Bakteriofágterápia a növényvédelemben Dr. Kovács Tamás, Enviroinvest Zrt Dr. Rákhely Gábor, SZTE Biotechnológiai TSZ XXX. BiokultúraTudományos Nap Budapest, 2017.12.02
Az antibiotikumok hanyatlása Chait et al.,nature Chemical Biology, 2012: 2-5 Alternatív megoldások szükségesek
Lehetséges megoldás: Bakteriofágterápia A bakteriofágok: baktériumokat fertőző vírusok 1915-ben Twort, ill. 1917-ben d Herelle fedezték fel Fej 96 %: Caudovirales dsdns Farok Twort fág 3 család: Podoviridae Myoviridae Siphoviridae Tiekotter and Ackermann, 2009, J. Virol. Met., 159: 87-92
A Caudovirales fágok Todar s online textbook of bacteriology Campbell, 2003, Naure Rev. Gen.
A fágterápia előnyei A hatásmechanizmusa eltér az antibiotikumokétól hatásos lehet olyan esetekben is, ahol az antibiotikumok nem A fágok is mutációra képesek Szűk gazdaspecificitás Gyorsan reagál a rezisztens baktérium mutánsok megjelenésére Minimálisan hat az eukarióta sejtekre: mellékhatások elkerülés Környezetbarát Alacsony költség
A fágterápia korlátai Réz-érzékenység Fagyás, meleg, kiszáradás csökkenti a hatást Rezisztencia (adszorpciós rezisztencia), immunitás (CRISPR/Cas rendszer) UV-érzékenység Jones és mtsai, Annu Rev Phytopathol., 2007, 45: 245-262
Top10 növénypatogén baktérium A Molecular Plant Pathology 2012-ben végzett felmérése alapján a top 10 (tudományos és gazdasági szempontból) legfontosabb növényi patogén baktérium: 1. Pseudomonas syringae pathovarok 2. Ralstonia solanacearum 3. Agrobacterium tumefaciens 4. Xanthomonas oryzae pv. oryzae 5. Xanthomonas campestris pathovarok 6. Xanthomonas anoxipodis pathovarok 7. Erwinia amylovora 8. Xylella fastidiosa 9. Dickeya dadantii és solani 10. Pectobacterium carotovorum
Eddigi fontosabb növényvédelmi fágterápiás eredmények A fágterápiás növényvédelmi kísérletek során megcélzott fontosabb baktériumfajok: Xanthomonas spp. Ralstonia solanacearum Pseudomonas spp. Agrobacterium tumefaciens Forgalomba került fágterápiás növényvédő szerek: Erwinia amylovora Agriphage (USA): X. campestris pv. vesicatoria és P. syringae pv. tomato ellen Erwiphage (Magyarország): E. amylovora ellen
Az Enviroinvest Zrt növényvédelmi fágterápiás fejlesztései Erwinia amylovora (almafélék tűzelhalásos betegségének kórokozója) Xanthomonas arboricola pv. juglandis (dió baktériumos rügy-, levél- és termésfoltosság kórokozója) Xanthomonas oryzae pv. oryzae (rizs baktériumos levélfoltosság kórokozója)
A tűzelhalásról Magyarországon 1994-től Érintett növények: Rosaceae (alma, körte, birs, madárbirs, japánbirs, galagonya, berkenye) Mintha tűzzel perzselnék Levél, gyümölcs, virág fán marad, pásztorbot-visszahajlás, nyálka A kórokozó áttelel
A tűzelhalásról: tünetek
A tűzelhalásról: kórokozó, védekezés Kórokozó: Erwinia amylovora (Gram-, Enterobacteriaceae) Kezelése: Streptomycin (már nem lehetséges), kasumin Alternatíva: Bakteriofágok A kutatások 2006-ban indultak, résztvevők: Enviroinvest Zrt. PTE Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézete SZTE Biotechnológiai Tanszéke
