Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai program Programvezető: Dr. Rontó Györgyi Budapest, 2006 A negyedleges szerkezet szerepe a kis hő-sokk fehérjék chaperon működésében Doktori értekezés tézisei Böde Csaba Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Témavezető: Dr. Fidy Judit
.
1. Bevezetés A kis hő-sokk fehérjék (shsp vagy más néven -hő-sokk fehérjék [?]) a dajkafehérjék egyik legsokszínűbb családját alkotják [?], az archebaktériumoktól a gerincesekig szinte minden élő szervezetben megtalálhatóak. A család tagjai közti homológia sokkal kisebb, mint más dajkafehérje családokban, azonban minden kis hő-sokk fehérje közös vonása a körülbelül 80 aminosav hosszúságú homológ -krisztallin domén, amely a család egyik fontos tagjáról, a szemlencsében felfedezett -krisztallinról kapta a nevét [?]. Az alfa-krisztallin domén jelenléte alapján (azaz szerkezeti és nem funkcionális alapon) azonosítják be a család különböző tagjait. Jelenlegi tudásunk alapján a kis hő-sokk fehérjék nem vesznek részt közvetlenül a fehérjék tekeredésében. Elsődleges feladatuk a stressz hatására aggregálódó fehérjék megkötése [?]. A kis hő-sokk fehérjék a szervezetben legtöbbször nagyméretű oligomereket képeznek, bár monomer egységeik (alegységeik) molekulatömege mindössze 12 és 43 kda között van [?]. Az egyes tagok oligomerizációja, és az oligomer szerkezet stressz hatására bekövetkező változásai a kis hő-sokk fehérjék családján belül nagyon különbözőek lehetnek [?]. Továbbá többségük negyedleges szerkezete is többféle lehet, oligomer populációjuk heterogén [?,?], vagyis egyszerre különböző méretű és szerkezetű oligomereket tartalmaz. E szerkezeti heterogenitás az oka annak, hogy kevés kis hő-sokk fehérjéről áll rendelkezésre röntgendiffrakciós szerkezeti modell, mivel a heterogén oligomerpopuláció miatt e fehérjéket nem lehet kristályosítani. Az oligomer szerkezet kialakulása a chaperon működés előfeltétele [?,?], az azonban nem ismert, hogy pontosan milyen negyedleges szerkezeti változások szükségesek a megfelelő chaperon működéshez. Munkánk során két kis hő-sokk fehérjét vizsgáltunk, a emlősök szemlencséjéből származó -krisztallint, illetve a Methanococcus jannaschii archebaktériumból származó 16.5 kda tömegű kis hő-sokk fehérjét (MjHSP16.5). Az MjHSP16.5 röntgendiffrakciós szerkezete ismert, és esetében eddig csupán 24 alegységből álló oligomereket figyeltek meg, más negyedleges szerkezetet nem [?]. Az - krisztallin negyedleges szerkezete nem ismert, azonban feltételezték [?], hogy a fehérje oligomer méretének növekedése szükséges a nagyobb chaperon aktivitás eléréséhez. 1
2. Célkitűzés Munkánk során célunk a következő kérdések vizsgálata volt: Milyen oligomer szerkezetű kis hő-sokk fehérjék képesek chaperon hatást kifejteni? Mi a szerepe a kis hő-sokk fehérjék többségénél megfigyelhető heterogén negyedleges szerkezetnek e fehérjék chaperon működésében? Köthető-e a chaperon működés egy jól definiált negyedleges szerkezethez? Milyen kölcsönhatások játszhatnak szerepet a kis hő-sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításában? 