A csuka (Esox lucius) sperma mélyhűtés eredményeinek és a spermabank felhasználási területeinek bemutatása

Átírás

1 A csuka (Esox lucius) sperma mélyhűtés eredményeinek és a spermabank felhasználási területeinek bemutatása Dr. Bernáth Gergely tanszéki mérnök SZIE MKK AKI

2 Mélyhűtés előnyei 1. Termelés gazdaságosságának növelése Költségek csökkentése Szaporítás egész évben 2. Asszinkron ivari működés kezelhetősége Tejesek vs. Ikrások fejése 3. Spermabank Genetikai diverzitás növelése Génmegőrzés Fajvédelem Kutatás segítése

3 Mélyhűtés fizikai és biológiai alapjai sejtek mélyhűtésének alapja: a víz vándorlása és a membránáteresztő képesség nagyobb sejt sejthártyája kevésbé permeábilis, tehát lassabban fagy meg, mint a víz számára átjárhatóbb membránnal rendelkező, kisebb sejt A tiszta, ionokat nem tartalmazó víz fagyáspontja 0 C. Különböző anyagokat tartalmazó folyékony közegek fagyáspontja tehát az oldott összetevők mennyiségétől függ állati sejtekben nagy mennyiségű víz, oldott cukrok és sók, valamint fontos fehérjék és zsírok találhatóak A plazmamembrán egy féligáteresztő hártya, amely csak a nagyobb molekulák számára jelent akadályt, a víz többé-kevésbé zavartalanul át tud hatolni rajta

4 Mélyhűtés fizikai és biológiai alapjai Ez az áramlás létfontosságú a sejten belüli és a sejten kívüli tér között, hiszen lehetővé teszi, hogy a különböző anyagok mennyisége egyensúlyban legyen a két oldalon. Az oldott anyagok mennyiségét az oldatban ozmolalitással szokás megadni, melynek mértékegysége mosmol/kg. Értéke egy átlagos sejtkultúra-közegben mosmol/kg

5 Mélyhűtés során fellépő sejtkárosodás A sejten belül jégkristályok jöhetnek létre, valamint zavart okozhat a dehidratáció. A hőmérséklet csökkenése során ozmotikus sokk érheti a sejteket 1. a külső környezet hipertonikus (nagyobb az oldott anyag mennyisége a sejten kívül, mint a sejten belül) 2. membránon kívüli közeg hipotonikus (nagyobb az oldott anyag mennyisége a sejten belül, mint a sejten kívül) A fenti jelenségek nagyban befolyásolják a krioprotektív anyagok beáramlását a sejten belüli térbe Ezek a védő anyagok gátolják meg a sejthártya károsodását a mélyhűtés során. Az ideális közeget izotóniásnak Halgazdálkodási nevezzük Tanszék

6 Mélyhűtés során fellépő sejtkárosodás gyakran előforduló probléma a fagyási folyamat szakaszossága: a tiszta víz hamarabb fog megszilárdulni a fagyás során és az oldott anyag nagy koncentrációban visszamarad jégkristályok képződnek túl gyors fagyasztási eljárás a sejt számára halálos jégkristályképződéssel jár viszont csökken a dehidratáció esélye túl lassú mélyhűtési folyamat megakadályozza a kristályképződést, ugyanakkor letális dehidratációhoz vezet A sejtek túlélésében a felolvasztási folyamat, ezen belül a felmelegítés mértéke és gyorsasága is nagy jelentőséggel bír. A hűtés sebessége és a fagyasztási hőmérséklet szabja meg a felolvasztás ütemét.

