Témavezető: Dr. Noszál Béla egyetemi tanár

Átírás

1 Ph.D. értekezés Mazák Károly Vinpocetin és rokon vegyületei analitikai és terápiás tulajdonságait befolyásoló fizikaikémiai paraméterek meghatározása Témavezető: Dr. oszál Béla egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészi Kémiai Intézet BMGE Általános és Analitikai Kémiai Tanszék

2 TARTALMJEGYZÉK 1 BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉS IRDALMI ÁTTEKITÉS A Vinca alkaloidok előfordulása, izolálása A Vinca alkaloidok szerkezete A Vinca alkaloidok fizikai-kémiai tulajdonságai és analitikai meghatározásuk A vinpocetin gyógyászati jelentősége, hatásmechanizmusa Farmakokinetika és metabolizmus A protonálódási folyamatok szubmolekuláris jellemzése A kapilláris elektroforézis elválasztások elméleti háttere A megoszlási hányados meghatározásának módszerei KÍSÉRLETES RÉSZ A vizsgált anyagok előállítása A protonálódási állandók meghatározása UV-pH titrálással Molekulamechanikai számítások Kapilláris elektroforézis elválasztás A megoszlási hányados meghatározása vékonyréteg-kromatográfiával A megoszlási hányados meghatározása keverőedényes módszerrel EREDMÉYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK A protonálódási makroállandók meghatározása A protonálódási mikroállandók számítása A protonálódási makro- és mikroállandók értékelése Kapilláris elektroforézis elválasztás és annak jellemzése A kapilláris elektroforézis elválasztás predikciója részben nemvizes közegekben A megoszlási hányadosok számítása vékonyréteg-kromatográfiával A megoszlási hányadosok meghatározása keverőedényes módszerrel A megoszlási hányadosok értékelése ÖSSZEFGLALÓ SUMMARY AGL YELVŰ KIVAT KÖSZÖETYÍLVÁÍTÁS IRDALMJEGYZÉK YILATKZAT AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBE MEGJELET SAJÁT KÖZLEMÉYEK JEGYZÉKE

3 1 BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉS A gyógyszervegyületek sav-bázis tulajdonságainak és lipofilitásának részletes ismerete a hatóanyagok szervezetbeni sorsának megismerésében (testnedvekben való oldódás, membránpenetráció, plazmafehérjékhez és receptorokhoz való kötődés, metabolizmus) és analitikai meghatározhatóságában egyaránt kulcsfontosságú. A vinkamin, vinpocetin és ennek származékai már évtizedek óta a gyógyszerkincs részét képezik, ennek ellenére sav-bázis tulajdonságaikról és lipofilitásukról csak igen hiányos ismereteink vannak. A protonálódási állandók segítségével kiszámítható, hogy egy adott biológiai közeg kémhatásán milyen mértékben vannak jelen a kérdéses vegyület különböző mértékben protonált, így eltérő töltéssel rendelkező formái. A protonáltsági állapot ismerete analitikai eljárások, például kapilláris elektroforetikus analízisek tervezésében is jelentős. Az elválasztás-technika leggyorsabban fejlődő ágában, a kapilláris elektroforézisben a szeparáció alapját képező mobilitáskülönbség a molekulák ph-függő töltéskülönbségének a függvénye, mely utóbbi a protonálódási állandók ismeretében számítható. Az általunk vizsgált 12 vegyület egy része terápiás alkalmazással rendelkezik vagy ezen molekulák metabolitja, más részük pedig potenciális gyógyszerjelölt molekula. Célul tűztük ki a vinpocetin és rokon vegyületei sav-bázis tulajdonságainak jellemzését makroszkopikus és mikroszkopikus protonálódási állandók szintjén. 10 molekula csak egy protonálható csoporttal rendelkezik, 2 molekula két csoporttal, így az utóbbiak esetén a sav-bázis tulajdonságok szubmolekuláris jellemzésére is lehetőség van a mikroszkopikus protonálódási állandók meghatározásával. Célunk volt ezek alapján a molekulák kapilláris elektroforetikus elválasztása és annak tanulmányozása, hogy milyen hatással van a háttér elektrolit paramétereinek megváltoztatása az elválasztásra. Elméleti háttérként az fford egyenlet alkalmazásának lehetőségét vizsgáltuk részben nemvizes közegekben. A molekulák rossz vízoldékonysága miatt lipofilitásuk fordított-fázisú vékonyétegkromatográfia segítségével jellemezhető. Céljaink között szerepelt egy olyan validált módszer kidolgozása, aminek révén a molekulák oktanol/víz megoszlási hányadosai meghatározhatók, majd ezeket felhasználva szerkezetlipofilitás-összefüggések is felállíthatók. 3

