PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM. Biológia Doktori Iskola Összehasonlító Neurobiológia Program NEURODEGENERÁCIÓS MODELLEK MORFOLÓGIAI ELEMZÉSE PATKÁNY RETINÁN

Átírás

1 PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológia Doktori Iskola Összehasonlító Neurobiológia Program NEURODEGENERÁCIÓS MODELLEK MORFOLÓGIAI ELEMZÉSE PATKÁNY RETINÁN PhD értekezés tézisei BABAI NORBERT Témavezető: Gábriel Róbert egyetemi tanár

2 Bevezetés PÉCS, 2007 A retina anatómiája A látott tárgyról visszaverődő fény a retinára a szem fénytörő közegein keresztül jut, majd áthalad a retina sejtrétegein a fotoreceptorokig, ahol megtörténik a fotonok energiájának átalakítása kémiai energiává. Ehhez a speciális funkcióhoz egy sajátos szerkezetű struktúra, a retina szükséges. A retina legkülső rétege a pigment epithelium. A pigmentrétegtől beljebb helyezkedik el a fényinformációt elektromos jellé átalakító fotoreceptorok rétege. A retina folytonos idegállományának külső határát jelzi a Müller-sejtek végtalpaiból álló nem folytonos réteg, a külső határhártya. A fotoreceptorok sejttestjei a külső magvas réteget alkotják. Az első szinapszis a külső rostos rétegben történik, a fotoreceptorok nyúlványai és a belső magvas rétegben lévő horizontális és bipoláris sejtek kifelé tekintő nyúlványai között. A bipoláris sejtek axonjai, a belső magvas réteg belső sejtsoraiban lévő amakrin sejtek belső retina felé tekintő nyúlványai, továbbá a retina dúcsejtjeinek dendritjei hozzák létre azt a nyúlványrendszert, amit belső rostos rétegnek nevezünk. A ganglionsejtek külön réteget képeznek. A retinában keletkező kódolt információt a ganglionsejtek axonjaiból összeszedődő optikus rostköteg továbbítja felsőbb központok felé. A retinát az üvegtesttől a Müllersejtek gliatalpaiból létrejövő belső határhártya izolálja el. A glutamát, mint retinális neurotranszmitter A retinában a fotoreceptorok, bipoláris sejtek és a ganglion sejtek mutatnak glutamát immunreaktivitást. A fotoreceptorok a glutamát szinaptikus résbe ürítésével jelzik a fotonokról begyűjtött információt a másodrendű neuronok számára. A glutamát transzporterek a Müller-sejtekbe bejuttatják a glutamátot három Na + kotranszportja, egy K + antiportja és egy OH - vagy egy HCO 3- mozgatása mellett. A glutamát transzporterek a szinaptikus résben alacsony koncentráción tartják a glutamát mennyiségét, így elkerülhető a glutamát-indukálta sejthalál. A Müller-sejtek a glutamátot átalakítják glutaminná és visszajuttatják a környező neuronokhoz. A neuronok képesek glutaminból glutamátot előállítani. A glutamát receptorok két nagy csoportját, nevezetesen az ionotróp és a metabotróp glutamát receptorokat különítjük el. Az ionotróp glutamát receptorok segítségével Na + és Ca 2+ áramlik be a sejtbe, míg a metabotróp glutamát receptorok G-proteint aktiválnak. A neuronkárosodás A neuron-degenerációnak két fő típusa ismert, nevezetesen a nekrózis és az apoptózis. Ez a két sejtpusztulási forma morfológiailag eltér egymástól. A nekrózis súlyos sérülés okozta sejthalál. Kiváltó oka lehet mechanikai sértés, oxigénhiány, toxikus anyag, sugárkárosodás stb. A sejthártya permeábilitásának növekedése miatt a víz és a Ca2+ a sejtbe áramlik, ezáltal a sejt és a sejt organellumai megduzzadnak, majd szétesnek. Az apoptózis létrejöhet külső és belső tényezőkkel előidézett, genetikailag meghatározott, programozott sejthalál útján. Ennek során a sejtek zsugorodnak, és a sejtmag perifériáján a kromatin kondenzálódik. A sejt összetöredezik és róla kis részek válnak le, miközben a membránok épek maradnak. A pusztuló sejtek káros anyagai nem ürülnek ki, így a környező sejtek nem károsodnak. A glutamáterg rendszer szerepe a neurotoxikációban A glutamát a normál szabályozó hatást kiváltó szintnél alig magasabb koncentrációban már neurotoxikus hatású. A vér-agy gát szabályozza a külsőleg bejuttatott glutamát átjutását az agyba, illetve a retinába, aholis a glutamát receptorokhoz kapcsolódik. Exogén glutamát bevitele esetén a vér-agy gát által nem védett területeken átjutva, az a neuronok degenerációját okozza. Mivel a szinapszisokban az excitációt a preszinaptikus membrán és a szinapszist közrefogó gliasejtek membránján lévő glutamát transzporterek szabályozzák, a megnövekedett glutamát koncentráció több receptor-típus közreműködésével indíthatja be a neuronális degenerációt.

