IN VIVO ÉS IN VITRO GENOTOXIKOLÓGIAI VIZSGÁLATI MÓDSZEREK TAPASZTALATAI A VÁLTOZÓ MÓDSZERTANI KÖVETELMÉNYEK ÉS JOGSZABÁLYOK TÜKRÉBEN Vértesi Adél, Béres Erzsébet, Sebestyén István, Hirka Gábor, Toxi-Coop Kutatóközpont Zrt., Balatonfüred
Áttekintés - Genotoxikológiai vizsgálataink célja - Nemzetközi irányelvek (OECD, EC, EPA, ICH, ISO, EMEA, etc.) - OECD irányelvek (Organisation for Economic Cooperation and Development: Nemzetközi Együttműködési és Fejlesztési Szervezet, OECD) - Genotoxikológia a TOXI-COOP ZRT-ben: - Baktériumokon végzett reverz mutációs vizsgálat Ames teszt (OECD 471) - Emlőssejteken végzett in vitro génmutációs vizsgálatok (OECD 476) - In vitro kromoszómaaberrációs vizsgálat (OECD 473) - In vivo emlős eritrocita mikronukleusz teszt (OECD 474)
Ames teszt (OECD 471) - Auxotróf mutáns baktériumok (indikátorszervezetek) - Salmonella typhimurium, Escherichia coli WP2 uvra - Reverz mutáció - Génmutációk
In Vitro Génmutációs Vizsgálatok - Kulcs-enzimek a purinbázisok mentési reakciójában (salvage reakciók) Timidin-kináz (Mouse Lymphoma Assay, MLA) - Egér limfóma L5178Y TK +/- -3.7.2C - Toxikus bázisanalóg: Trifluorotimidin (TFT) Hipoxantin-guanin-foszforibozil transzferáz (HPRT) - Kínai aranyhörcsög ovárium CHO-K1, vagy tüdő fibroblaszt V79 - Toxikus bázisanalóg: 6-tioguanin (6-TG)
In Vitro Kromoszómaaberrációs Vizsgálat - Kínai aranyhörcsög ovárium CHO-K1, vagy tüdő fibroblaszt V79 - Kromatid-, és kromoszómaszintű strukturális aberrációk: törések, átrendeződések, deléciók - Numerikus: endoreduklikáció, poliploidia
In Vivo Emlős Eritrocita Mikronukleusz Teszt - NMRI BR egerek csontvelői polikromáziás eritrocita - Mikronukleált polikromáziás eritrociták számának emelkedése a kezelt állatokban a kontrollhoz képest - A mikronukleuszt tartalmazó polikromáziás eritrociták megemelkedett száma kromoszómaaberrációkra utal: acentrikus kromoszóma, visszamaradt kromoszóma fragmentumok, teljes kromoszómák - Az in vivo mikronukleusz teszt klasztogén és aneugén anyagok kimutatását is lehetővé teszi.
Az OECD Irányelvek Változásai I. - változások a genotoxikológia területén; - ismeretanyag, tapasztalat gyűlt össze az irányelvekben foglalt módszerek alkalmazása során; - változások gazdasági területen; - szabályozó, korlátozó rendeletek (pl.: REACH rendelet életbe lépése 2007-ben); - állatvédelmi szempontok a genotoxikológia területén: - más toxicitási tesztekkel való kombináció lehetősége, - pozitív kontroll állatok számának indokolt csökkentése. A teszteknek hatékonyabbaknak, gyorsabbaknak, és olcsóbbaknak kellene lenniük, ugyanakkor az érzékenységüknek, és specifitásuknak nem szabad csorbát szenvednie.
Az OECD Irányelvek Változásai II. Életbe lépés Felülvizsgálat 471 Bacterial Reverse Mutation Assay 1983 1997 473 In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test 1983 474 Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test 1983 476 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test (In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests using the Hprt and xprt genes) 1984 1997 / 2014 / 2016 1997 / 2014 / 2016 1997 / 2015 / 2016 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay 2014 2016 490 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests Using the Thymidine Kinase Gene 2015 2016
Mini-Ames Screening Salmonella typhimurium TA98 Salmonella typhimurium TA100 Salmonella typhimurium TA1535 Salmonella typhimurium TA1537 Escherichia coli WP2 uvra 4-Nitro-1,2- phenylenediamine, NPD Sodium azide, SAZ 9-Aminoacridine, 9AA Methyl methanesulfonate, MMS 2-aminoanthracene, 2AA Dimethyl sulfoxide Water Test Item
OECD 476: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test using the Hprt and xprt genes 3-6 óra + és -S9 Mix 20 óra, -S9 Mix 3-5 óra: + és -S9 Mix Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: 10 mm vagy 5 mg/ml vagy 5 μl/ml Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: 10 mm vagy 2 mg/ml vagy 2 μl/ml Párhuzamosok száma: 2 / koncentráció Párhuzamosok száma: 4 / koncentráció 2 x 4 millió / koncentráció 4 x 10 millió / koncentráció Történelmi kontroll: min-max tartomány Történelmi kontroll: C-Chart szerint
Történelmi kontroll adattábla (C-Chart)
OECD 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: relatív túlélés alapján (RCC %) Legmagasabb vizsgálandó koncentráció: RPD (%) vagy RICC (%) alapján 100 + 100 metafázis (koncenrációnként, párhuzamosonként) 150 + 150 metafázis (koncenrációnként, párhuzamosonként) Történelmi kontroll: min-max tartomány Történelmi kontroll: C-Chart szerint
OECD 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test PCE/MCE arány: 200 sejt PCE/MCE arány: 500 sejt Állatonként 2000 PCE Állatonként 4000 PCE Történelmi kontroll: min-max tartomány Történelmi kontroll: C-Chart szerint
OECD 489: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay - sejtek agaróz gélbe ágyazása - lízis - DNS denaturáció - elektroforézis - neutralizálás - festés, értékelés 14
OECD 489: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay - érzékeny; - egyszerre két vagy több szövettípus vizsgálata; - viszonylag kevés sejtet igényel; - minden olyan szövettípuson elvégezhető, melyből jó minőségű sejtszupenzió állítható elő; - könnyen kombinálható más toxikológiai vizsgálatokkal. 15
csóvahoszz (µm) % csóva DNS OTM OECD 489: In Vivo Mammalian Comet Assay 40 35 25 20 30 25 15 20 10 15 10 5 0 gyomor vékonybél máj 5 0 gyomor vékonybél máj 140 120 100 80 60 40 20 0 gyomor vékonybél máj 16
Összefoglalás - A vizsgálatok tervezése - OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris
Köszönöm a figyelmet! Béres Erzsébet Biermanné Major Erika Buda Tamás Fekete Mónika Fekete Stella Frank Zoltánné Hirka Gábor Jurácsikné Sereg Kornélia Kékesiné Forintos Anita Kurdiné Pongrácz Nóra Mesterháziné Kővári Edi Sebestyén István Szabóné Lennert Mariann Vértesi Adél