4 2 IRDALMI ÁTTEKITÉS 2.1 A Vinca alkaloidok előfordulása, izolálása Az Apocynaceae családba tartozó kis télizöld meténg (Vinca minor) leveleinek gyógyító hatását már régen felismerték. Ennek első írásos dokumentuma 1684-ből származik [02Ká]. Bár a növény továbbra is folyamatosan szerepelt a népi orvoslás gyógyszerlistáján, az első tudományos vizsgálatokra csak az 1950-es években került sor. E kutatások során a növényből eltérő módon készített kivonatokat alkalmaztak és ezért a megfigyelt hatások is különböztek. A hatástani kép azután válhatott konzisztensebbé és pontosabbá, miután sikerült a növény alkaloidjait kémiailag tiszta formában kivonni, majd szintetizálni. A fő hatóanyagot, a vinkamint (2.1. ábra) először az 1950-es években izolálták [53Sc], majd 1961-ben a szerkezetét is tisztázták [61Tr]. A Richter Gedeon Vegyészeti Gyár kutatóinak 1955-ben ipari mennyiségben sikerült kivonniuk vinkamint a növényből [58Sz]. A lefolytatott preklinikai és klinikai vizsgálatok után a vinkamin Devincan néven került terápiás alkalmazásra 1961-ben Magyarországon és a Szovjetunióban, később más országokban is. A vinkamin értágító hatású, fő terápiás területe a cerebrovaszkuláris rendszer. A vinkamint azonban jóval hatékonyabb félszintetikus származéka, a vinpocetin (2.1. ábra) jelentős mértékben kiszorította a klinikai használatból C H H vinkamin 6 H C 2 H ábra A vinkamin és vinpocetin szerkezete H 5 C 2 A H C B E D C 2 H 5 vinpocetin 2.2 A Vinca alkaloidok szerkezete 4

