A citoszkeletális rendszer, motorfehérjék. Citoszkeleton: eukarióta sejtek dinamikus fehérjevázrendszere Három fő filamentum-osztály: A. Intermedier B. Mikrotubulus C. Mikrofilamentum SCIENCE PHOTO LIBRARY Huber Tamás 2014. 11. 18. 20 µm citokeratin (PANC1) alfa-tubulin (HeLa) aktin (endothel sejtek) Abcam plc, 332 Science Park, Cambridge CB4 0WN, United Kingdom Donald E. Ingber, The Architecture of Life Scientific American, Jan. 1998 Szerep: 1. mozgás, alakváltozás, 2. sejtosztódás, 3. intracelluláris transzport Mikrofilamentum rendszer (aktin) Aktin monomer: 4 nukleotid 2 Globuláris (G-) aktin : MW: 42,3 kda, 375 aminosav Nukleotidot (ATP, ADP) köt Kétértékű kationt köt (Ca 2+, Mg 2+ ) 4 szubdoménre osztható 3 1 Polimerizáció a polimer képződésének időbeli folyamata, monomerek egymáshoz kapcsolódása polimer-mennyiség lag elongáció steady-state A polimerizáció fázisai: 1. Lag fázis: nukleáció 2. Növekedési fázis 3. Dinamikus egyensúly idő 1
Intensity (CPS) Valódi equilibrium: Polimerizációs egyensúlyok Aktin polimer: 37 nm Filamentális (F-) aktin: Legnagyobb mennyiségben előforduló fehérje az eukarióta sejtben (~ 5%) Tread-milling (taposómalom): aktin Dinamikus instabilitás: mikrotubulusok ~7 nm vastag, hossza in vitro több 10 µm, in vivo 1-2 µm Jobbmenetes dupla helix Szemiflexibilis polimerlánc (perzisztenciahossz: ~10 µm) Szerkezeti polarizáció: miozin fejjel alkotott komplexe szögesdrót alakja alapján: szöges vég: "barbed end (+ vég) polimerizáció gyors, hegyes vég: "pointed end (- vég) polimerizáció lassú Motorfehérjéi: miozinok Fluorimetriás polimerizációs esszé Polimerizáció vizsgálata (TIRFM) 1200000 1000000 800000 ctrl + ABP 600000 400000 200000 0 0 5000 10000 Time (s) http://www.bms.ed.ac.uk/research/others/smaciver/protocols/pyrene_files/pyreneprep.htm 2
Tubulin monomer: Mikrotubuláris rendszer Polimer: mikrotubulus ~25 nm-es átmérő, üreges cső, 13 protofilamentum MW: ~50 kda, idegszövetben az összfehérje 10-20%-a jobbmenetes rövidmenetû helix, balmenetes hosszúmenetû helix - és -tubulin alkot heterodimért GTP vagy GDP nukleotidot köt kicserélhető ( ), ill. nem kicserélhető ( ) Merev polimerlánc (perzisztenciahossz: néhány mm!) Szerkezeti polarizáció: + vég: polimerizáció gyors, - vég: polimerizáció lassú Motorfehérjéi: dinein, kinezin, dinamin Sejtosztódás Monomer: Intermedier filamentális rendszer Az intermedier filamentum alegysége: coiled-coil dimer N-terminális fej, centrális rúd (α-helix), C-terminális farok hidrofób aminosavak heptád ismétlődése a centrális rúdban Wadsworth Center's Featured Image - Archives Vimentin dimer szalagdiagramja 3
Intermedier filamentumok Citoszkeleton vizsgálata biomimetikus esszével I. A sejtben teljesen polimerizált állapotban találhatók (nincs polimerizációs-depolimerizációs dinamizmus) Centrális rudak hidrofób-hidrofób kölcsönhatása: coiled-coil dimer 2 dimer antiparallel elrendeződése: tetramer (szerkezeti apolaritás) protofilamentum Tetramerek longitudinális sorozata: protofilamentum 8 protofilamentum: filamentum, 8-10 nm-es átmérő filamentum Bugyi et al., FEBS Letters 582 (2008) 2086 2092 Citoszkeleton vizsgálata biomimetikus esszével II. Epitheliális sejtek Salmonella typhimuriummal fertőzve Készítették: Julie Theriot & Dan Portnoy Készítette: Dr. Bugyi Beáta Theriot Lab, Department of Biochemistry, Beckman Center, Stanford University Medical School, in Palo Alto, CA. 4
Citoszkeletonhoz asszociált fehérjék Különböző funkciójú fehérjék nagy csoportja, mely a citoszkeletális rendszer egyes filamentumaihoz specifikusan kapcsolódik Csoportosítás: A. Filamentális rendszer szerint 1. Aktin-asszociált (pl. miozin) 2. MT-asszociált (pl. tau) 3. IF-asszociált (pl. plektin, citokeratin) B. Kapcsolódás geometriája szerint 1. Véghez kapcsolódó ( capping, pl. gelsolin) 2. Oldalról kapcsolódó (pl. tropomiozin) C. Funkció szerint 1. Keresztkötő a. Gélformáló (pl. filamin, spektrin) b. Kötegformáló (pl. α-aktinin, fimbrin, villin) 2. Polimerizációt befolyásoló a. Depolimerizáló ( severing, pl. gelsolin) b. Stabilizáló (pl. profilin, tropomiozin) 3. Motorfehérjék Motorfehérjék 1. Specifikus citoszkeletális filamentumhoz kapcsolódnak 2. A filamentum mentén elmozdulnak, illetve erôt fejtenek ki 3. ATP-t/ GTP-t bontanak A motorfehérjék típusai 1. Aktin-alapú motorok: miozin fehérjecsalád. Konvencionális (miozin II) és nemkonvencionális miozinok Miozin I-XVIII osztályok 2. Mikrotubulus alapú motorok a. Dinein Ciliáris (flagelláris) és citoplazmás dineinek. A mikrotubuluson a minusz vég irányába mozognak b. Kinezin Neuronokban, axonális vezikulum transzportért felelôsek Kinezin fehérjecsalád: konvencionális kinezinek + izoformák. A mikrotubuluson a plusz vég irányába mozognak c. Dinamin GTP-áz aktivitás, vezikulumok lefűzésében van szerepük 3. Nukleinsav alapú motorok DNS és RNS polimerázok A DNS szál mentén mozognak és erôt fejtenek ki 4. Rotációs motorok Forgómozgást hoznak létre /pl.: F1F0 ATP-szintáz, bakteriális flagellum motor/ ATP hidrolízis ciklus Kapcsolt Szétkapcsolt off Munka arány: r off A motorfehérje munkaciklusa total kapcsolás In vitro csúszási sebesség: v munkacsapás visszacsapás Kapcsolt idô: v = munkatávolság szétkapcsolás Ciklusidô: total 1 V =munka- vagy lépéstávolság; V=ATPáz sebesség; v=motilitási sebesség 5
Gyöngyök távolsága Munkaciklus arány: Miozin szupercsalád r V v Processzív motor: r->1 pl. kinezin, DNS-, RNS-polimeráz munkaciklus nagy részében kapcsolt állapotban Nonprocesszív motor: r->0 pl. miozin II. munkaciklus nagy részében szétkapcsolt állapotban sokaság mûködik együtt Egyetlen motorfehérje által kifejtett erô: néhány pn. Miozin II., egy nem-processzív motor fehérje Lépkedő miozin V. (realtime) Three bead assay N. Kodera et al., Nature 468, 72 (2010). Idő Knight et al., Progress in Biophysics & Molecular Biology 77 (2001) 45 72 6
Köszönöm a figyelmet! 7