális szekvenciák kölcsönhatásba lépnek a citoszkeletonnal. PROTEIN TRANSZPORT A MITOKONDRIUMBA A citoszól riboszómáin képződő fehérjék a mitokondriumba, a kloroplasztiszba és a peroxiszómákba transzportálódnak. A mitokondrium és a kloroplasztisz kettős membránnal határolt, míg a peroxiszómákat egyrétegű membrán veszi körül (csak a mitokondriumokat tárgyaljuk). Azok a fehérjék, melyeket a mitokondrium (és a kloroplasztisz) saját DNS-e kódol a sejtszervecskék riboszómáin képződnek, és közvetlenül a képződés után a megfelelő al-kompartmentekbe vándorolnak. A mitokondrium (és kloroplasztisz) fehérjéinek többsége azonban a sejtmagban kódolt, ezért azokat transzportálni kell a sejtszervecskékhez. Megjegyzés: a mitokondrium (és kloroplasztisz) DNS-e bakteriális eredetű. Az idők során a DNS szekvenciák zöme eliminálódott (eltűnt), egy jelentős része a magi DNS-be került (ennek mechanizmusát nem ismerjük), s csupán egy kis része maradt a sejtszervecskékben. Azok a prekurzor fehérjék, amelyek a mitokondrium mátrixába (ill. a kloroplasztisz sztrómájába) kerülnek specifikus mátrix targeting szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a sejtszervecske felszínén elhelyezkedő receptorokhoz való kapcsolódásért felelősek. Ezek a szekvenciák
rendszerint levágódnak a mátrixba kerülést közben. A mitokondriumba és a kloroplasztiszba irányuló transzport energiaigényes, az energianyerés a külső és belső membrán érintkezésénél történik. A kettős membrán miatt, az ezekbe a sejtszervecskékbe történő transzport két targeting szekvenciát és két membránhoz kötött transzlokációs rendszert kíván: az egyik a szervecskéhez való transzporthoz, a másik pedig a sejtszervecske belsejébe, vagy annak membránjába való bejutáshoz szükséges. Amfipatikus N-terminális szignál szekvenciák irányítják a fehérjéket a mitokondriális mátrixba Az összes fehérje, amelyik a citoszólból a mitokondriumba szállítódik, a targeting szignáljukban szekvenciálisan hasonló motívumokkal rendelkezik. Ezek közül a legismertebbek a mátrix-targeting szekvenciák, 20-50 aminosavat tartalmaznak, a fehérje N-terminálisán helyezkednek el, -helikális szerkezűek: a spirál egyik oldalán pozitív töltésű aminosavak, a másikon pedig hidrofób aminosavak dominálnak ezt nevezzük amfipatikus sajátságnak. DIA 12 (1) Transzport a mitokondrium mátrixba (mátrix proteinek szállítása) A mitokondriális protein importhoz szükségesek külső-membrán receptorok és transzlokonok mindkét membránban. A citoszólban való szintézist követően a fehérjék a mitokondrium felszínéhez kerülnek, s a prekurzor fehérjék közvetlenül kerülnek kapcsolatba a mitokondrium import receptorával (nincs SRP). A 3D-s konformációjú fehérjék membránon való áthaladása nem lehetséges, ezért nem teljesen kész fehérjék szállítódnak a mitokondriumba. (1) A chaperonok, mint pl. a citoszólikus Hsc70 a fehérjéket össze nem tekeredett (unfolded) vagy részlegesen összetekeredett állapotban tartják. (2) E fehérjék mitokondriális (mátrix) targeting szekvenciái a külső mitokondriális membrán import receptorához kapcsolódnak. Az N-terminális mátrix targeting szekvenciákat a Tom20 és Tom22 (translocon of the outer membrane; a külső membrán transzlokonja) import receptor fehérjék ismerik fel, amik, ezt követően (3) a prekurzor proteineket egy import csatornához szállítják. Ezt a csatorna a Tom40 protein. (4, 5) A mátrixba kerülő prekurzor fehérjék transzportja egyidejűleg történik a külső és a belső membránon egy belső membrán csatornán át, amely Tim23 és Tim17 proteinekből áll (translocon of the inner membrane; a belső membrán transzlokonja). A mátrixba történő transzlokáció a két membrán egymáshoz közeli, kontakt helyein történik. A transzfer folyamatot a mátrix Hsc70 chaperon segíti (a chaperont a Tim44-hez való kötődés hozza közel a transzlokonhoz), melyhez az energiát az ATP-ből szerzi. (6) A mátrix-targeting szekvenciát egy proteáz enzim levágja a mitkondriális mátrixban, s ezzel egyidejűleg a Hsc70 leválik a fehérjéről. (7) Néhány importált fehérje esetében spontán kialakul az aktív térszerkezet, sok mátrix fehérjének azonban chaperoninek segítenek ebben. 