5 A vinkamin és a vinpocetin (lásd 2.1. ábra) pentaciklusos eburnánvázat tartalmazó alkaloid, ahol a D/E gyűrűanelláció cisz, azaz 3α-H,16α-etil (3S,16S) konfigurációjú. Az eburnánvázas alkaloidok nevezéktana és a vázak számozása nem egységes, a disszertációban a szerves vegyészek nem pedig a növénykémikusok [94Sz] - által használt konvenciókat követtem. Egyes szerzők [78Pf] megkülönböztetik az eburnán (3β,16β) és a vinkán (3α,16α) vázat. Későbbi publikációkban a szerzők egyre inkább elhagyják a megkülönböztetést és az egész csoportot az eburnánváz származékaként írják le. Ezt erősíti az a tény is, hogy a CA (Chemical Abstracts) nevezéktan az eburnamenint választotta a vegyületcsoport alapvázául. A fenti okok miatt a disszertációban a vegyületek tágabb értelemben vett eburnánvázas vegyületekként szerepelnek. A vinpocetin a C(3) és C(16) révén két kiralitáscentrummal rendelkezik, így összesen 4 sztereoizomerje létezik 2 enantiomer párt alkotva (az egyik pár cisz, a másik transz anellációjú). Valamennyi sztereoizomer totál szintézise megvalósítható, szerkezetüket 1 H- és 13 C-MR spektroszkópiai vizsgálatokkal igazolták [93Cz]. A merev eburnánváz nem teszi lehetővé az (4) nemkötő elektronpár térállásának inverzióját, így elvileg ez a tercier aminocsoport is kiralitáscentrumnak tekinthető. Ám az eddig leírt összes eburnán származékban a (4) atom nemkötő elektronpárjának térállása megfelel a C(16) szénatomhoz kapcsolódó szubsztituens térállásának, ezzel ellentétes térállású származékot szintetikus úton sem tudtak idáig előállítani [78Pf, 73Im, 81Da, 82Va]. A vinpocetin cisz és transz D/E anellációjú epimerjének molekulamechanikai számításokkal (3.3. fejezet) optimalizált térszerkezete a 2.2. ábrán látható. A vinkamin esetén a C(14) szénatom is kiralitáscentrum, így összesen 8 sztereoizomerje létezik a molekulának. A cerebrovaszkuláris hatás hordozója a cisz-16α-etil(3s,16s)-eburnamin váz, míg a transz-16β-etil(3s,16r)-eburnamin váz perifériás értágító hatású [93Cz]. Az utóbbi években a transz-16α-etil(3r, 16S)-eburnamin vázas vegyületek szisztematikus farmakológiai vizsgálata is megkezdődött. A Richter Gedeon Vegyészeti Gyárban számos, a fenti anellációjú vegyületet szintetizáltak [98Szá], amelyeknél a C(14) oldallánc hosszát és karakterét (észter csoportok száma) változtatták. Az általunk vizsgált 4 vinkamin sztereoizomer és 8 vinpocetin származék a következő volt (2.3. ábra): (3S,14S,16S) vinkamin, (3S,14R,16S) epivinkamin, 5

6 2.2. ábra. A vinpocetin cisz és transz D/E anellációjú epimerjének molekulamechanikai számításokkal optimalizált térszerkezete. (3R,14S,16S) transz-vinkamin, (3R,14R,16S) transz-epivinkamin, (3S,16S) etil-ciszapovinkaminát (vinpocetin), (3R,16S) etil-transz-apovinkaminát (transz-vinpocetin), (3R,16S) (2-acetoxi)-etil-transz-apovinkaminát, (3R,16S) (2-hidroxi)-etil-transzapovinkaminát, (3R,16S) (3-acetoxi)-propil-transz-apovinkaminát, (3R,16S) (3- hidroxi)-propil-transz-apovinkaminát, (3S,16S) cisz-apovinkaminsav, (3R,16S) transzapovinkaminsav. A 12 molekula között 4 cisz- és transz-d/e anellációs epimer pár és 2 C(14) konfigurációs epimer pár található. A molekulák között 2 karbonsav és 10 észter található. Az észterek esetén a karboxilcsoporthoz kapcsolódó oldallánc hossza és karaktere változó. A 4 vinkaminsav származék metil-észter (vinkamin és diasztereomerjei), a 6 apovinkaminsav származék között 2 etil-észter (vipocetin és epimerje), 2 hidroxi-alkil- és 2 acetoxi-alkil-észter. 2.3 A Vinca alkaloidok fizikai-kémiai tulajdonságai és analitikai meghatározásuk a) MR-spektrális jellemzők: A vegyületek egy részének asszignációja ( 1 H- és 13 C- MR kémiai eltolódások, csatolási állandók) megtalálható az irodalomban [92Mol, 85Tó, 93Cz]. A (3S,16S) cisz- és (3S,16R) transz-d/e anellációs epimer párok 6

