Lipid alapú nanorészecskék fejlesztése mint a személyre szabott terápia egyik lehetősége

Átírás

1 MultiScience - XXXI. microcad International Multidisciplinary Scientific Conference University of Miskolc, Hungary, April 2017 ISBN Lipid alapú nanorészecskék fejlesztése mint a személyre szabott terápia egyik lehetősége Juhászné Szalai Adrienn 1, Dojácskné Kiss-Tóth Éva 2, dr. habil. Fodor Bertalan 3 1 tudományos segédmunkatárs, 2 tudományos segédmunkatárs, 3 főiskolai tanár 1,2,3 Miskolci Egyetem, Egészségügyi Kar 1. BEVEZETÉS A tudomány fejlődése során az ember mind újabb és újabb eszközöket fejlesztett ki, hogy jobban megismerhesse az őt körülvevő világot. Ezek segítségével egyre részletesebb, pontosabb információkat szerzünk az anyagok természetéről, tulajdonságairól. Jelenleg már olyan műszerek állnak rendelkezésünkre, melyek a nanométeres nagyságrend tanulmányozását is lehetővé teszik. Az a felismerés, hogy az anyagok tulajdonságai méretfüggőek, komoly szemléletváltást váltott ki. A nanomérettartományt ( m) elérve lényegi változás tapasztalható az anyagok viselkedésében, ami főleg a megnövekedett fajlagos felületüknek köszönhető [1]. Általában 100 nm alatti részecskéket tekintjük nanorészecskének [2]. Alkalmazásuk számos, új lehetőséget rejt magában, kihasználva különleges tulajdonságaikat. Az orvosi kutatásokban is számos, különböző alakú, kémiai összetételű, kristályszerkezetű nanoméretű anyag lehetséges gyógyászati felhasználását vizsgálják. Leggyakrabban gyógyszerhordozó rendszerként történő alkalmazásuk áll a középpontban, mivel ezen rendszerek számos terápiás előnnyel járnának, mint például a célzott gyógyszerterápia, vagy a jóval kisebb dózis használatának lehetősége. A liposzómákat egy brit hematológus Alec D. Bangham figyelete meg és írta le először [3]. A liposzómák mesterségesen előállított vezikulák, melyek falát lipid kettősréteg alkotja. Ez a felépítés nagyon hasonlóvá teszi őket a sejtmembránhoz, ami lehetővé teszi, hogy a liposzómákat hatékonyan alkalmazzák a gyógyászatban mint például mesterséges gyógyszer- és génhordozó rendszereket. Ilyen esetben a szállítandó gyógyszermolekulát a belső, általában vizes közeget tartalmazó üregükbe, vagy a lipid kettősrétegükbe juttatják annak oldhatósági tulajdonságaitól függően [4]. A liposzómák biodegradábilisek és viszonylag enyhe immunválaszt váltanak ki, mely hatás bizonyos segédanyagokkal leggyakrabban polietilén-glikollal (PEG) még csökkenthető. Emellett a polietilén-glikol - irodalmi adatok alapján - növeli a liposzóma rendszer kolloidstabilitást is [5]. A kisebb, egy dupla foszfolipid réteggel határolt liposzómák általában 100 nm körüli méretűek. Előállításuk során nagyon lényeges, hogy megfelelő összetételű és töltésű lipideket válasszunk, melyek lehetőleg PEG-gel fedettek. A kapott vezikulák esetén a méret, a felszíni töltés vizsgálata szükséges, annak megállapítására, hogy a kívánt méretű és stabilitású részecskék keletkeztek-e. A felszíni töltés jellemzésére a zéta-potenciált használják. A zéta-potenciál a nanoanyagok felszíni töltésének mértéke [6]. A felszíni töltés egyrészt hatással lehet a részecske stabilitására, másrészt nagyban befolyásolja az oldhatóságát. DOI: /musci