3 Degenerációs retinamodellek létrehozása Sokféle retina-degenerációs modell leírását lelhetjük fel a szakirodalomban, amelyeket két nagy csoportra oszthatunk. Az egyik csoportba tartoznak a genetikai háttérrel rendelkezők, míg a másikba a metabolikus, vagy traumatikus eseményeken alapulók. A glutamát receptorok patológiás aktivációja kulcsszerepet játszik számos neurológiai betegség okozta idegrendszeri degenerációban. A szemben számos patológiai körülményt, például ischemiát és a különböző típusú glaukómákat lehet kísérletesen utánozni az extracelluláris glutamát, vagy glutamát-agonisták alkalmazásával. Egyik ilyen alkalmazott anyag a monosodium L-glutamát (MSG), mely nagy dózisban, szubkután injekció formájában adva az egész belső retina pusztulását okozza. Ez a kezelés a belső retina sejtjeinek depolarizálódásához vezet, és megnöveli a Ca 2+ beáramlását a neuronokba és a sejtek elhalásához vezet. Hasonlóan, a retina degenerációját idézi elő a szemhez futó erek, vagy a bilaterális arteria carotis communis lekötése (BCCAO). Az elektroretinográfiás és a morfológia tanulmányok is azt mutatják, hogy a BCCAO a retina sérüléséhez vezet. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk során célul tűztük ki, hogy: különböző MSG kezelések alkalmazásával retinaroncsolást idézzünk elő, amelynek fény- és elektronmikroszkóposan megfigyelhető jellemzőit feltárjuk, keressünk egy olyan optimális retina-degenerációs modellt, ami reprodukálható és alkalmas a gyógyászatban alkalmazható neuroprotektív anyagok teszteléséhez. Továbbá meg szerettük volna határozni: azt az optimális glutamát koncentrációt és adagolást, ami mérhető degeneratív változást okoz a retinában, de azt nem pusztítja el teljesen a pusztuló sejtek típusát Ca 2+ kötő fehérjék glutamát transzporterek tirozin-hidroxiláz (TH) GABA-transzporter elleni antitestek alkalmazásával. A retina homeosztázisban bekövetkező kismértékű változása is végzetes lehet a retina sejtjeire nézve. Az egyik létfontosságú tényező a retina vérellátása, ezért további retinadegeneráció létrehozására alkalmas modellként a BCCAO-t használtuk. Számos retinabetegséget a retina csökkent oxigén ellátottsága hozza létre. Kísérletünkben zárt térben azt az oxigénhiányos állapotot kívántuk létre hozni, ami unilaterális arteria carotis communis lekötéssel (UCCAO) kombinálva lehetővé teszi, hogy az oxigénhiányos állapot és a csökkent vérellátás hatását együtt és külön is megvizsgáljuk. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK MSG kezelés: A kísérleteket saját tenyésztésű törzsből származó hím és nőstény Wistar patkányokon végeztük, betartva a NIH (National Institute of Health) előírásait. Összesen 45 patkány bőre alá juttattunk a születés utáni első, ötödik és kilencedik, tizenharmadik és tizenhetedik napon (PD 1, PD 5, PD 9, PD 13, PD 17) 2 mg/testtömeg gramm MSG-t. Az állatokat 3 hetes korukban túlaltattuk, a szemüket kivettük, és eye-cup (szemserleg) preparátumot készítettünk belőlük. Ezután normál fény- és elektronmikroszkópos szövettani technikát alkalmazva vizsgáltuk az elkészített metszeteket. Bilaterális arteria carotis communis lekötés (BCCAO): Összesen 18 ivarérett Wistar patkányt felhasználva, altatás közben mindkét oldali arteria carotis communist elkötöttük egy középvonali bevágást követően. Három hét elteltével az állatok retináját szövettani feldolgozásnak vetettük alá. Unilaterális arteria carotis communis lekötés (UCCAO) és hipoxia kombinált alkalmazása: Altatott állapotban lévő egy hetes (n=8) Wistar patkány egyik oldali arteria carotis communisát elkötöttük. A műtét után az állatokat 2 órára hipoxiás kamrába zártuk egyszeri alkalommal, így az egyik szemük hipoxia és UCCAO kezelést kapott, míg a másik szemük csak hipoxiában részesült. Két hét eltelte után retinájukat szövettanilag vizsgáltuk. Immuncitokémiai vizsgálatok: A kezelést kapott állatok szeméből készített eye-cup preparátumokat kriosztáttal lemetszettük, majd a készített metszeteket zselatinos tárgylemezre helyezve, immunjelölést végeztünk a következő antigének elleni antitestekkel: VGLUT-1 (vezikuláris glutamát transzporter), VGLUT-2, VGAT (GABA transzporter), TH (tirozin-hidroxiláz), calretinin, calbindin, parvalbumin.