7 spektrális jellemzői között számos karakterisztikus eltérést tapasztaltak, így például a H(3) 0,9 ppm egységgel árnyékoltabb a transz epimerek esetében. Ennek oka a (4) magános elektronpárjának térállása és a D gyűrű anizotróp árnyékoló hatása. b) Tömegspektrometriai jellemzők: Az elektron bombázásos ionizáció utáni fragmentáció során a [M-70] +. ionok keletkezése a cisz-d/e anellációs epimerre jellemző [84Cz]. A jelenség valószínű oka az, hogy a [M-70] +. ionok képződéséhez egy sztereospecifikus retro-diels-alder reakcióval átrendeződő molekulaion szükséges. c) CD-spektrális jellemzők: A vinkamin 8 sztereoizomerjének etanolban felvett CDspektruma megtalálható az irodalomban [00Ca]. A (3R,14S) konfigurációjú epimerek esetén a pozitív Cotton-hatás-görbe maximuma 235 nm-nél van, míg a (3R,14R) konfigurációjú epimerek esetén 220 nm-nél. d) Sav-bázis tulajdonságok: Mindegyik vegyület tartalmaz egy bázikus (4) tercier aminocsoportot (az indolgyűrű nitrogénatomja nem bázikus, extrém savas közegben is először egy szénatom protonálódik az indol vázon). A két apovinkaminsav molekula ezen felül rendelkezik még 1-1 karboxilcsoporttal is. Irodalmi adatok [85Po] szerint a vinpocetin protonálódási állandójának logaritmusa 7,31, míg a ciszapovinkaminsav 2 protonálódási állandójának logaritmusa 8,3 illetve 2,4 [82Ko]. Az állandók meghatározásának módszerét és a körülményeket (hőmérséklet, ionerősség) nem közölték. e) ldhatóság: A vinpocetin és a cisz-apovinkaminsav vízben való oldhatóságát a ph=2-8 tartományban vizsgálták 20 C-on McIlvaine (citromsav és foszforsav tartalmú) puffereket használva [93Pu]. A vinpocetin esetén az oldhatóság a ph=4 és ph=8 intervallumban közel 4 nagyságrenddel csökkent. Ez összhangban van azzal a ténnyel, hogy a ph növekedésével a kationos, vízben jobban oldódó forma koncentrációja csökken. A cisz-apovinkaminsav oldhatósága a teljes tartományon belül az 1 mmol/dm 3 közelében volt. Ez szintén jól magyarázható a molekula savbázis tulajdonságainak ismeretében. A teljes vizsgált ph-tartományban ugyanis az ionos illetve ikerionos formák relatív koncentrációja dominál a töltés nélküli formáé felett. A vinpocetin oldhatósága jelentősen javítható volt γ-ciklodextrinnel való komplexképzés révén [86Ka]. 7

8 10 11 C H H H 3 C 2 H (3S,14S,16S) vinkamin C H 3 H H C 2 H 5 (3R,14S,16S) transz-vinkamin C H 3 H H C 2 H 5 (3S,14R,16S) epivinkamin C H 3 H H C 2 H 5 (3R,14R,16S) transz-epivinkamin H H H H C 2 H 5 (3S,16S) cisz-apovinkaminsav C 2 H 5 (3R,16S) transz-apovinkaminsav H 5 C 2 H C 2 H 5 (3S,16S) vinpocetin H H 5 C 2 C 2 H 5 (3R,16S) transz-vinpocetin C H 3 H H H C 2 H 4 C 2 H 5 (3R,16S) (2-acetoxi)-etil-transz-apovinkaminát C 2 H 4 C 2 H 5 (3R,16S) (2-hidroxi)-etil-transz-apovinkaminát C H 3 H H H C 3 H 6 C 2 H C 3 H 6 5 C 2 H 5 (3R,16S) (3-acetoxi)-propil-transz-apovinkaminát (3R,16S) (3-hidroxi)-propil-transz-apovinkaminát 2.3. ábra A 4 vinkamin és 8 vinpocetin származék szerkezete 8