2 Vizes oldatban az elektromos töltéssel rendelkező részecskéket egy ellentétes töltésű ionréteg veszi körül, amelynek egy része erősen kötött, ún. Stern réteg, mely megközelítőleg 0,3-0,4 nm vastag, majd ezt egy, már lazábban kötött diffúz réteg követi. A diffúz réteg vastagsága nagyon eltérő lehet anyagtulajdonságtól és a közeg viszkozitásáról függően. Az elektromos tér hatására elmozduló részecske körül a diffúz kettős réteg megszakad, és hasadási sík jön létre. Az itt mérhető potenciál értéke az elektrokinetikai vagy zétapotenciál [7]. Ha a zéta-potenciál értéke nulla, vagy ahhoz közeli érték, akkor a részecskék könnyebben összetapadhatnak, mely aggregátumok képződéséhez vezethet. Ha a vizsgált nanorészecske felszíni töltésének értéke megközelítőleg ±30 mv tartományba esik akkor aggregációs hajlama fokozottabb. Az ezen érték fölötti töltéstartomány a stabilabb részecskéket jellemzi. Emellett a felszíni töltés befolyással lehet a nanorészecskék biológiai rendszerekben kifejtett hatására is. A liposzómák előállítására számos lehetőség létezik. A legegyszerűbb módszer, melyet Bangham is alkalmazott, a rehidrációs módszer [3]. A módszer azon alapszik, hogy egy beszárított lipidfilm vizes közegben, enyhe rázás, keverés hatására spontán gömbszerű vezikulákat, vagyis liposzómákat képez. Az ekkor keletkező foszfolipid vezikulák falát több, egymást koncentrikusan körülvevő lipid kettősréteg alkotja. Ezeket multilamelláris vezikuláknak is nevezik (MLV). A rázás energiája befolyásolja a keletkezett vezikulák homogenitását. Enyhébb rázás esetén nagyobb méretű vezikulák keletkeznek, melyek diverzitása is nagy. Erőteljesebb rázással 1-4 m méretű, viszonylag homogén rendszer állítható elő [8]. A beszárított lipidfilmet általában a foszfolipidek valamilyen szerves oldószerben (kloroform, metanol, éter stb.) történő feloldásával, majd az oldószer eltávolításával állítják elő. Az eltávolításhoz vakuum bepárlást, vagy nitrogén gázzal történő szárítást alkalmaznak a leggyakrabban [8,9]. Sok esetben jobban használhatóak azok a liposzómák, melyeket csak egyetlen külső kettősréteg határol. Ebben az esetben is megkülönböztetnek kis unilamelláris vezikulákat (SUV), melyek mérete nm, nagy unilamelláris vezikulákat (LUV), melyek m közöttiek, valamint óriás unilamelláris vezikulákat (GUV), melyek nagyobbak, mint 50 m [8]. Ezeket a fenti módszer továbbfejlesztésével lehet többek között - előállítani. Két leggyakoribb lehetőség a szonikáció és az extrúzió. A szonikáció estén a rehidrációs módszerrel előállított szuszpenziót szonikátorba helyezik és hosszabb ideig ultrahang kezelésnek vetik alá [10]. Az extrúziós módszer esetén a multilamelláris vezikulákat úgy alakítják unilamellárissá, hogy egy speciális vastag falú eszközben (extrúder) nagy nyomást alkalmazva a szuszpenziót többször átpréselik egy adott pórusátmérőjű membránon. A kapott liposzómák átmérője hozzávetőleg megegyezik a membrán pórusátmérőjével [11]. A maradék szerves oldószertartalmat vakuummal, gél filtrációs eljárással, dialízissel, kromatográfiával, adszorpcióval vagy centrifugálással távolítják el [8,9]. Számos egyéb módszer is létezik azonban liposzómák előállítására. Az injektációs módszer esetében a szerves oldószerben feloldott lipideket meleg vízbe injektálják, aminek hatására különböző méretű unilamelláris liposzómák (SUV és LUV) keletkeznek. A töltéssel rendelkező foszfolipidket tartalmazó szuszpenzió ph-jának ciklikus változtatásával is hasonló vezikulák állíthatók elő [8].

3 Emulziókat is gyakran alkalmaznak lipószómák előállítására. Leggyakrabban fordított emulziók szerves fázisában hozzák létre a vezikulákat, majd a szerves fázist eltávolítják. Ez a fordított fázis evaporációs módszer [8]. Kifejlesztettek dupla emulziós technikát is (víz az olajban a vízben), amely teljesen monodiszperz rendszer kialakítását teszi lehetővé [12]. A melegítéses módszert azért fejlesztették ki, hogy elkerülhető legyen a szerves oldószermaradványok által kiváltott toxicitás. Ebben az esetben a foszfolipideket vízben oldják fel, melyhez glicerint adnak A vezikulák képződéséhez 210 C melegítik a rendszert. A glicerin az élő szervezetekben is előfordul, így nem károsítja azokat, és a kialakuló liposzómák stabilizálását is elősegíti. 2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 2.1 Vegyszerek A liposzómák készítéséhez használt nagytisztaságú vizet (szervesanyag mentes, R>12MΩ) Zeneer Up 900 Water Purification System (Human Corporation) készülékkel állítottuk elő. A liposzómák előállításához használt lipidek: 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DMPC, Avanti Polar Lipids), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (DOPE, Avanti Polar Lipids)1,2-dioleoyl-3- trimethylammonium-propane (DOTAP, Avanti Polar Lipids), 1,2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine (DPPC, Avanti Polar Lipids), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC, Avanti Polar Lipids), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-n-(methoxy(polyethylene glycol)-2000) (DMPE-PEG, Avanti Polar Lipids), koleszterin (Avanti Polar Lipids). Foszfáttal pufferált sóoldat (PBS, Sigma-Aldrih) és etanol (WVR) került még felhasználásra a lipidek előállítása során. 2.2 Kísérleti rész: liposzómák előállítása A foszfolipid nanorészecskék előállítására a rehidrációs módszert alkalmaztuk, melynek végén a vezikulák méretét extrúzióval állítottuk be. A kísérletek során 12 különböző lipid összetételű liposzóma előállítását végeztük el vizsgálva, hogy melyik összetétel eredményezi a legstabilabb és leghomogénebb rendszert, mely a későbbiekben potenciális gyógyszerhordozóként szerepelhet. A foszfolipidek különböző mol arányú kombinációját használtuk a liposzómák előállításához. A vizsgált foszfolipid összetételeket az 1. táblázat foglalja össze. A foszfolipideket - kiolvasztás után az 1. táblázat szerint egy Falcon csőbe kimérve, enyhén melegítés segítségével 10 ml etanolban feloldottuk, majd egy gömblombikba töltöttük. A lombik alját 60 C-os vízfürdőbe (IKA HB 10 digital) merítve 40 rpm fordulattal forgatni kezdtük, -80 kpa vakuum alá helyezve a rendszert. A bepárlást 60 percig a fenti körülmények között folytattuk, majd a nyomást -75 kpa-ra változtattuk az oldat felhabzásának elkerülésére, és további 120 percig végeztük a folyamatot.