7 A mélyhűtés folymata Halak kezelése Mintavétel Sperma minősítése Termékenyítés Sperma minősítése Mélyhűtés

8 Fejés A csontoshalak nagy részénél a spermát le lehet fejni (pl.: szivárványos pisztráng (Oncorhynchus mykiss), azaz a hasfal masszírozásával kinyerhető a herében tárolt sperma. Egyes halfajok (pl. csuka (Esox lucius) esetében a mintavétel igen drasztikus, hiszen a faj anatómiai sajátosságai miatt az egyedet el kell pusztítani, és az ivarszervéből kell kinyerni a spermát. Mindkét módszer esetében a folyamat a kiválasztott egyed altatásával kezdődik. Altatáshoz a legtöbb esetben trikain-metánszulfonsavat (MS- 222-t), 2-fenoxietanolt, vagy szegfűszeg olajat alkalmaznak. A sperma kinyerése során el kell kerülnünk a minta vérrel, vizelettel, széklettel vagy egyéb anyagokkal történő szennyeződését.

9 Fejés A hasfal-masszázs alkalmazása közben használhatunk az ivarvezetékbe helyezett katétert, mellyel tovább csökkenthetjük a szennyeződés lehetőségét. A gyűjtött spermát felhasználásig oxigéndús környezetben, 0-4 C -on kell tárolni. Ha a minta szállítást igényel, akkor a tárolásnál megadott hőmérsékletet és oxigénellátottságot kell biztosítani.

10

11 Spermaminősítési módszerek CASA

12 Sperma aktiváció a sperma a szeminális plazmában nyugalmi, immobilis állapotban van Az aktiváció kiváltásához vizes közegre vagy speciális aktiváló oldatra van szükség. Az aktiváló oldatok ionos összetétele révén a spermiumok körül ozmotikus nyomáskülönbség alakul ki. Attól függően, hogy édesvízi, vagy tengeri fajról beszélünk az ozmolalitásnak az aktiváló oldatban alacsonyabbnak vagy magasabbnak kell lennie, mint a szeminális plazmában. Az édesvízi fajok esetében az ozmolalitás csökkenése, míg a tengeri fajok esetében annak növekedése váltja ki a sejtek mozgását. Egyes fajokban a káliumion (tokalakúak, lazacfélék), más esetben a széndioxid (lepényhalalakúak-pleuronectiformes) koncentrációjának nagyarányú csökkenése szükséges az aktivációhoz. az immobilizáló oldattal vagy hígítóval pedig megakadályozható a spermiummozgás

13 Mozgás időtartama az aktivációt követően néhány perc, de nagyon gyakran kevesebb, mint egy perc. Vigyázni kell tehát a fejés során, hogy a sperma ne érintkezzen semmilyen, aktivációra képes anyaggal (vizelet, bélsár, víz, vér stb.), elkerülve ezzel is a mozgás vizsgálat előtti indukálását. Előaktivációt okozhat továbbá a minták tárolására, vagy előhígítására szolgáló immobilizáló oldat vagy hígító. A spermiumok kezdeti motilitásának 2-3 másodperccel az aktivációt követően igen magas a sebessége (300 µm/s) és a flagellum mozgási frekvenciája (100 Hz), azonban ezek az értékek az idő előrehaladtával arányosan csökkenek. A vágótok (Acipenser gueldenstaedtii) esetében a motilitás időtartama körübelül 245 mp, a ponty (Cyprinus carpio) esetében 90 mp, sebes pisztráng (Salmo trutta m. fario) esetében 100 mp. A sügér (Perca fluviatilis) sperma esetében még 2 órával az aktivációt követően is fedeztek fel mozgó sejteket.