4 EREDMÉNYEK Az ismételt MSG kezelések szabályos, látható változásokat idéztek elő a retina morfológiájában. Egyszeres MSG kezelés nem okozott jelentős mértékű, látható változást fénymikroszkópos szinten, és a rétegek vastagsága hasonló volt a kontroll retinán látotthoz, de látszik, hogy a degeneratív folyamatok már elindultak (megduzzadt sejtek és idegrendszeri elemek, kis lyukak a szövetben, piknotikus sejtmagok). A többszörös (2xes, 3x-os, 5x-ös) MSG kezelésen átesett állatok retinájának szövettani képe számos eltérést mutatott a kontrollhoz képest. Szignifikáns mértékű változást tapasztaltunk a külső határmembrán és a belső határmembrán közötti távolság és a belső retina rétegek (belső magvas réteg, belső rostos réteg) vastagságában. A belső rostos réteg nagy része eltűnt, valamint a belső sejtes és a ganglion sejtréteg sejtjei összekeveredtek. A BCCAO látványosan csökkentette a retina rétegeinek vastagságát az áloperált állatokhoz képest. A legkifejezettebb rétegvastagság csökkenés a plexiform rétegekben figyelhető meg, és ennek következtében a külső és a belső határmembránok közötti távolság szignifikánsan kisebbnek mutatkozott, mint a kontroll állatokban. Az UCCAO és hipoxiás kezelés együttes alkalmazásának hatására a belső magvas réteg, belső és a külső rostos rétegek méretei jelentősen csökkentek, annak ellenére, hogy a külső sejtes réteg vastagsága megnőtt. A csak hipoxia kezelésben részesült retina keresztmetszete kismértékben megnövekedett, a belső és a külső sejtes rétegek vastagsága megnőtt, viszont a belső és a külső rostos rétegek mérete lecsökkent. Az MSG modellekben jelentősen csökkent az immunjelölések erőssége és a jelölt sejtek száma a VGLUT-1, VGLUT-2, VGAT, calretinin, parvalbumin és TH immunfestés során. A horizontális sejteket calbindin immunreakcióval megjelölve látható, hogy a sejtek száma nem változott, míg méretük megnőtt. DISZKUSSZIÓ A glutamát indukálta toxicitás kulcsszerepet játszik számos ismert retina betegségben, mint pl. retinális ischemiában, amikor is egy kaszkád folyamat indul el, ami a retina sejtjeinek elhalásához vezet. Továbbá, a megemelkedett glutamát szint sejtroncsolást okoz a glaucomában szenvedő betegeknél. Eddigi eredményeink összefüggenek azzal a ténnyel, hogy az ionotróp glutamát receptorok nagy része a belső retinában helyezkedik el, következésképp az MSG kezelés a fotoreceptorokat nem befolyásolja, és csak a belső retina degenerálódik. Viszont eléggé meglepő, hogy az 1x-es MSG kezelés hatására a külső rostos rétegben számos degenerációt jelző folyamat elindul, amíg a belső rostos rétegre a kezelés nincs hatással. Csak kismértékű különbség volt a PD1 (amikor is az új sejtek kialakulnak) és a PD5 (ekkor történik a legintenzívebb szinaptogenezis) időpontban kezelt állatok között. Többszörös MSG kezelés hatására nem vártunk ilyen extenzív sérüléseket a külső rostos rétegben, csak kis változást lehetett látni fénymikroszkópos szinten. Érdekes módon a rövid idejű excitotoxikus inzultus hatására a külső és a belső rostos rétegeket egyenlő mértékben érte a károsodás. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a mi esetünkben az állatokat hosszú idővel a kezelés után öltük meg, így elég idő lehetett a struktúrális újrarendeződésre. Összességében az 1x-es MSG kezelés csupán néhány apróbb ultrastruktúrális változást okozott a szövetekben, ezért nem szolgál jó modellként arra, hogy neuroprotekciót tanulmányozzunk a retinán. Legalább 2x-es MSG kezelés szükséges ahhoz, hogy a neuroprotekció tanulmányozására alkalmas, nagymértékű degeneráció létrejöjjön. A megfelelő koncentrációjú MSG kezelés a sejt intracelluláris Ca 2+ szintjének megemelésével a sejt halálát okozza. A Ca 2+ kötő fehérjék a kapacitásuknak megfelelően ezt a megemelkedett szintet pufferelik. Az általunk elvégzett immunjelölések alapján elmondhatjuk, hogy az AII-es amakrin (parvalbumin tartalmú) és a ganglion (calretinin tartalmú), valamint a horizontális sejtek(calbindin tartalmú) egyaránt károsodtak. Az utóbbi sejttestjeinek átmérője megnőtt, ami a glutamát okozta excitotoxicitás kísérő tünete. A dopaminerg sejtek épsége függ az azokat érő, a fény által vezérelt szinaptikus bemenetektől. Mivel az MSG kezelés tönkretette ezeket az inputokat, így a dopaminerg sejtek is károsodtak (TH immunjelölés). A BCCAO okozta ischemia által kiváltott retina degeneráció kulcsfontosságú faktorai a serkentő neurotranszmitter-ürülés, a glia diszfunkció, az intracelluláris Ca 2+ koncentráció mennyiségének növekedése, a szabad gyökök felhalmozódása, a nitrogénmonoxid szint megemelkedése és a gyulladásos sejtek által ürített toxikus mediátor anyagok megjelenése, pl. a tumor nekrózis faktor és az interleukin-1. Ez a komplex kaszkádfolyamat vezet a különböző sejtpopulációk vagy az egész retina degenerációjához, az ischemiát okozó esemény erősségétől és/vagy idejétől függően. Ennek az eseménysorozatnak következményeként a külső sejtes és a külső rostos rétegeket is befolyásolja az ischemiás beavatkozás, összehasonlítva az MSG okozta degenerációval, ahol szinte az egész belső retina megsérül. A retina oxigénellátása két különálló érrendszerből származik. A choroidea látja el oxigénnel a külső retinát, míg a belső retina oxigénellátását az ún. retinális cirkuláció biztosítja. A két érrendszer keringése eltérő. Ugyan kísérleteinkben az arteria carotis communis lekötésével csökkentettük a fotoreceptorok, a külső sejtes és a