4 1. táblázat Az alkalmazott foszfolipid összetételek és az összetevők mol aránya Termék neve Alkalmazott foszfolipidek molaránya Liposzóma 1 DMPC:kolesztein = 2:1 Liposzóma 2 DMPC:koleszterin: DMPE-PEG = 2:1:0,1 Liposzóma 3 DMPC:koleszterin:DOTAP:DOPE = 6:3:1:1 Liposzóma 4 DMPC:koleszterin:DOTAP:DOPE:DMPE- PEG = 56:28:10:10:6,25 Liposzóma 5 DPPC:koleszterin = 2:1 Liposzóma 6 DPPC:koleszterin:DMPE-PEG = 2:1:0,2 Liposzóma 7 DPPC:koleszterin:DOTAP:DOPE = 6:3:1:1 Liposzóma 8 DPPC:koleszterin:DOTAP:DOPE:DMPE- PEG = 56:28:10:10:6,25 Liposzóma 9 DSPC:koleszterin = 2:1 Liposzóma 10 DSPC:koleszterin:DMPE-PEG = 2:1:0,2 Liposzóma 11 DSPC:koleszterin:DOTAP:DOPE = 6:3:1:1 Liposzóma 12 DSPC:koleszterin:DOTAP:DOPE:DMPE- PEG = 56:28:10:10:6,25 A teljesen bepárolt mintát 10 ml PBS-ben reszuszpendáltuk, és 4-5 db üveggyöngy hozzáadása után, enyhe rázással eltávolítottuk a lombik falára tapadt lipidfilmet. Lipex extrúdert segítségével 60 C-on 100 nm pórusátmérőjű filtrációs membránt alkalmazva, 10 bar nyomással 10 egymást követő alkalommal átpréseltük a liposzóma szuszpenziót a membránon. A kapott szuszpenziót ezt követően dinamikus fényszórás elvén (DLS) működő műszerrel (Zetasizer Nano ZS) karakterizáltuk méret és zéta-potenciál tekintetében. 3. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE Az előállítás során átlag 106,8 nm körüli liposzómák keletkezését feltételezhetjük az eredmények alapján. A minták mérése 100x PBS-oldatos hígításban történt háromszori ismétlésben. A kék oszlopok a DMPC tartalmú, a lila oszlopok a DPPC tartalmú, a sárga oszlopok a DSPC tartalmú liposzómákat jelölik. Az eredményeket a 1. és 2. ábra mutatja be. Azt tapasztaltuk, hogy a PEG tartalom általában csökkenti a méretet.

5 Liposzóma1 Liposzóma2 Liposzóma3 Liposzóma4 Liposzóma5 Liposzóma6 Liposzóma7 Liposzóma8 Liposzóma9 Liposzóma10 Liposzóma11 Liposzóma12 Átlag méret nm DMPC DPPC DSPC 1.ábra A különböző összetételű liposzómák átlag mérete 2.ábra A különböző összetételű liposzómák átlag mérete Az intenzitás görbék, homogén, egyenletes méretű liposzómák kialakulására utalnak. A minták homogén rendszert alkotnak a mért polidiszperzitási index értékek (PdI) alapján is, melyek átlaga 0,12.