14 Rögzített paraméter (angol) Paraméterek magyar meghatározása Mértékegység Motility Motilitás % Progressive motility Progresszív motilitás % VCL-curvilinear velocity A hímivarsejt sebessége a ténylegesen μm/s megtett, teljes mozgási útvonalára számolva VSL-straight line velocity A hímivarsejt sebessége mozgásának μm/s kiindulási és végpontja közötti távolságra számolva (progresszív sebesség) LIN linearity A hímivarsejt ténylegesen megtett mozgási % útvonalának az egyenestől számított eltérése VAP-Average Path Velocity A hímivarsejt sebessége mozgásának μm/s átlagolt útvonlára számolva ALH- amplitude lateral Head A fej oldalirányú kitérésének átlagos μm Displacement nagysága BCF-Beat Cross Frequency A fej kilengésének frekvenciája Hz DAP- distance average path A hímivarsejt ténylegesen megtett μm útonalának és a mozgásának kiindulási és végpontja között mért távolságnak (nettó) az átlagolt hosszúsága DCL-distance curved line A hímivarsejt által ténylegesen megtett út μm hosszúsága DSL- distance straight line A hímivarsejt által megtett egyenes útvonal μm WOB- wobble A hímivarsejt teljes mozgási útvonalának az átlagolt mozgási útvonaltól számított eltérése % STR-straightness A hímivarsejt átlagolt mozgási útvonalának % Halgazdálkodási az egyenestől számított eltérése Tanszék

15

16 Spermaminősítési módszerek Sejtsűrűség

17 Spermaminősítési módszerek sejtek életképesség vizsgálata

18 Spermamélyhűtés folyamata A hűtőmédium és equilibráció A minta hűtőmédiummal történő hígítása fajspecifikus és tág keretek között mozog (általában 1:1-1:9). A közeg, mely mélyhűtés közben körülveszi a spermiumokat, két fő összetevőből áll. Az első ezek közül egy hígító, amely a szeminális plazmának megfelelő izotóniás oldat megfelelő puffer rendszerrel és membránstabilizáló anyagokkal. Az alkalmazott hígító nem aktiválja a sejtek mozgását, és összetétele taxon függő. Az egyik legfontosabb összetevője a puffer rendszer, amely megakadályozza a hűtés és felolvasztás során az oldat ph-értékének jelentős ingadozását.

19 Spermamélyhűtés folyamata A hűtőmédium és equilibráció Másik jelentős alkotórésze a membránstabilizáló, mely fontos szerepet játszik a sejtek külső felületének védelmében. Jól alkalmazható stabilizáló anyag pisztrángfélék esetében a tojássárgája, a BSA és a promin D. A hűtőmédium szintén fontos alkotója az ún. védőanyag vagy krioprotektáns. A védőanyagok általában alacsony molekuláris tömegű vegyületek, hiszen át kell hatolniuk a sejtek plazmamembránján. Egyes krioprotektív anyagok toxikusak lehetnek a sejtek számára. A spermiumokba jutva megakadályozzák a jégkristályok kialakulását a mélyhűtés alatt.

20 Ilyen anyagok használata nélkül a sperma termékenyítő-képessége a felolvasztás után jelentősen lecsökken. Halaknál jól alkalmazható védőanyagok például a DMSO, a glicerin, vagy a metanol. A sejtbe történő behatolásukhoz időre van szükség, amelyet equilibrációs időnek nevezünk. Spermamélyhűtés folyamata A hűtőmédium és equilibráció Az equilibrációs folyamat addig tart, amíg a krioprotektív anyag koncentrációja a sejten belül és kívül ki nem egyenlítődik. Kis sejtek és egyes védőanyagok (pl. metanol) esetében a jelenség a hígítás után azonnal lezajlik és nincs szükség várakozási időre.

21 Spermamélyhűtés folyamata Mélyhűtés és tárolás Az előkészített spermamintákat cseppek (pelletek) formájában közvetlenül, vagy műszalmákba, illetve ampullákba töltve hűtik. Utóbbi kettő alkalmazása kényelmesebb, hiszen könnyebb adagolást tesz lehetővé. A műszalmák mérete változó lehet (0,25-5 ml). Az évek során számtalan módszer alakult ki a sperma mélyhűtésére.

22 Spermamélyhűtés folyamata Mélyhűtés és tárolás Pelletes módszer A legegyszerűbb és legolcsóbb a szárazjég használata, melynek szublimációs hőmérséklete -78,5 C. Ennél az eljárásnál ún. pelleteket cseppentenek a szárazjégtömb felületén lévő mélyedésekbe. A módszer hátránya, hogy a hűtési sebesség és az arány nagyban függ a minta nagyságától. Előfordul, hogy a pelletek nem egyenletesen fagynak meg.