5 külső rostos rétegek vérellátását, ezáltal oxigénellátását is, viszont a belső retina sokkal érzékenyebb az oxigénhiányos állapotokra, így az egész retina károsodott. Összességében megállapítható, hogy mindhárom általunk alkalmazott modell további neuroprotekciós vizsgálatok végzésére alkalmas. További kutatásokat kívánunk folytatni a degenerációt elszenvedő sejtek típusára és a károsodás mechanizmusára vonatkozóan.

6 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK Disszertáció alapjául szolgáló tudományos közlemények 1. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2006): Search for the optimal monosodium glutamate treatment schedule to study the neuroprotective effects of PACAP in the retina. Ann. Ny. Acad. Sci. 1070: Kiss, P., Tamás, A., Lubics, A., Lengvári, I., Szalai, M., Hauser, D., Horváth, ZS., Rácz, B., Gábriel, R., Babai, N., Tóth, G., Reglődi, D. (2006): Effects of systemic PACAP treatment in monosodium glutamate-induced behavioral changes and retinal degeneration. Ann. Ny. Acad. Sci. 1070: Rácz, B., Reglődi, D., Kiss, P., Babai, N., Atlasz, T., Gábriel, R., Lubics, A., Gallyas, FJr., Gasz, B., Tóth, G., Hegyi, O., Tamás, A. (2006): In vivo neuroprotection by PACAP in excitotoxic retinal injury: review of effects on retinal morphology and apoptotic signal transduction. Int. J. Neuroprot. Neurodeg., 2: Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2005): Degree of damage compensation by various PACAP treatments in monosodium glutamate-induced retinal degeneration. Neurotox. Res. 8: Disszertáció alapjául szolgáló konferencia előadások és poszterek 1. Kiss, P., Atlasz, T., Babai, N., Tamás, A., Schäffer, D., Lubics, A., Reglődi, D., Tóth, G., Hegyi, O., Gábriel, R. (2006): Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) protects rat retina against hypoxic/ischemic injury. 23rd Conf. Europ. Comp. Endocrinologists (CECE), Manchester, UK, poster abstract. 2. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006): Evaluation of different neurodegeneration models in the rodent retina. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A111.3, poster abstract. 3. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006): Comparison of three different neurodegeneration models in the rat retina: monosodium-glutamate (MSG), hypoxic insult combined with unilateral carotis occlusion and bilateral carotis occlusion. Int. Brain Res. Org (IBRO) Workshop, Budapest, Hungary, Vol. 59(S1)1-72, poster abstract. 4. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Gábriel, R. (2005): Degree of damage compensation by various PACAP treatment regimes in monosodium glutamate-induced retinal degeneration. VII. Internat. Symp. on VIP, PACAP and Related Peptides, Rouen, France, poster abstract. 5. Babai, N., Schäffer, D., Gábriel, R. (2005): Photoreceptor distribution in retina of the spadefoot toad. IX. MITT Conf. Hungary, Pécs Clin.Neurosci./Ideggy. Szemle., 58: 1-112, poster abstract. Egyéb tudományos közlemények 1. Olah, Z., Josvay, K., Pecze, L., Letoha, T., Babai, N., Budai, D., Otvos, F., Szalma, S., Vizler, C. (2007): Anti-calmodulins and tricyclic adjuvants in pain therapy block the TRPV1 channel. PLoS ONE., 20; 2: e Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Bari, F., Domoki, F., Gabriel, R. (2007): Diazoxide is protective in the rat retina against ischemic injury induced by bilateral carotid occlusion and glutamate-induced degeneration Neurotox. Res., 12: 1-8.