3. Módszerek Munkánk során marha szemből izolált -krisztallint használtunk. A frissen vágott állatok szemlencséjéből izolált -krisztallin aktivitását irodalmi adatokkal összevetve ellenőriztük. Az E. coli baktériumban kifejezett MjHSP16.5 fehérjét Prof. K.K. Kim (Suwon Egyetem, Dél-Korea) bocsátotta rendelkezésünkre [?], akivel munkacsoportunk együttműködésben áll. A fehérjék szerkezetét két módszerrel: nagy nyomás rövid ideig tartó alkalmazásával és a környezeti ph rövid ideig tartó, savas irányú megváltoztatásával módosítottuk, majd vizsgáltuk az ennek hatására bekövetkező szerkezeti és funkcionális változásokat. A nagy nyomás különösen alkalmas az oligomer szerkezetű fehérjék vizsgálatára, mivel a másodlagos szerkezet sérülése nagyobb nyomáson következik be, mint az oligomer szerkezet disszociációja. Ezáltal lehetőségünk van az oligomer szerkezet tanulmányozására a fehérje denaturációja nélkül, amit semmilyen más módszerrel nem tudunk megtenni. A környezeti ph változása az aminosav oldalláncok töltésein keresztül hat a fehérjék szerkezetére. Kis ph változás az oldallácok által kialakított gyenge kötések felbomlásához, míg nagy ph változás a fehérje denaturációjához vezet. Az -krisztallin esetében a chaperon aktivitás mérését inzulin aggregációs teszttel végeztük [?], amely során az inzulin aggregációjának gátlásával jellemezhetjük a chaperon aktivitást. Az MjHSP16.5 fehérje esetében rodanáz aggregációs tesztet használtunk a fehérje termofil jellege miatt. 2
A fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezeti változását fluoreszcencia spektroszkópiával (triptofán illetve ANS jelölés), illetve Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiával vizsgáltuk. Az oligomerek disszociációját és a fehérjék negyedleges szerkezetét sztatikus fényszórással, illetve illetve az MjHSP16.5 esetében natív poliakrilamid gélelektroforézissel követtük nyomon. 4. Eredmények és következtetések 1. Az -krisztallin esetében kimutattuk, hogy a nagy nyomással (<400 MPa) való kezelés a chaperon aktivitás növekedését okozza. Ezáltal bebizonyítottuk, hogy többféle, in vitro chaperon aktivitással rendelkező negyedleges szerkezete is létezik. Nagy nyomás segítségével megfigyeltük az -krisztallin oligomerek részleges disszociációját, míg a rövid ideig tartó ph stressz hatására az oligomerek aggregálódtak. Mindkét kezelés az chaperon aktivitás növekedését okozta, azonban a nagy nyomással elért aktivitásnövekedés légköri nyomásra visszatérve 2 0,5 órás relaxációs idővel eltűnt. Ezzel szemben a rövid ideig tartó savas ph-sokkal elért aktivitásnövekedés még hosszú idő (1 nap) után is megyfigyelhető volt. Vagyis a fehérje chaperon működését több, különböző negyedleges szerkezet mellett is megfigyeltük. 2. Kimutattuk, hogy az -krisztallin esetében nem szükséges az oligomerek méretének növekedése a chaperon aktivitás növekedéséhez, kisebb méretű oligomerek is képesek védőhatást kifejteni. 3. Felderítettük az MjHSP16.5 fehérje nyomás hatására történő disszociációjának egy lehetséges mechanizmusát és eközben először figyeltünk meg a 24 alegységből álló oligomer formától különböző, chaperon aktivitással rendelkező negyedleges szerkezetet. A fehérjét korábban mindig csak 24 alegységből álló oligomer formában sikerült megfigyelni, az egyértelműen definiált negyedleges szerkezet tette lehetőve a fehérje kristályosítását is [?]. Nagy nyomáson végzett natív poliakrilamid gélelektroforézis mérések segítségével felderítettük az MjHSP16.5 fehérje nyomás hatására történő disszociációjának egy lehetséges mechanizmusát. Eszerint a disszociáció során első lépésben az oligomerek felfúvódnak, belső üregükbe feltehetően víz jut. Ezután történik a disszociáció, melynek során először a 24 alegységből álló oligomerek két, 12 alegységből álló kisebb oligomerre esnek szét. Ezzel párhuzamosan az elvégzett chaperon aktivitás vizs- 3