23 (kép: Horváth Ákos, 2000)

24 Spermamélyhűtés folyamata Mélyhűtés és tárolás Alkoholos fürdő A szárazjéghez hasonló módszer a hideg alkoholos fürdő. A spermát műszalmákba töltve fagyaszthatjuk le. Ebben az esetben is szigetelt tárolóegységet alkalmaznak, de ebbe folyamatosan áramoltatják az alacsony hőmérsékletű alkoholt. A hűtőközeg ebben az esetben általában minimum 95%-os és -78 C -os metanol, etanol vagy akár izopropanol. Szárazjég is adagolható a rendszerhez, ezzel is szabályozva a hűtés sebességét. Ennek a lépésnek hirtelen buborékképződés lehet az eredménye, ami csökkentheti a mélyhűtés sikerét.

25 Hűtő keret Spermamélyhűtés folyamata Mélyhűtés és tárolás A fenti módszerhez képest több előnnyel bír a cseppfolyós nitrogén alkalmazása. Ebben az esetben is szükség van hőszigetelt edényre, amelybe a -196 C - os hűtőközeget helyezik. A mintákat műszalmákba, vagy hűthető ampullákba töltik, melyeket egyenesen a folyékony nitrogénbe vagy egy, a közeg tetején úszó keretre helyeznek. A felületen lebegő tartó különböző vastagságú lehet, ezzel beállítható a hűtés sebessége és hőmérséklete. Ez a módszer lehetővé teszi fajra jellemző hűtési eljárások kidolgozását.

26

27 Spermamélyhűtés folyamata Mélyhűtés és tárolás Programozható mélyhűtő berendezés A negyedik lehetőség a programozható elektromos mélyhűtő berendezések használata. Ezek hűtőkamrájába kell belehelyezni a hűteni kívánt műszalmákat vagy hűthető ampullákat. A kamrába a számítógép egy előre megírt program alapján adagolja a cseppfolyós nitrogén gőzét, így belső érzékelői segítségével szabályozza a minta körüli hőmérsékletet. A készülékek előnye, hogy a mélyhűtést befolyásoló fontos változók (pl. hűtési sebesség és a környezet a minta körül) a fagyasztás alatt egységesek és változatlanok. A programozható mélyhűtő berendezésekkel fajra jellemző fagyasztási módszerek kidolgozása válik lehetővé (pl. hígító, védőanyag, fagyasztásra való érzékenység tesztelése.

28 Spermamélyhűtés folyamata Mélyhűtés és tárolás A készülék kapacitása akár több száz műszalma is lehet típustól függően. Kereskedelmi forgalomban számos ilyen berendezés érhető el *pl. (Cryomed TM, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA), (IceCube, Sy-Lab, Neupurkersdorf, Ausztria), (Asymptote EF600, Asymptote Ltd., St John s Innovation Centre, Cambridge, Egyesült Királyság)+. A programozható fagyasztó készülékek használatával, a kontrollált környezetnek köszönhetően, növelhető a mélyhűtési protokollok ismételhetősége. Hátránya ezeknek a berendezéseknek, hogy nagy az áramfelvételük és viszonylag nagy méretüknél fogva terepen egyáltalán nem vagy csak nehezen alkalmazhatók.

29

30

31

32 Spermamélyhűtés folyamata Felolvasztás Hasonlóan a mélyhűtéshez, itt is törekedni kell a megfelelő sebességre. A műszalmák esetében a gyors (nem túl gyors), dinamikus felolvasztás szükséges (pl. 0.25mL-es műszalma 40 C-on 5 mp). Ha a folyamat lassú, az intracelluláris jégkristályok rekrisztalizálódnak (nagyobb kristály jön létre), mely káros a sejt számára. A felolvasztás során eredményesen alkalmazható vízfűrdő berendezés. A felolvasztás sebességét a minta méretétől függően, fajspecifikusan (pl. hideg és melegvízi halfajok) kell beállítani.