7 3. Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Babai, N., Tamás, A., Reglődi, D., Kovács, P., Hernádi, I., Gábriel, R. (2006): Microiontophoretically applied PACAP blocks excitatory effects of kainic acid in vivo. Ann. Ny. Acad. Sci., 1070: Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Szabadfi, K., Tóth, G., Hegyi, O., Gábriel, R. (2006): Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide is protective in bilateral carotid occlusioninduced retinal lesion in rats. Gen. Comp. Endocrin., 153: Atlasz, T., Kellenyi, L., Kovács, P., Babai, N., Thuroczy, G., Hejjel, L., Hernadi, I. (2006): The application of surface plethysmography for heart rate variability analysis after GSM radiofrequency explosure J. Biochem. Biophys. Methods, 69: Kőszegi, Zs., Kovacs, P., Wilhelm, M., Atlasz, T., Babai, N., Kallai, V., Hernadi, I. (2006): Microiontophoretic investigation of the effects of mast cells on neurons in the rat brain in vivo. J. Biochem. Biophys. Methods, 69: Egyéb konferencia előadások és poszterek 1. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Fekete, É., Zorilla, E.P., Reglődi, D. (2007): Különböző neuroprotektív anyagok hatásai retina degenerációs modellekben. X. MITT Konf., Szeged, legjobb poszter díj, poster abstract. 2. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Reglődi, D. (2007): Comparison of diazoxide and PACAP as neuroprotective compounds on different retina degneration models: histological and immuncytochemical investigations: III. Neurotox. Soc. Meet., Pucon, Chile, poster abstract. 3. Szabadfi, K., Atlasz, T., Csupor, D., Kőszegi, Zs., Kovács, P., Babai, N., Hohmann, J., Hernádi, I. (2006): In vivo electrophysiological effects of aconitum alcaloids in the mammalian brain. MÉT LXX. Conf., Hungary, Szeged, poster abstract. 4. Atlasz, T., Kovács, P., Kellényi, L., Thuróczy, Gy., Ajtay, Z., Hejjel, L., Babai, N., Hernádi I. (2005): The effects of GSM mobile phones on heart rate and heart rate variability in young adults. 8th Symp. Instrum. Analysis, Austria, Graz, poster abstract. 5. Atlasz, T., Babai, N., Uzsoki, B, Kovács, P., Hernádi, I. (2003): A yohimbin specifikus preszinaptikus alfa-2a/d noradrenerg receptor antagonistaként hat: elektrofiziológiai és magatartási bizonyítékok. IX. MITT Konf., Balatonfüred, Clin.Neurosci./Ideggy. Szemle 56, poster abstract. 6. Kovács, P., Babai, N., Hernádi, I. (2002): NA-ergic receptors mediate the action of lithium on prerontal neurons of the rat. IBRO-MIT Symp., Hungary, Debrecen, Acta Physiol. Hung. 89, poster abstract.

8 UNIVERSITY OF PÉCS Biology Doctoral School Comparative Neurobiology Program MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF NEURODEGENERATION MODELS IN RAT RETINA PhD thesis BABAI NORBERT Thesis supervisor: Gábriel Róbert PhD, DSc PÉCS, 2007

9 Introduction The anatomy of the retina The light reflected from objects travels through the refracting materials of the eye and the layers of the retina to the photoreceptors in the back of the eye where the light signal is transformed to chemical energy, which leads to neural transmission. This special function requires a finely structured retina. The vertebrate retina has ten distinct layers. From outermost to innermost, they include: 1. Retinal pigment epithelium (supporting cells for the neural portion of the retina). 2. Photoreceptor layer (rods and cones). 3. External limiting membrane (a layer which imperfectly separates the inner segment portions of the photoreceptors from their cell bodies). This layer is built up from glial (Müller cell) processes 4. Outer nuclear layer (cell bodies of rods and cones). 5. Outer plexiform layer (rod and cone axons, horizontal cell dendrites, bipolar dendrites). 6. Inner nuclear layer (somatas of horizontal, bipolar and amacrine cells, main portion of Müller cells). 7. Inner plexiform layer (axons of bipolars and amacrines, dendrites of ganglion cells). 8. Ganglion cell layer (layer that contains nuclei of ganglion cells and gives rise to optic nerve fibers). 9. Nerve fiber layer (fibers from ganglion cells traversing the retina to leave the eyeball at the optic disk). 10. Inner limiting membrane: (Müller cell footplates). This structure provides for the neuronal background of the first steps in processing contrast, colour and motion. Glutamate as retinal transmitter The photoreceptors, the bipolar and the ganglion cells show glutamate-immunreactivity in the retina. By secreting glutamate, the photoreceptors signal information, collected from photons, for the second order neurons and ganglion cells, respectively. The glutamate transporters take up glutamate into the Müller cells with one K + cotransport and three Na +, one OH - or one HCO - 3 antiport. Glutamate transporters keep the glutamate at low level in the synaptic cleft, thus avoiding glutamateinduced cell death. The Muller-cells transform the glutamate to glutamine and feed glutamine to surrounding neurons. The neurons then make glutamate from glutamine.

