Redox- és ph-érzékeny poli(aszparaginsav) gélek: kémiai szerkezet és szabályozható válaszreakciók

Átírás

1 Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar láh György Doktori Iskola Redox- és ph-érzékeny poli(aszparaginsav) gélek: kémiai szerkezet és szabályozható válaszreakciók A PhD értekezés tézisei Szerző: Gyarmati Benjámin Sándor Témavezető: András Szilágyi Lágy Anyagok Kutatócsoport Fizikai Kémia és Anyagtudományi Tanszék Physical Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem 2014

2 A PhD értekezés tézisei 1 1. Bevezetés A polimer hidrogélek váza olyan háromdimenziós hidrofil polimer térháló, amely vizes közegben duzzad, de nem oldódik fel a kémia és fizikai térhálópontoknak köszönhetően 1. Nagy vízmegkötő képességük, a szövetekhez hasonló mechanikai tulajdonságaik, kis felületi súrlódásuk, viszkoelasztikusságuk, átjárható szerkezetük, várható biokompatibilitásuk és biológiai lebonthatósága számos gyógyászati alkalmazást tesz lehetővé, többek között a célzott rákterápia és a mesterséges szövetépítés területén 2. A hidrogélek fontos csoportját képezik a reszponzív gélek, melyek egy előre meghatározott válaszreakcióval pl. gél-szol átmenet vagy térfogatváltozás reagálnak bizonyos környezeti paraméterek, pl. a ph, hőmérséklet, redox potenciál megváltozására vagy elektromágneses tér alkalmazására 3. A reszponzív hidrogélek számos alkalmazással bírnak a célzott és szabályozott hatóanyag-leadás, valamint a regeneratív terápiák területén. A szervezetbe ültetett mátrixok esetén különösen fontosak az in situ gélesedő polimerek, melyek könnyen kivitelezhető sebészeti beavatkozást tesznek lehetővé, és a formulába a gélesedés során a hagyományos gélekhez képest jóval hatékonyabban zárhatóak gyógyszerhatóanyagok, gének vagy sejtcsoportok 4. A gyógyászati célra fejlesztett reszponzív gélek esetében leggyakrabban a hőmérséklet illetve a ph megváltozására reagáló polimereket állítanak elő, de a célzott terápia hatékonyságának 1 Tanaka F. Classical theory of gelation. In: Tanaka F, editor. Polymer Physics. Cambridge, UK: Cambridge University Press; Park K, kano T. Biomedical Applications of Hydrogels Handbook. New York, USA: Springer Science+Business Media, LLC; Roy D, Cambre JN, Sumerlin BS. Future perspectives and recent advances in stimuli-responsive materials. Prog. Polym. Sci ;35: Peppas NA, Hilt JZ, Khademhosseini A, Langer R. Hydrogels in Biology and Medicine: From Molecular Principles to Bionanotechnology. Advanced Materials. 2006;18(11):

3 2 A PhD értekezés tézisei növelése igényli más paraméterekre érzékeny hidrogélek fejlesztését is 5. Az elmúlt évtizedben előtérbe került a környezeti redox-potenciálra, ezen belül a redukcióra érzékeny biopolimerek és hidrogélek szintézise 6. A polimer mátrixok szintézise során a tiol-diszulfid átalakulásnak kiemelt biológiai jelentősége van, mivel a szervezetben előforduló redox folyamatok kulcsmediátora a tiolcsoportot tartalmazó glutation tripeptid 7. A glutation redukált formájának koncentrációja lényegesen eltérő a sejten belüli és sejten kívüli terekben, és változik a sejt élete során. A tipikus intracelluláris koncentráció 10 mm, az extracelluláris mintegy mm. Az ebből következő redox potenciál gradiens adja az alapját számos redox-reszponzív hatóanyag-hordozó mátrix fejlesztésének 8. Számos természetes (kitozán, hialuronsav, cellulóz zselation, kollagén) és szintetikus polimert (poliakrilsav származékok) használnak polimer gélek szintézise során. Egy biokompatibilis és biológiailag lebontható szintetikus polimer alkalmazása azonban jóval előnyösebb a felsorolt polimereknél. A poli(aszparaginsav) (PASP) teljesíti ezen követelményeket 9. A PASP-ot mint természetes aminosavból felépülő polimert biokompatibilisnek tekinti a szakirodalom, bizonyítottan biodegradábilis és a degradációjának sebessége az oldalcsoportjainak kémiai minőségétől és koncentrációjától 5 Pasparakis G, Vamvakaki M. Multiresponsive polymers: nano-sized assemblies, stimuli-sensitive gels and smart surfaces. Polym. Chem. 2011;2: Meng FH, Hennink WE, Zhong Z. Reduction-sensitive polymers and bioconjugates for biomedical applications. Biomaterials. 2009;30: Schafer FQ, Buettner GR. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Rad. Biol. Med. 2001;30: Kim T-i, Kim SW. Bioreducible polymers for gene delivery. React. Funct. Pol. 2011;71: Joentgen W, Müller N, Mitschker A, Schmidt H. Polyaspartic Acids. Biopolymers nline: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; 2005.