33

34 Csuka sperma vizsgálat és mélyhűtés eddig elért eredményei 1. Babiak et al (Journal of Fish Biology) 7 féle hígító, 3 felolvasztási vegyület és 2 felolvasztási hőmérséklet (22 és 30 C) Erdahl és Graham hígító, tojássárgája, 120M NaCl, 30 C: 75%- os kelés 2. Lin et al ( muskellunge -Esox masquinongy, Transactions of the American Fisheries Society) sperma struktúra és kémiai összetétele a szeminális plazmának, sperma koncentráció SEM és TEM mikroszkóp 3. Babiak et al (Aquaculture Research) egyedi variancia vizsgálata Termékenyülés: 7%-96%, pool -ozott: 72%

35 Csuka sperma vizsgálat és mélyhűtés eddig elért eredményei 4. Glogowski et al (Journal of Applied Aquaculture) szalma vs pellet, különböző hígítók és védőanyagok, enzimaktivitás 0,6 M szacharóz, 15% DMSO, 10% tojássárgája, pellet: 91% kontroll 89%) 5. Lahnsteiner et al (Aquaculture Research) Fejt vs kioperált here mélyhűtése 74 és 85 % 1,2 ml-es hasonlóan működött mint a 0,5 ml-es 6. Babiak et al (Theriogenology) Hígító: tojássárgája, LDL Termékenyítő oldat: metilxantinok (koffein, teofillin) tojássárgája, LDL : nem javította az eredményességet Koffein: csökkentette, teofiilin: nem befolyásolta

36 Csuka sperma vizsgálat és mélyhűtés eddig elért eredményei 7. Hulak et al (Cybium) fejt vs kioperált here spermavizsgálat, desztvíz vs. vizelet hatása 59-91%, magasabb a vizelettel 8. Hulak et al (Aquatic Living Resources) fejt vs kioperált here spermavizsgálat, desztvíz vs. vizelet hatása magasabb ozmolalitás, ion és sejtkoncentráció a kioperáltban mint a fejtben mindkettőben magasabb motilitás vizelettel aktiválva, mint desztvízzel 9. Alavi et al (Theriogenology) Motilitás, flagellum mozgás, ozmolalitás,sperma morfológia 375 mosmol/kg megakadályozza a mozgást 125 és 235 mosmol/kg között a legmagasabb a motilitás, emelve nő a gyorsaság, a flagellum amplitudó és a hullámsűrűség

37 Csuka sperma vizsgálat és mélyhűtés eddig elért eredményei 10. Dzyuba et al (Journal of Applied Ichthyology) sperma spontán aktivációja a felolvasztást követően csukában nem jelentkezett 11. Zhang et al (Journal of Applied Ichthyology) hígító, sperma ikra-arány, kioperált here a sperma ikra arány és a hígító összetétel nem befolyásolt 0.3 M glükóz és 10% metanol 10 6 spermium/ikraszem: 92% termékenyülés 12. Cejko et al (Czech Journal of Animal Science) Különböző termékenyítő oldatok hatása (Billard féle oldat, keltetőházi rendszervíz és Woynárovich oldat) keltetőházi rendszervíz és Woynárovich oldat eredményesebb mint a Billard féle oldat (CASA)

38 Köszönetnyilvánítás A munkát és előadást a GINOP , EFOP VEKOP és a Halászati Operatív Program III. tengelye, valamint Bernáth Gergely Bolyai János Kutatási (BO/00508/18/4) Ösztöndíja és Az Emberi Erőforrások Minisztériuma ÚNKP-18-4 kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programja támogatta. A vizsgálatok és a bemutató továbbá a Szegedfish Kft.-vel együttműködve valósultak meg.