gálatok azt mutatták, hogy ez a szerkezet is aktív. 4. Kísérleteink alapján arra következtethetünk, hogy a kis hő-sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításában az intermolekuláris -kölcsönhatások mellett lényeges szerepük van a gyenge, másodlagos kötőerőknek is. Az elvégzett szerkezeti méréseinkből meg tudtuk állapítani, hogy milyen kölcsönhatások vesznek részt a kis hő-sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításában. Az általunk vizsgált kis hő-sokk fehérjék infravörös elnyelési spektrumában az amid I sávban található egy komponens 1688 cm -nél, ami az intermolekuláris -kölcsönhatások jelenlétére utal. Ezek az intermolekuláris -lemezek megfigyelhetőek mindhárom eddig ismert szerkezetű kis hő-sokk fehérje (MjHSP16.5, Búza HSP16.9, TSP36) röntgendiffrakciós szerkezetén is. Amennyiben megfigyeljük a fehérjék disszociációjának nyomásfüggését, azt összehasonlítva az 1688 cm komponens nyomás hatására megfigyelhető gyengülésével azt tapasztaljuk, hogy a fehérjék disszociációja kisebb nyomáson elkezdődik, mint az 1688 cm -nél található infravörös elnyelési komponens gyengülése. A disszociáció mindkét fehérje esetében 50 MPa nyomásnál megfigyelhető, míg az intermolekuláris -kölcsönhatások erősségére jellemző 1688 cm - nél található infravörös elnyelési komponens gyengülés -krisztallinnál 200 MPa, MjHSP16.5 fehérje esetében pedig 1700 MPa nyomás felett látható. Azaz a fehérje disszociációja nem jár együtt az intermolekuláris -kölcsönhatások gyengülésével, ami alátámasztja a gyenge kötőerők szerepét az -krisztallin negyedleges szerkezetének kialakításában. 5. Az -krisztallin esetében kimutattuk, hogy savas ph-n történő denaturáció után a natív (ph 7) környezetet visszaállítva a fehérje másodlagos szerkezete gyorsan visszaáll, a negyedleges szerkezet ezzel szemben nem. Ilyen állapotban a fehérje chaperon aktivitása nagyobb, ami megerősíti azt a feltételezést, hogy a kis hő-sokk fehérjéknek fontos szerepük van a savas környezet és többek között az Ischémia-Reperfúziós károsodás elleni védekezésben. 4
5. Saját közlemények jegyzéke Cikkek referált folyóiratban 1. S. V. Avilov, Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, A. S. Klymchenko, J. Fidy, A. P. Demchenko. Heat perturbation of bovine eye lens alpha-crystallin probed by covalently attached ratiometric fluorescent dye 4 -diethylamino-3- hydroxyflavone. Biopolymers (2005) 78, 340-348 IF: 2.863 2. S. V. Avilov, Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, A. S. Klymchenko, J. Fidy, A. P. Demchenko. Temperature effects on alpha-crystallin structure probed by 6-bromomethyl-2-(2-furanyl)-3-hydroxychromone, an environmentally sensitive two-wavelength fluorescent dye covalently attached to the single Cys residue. International Journal of Biological Macromolecules (2005) 36, 290-298 IF: 1.328 3. F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller, K. K. Kim, K. Heremans, J. Fidy. Pressure activation of the chaperone function of small heat-shock proteins. Cell. Mol. Biol. (2004) 50, 361-369 IF: 0.873 4. Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, L. Smeller, K. Heremans, S. V. Avilov, J. Fidy Chaperone-like Activity of a-crystallin is Enhanced by High Pressure Treatment. Biochemical Journal (2003) 370, 859-866. IF: 4.101 5. L. Smeller, F. Meersman, F. Tölgyesi, Cs. Böde, J. Fidy, K. Heremans. From aggregation to Chaperoning: Pressure effect on Intermolecular Interactions of Proteins High Pressure Research (2002) 22, 751-756. IF: 0.414 A publikációk összesített impakt faktora: 9.579 Poszterek és előadások 1. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins poszter 30. FEBS kongresszus, 2005. 07. 02-07. Budapest, Magyarország 2. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins poszter 29. FEBS kongresszus, 2004. 06. 26-07.01. Varsó, Lengyelország 5
3. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins poszter 2003 Gordon Research Conference on Proteins 2003. 06. 23-27. Holderness School NH. USA. 4. Böde Cs., Tölgyesi F., Smeller L., Fidy J.: Szerkezeti perturbációk hatása az alfa-krisztallin chaperone működésére előadás MBFT Vándorgyűlés 2003. 08. 24-27. Szeged. 5. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, J. Fidy: Az alfa-krisztallin chaperone működésének vizsgálata előadás Ph.D. tudományos napok 2003. 04. 10-11. Budapest 6. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, S. Avilov and J. Fidy: High pressure induced chaperone activity at alpha-crystallin poszter FEBS Forum for Young Scientists 2002 10. 18-20. Isztambul, Törökország 7. Cs: Böde, F: Tölgyesi, L. Smeller, K. Heremans, J. Fidy: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Oligomeric Protein Alpha Crystallin poszter 2002. High Pressure Bioscience and Biotechnolgy, 2002. 09. 16-19. Dortmund, Németország 8. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, J. Fidy: Az alfa-krisztallin chaperone működésének vizsgálata előadás Ph.D. tudományos napok 2002. 06. 7.- 8. Budapest 9. Cs. Böde, K. K. Kim, L. Smeller, F. Tölgyesi, J. Fidy: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Protein Oligomer Alpha Crystallin poszter XIV. International Biophysical Congress 2002. 04. 27-05. 01. Buenos Aires, Argentína 10. J. Fidy, F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Oligomeric Protein Alpha Crystallin poszter 2002. Gordon Research Conference on Protein Folding Dynamics 2002. 01. 20-25. Ventura, CA, USA 11. L. Smeller, F. Meersman, Cs. Böde, F. Tölgyesi, J. Fidy, K. Heremans: Intermolecular Interactions of Proteins Affected by Pressure Aggregation, Dissociation, Chaperoning előadás European High Pressure Research Group Conference 2001. 09. 16.-19. Santander, Spanyolország 6
12. F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller, K. Heremans, Sz. Avilov, J. Fidy.: Nagy nyomás által kiváltott chaperon aktivitás alfa-krisztallinnál előadás Magyar Biofizikai Társaság 20. Kongresszusa, 2001. Júl. 5-7. Budapest 13. Cs. Böde: Az alfa-krisztallin chaperone működésének vizsgálata. XXV. OTDK Fizika szekció, Biofizika, Radioaktív környezetvizsgálat tagozat, 2001. 1. Díj 14. Cs. Böde: Az alfa-krisztallin chaperone működésének vizsgálata. XXV. OTDK Orvostudományi szekció, Biokémia tagozat, 2001. 3. Díj 15. F. Tölgyesi, L. Smeller, Cs. Böde, K. Módos, K. Heremans, J. Fidy.: Pressurization of alpha-crystallin Induces Chaperone Activity poszter III. International Conference on Molecular Recognition 2000. 08. 12-16. Pécs 16. R. Galántai, F. Tölgyesi, L. Smeller, Cs. Böde, J. Fidy Pressure Perturbation of The Structure of alpha-crystallin and its Relation to Chaperone Activity Poszter 2000. FASEB Summer Research Conference Saxtons River Vermont, USA Hivatkozások [1] F. Narberhaus: Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network, Microbiol Mol Biol Rev 66 (2002), 64 93. [2] M. Haslbeck, T. Franzmann, D. Weinfurtner és J. Buchner: Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins, Nat Struct Mol Biol 12 (2005), 842 6. [3] W. W. de Jong, G. J. Caspers és J. A. Leunissen: Genealogy of the alphacrystallin small heat-shock protein superfamily, Int J Biol Macromol 22 (1998), 151 62. [4] K. Rajaraman, B. Raman, T. Ramakrishna és C. M. Rao: The chaperonelike alpha-crystallin forms a complex only with the aggregation-prone molten globule state of alpha-lactalbumin, Biochem Biophys Res Commun 249 (1998), 917 21. 7