4 A PhD értekezés tézisei 3 függ 10,11. A PASP anhidridje, a poliszukcinimid (PSI) könnyen reakcióba vihető primer aminokkal, és a keletkező PSI származékok enyhe körülmények között a megfelelő PASP származékká hidrolizálhatóak 12. Kutatócsoportunk tevékenysége a gyógyászati célra alkalmazható PASP hidrogélek szintézisére koncentrál. Az irodalomban ugyan néhány publikáció található PASP származékok előállítására karbodiimid alkalmazásával 13, de ezen eljárások a szükséges nagy reagens felesleg miatt költségesek. Ezen túlmenően az irodalomban közölt PASP származékok esetén a tiolcsoportokat csak a gélek szerkezetének stabilizálására használták, de a tioltartalom és az oxidációs állapot szabályozását nem publikálták ezidáig. Redukcióra reagáló PASP hidrogéleket már állítottak elő, de reverzibilis redox reakciót nem valósítottak meg a gélben 14. A PhD dolgozatom célja olyan redox hatásra reverzibilis válaszreakciót adó PASP gélek szintézise volt, melyek a jövőben gyógyászati célra alkalmazhatóak. A munka fő részét képezte a redox hatásra reverzibilis szol-gél reakciót mutató polimerek, illetve reverzibilisen duzzadó gélek előállítása. A PASP gélek kémiai szerkezetét részletesen vizsgáltam. 10 Roweton S, Huang SJ, Swift G. Poly(aspartic acid): Synthesis, biodegradation, and current applications. J. Environ. Polym. Degr. 1997;5(3): Lu Y, Chau M, Boyle AJ, Liu P, Niehoff A, Weinrich D, Reilly RM, Winnik MA. Effect of Pendant Group Structure on the Hydrolytic Stability of Polyaspartamide Polymers under Physiological Conditions. Biomacromolecules. 2012;13(5): Gyenes T, Torma V, Gyarmati B, Zrínyi M. Synthesis and swelling properties of novel ph-sensitive poly(aspartic acid) gels. Acta Biomater. 2008;4(3): Shu S, Wang X, Zhang X, Zhang X, Wang Z, Li C. Disulfide cross-linked biodegradable polyelectrolyte nanoparticles for the oral delivery of protein drugs. New J. Chem. 2009;33(9): Zrínyi M, Gyenes T, Juriga D, Kim JH. Volume change of double crosslinked poly(aspartic acid) hydrogels induced by cleavage of one of the crosslinks. Acta Biomater. 2013;9(2):