10 There are two types of glutamate receptors: ionotropic and metabotropic one. The ionotropic glutamate receptors allow Na + and Ca 2+ to enter the cells upon ligand binding while the metabotropic glutamate receptors activate G-proteins. Neuron degeneration There are two possible ways of neuron degeneration, namely necrosis and apoptosis. These two kinds of degenerations have a characteristic series of processes marked by different morphological appearences. Necrosis is a kind of cell death caused by serious injury to the cell. The injury could be from mechanic intervention, hypoxia, toxic agents etc. Water and Ca 2+ diffuse into the cell because of the increased membrane permeability, whereby the cell and the organelles become swollen and fragmented. Apoptosis (programmed all death) may be caused by intrinsic or extrinsict factors or can be genetically determined. In the course apoptosis, the cells shrink and the chromatin in the nucleus condenses. The cell blebs into fragments but the cells membrane remains intact. Harmful materials of the cells are therefore contained, and this way the neighbouring cells do not acquire injury. Role of glutamate in the neurotoxic processses Glutamate is neurotoxic at a slightly higher than physiological level. The blood-brain barrier regulates the level of ingested extrinsic glutamate getting over to the brain and the retina, where it binds to the glutamate receptors, eventually inducing neuron degeneration. Since in the synapse there is an excitation control mechanism executed by glutamate transporters which are found in the presynaptic membrane and the surrounding glial cell membrane, the increased glutamate concentration has effects on both glutamate receptors and glutamate transporters, inducing neuronal degeneration. Retina degeneration models There are many types of retina degeneration models described in the literature. They can be grouped into two main categories: one is with a known genetic background, the other is induced by metabolic or traumatic events. These induced retinal degenerations, among others, may be caused by aging, glaucoma, ischemic damage, autoimmune processes, diabetes, toxic agents and exposure to extremely strong light. Pathological activation of glutamate receptors is thought to play a key role in neuronal damage in many neurological diseases. In the eye, several pathological conditions such as ischemia and some types of glaucoma can be mimicked by experimentally elevating extracellular glutamate concentrations or applying its analogues. One such agent is monosodium L-glutamate (MSG) which can be administered in the form of subcutaneous

11 injection, and finally leads to the destruction of the entire inner retina. This treatment leads to depolarization of inner retinal cells and causes Ca 2+ influx into the neurons. In the same way, applying occlusion to the vessel supplying the eye or with bilateral carotid artery occlusion (BCCAO) we can induce retina degeneration. Electroretinographic and morphological studies also show that BCCAO induces severe retina damage. AIMs OF THE STUDY Our aim was to: induce retina degeneration applying different MSG treatments, and reveal its morphological features. find an optimal retina degeneration model that is reproducable and suitable for testing neuroprotective compounds. We would also like to determine: the optimal glutamate concentration and dose, which gives measurable degeneration, but does not destroy the entire retina; the types of degenerating cells applying antibody against: Ca 2+ -binding proteins glutamate transporters tyrozin-hydroxylase (TH) GABA-transporters. Little change in the homeostasis of the retina could be fatal for the cells of the retina. One of the most important factor is the blood supply of the retina. Therefore, we performed: BCCAO for further investigation applied hypoxic conditions in a chamber and combined with unilateral carotid artery occlusion (UCCAO). These conditions were applied separetely or conjointly. MATERIALS AND METHODS MSG treatment: Experimental animals were derived from the local colony of Wistar rats. They were housed in individual cages, fed and watered ad libitum, under light/dark cycles of 12/12 h. The NIH and local animal care committee guidelines were carefully followed throughout the entire procedure. Newborn rats from both sexes (n=45) were injected s.c. with 2 mg/g b.w. MSG on postnatal days (PD) 1, 5, 9, 13, and 17. At 3 weeks of age, rats were killed with an overdose of anesthetic, the eyes were processed for normal light and electron microscopy. BCCAO: Adult male Wistar rats (n=18) weighing g were subjected to permanent bilateral carotid artery occlusion. Under pentobarbital anesthesia (35 mg/kg bodyweight), both

12 common carotid arteries were ligated with a 3-0 filament through a midline incision. Three weeks after the carotid occlusion, rats were sacrificed with an overdose of anesthetic, the eyes were processed for normal light microscopic technique. UCCAO and hipoxic treatment: One week old Wistar rats (n=8) were subjected to permanent bilateral carotid artery occlusion. Under pentobarbital anesthesia (35 mg/kg bodyweight), left side common carotid arteries were ligated with a 3-0 filament through a midline incision. After the operation animals were put in hypoxic chamber one time for two hours. Two weeks after the carotid occlusion, rats were sacrificed with an overdose of anesthetic and the eyes were processed for normal light microscopic technique. Immunchytochemical investigations: The eye-cup preparatums, made from animal s eyes were cut in a cryostat and the slices were put on a gelatin-coated microscopic slide. We used the following primary antibodies: anti-vglut1, -VGLUT2 (vesicular glutamate transporters), -TH (tyrosinehydroxylase), -VGAT (vesicular GABA transporter), -calretinin, -calbindin, and -parvalbumin. RESULTS Repeated application of MSG causes progressively severe alterations in retinal morphology. One time MSG treatment did not cause remarkable alterations at light microscopic level. The thickness of the retina layers were the same as in the control retina, but we noticed signs of early degeneration processes (swollen cells, small holes in the tissue and picnotic nuclei). Retinal tissue from animals treated with repeated (2x, 3x, 5x) MSG show severe degeneration compared to the controls. The distance of the outer limiting membrane and inner liminting membrane and the thickness of the inner retina layers significantly diminished. Much of the inner plexiform layer disappearsed and the inner nuclear- and ganglion cell layers are intermingled. As a consequence, the total thickness of the retina was significantly reduced. Only the photoreceptor layer seemsed unchanged. Bilateral carotid occlusion resulted in severely reduced thickness of retinal layers as observed three weeks after ligation (compared to sham-operated control). The most marked reduction in thickness was found in the plexiform layers, and as a consequence, the distance between outer limiting membrane and inner limiting membrane was significantly less than in control preparations. As a result of UCCAO and hypoxia treatment, the inner nuclear-, inner plexiform- and outer plexiform layers thickness decreased. Applying hypoxic environment caused a slightly increased thickness of the inner nuclear- and outer nuclear layers while the thickness of the inner plexiform- and outer plexiform layers significantly decreased. In the MSG models the strength of immunolabelling and the number of labeled cells significantly decreased in the course of VGLUT-1, VGLUT-2, VGAT, calretinin, parvalbumin and TH immunostaining. The calbindin-immunolabeled horizontal cell number did not change, but the size of the cells grew.