7 DIA 13 Többszörös szignálok és útvonalak irányítják a proteineket a szubmitokondriális kompartmentekbe Eltérően a mátrixba való transzporttól, fehérjék szállítása a mitokondrium külső- és belső membránjába, vagy a membránok közötti térbe, általában több targeting szekvencia és több útvonal részvételét követeli meg (ld. lentebb). A dia teljes anyaga csak illusztrációként szolgál, nem kell megtanulni. DIA 14 (2) Transzport a belső mitokondrium membránba (belső membrán proteinek szállítása) Három különböző útvonal irányítja a fehérjéket a belső mitokondrium membránba. (A) Az A útvonal ugyanazt a molekuláris mechanizmust használja, amely a mátrixba szállítja a proteineket (ld. DIA 12). Például, a citokróm oxidáz CoxVa alegysége szállítódik ezen az útvonalon. A prekurzor CoxVa N-terminális mátrix-targeting szekvenciáját a dimer szerkezetű Tom20/22 import receptor ismeri fel. Ezt követően a fehérje átjut a külső membrán általános import pórusán (Tom40) és a belső membrán Tim23/17 transzlokációs komplexén. A mátrix-targeting szekvencián (amely levágódik az import közben) kívül a CoxVa tartalmaz még egy hidrofób stop-transzfer szekvenciát is. A transzfer folyamatot a mátrix Hsc70 chaperon segíti (a chaperont a Tim44-hez való kötődés hozza közel a transzlokonhoz), melyhez az energiát az ATP-ből szerzi. Ahogy a fehérje áthalad a Tim23/17 csatornán, a stop-transzfer szekvencia blokkolja a C-terminus belső membránon keresztüli transzlokációját, majd ezt követően laterálisan (oldal irányban) szállítódik a lipid kettős rétegben. (B) A belső membránba történő szállítás B útvonalát az ATP szintetáz 9-es alegységének transzportja révén mutatjuk be. Ez a fehérje tartalmaz egy mátrix-targeting szekvenciát és egy belső hidrofób domént, melyet egy belső membrán protein, az Oxa1 ismer fel. Ez az útvonal magában foglalja a prekurzor protein egy részének a mátrixba való transzportját a Tom20/22 és Tim23/17 csatornák segítségével. A mátrix-targeting szekvencia levágását követően, a fehérje a belső membránba épül be egy olyan folyamat révén, amelyhez az Oxa1 protein szükséges. A Hsc70 chaperon ebben a folyamatban is részt vesz. (C) A C útvonal a 6 membrán domént tartalmazó fehérjék szállítását végzi. Ezek a fehérjék nem rendelkeznek N-terminális mátrix-targeting szekvenciával, de többszörös belső mitokondriális targeting szekvenciákat tartalmaznak. A belső szekvenciákat a Tom70 ismeri fel, majd ezután az importált fehérjék áthaladnak a külső membrán általános import pórusán. Ezt követően, a protein egy a belső membránban elhelyezkedő 2. transzlokációs komplexhez szállítódik (Tim22/54 komplex). Ezt a folyamatot két kis protein, a dimert alkotó Tim9 és Tim10 (intermembrán térben helyezkednek el) chaperonként segíti. A Tim22/54 komplex felelős a többszörös hidrofób szegmensek belső membránba való beépüléséért.
DIA 15 (3) Transzport a mitokondriális inter-membrán térbe (Inter-membrán-tér proteinek szállítása; inter-membrán = membránok közötti) Két útvonalon kerülhet egy citoszólikus fehérje a külső vagy a belső mitokondriális membrán közé. (A) A fő útvonalat a citokróm b2 fehérje transzportjával illusztráljuk. E fehérje prekurzora két különböző N-terminális targeting szekvenciát tartalmaz, melyek a folyamat végén levágódnak. Az N-terminálishoz közelebb eső szekvencia, egy mátrixtargeting szekvencia, melyet a mátrix proteázok vágnak le. A második targeting szekvencia egy hidrofób szegmens, amely blokkolja az import fehérje teljes transzlokációját a belső membránon keresztül. Ezt követően a membránba ágyazott fehérje laterálisan diffundál a Tim23/17 transzlokációs csatornától elfelé, közben egy proteáz levágja a hidrofób transzmembrán szegmenst, s így a maradék fehérje az intermembrán térbe kerül. (B) A citokróm c hem liáz (a hem citokróm c-hez való kovalens kötődésért felelős enzim) transzportján keresztül illusztráljuk ezt a mechanizmust. Ebben az útvonalban a protein közvetlenül szállítódik az intermembrán térbe, az általános import póruson (Tom40) keresztül, transzlokációs faktorok részvétele nélkül. Nincs DIA (4) Transzport a külső mitokondrium membránba (külső membrán proteinek szállítása) A mitokondriális porin (P70) szolgáltat példát erre a transzport folyamatra. A fehérjén egy rövid mátrix-targeting szekvencia (N-terminálison) követően egy hosszú hidrofób szekvencia található; az utóbbi hiányában a fehérje a mátrixban halmozódik fel. Ebből az következik, hogy a hidrofób szekvenciák stop-transzfer szekvenciákként funkcionálnak, melyek megakadályozzák a protein mátrixba való transzportját és kikötik azt a külső membránhoz. Normálisan, sem a mátrix-targeting-, sem a stop-transzfer szekvencia nem vágódik le a fehérjéről. 8