5 4 A PhD értekezés tézisei A munkám utolsó részében a jövőben regeneratív terápia során alkalmazható, pórusos PASP hidrogéleket állítottam elő. 2. Anyagok és módszerek 2.1. Szintézis A tiolcsoportokat tartalmazó PASP szintézise során a PSI-t ciszteaminnal reagáltattam dimetil formamid oldószerben, bázisként dibutilamint alkalmaztam (1. reakcióegyenlet). A keletkező polimer tiol oldalcsoportjait diszulfidcsoportokká oxidáltam levegő jelenlétében. Az így nyert PSI térhálót ph = 8 pufferben PASP hidrogéllé hidrolizáltam. A ciszteaminnal módosított PASP származékot a PASP hidrogél redukciójával, majd tisztításával (dialízis és liofilizálás) állítottam elő. A ciszteaminnal módosított PSI-t 1,4-diaminobutánnal térhálósítva és a keletkező térhálót hidrolizálva szintetizáltam redox hatásra reverzibilisen duzzadó PASP hidrogéleket. Szabályozott morfológiájú gélek előállításához a PSI térhálósítását az oldószer (dimetil szulfoxid) fagyáspontja alatt végeztem (-10 és -40 C között) Jellemzési módszerek Mágneses magrezonancia (NMR) mérések segítségével azonosítottam és jellemeztem az előállított polimereket (Bruker Avance 300 spektrométer, 300 MHz). A polimerek tioltartalmát 5,5'-ditiobisz(2-nitrobenzoesav)-val (Ellman-reagens) történő származékképzést követően határoztam meg. Az abszorbancia spektrumokat UV Vis spektrofotométerrel vettem fel (Specord 200, Analytic Jena), a kalibráció során N-acetil-ciszteint használtam standard vegyületként. A hidrogélek rugalmassági modulusát egyirányú összenyomással határoztam meg henger alakú próbatesteken (Instron 5543 erőmérő). A tioltartalmú polimer oxidáció hatására

6 A PhD értekezés tézisei 5 bekövetkező gélesedését oszcillációs reológiával jellemeztem (Anton Paar Physica MCR 301, kúp-lap elrendezés, CP25-1). A PASP gélek morfológiáját pásztázó elektronmikroszkópiás felvételekkel jellemeztem (SEM JEL JSM 6380 LA, gyorsítófeszültség: 15 kv). A SEM mérések előtt a hidrogéleket folyékony nitrogénbe helyeztem és fagyasztva szárítottam. A szilárd mintákat vékony aranyréteggel vontam be. A PASP gélek pórusszerkezetének átjárhatóságát folyadékátesztéses kísérletekben vizsgáltam. N n + SH 3 Cl - Dibutilamin DMF HN p N q Levegő 2 Poliszukcinimid (PSI) SH Ciszteaminnal módosított PSI HN HN S S p s N q N t Hidrolízis H 2, ph = 8 HN HN S S p s H H q t Ditiotreitol H 2, ph = 8 HN HN SH SH s p H H t q Diszulfidhídon keresztül térhálósított PSI Diszulfidhídon keresztül térhálósított poliaszparaginsav PASP-SS Ciszteaminnal módosított poliaszpraginsav PASP-SH 1. reakcióegyenlet: Ciszteaminnal módosított PASP szintézise

7 6 A PhD értekezés tézisei A térhálósított PASP gélek kémiai szerkezetét a keresztkötő molekulák konverziójával jellemeztem. Az el nem reagált molekulákat oldószeres mosással távolítottam el a gélekből, majd meghatároztam a térhálóban a szabad amin csoportok koncentrációját egy általam fejlesztett származékképzésen alapuló reakcióval, 2,4,6-trinitro-benzolszulfonsav (TNBS) alkalmazásával. A hatóanyag-kioldódási mérésekhez modell hatóanyagot zártam a hidrogélbe térhálósítás során. A gélből történő hatóanyag-kioldódás sebességét redukálószer nélkül és redukálószer jelenlétében vizsgáltam UV Vis spektrofotométerrel. 3. Eredmények Kutatómunkám során módszert dolgoztam ki tiolcsoportokkal módosított PASP szintézisére. Az előállított polimerek szerkezetét NMR mérésekkel igazoltam. Az oxidáció illetve redukció hatására bekövetkező reverzibilis tiol-diszulfid átalakulást a polimer makroszkopikus szol-gél átmenetével bizonyítottam (1. ábra) 1. ábra A ciszteaminnal módosított PASP vizes oldatának (bal oldali kép) oxidáció hatására lejátszódó szol-gél átmenete PASP hidrogéllé (jobb oldali kép)