13 DISCUSSION Glutamate-induced toxicity is known to play a key role in several retinal pathologies. Glutamate released in retinal ischemia, initiates a cascade leading to retinal cell death. Increased glutamate level induces cell death in glaucoma patients too. Our results correspond to the finding that most glutamate receptors are found in the inner retina, and consequently the MSG treatment does not influence photoreceptors. Strictly the inner retina is degenerated. There was little difference between the animals treated with MSG at P1 (when new cells are still being generated) or P5 (when most intensive synaptogenesis occurs). We did not expect an extensive damage in the outer plexiform layer, because just a slight change was seen at the light microscopic level. Interestingly, short time excytotoxic insult equally causes outer and inner plexiform layer degeneration. For finding, there could be an explanation; since we sacrificed the animals long time after the treatment, the retina would have enough time for a structural reorganization. One time MSG treatment at PD 1 does not cause much damage to the retina, therefore it is not a good model for studying neuroprotection on retina. At least 2x MSG treatment is necessery for the retina degeneration model causing enough damage to the retina for studying neuroprotection. Applying MSG, through possible increases in the intracellular Ca 2+ level, cell death can be induced. The Ca 2+ -binding proteins may be able to buffer the increased Ca 2+ level. Based on our experience we can declare that both the AII amacrine (parvalbumin-positive) and the ganglion cells (calretinin-positive) were damaged. Also, the horizontal cells (calbindin-positive) changed: the diamater of the their cell body increased. This is a symptom of glutamate excitotoxicity. The function of the dopaminergic cells depend on the absorbed light, and the light-driven synaptic inputs. Since the MSG treatment ruins these inputs, the dopaminergic (THimmunolabeled) cells are also damaged. The BCCAO-induced ischemia caused retina degeneration that may be a consequence of stimulated neurotransmitter exocytosis, glial disfunction, increase of the intracellular Ca 2+ level, accumulating free radicals, increasing NO level and the appearance of the toxic mediator compounds exocytosed by imflammatory cells, for example, tumour necrosis factor or interleukin-1. These complete cascade processes lead to the degradation of the different groups of cells or the whole retina and depend on the strength and/or time of the events caused by retinal ischemia. In these processes both the outer nuclear and the outer plexiform layers were damaged, compared with MSG treatment, where almost the entire inner retina was degenerated. The retina has a dual blood supply, reflecting its embryological origins. The photoreceptors, including their cell bodies in the outer nuclear layer, and the greater portion of the outer plexiform layer are nourished indirectly from the choriocapillaris, a richly anastomotic vascular layer that corresponds to the pia-arachnoid vessels in the rest of the brain. The inner retinal layers are nourished by branches of the central retinal artery, which arises directly from the ophthalmic artery in the region of the optic foramen. In our experiment, we ligated carotis communis artery on one side. The inner retina was much more sensitive to hypoxic conditions, but the entire retina was damaged to a certain extent. In conclusion, all three retina degeneration models used in this study can be utilized to examine neuroprotection. Further experiments will be done to identify the cell types which suffer damage and the mechanisms of degeneration.