Erwiphage készítmény létrehozása: K+F Izolálás Jellemzés (elektronmikroszkópia, RFLP, gazdaspecifitás) Laboratóriumi hatékonysági teszt (+rezisztencia vizsgálatok) Penetrációs vizsgálatok Ökotoxikológia Szabadföldi kísérletek Teljes genomi szekvencia meghatározása
Erwiphage készítmény létrehozása: K+F Izolálás Jellemzés (elektronmikroszkópia, RFLP, gazdaspecifitás) Laboratóriumi hatékonysági teszt (+rezisztencia vizsgálatok) Penetrációs vizsgálatok Ökotoxikológia Szabadföldi kísérletek Teljes genomi szekvencia meghatározása Myoviridae
Élősejtszám / ml Erwiphage készítmény létrehozása: K+F Izolálás 1,00E+09 1,00E+08 Jellemzés (elektronmikroszkópia, RFLP, gazdaspecifitás) Laboratóriumi 1,00E+07 hatékonysági teszt (+rezisztencia vizsgálatok) 1,00E+06 Penetrációs 1,00E+05 vizsgálatok Ökotoxikológia 1,00E+04 Szabadföldi kísérletek 0 6 12 18 24 t (h) Teljes genomi szekvencia meghatározása Kontroll PhiEaH1 PhiEaH2
Erwiphage készítmény létrehozása: K+F Izolálás Jellemzés (elektronmikroszkópia, RFLP, gazdaspecifitás) Laboratóriumi hatékonysági teszt (+rezisztencia vizsgálatok) Penetrációs vizsgálatok Ökotoxikológia Kismértékben felszívódik permetezéssel a leveleken keresztül és transzlokálódik a gyökérzónába. Szabadföldi kísérletek Teljes genomi szekvencia meghatározása
Erwiphage készítmény létrehozása: K+F Izolálás Jellemzés (elektronmikroszkópia, RFLP, gazdaspecifitás) Nem toxikus méhekre Laboratóriumi hatékonysági teszt (+rezisztencia Nem toxikus halakra (ponty, pisztráng) vizsgálatok) Nem toxikus daphnia-ra Penetrációs vizsgálatok Nem toxikus algákra Ökotoxikológia Nincs gátló hatása csíranövény-tesztben Szabadföldi kísérletek Teljes genomi szekvencia meghatározása
Átlagos esetszám (fertőzött hajtás/fa) Erwiphage készítmény létrehozása: K+F Izolálás 1,5 Jellemzés (elektronmikroszkópia, RFLP, 1 gazdaspecifitás) Megelőzéses kísérlet, nincs mesterséges fertőzés! Laboratóriumi hatékonysági teszt (+rezisztencia vizsgálatok) Helyszín: Debrecen-Pallag 15 éves Jonagold almafák 70 fa kezeletlen kontroll, 66 fa kezelve Penetrációs vizsgálatok Kezelés: permetezéssel, 20 liter 103 PFU/ml titerű Ökotoxikológia phieah1, 103 PFU/ml titerű phieah2, 0,5 (W/V) % alginát, 0,001 M nátrium-fumarát Szabadföldi kísérletek Teljes genomi szekvencia meghatározása 0,5 0 0 10 20 30 40 Idő (d) Kontroll Fág-kezelt
Erwiphage készítmény létrehozása: K+F Izolálás Jellemzés (elektronmikroszkópia, RFLP, gazdaspecifitás) Laboratóriumi hatékonysági teszt (+rezisztencia vizsgálatok) Penetrációs vizsgálatok Ökotoxikológia Szabadföldi kísérletek Teljes Similarity genomi of PhiEaH1 szekvencia and meghatározása PhiEaH2 is around 4%.
Erwiphage készítmény 2 komponensből áll: A komponens: 100 ml-es kiszerelés, hűtve tárolandó. Ez tartalmazza a fágokat. B komponens: 1 l-es kiszerelés. Ez UV-védő anyagot (fumársav) és kitapadást segítő anyagot (Na-alginát) tartalmaz. Dózis: 100 ml A komponens, 1 l B komponens /ha (1000 l vízben). Kijuttatás: permetezéssel.