8 A PhD értekezés tézisei 7 A ciszteaminnal módosított PASP oxidáció hatására bekövetkező térhálósodása során vízoldható hatónyagot zártam a kialakuló gélbe. A bezárt hatóanyag kevesebb mint 20 %-át adta le a gél redukálószer nélkül a mérés időtartam alatt (2. ábra). Redukálószer hozzáadása elősegítette a gél erózióját, ezzel a kioldódás jelentősen felgyorsult, és a bezárt hatóanyag teljes mennyisége kioldódott. Az eredményekkel igazoltam, hogy az előállított PASP gélekből történő hatóanyag-leadás kinetikája a környezeti redox potenciállal szabályozható. A redukálószer konverziója (%) Redukálószerrel Redukálószer nélkül t (min) Kioldódott hatóanyag (%) 2. ábra Hatóanyag-leadás diszulfidhídon keresztül térhálósított PASP gélekből redukálószer nélkül és redukálószer jelenlétében. A ciszteaminnal módosított PASP polimerek gélesedését oszcillációs reológiával jellemeztem. A gél prekurzor oldatának polimer koncentrációja mind a gélesedési időt, mint a keletkező gélek merevségét befolyásolja, azonban az alkalmazott

9 8 A PhD értekezés tézisei oxidálószer koncentráció csak a gélesedési időre van hatással egy széles koncentrációtartományban, miközben a gélek merevsége állandó (3. ábra). Így a polimer vizes oldata előre meghatározott merevségű géllé alakítható oxidálószer hozzáadásával, a gélesedési idő pedig szabályozható a jövőbeli alkalmazásoknak megfelelően Tárolási modulus, G' (Pa) Gélesedési idő (s) xidálószer koncentrációja (M) 3. ábra A gélesedési idő ( ) és az oxidáció során keletkező gélek tárolási modulusának ( ) függése az oxidálószer koncentrációjától. A ciszteaminnal módosított PSI redox-inert keresztkötővel történő térhálósításával redox hatásra duzzadásfok-változást mutató PASP géleket szintetizáltam. Az oxidáció illetve redukció hatására bekövetkező duzzadásfok- és rugalmassági modulus változás reverzibilisnek bizonyult több cikluson keresztül. A tiolcsoportok mennyiségi jellemzésével bizonyítottam, hogy a

10 A PhD értekezés tézisei 9 redox hatásra adott választ a gélben lejátszódó tiol-diszulfid átalakulás okozza és a gélbeli térhálópont sűrűség szabályozható a funkciós csoportok oxidációjával és redukciójával. A PASP hidrogélek duzzadási tulajdonságait a kémiai szerkezetük nagymértékben befolyásolja, így egyszerű és megbízható, származékképzésen alapuló analitikai módszert fejlesztettem a keresztkötő molekulák konverziójának meghatározására. A primer aminok meghatározására szolgáló hagyományos módszer nem alkalmazható polimer gélekre a reagens bomlása miatt, ezért továbbfejlesztettem a módszert. Az elemzés során használt oldószert vizes közegről dimetil szulfoxidra cserélem és a reakciómechanizmust NMR mérésekkel határoztam meg. Az új módszer analitikai teljesítménye, így linearitása, helyessége, ismételhetősége és a reagens stabilitása dimetil szulfoxidban kiváló. Megállapítottam, hogy gyakorlatilag az összes keresztkötő molekula reagál legalább egyik funkciós csoportjával a térhálósítás során, de a lelógó szabad amin csoportok amid csoporttá való konverziója erősen függ a gélesítés során alkalmazott prekurzor oldat összetételétől. 4. ábra a) A makropórusos PASP hidrogélek morfológiája; b) makropórusos és hagyományos PASP hidrogélek folyadékáteresztése

11 10 A PhD értekezés tézisei A kutatócsoport tevékenysége az elmúlt években a regeneratív terápiában használható pórusos PASP hidrogélek fejlesztésével bővült. Alacsony hőmérsékletű folyadék-szilárd fázisszeparáció alkalmazásával makropórusos PASP géleket állítottam elő, melyek átlagos pórusátmérője a szupermakropórusos tartományba (5 200 µm) esett (4.a ábra). A pórusméret és a pórusok alakja a gélesítés hőmérsékletével és a térhálósítás mértékével szabályozható. A nyílt cellás pórusszerkezetet bizonyítja a szupermakropórusos gél nagy folyadékáteresztése, szemben a hagyományos, szobahőmérsékleten előállított PASP gélek elhanyagolható permeabilitásával (4.b ábra). 4. Új tudományos eredmények 1. Egyszerű szintézismódszert dolgoztam ki ciszteaminnal módosított poli(aszparaginsav) előállítására. Igazoltam, hogy a polimer tioltartalma szabályozható a reakcióelegy összetételével. Az előállított tioltartalmú polimer NMR hozzárendelését elsőként közöltem az irodalomban [1,5]. 2. A ciszteaminnal módosított poli(aszparaginsav) vizes közegben diszulfidhídon keresztül térhálósított, makroszkópikus hidrogéllé oxidálható, és a szol-gél átmenet reverzibilis. Raman spektroszkópiás és Ellman analitikai módszerrel igazoltam, hogy a gélesedés a tiolcsoportok diszulfidhíddá történő oxidációja miatt következik be [1,2].