6 Liposzóma1 Liposzóma2 Liposzóma3 Liposzóma4 Liposzóma5 Liposzóma6 Liposzóma7 Liposzóma8 Liposzóma9 Liposzóma10 Liposzóma11 Liposzóma12 Liposzóma1 Liposzóma2 Liposzóma3 Liposzóma4 Liposzóma5 Liposzóma6 Liposzóma7 Liposzóma8 Liposzóma9 Liposzóma10 Liposzóma11 Liposzóma12 Áltag PdI 0,3 0,25 DMPC DPPC DSPC 0,2 0,15 0,1 0, ábra A különböző összetételű liposzómák átlag polidiszperzitási indexe Zeta potenciál értékek DMPC DPPC DSPC mv ábra A különböző összetételű liposzómák átlag zéta-potenciál értéke

7 A 3. ábrán láthatók a különböző összetételű liposzómák polidiszperzitási indexei. A kék oszlopok a DMPC tartalmú, a lila oszlopok a DPPC tartalmú, a sárga oszlopok a DSPC tartalmú liposzómákat jelölik. Az előállított liposzómák zéta-potenciál értéke változó. Ez elsősorban az alkalmazott foszfolipidek töltésétől függ. A 3, 4, 7, 8, 11, és12 liposzóma kationos foszfolipidet tartalmaz (DOTAP), amely miatt ezen liposzómák töltése pozitív értéket vesz fel. A kék oszlopok a DMPC tartalmú, a lila oszlopok a DPPC tartalmú, a sárga oszlopok a DSPC tartalmú liposzómákat jelölik. Az eredményeket a 4. ábra mutatja be. 4. ÖSSZEGZÉS Különböző összetételű liposzómákat állítottunk elő és elvégeztük karakterizálásukat. Az eredmények alapján a DMPC tartalmú liposzómák rendelkeztek a legoptimálisabb tulajdonságokkal mind méret mind homogenitás tekintetében. Viszont mindegyik liposzóma egyenletes méreteloszlást mutat. A zéta-potenciál alapján a 2,3,4,6,7,9,10 liposzóma rendszerek kolloidstabilitása mutatkozik a legjobbnak. A jövőben DMPC tartalmú liposzómák részletesebb vizsgálatát tervezzük. Célunk összetételük optimalizálása, hogy az így előállított liposzómális rendszerek rendelkezzenek olyan stabilitással, hogy a későbbiekben gyógyászati célra is potenciálisan alkalmasak legyenek mint gyógyszerhordozó rendszerek. 5. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ez úton szeretnék köszönetet mondani a Miskolci Egyetem Egészségügyi Karán működő Nanobiotechnológiai Laboratórium minden jelenlegi és korábbi munkatársának a kutatásainkban nyújtott segítségéért. A kutató munka a Miskolci Egyetem stratégiai kutatási területén működő Alkalmazott Anyagtudomány és Nanotechnológia Kiválósági Központ keretében valósult meg. 6. FELHASZNÁLT IRODALOM [1] KAPTAY GY., Anyagegyensúlyok, Miskolc, Raszter Nyomda Kft [2] JACOBS J.F, VAN DE POEL I., OSSEWEIJER P.: Sunscreens with Titanium Dioxide (TiO2) Nano-Particles:A Societal Experiment. Nanoethics, , [3] BANGHAM, A. D., HORNE, R. W. : Negative Staining of Phospholipids and Their Structural Modification by Surface-Active Agents As Observed in the Electron Microscope. Journal of Molecular Biology, ,

8 [4] YANG T., CUI F-D., CHOI M-K., LIN H., CHUNG S-J., SHIM CH-K., KIM D-D.: Liposome formulation of Paclitaxel with enhanced solubility and stability. Drug Delivery, 2007, 14, [5] SZEBENI J.: Complement activation-related pseudoallergy: A new class of drug-induced acute immune toxicity. Toxicology 216 (2005) [6] STONE V., NOWACK B., BAUN A., ET AL.: Nanomaterials for environmental studies: Classification, reference material issues, and strategies for physico-chemical characterization. Science of the Total Environment, , [7] BÁRÁNY S.: Az elektrokinetikai potenciál számítására használt Smoluchowski egyenlet alkalmazhatóságáról. Magyar Kémiai Folyóirat, 2005., 111(3), [8] LASIC DD: The mechanism of vesicle formation. Biochem J ,1-11. [9] MOZAFARI M R: Liposomes: An overview of manufacturing techniques. Cell. Mol Biol. Lett. 2005, 10, [10] KISEL M.A. ET AL.: Liposomes with phosphatidylethanol as a carrier for oral delivery of insulin: studies in the rat International Journal of Pharmaceutics , ] [11] MUI B, CHOW L, HOPE M J: Extrusion Technique to Generate Liposomes of Defined Size. Methods in Enzymology 2003, 367, [12] SHUM H CH, LEE D, YOON I, KODGER T, WEITZ D A: Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir, ,