[5] D. A. Haley, M. P. Bova, Q. L. Huang, H. S. McHaourab és P. L. Stewart: Small heat-shock protein structures reveal a continuum from symmetric to variable assemblies, J Mol Biol 298 (2000), 261 72. [6] M. R. Leroux, R. Melki, B. Gordon, G. Batelier és E. P. Candido: Structurefunction studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides, J Biol Chem 272 (1997), 24646 56. [7] M. Haslbeck: shsps and their role in the chaperone network, Cell Mol Life Sci 59 (2002), 1649 57. [8] N. Lentze, S. Studer és F. Narberhaus: Structural and functional defects caused by point mutations in the alpha-crystallin domain of a bacterial alphaheat shock protein, J Mol Biol 328 (2003), 927 37. [9] K. C. Giese és E. Vierling: Changes in oligomerization are essential for the chaperone activity of a small heat shock protein in vivo and in vitro, J Biol Chem 277 (2002), 46310 8. [10] D. R. Kim, I. Lee, S. C. Ha és K. K. Kim: Activation mechanism of hsp16.5 from methanococcus jannaschii, Biochem Biophys Res Commun 307 (2003), 991 8. [11] M. R. Burgio, C. J. Kim, C. C. Dow és J. F. Koretz: Correlation between the chaperone-like activity and aggregate size of alpha-crystallin with increasing temperature, Biochem Biophys Res Commun 268 (2000), 426 32. [12] K. K. Kim, H. Yokota, S. Santoso, D. Lerner, R. Kim és S. H. Kim: Purification, crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from methanococcus jannaschii, a hyperthermophile, J Struct Biol 121 (1998), 76 80. [13] Z. T. Farahbakhsh, Q. L. Huang, L. L. Ding, C. Altenbach, H. J. Steinhoff, J. Horwitz és W. L. Hubbell: Interaction of alpha-crystallin with spinlabeled peptides, Biochemistry 34 (1995), 509 16. [14] K. K. Kim, R. Kim és S. H. Kim: Crystal structure of a small heat-shock protein, Nature 394 (1998), 595 9. 8
6. Köszönetnyilvánítás Egy ekkora munkát nem lehet segítség és támogatás nélkül elvégezni, ez nem vitás. Először is hálás vagyok szüleimnek, hogy a gondolkodás és a természettudományok tiszteletére neveltek gyermekkorom óta. Köszönöm egykori fizikatanáromnak, Skoda Lászlónénak a fizika csodáinak megmutatását. Csermely Péter professzornak, a Kutató Diákok Szövetségének és az ELTE Bolyai Kollégium közösségének pedig azt, hogy bevezettek a tudomány világába. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Fidy Judit Professzorasszonynak, témavezetőmnek, Dr. Rontó Györgyi Professzorasszonynak, az Inonizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai című doktori program vezetőjének, Dr. Rosivall László professzor úrnak az Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola vezetőjének a doktori tanulmányaim során nyújtott támogatásukért. Szintén köszönet illeti Monos Emil Professzor urat, az Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola volt vezetőjét. Hálával tartozom egykori diplomamunka és TDK-témavezetőmnek, Dr. Tölgyesi Ferencnek és közvetlen munkatársamnak, Dr. Smeller Lászlónak, akikre mindig számíthattam és akiktől sok segítséget és ösztönzést kaptam munkám során. Köszönöm az egész LSL labornak: Dr. Kaposi Andrásnak, Szigeti Krisztiánnak, Schay Gusztávnak, Dr. Osváth Szabolcsnak, Dr. Kulcsár Ágnesnek, Dr. Herényi Leventének, Dr. Kis-Petik Katalinnak, Dr. Végh Attilának és Árpádiné Markács Rózsának a sok-sok termékeny beszélgetést és a jó hangulatot. Köszönöm mindenkinek a Biofizikai Intézetben, hogy segítettek mind a doktori, mind az oktatási munkám során. Külön köszönöm Dr. Budai Mariannak a rengeteg beszélgetést és hogy "bevezetett" a német gyakorlatok tartásába. Köszönet illeti a Trefort-kert portásait az együttműködésért az estébe nyúló mérések során és a Doktori Titkárság munkatársait a mindig segítőkész, rugalmas munkavégzésért. Végül köszönöm Feleségemnek, Gabinak, azt, hogy végig mellettem állt és támogatott. 9