12 A PhD értekezés tézisei A ciszteaminnal módosított poli(aszparaginsav) oxidáció hatására bekövetkező gélesedésének ideje és a keletkező gélek modulusa erősen függ a prekurzor polimeroldat összetételétől. Igazoltam, hogy a gélesedési idő az oxidálószer koncentrációjának változtatásával szabályozható oly módon, hogy a keletkező gélek modulusa azonos marad [5]. 4. lyan redox-reszponzív poli(aszparaginsav) hidrogélt szintetizáltam, melynek duzzadásfoka és modulusa szabályozható redukálószer illetve oxidálószer hozzáadásával. A ciszteaminnal módosított poliaszparaginsavat redox-inert, permanens keresztkötővel térhálósítottam, így elsőként állítottam elő olyan poliaminosav alapú hidrogélt, mely reverzibilisen reagál a redox hatásra a gélállapot megszűnése nélkül [3]. 5. Módszert dolgoztam ki permanensen térhálósított redoxérzékeny gélen belül a tiolcsoportok mennyiségi meghatározására, mind redukált, mind oxidált állapotban. A módosított Brannon-Peppas Peppas modell alkalmazásával meghatároztam a redukált és oxidált állapotban lévő gél térhálópont sűrűségét a ph-függő duzzadásfok mérések eredményeiből. A két független módszerrel igazoltam, hogy a gélbeli térhálópontsűrűség szabályozható a gél környezetének redox-pontenciáljával [3]. 6. Módszert dolgoztam ki a kémiai térhálópontok koncentrációjának meghatározására polimer gélekben. Igazoltam, hogy 1,4-diaminobutánnal térhálósított gélek esetén a nem reagáló keresztkötők koncentrációja elhanyagolható. A lelógó amin csoportok amid kötéseket hoznak létre a térhálósodás során nagy konverzióval, de a konverzió pontos értéke erősen függ a szintézis során alkalmazott keresztkötő koncentrációtól [4].

13 12 A PhD értekezés tézisei 7. Szintézismódszert dolgoztam ki kémiailag térhálósított makropórusos poli(aszparaginsav) hidrogélek előállítására. Megmutattam, hogy a kialakuló pórusok alakja és mérete erősen függ a gélesítési hőmérséklettől és a térhálósítási aránytól. Igazoltam a nyílt cellás pórusszerkezet jelenlétét [6]. 5. Az elért eredmények alkalmazási lehetőségei A diszulfidhídon keresztül térhálósított PASP hidrogélek számos előnyös tulajdonsága reszponzív karakter, nagy víztartalom, várható biokompatibilitás számos gyógyászati felhasználás alapját jelentheti, különösen tekintettel a hatóanyagleadó rendszerként és implantátumként történő alkalmazásra. A ciszteaminnal módosított PASP származékok in situ, oxidáció hatására bekövetkező gélesedése lehetővé teszi, hogy a polimer oldatot a szervezet kívánt pontjára injektálhassuk. A polimer szabad tiolcsoportjai kölcsönhatásba léphetnek a nyálkahártya cisztein egységeinek tiolcsoportjaival, ami erős adhéziót és elnyújtott hatóanyag-leadást tesz lehetővé. Mindebből adódóan, a fejlesztett PASP származékok különösen alkalmasak lehetnek pl. szemészeti készítmények előállítására, ugyanis a szemben a hagyományos formulák kis tartózkodási ideje gyenge biohasznosulást eredményez, mely a tiolcsoportokat tartalmazó PASP polimerekkel várhatóan jelentősen javítható.