14 PUBLICATIONS Publications related to the thesis 5. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2006): Search for the optimal monosodium glutamate treatment schedule to study the neuroprotective effects of PACAP in the retina. Ann. Ny. Acad. Sci. 1070: Kiss, P., Tamás, A., Lubics, A., Lengvári, I., Szalai, M., Hauser, D., Horváth, ZS., Rácz, B., Gábriel, R., Babai, N., Tóth, G., Reglődi, D. (2006): Effects of systemic PACAP treatment in monosodium glutamate-induced behavioral changes and retinal degeneration. Ann. Ny. Acad. Sci. 1070: Rácz, B., Reglődi, D., Kiss, P., Babai, N., Atlasz, T., Gábriel, R., Lubics, A., Gallyas, FJr., Gasz, B., Tóth, G., Hegyi, O., Tamás, A. (2006): In vivo neuroprotection by PACAP in excitotoxic retinal injury: review of effects on retinal morphology and apoptotic signal transduction. Int. J. Neuroprot. Neurodeg., 2: Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2005): Degree of damage compensation by various PACAP treatments in monosodium glutamate-induced retinal degeneration. Neurotox. Res. 8: Conference abstracts related to the thesis 6. Kiss, P., Atlasz, T., Babai, N., Tamás, A., Schäffer, D., Lubics, A., Reglődi, D., Tóth, G., Hegyi, O., Gábriel, R. (2006): Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) protects rat retina against hypoxic/ischemic injury. 23rd Conf. Europ. Comp. Endocrinologists (CECE), Manchester, UK, poster abstract. 7. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006): Evaluation of different neurodegeneration models in the rodent retina. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A111.3, poster abstract. 8. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006): Comparison of three different neurodegeneration models in the rat retina: monosodium-glutamate (MSG), hypoxic insult combined with unilateral carotis occlusion and bilateral carotis occlusion. Int. Brain Res. Org (IBRO) Workshop, Budapest, Hungary, Vol. 59(S1)1-72, poster abstract. 9. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Gábriel, R. (2005): Degree of damage compensation by various PACAP treatment regimes in monosodium glutamate-induced retinal degeneration. VII. Internat. Symp. on VIP, PACAP and Related Peptides, Rouen, France, poster abstract. 10. Babai, N., Schäffer, D., Gábriel, R. (2005): Photoreceptor distribution in retina of the spadefoot toad. IX. MITT Conf. Hungary, Pécs Clin.Neurosci./Ideggy. Szemle., 58: 1-112, poster abstract. Publications not related to the thesis 7. Olah, Z., Josvay, K., Pecze, L., Letoha, T., Babai, N., Budai, D., Otvos, F., Szalma, S., Vizler, C. (2007): Anti-calmodulins and tricyclic adjuvants in pain therapy block the TRPV1 channel. PLoS ONE., 20; 2: e Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Bari, F., Domoki, F., Gabriel, R. (2007): Diazoxide is protective in the rat retina against ischemic injury induced by bilateral carotid occlusion and glutamate-induced degeneration Neurotox. Res., 12: 1-8.

15 9. Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Babai, N., Tamás, A., Reglődi, D., Kovács, P., Hernádi, I., Gábriel, R. (2006): Microiontophoretically applied PACAP blocks excitatory effects of kainic acid in vivo. Ann. Ny. Acad. Sci., 1070: Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Szabadfi, K., Tóth, G., Hegyi, O., Gábriel, R. (2006): Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide is protective in bilateral carotid occlusioninduced retinal lesion in rats. Gen. Comp. Endocrin., 153: Atlasz, T., Kellenyi, L., Kovács, P., Babai, N., Thuroczy, G., Hejjel, L., Hernadi, I. (2006): The application of surface plethysmography for heart rate variability analysis after GSM radiofrequency explosure J. Biochem. Biophys. Methods, 69: Kőszegi, Zs., Kovacs, P., Wilhelm, M., Atlasz, T., Babai, N., Kallai, V., Hernadi, I. (2006): Microiontophoretic investigation of the effects of mast cells on neurons in the rat brain in vivo. J. Biochem. Biophys. Methods, 69: Conference abstracts not related to the thesis 7. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Fekete, É., Zorilla, E.P., Reglődi, D. (2007): Különböző neuroprotektív anyagok hatásai retina degenerációs modellekben. X. MITT Konf., Szeged, legjobb poszter díj, poster abstract. 8. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Reglődi, D. (2007): Comparison of diazoxide and PACAP as neuroprotective compounds on different retina degneration models: histological and immuncytochemical investigations: III. Neurotox. Soc. Meet., Pucon, Chile, poster abstract. 9. Szabadfi, K., Atlasz, T., Csupor, D., Kőszegi, Zs., Kovács, P., Babai, N., Hohmann, J., Hernádi, I. (2006): In vivo electrophysiological effects of aconitum alcaloids in the mammalian brain. MÉT LXX. Conf., Hungary, Szeged, poster abstract. 10. Atlasz, T., Kovács, P., Kellényi, L., Thuróczy, Gy., Ajtay, Z., Hejjel, L., Babai, N., Hernádi I. (2005): The effects of GSM mobile phones on heart rate and heart rate variability in young adults. 8th Symp. Instrum. Analysis, Austria, Graz, poster abstract. 11. Atlasz, T., Babai, N., Uzsoki, B, Kovács, P., Hernádi, I. (2003): A yohimbin specifikus preszinaptikus alfa-2a/d noradrenerg receptor antagonistaként hat: elektrofiziológiai és magatartási bizonyítékok. IX. MITT Konf., Balatonfüred, Clin.Neurosci./Ideggy. Szemle 56, poster abstract. 12. Kovács, P., Babai, N., Hernádi, I. (2002): NA-ergic receptors mediate the action of lithium on prerontal neurons of the rat. IBRO-MIT Symp., Hungary, Debrecen, Acta Physiol. Hung. 89, poster abstract.