Összehasonlítás más készítményekkel Kolozsvári Nagy és mtsai, Cent. Eur. J. Biol., 2012, 7: 1-12
2012. évi elégedettségi felmérések Az almetermelők elégedettsége (kezelt terület) A birstermelők elégedettsége (kezelt terület) Nem elégedett 14% Közepesen 6% Nem elégedett Közepesen Elégedett 80% Elégedett
Erwiphage: alkalmazási tanácsok Keverhetőség: lsd. erwiphage.com honlap Egyidőben rézzel vagy réztartalmú szerekkel, illetve minden olyan készítménnyel, mely a fehérjéket denaturálja nem lehetséges. Időben eltolt alkalmazás (pl. Stericlean-el). Fontos a hígításhoz használt víz minősége. Hűvös, napfénytől védett helyen tároljuk az A komponenst. Napnyugta után permetezzünk.
Az Enviroinvest Zrt növényvédelmi fágterápiás fejlesztései Erwinia amylovora (almafélék tűzelhalásos betegségének kórokozója) Xanthomonas arboricola pv. juglandis (dió baktériumos rügy-, levél- és termésfoltosság kórokozója) Xanthomonas oryzae pv. oryzae (rizs baktériumos levélfoltosság kórokozója)
A dió xanthomonas-os betegsége A dió leggyakoribb bakteriális betegsége, akár 50-80 %-os terméskiesést is okozhat A baktérium áttelel Víz szükséges a fertőzéshez Kezelése: réz (csökken a hatékonyság) vagy streptomycin (nem engedélyezett)
A dió xanthomonas-os betegsége 17 fágtörzset izoláltunk (Lengyeltóti, Nagysimonyi) 2 szűk, 12 közepes, 3 tág gazdaspecificitású Elektronmikroszkópia: Podoviridae családba tartoznak Xaj24 elektronmikroszkópia
Élősejtszám (CFU/ml) Laboratóriumi hatékonysági vizsgálat (Xaj24) 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 0 4 8 12 16 20 24 Idő (h)
A dió xanthomonas-os betegsége: genomika Az elsőként publikált X. arboricola pv. juglandis fág teljes genomok Xaj2: egyedi szekvencia, Xaj24: Prado fág-szerű
Az Enviroinvest Zrt növényvédelmi fágterápiás fejlesztései Erwinia amylovora (almafélék tűzelhalásos betegségének kórokozója) Xanthomonas arboricola pv. juglandis (dió baktériumos rügy-, levél- és termésfoltosság kórokozója) Xanthomonas oryzae pv. oryzae (rizs baktériumos levélfoltosság kórokozója)
Rizs baktériumos levélfoltosság Hatalmas gazdasági károkat okoz Ázsiában és Afrika nyugati részén.
Fágok izolálása együttműködés az IRRI-vel IRRI: International Rice Research Institute (Fülöp-szigetek, Los Banos)
OD XOO-ellenes fágok laboratóriumi hatékonysági vizsgálata 1 0,1 0,01 0 12 24 36 48 t (h) Kontroll XPP1 XPP2 XPP3 XPP4 XPP5 XPP6 XPP7 XPP8
Fágterápia jövője 1. UV-érzékenység: nem patogén, alternatív baktériummal kijuttatni, vagy UV-védő adalékanyag 2. Baktérium immunitása: DNS-mentes fágterápia
Összefoglalás A bakteriofágok hatékony, környezetbarát biokontroll ágensek bakteriális növénybetegségek leküzdésére Alkalmazás előtt alaposan jellemezni kell a fágokat A fágterápiás készítmények állandó kutatásfejlesztést igényelnek A fágok érzékeny hatóanyagok Lényeges az engedélyezési kérdések újragondolása
Köszönjük a figyelmet!