14 A PhD értekezés tézisei Publikációk 6.1. A dolgozat alapját képező közlemények: Megjelent illetve közlésre elfogadott publikációk: (IF: impakt faktor, IC: független hivatkozás) 1. Gyarmati B, Vajna B, Némethy Á, László K, Szilágyi A. Redox- and ph-responsive cysteamine-modified poly(aspartic acid) showing a reversible sol gel transition. Macromol. Biosci. 2013;13(5): (IF 2012: 3.742, IC:2) 2. Gyarmati B, Némethy Á, Szilágyi A. Reversible disulphide formation in polymer networks: A versatile functional group from synthesis to applications. Eur. Polym. J. 2013;49(6): (IF 2012: 2.562, IC:5) 3. Gyarmati B, Némethy Á, Szilágyi A. Reversible response of poly(aspartic acid) hydrogels to external redox and ph stimuli. RSC Adv. 2014;4(17): (IF 2012 részleges: 2.562, IC:1) 4. Gyarmati B, Hegyesi N, Pukánszky B, Szilágyi A. A colorimetric method for the determination of degree of chemical cross-linking in aspartic acid based polymer gels. Express Polym. Lett. 2014, Közlésre elfogadva (IF 2012: 2.294) Közlésre beküldött publikációk: 5. Gyarmati B, Krisch E, Szilágyi A. In situ oxidation-induced gelation of poly(aspartic acid) thiomers. 6. Gyarmati B, Mészár EZ, László K, Szilágyi A. Supermacroporous chemically cross-linked poly(aspartic acid) hydrogels.

15 14 A PhD értekezés tézisei 6.2. További publikációk 1. Gyenes T, Torma V, Gyarmati B, Zrínyi M. Synthesis and swelling properties of novel ph-sensitive poly(aspartic acid) gels. Acta Biomater. 2008; 4(3): (IF 2012: 3.727, IC:42) 2. Balogh GT, Gyarmati B, Nagy B, Molnár L, Keserű GM. Comparative evaluation of in silico pk a prediction tools on the Gold Standard dataset. QSAR Comb. Sci. 2009; 28(10): (IF 2012: 3.027, IC:22) 3. Némethy Á, Solti K, Kiss L, Gyarmati B, Deli MA, Csányi E, Szilágyi A. ph-and temperature-responsive poly (aspartic acid)-l-poly(n-isopropylacrylamide) conetwork hydrogel. Eur. Polym. J. 2013; 49(9): (IF 2012: 2.562, IC:1) 4. Gyarmati B, Szilágyi A. Preface for papers presented at AMSALS Period. Polytech. Chem. Eng. 2013; 58(1): (IF 2012: 0.269, IC:0) 5. Horváth Z, Gyarmati B, Menyhárd A, Doshev P, Gahleitner M, Varga J, Pukánszky B. The role of solubility and critical temperatures on the efficiency of sorbitol clarifiers in polypropylene. RSC Adv. 2014; 4(38): (IF 2012 részleges: 2.562, IC:0) 6.3. Konferencia előadások Saját szóbeli előadások: 1. Gyarmati B. A környezet redoxpotenciáljára érzékeny aminosavgélek. BME VBK TDK Konferencia; Budapest, (1. díj) 2. Gyarmati B. Kémiai környezetre érzékenyen reagáló poliaminosav-gélek. TDK Konferencia, Kémiai és Vegyipari Szekció; Szeged, 2007.

16 A PhD értekezés tézisei Gyarmati B, Gyenes T, Némethy Á, Torma V, Szilágyi A, Zrínyi M. A környezet ph-jára és redoxpotenciáljára érzékenyen reagáló poliaminosav-gélek. XXX. Kémiai Előadói Napok; Szeged, Gyarmati B, Faludi G, Némethy Á. Colloid Particles and Surface Chemistry in the BISPNA Project. BISPNA Symposium; IMRE Szingapúr; Gyarmati B, Szilágyi A. Redox-sensitive poly(amino acid) based gels. Ninth young researchers conference Materials Science and Engineering; Belgrád, Szerbia; Gyarmati B, Némethy Á, Szilágyi A. Poli(aszparaginsav) gélek redox-indukált szol-gél átalakulása. XVII. Nemzetközi Vegyészkonferencia; Kolozsvár, Románia; további szóbeli és poszter előadás

17

18