9 f) Lipofilitás: A vinpocetin és a cisz-apovinkaminsav oktanol-víz megoszlási hányadosát szintén a ph 2-8 tartományban vizsgálták 37 C-on McIlvaine puffereket használva [93Pu]. A vinpocetin koncentrációját az egyes fázisokban GC, míg a cisz-apovinkaminsavét HPLC segítségével határozták meg. A vinpocetin esetén a megoszlási hányados a mért intervallumban monoton nő közel 3 nagyságrenddel, hiszen a lipofil semleges forma relatív koncentrációja is nő a ph emelésével. Ezzel ellentétben a cisz-apovinkaminsav megoszlási hányadosa alig változik a ph változtatásával, a teljes vizsgált ph-tartományban jobban oldódik a vizes fázisban, mint az oktanolosban. Ez a jelenség az ionos formák dominanciájára vezethető vissza. A fenti publikációban nem közöltek pontos log P értékeket, csak a lipofilitás-ph profilt ábrázolták. Egy másik kutatócsoport is meghatározta bőr permeációs vizsgálatok kapcsán a vinpocetin oktanol-víz megoszlási hányadosát 37 C-on HPLC segítségével, a kapott érték logaritmusa 3,56 volt [93Ko]. Az irodalomban nem találtam adatokat az oktanol-víz megoszlási hányados értékéről 25 C-on, amely hőmérsékletre vonatkoztatva a megoszlási hányadosok zöme található. Korábbi mérések nyomán [85Po] ismert a vinpocetin o-xilén-víz (log P = 3,02) illetve benzol-víz (log P = 3,14) megoszlási hányadosa is (a hőmérséklet nem volt megadva). g) Kötődés humán szérum proteinekhez: A (3S,16R) transz epimerek kimagasló affinitással kötödnek AGP-hez (α 1 -savas glikoprotein) az enantiomer (3R,16S) transz, illetve a (3S,16S) illetve (3R,16R) cisz diasztereomerekhez képest [91Fi]. A transz enantiomerek (függetlenül abszolút konfigurációjuktól) átlagosan háromszor nagyobb affinitással kötődnek a HSA-hoz (humán szérum albumin), mint a cisz diasztereomerek [92Fi]. h) HPLC elválasztás: A 8 vinkamin sztereoizomer elválasztására kromatográfiás rendszert dolgoztak ki cianopropil-szilika álló fázist és a mobil fázisban oldott királis kámforszulfonsavat felhasználva [82Sze]. A közelmúltban a 8 diasztereomer elválasztását királis állófázison (amilóz trisz-3,5-dimetil-fenil-karbamát) is megoldották [00Ca]. agy számú Vinca alkaloid elválasztása királis AGP oszlopon nagyobb sztereoszelektivitással és jobb felbontással járt, mint a királis HSA- 9

10 Sepharose oszlopon [92Fi]. A királis AGP oszlopot használva a vinpocetin 4 diasztereomerjének elválasztását is megvalósították [92He]. i) Meghatározás humán plazmában: Számos eljárást dolgoztak ki a vinpocetin, a ciszapovinkaminsav és a vinkamin mennyiségének meghatározására humán plazmában. A vinpocetin esetén szilárd fázisú extrakciót követő GC-MS alkalmazásával 0,1 ng/ml meghatározhatósági határt értek el [97Va]. A cisz-apovinkaminsav esetén RP- HPLC módszerrel a meghatározhatósági határ 5 ng/ml volt [96Ma]. A vinkamin esetében szintén RP-HPLC módszerrel hasonló érzékenységet értek el [92Da]. 2.4 A vinpocetin gyógyászati jelentősége, hatásmechanizmusa A vinpocetin, a Richter Gedeon Vegyészeti Gyár (korábban: Kőbányai Gyógyszerárugyár) Cavinton nevű originális készítményének hatóanyaga mindeddig a leghatásosabbnak bizonyult vinkamin származék. A Cavinton magyarországi törzskönyvezése (1977) és kereskedelmi forgalomba hozatala (1978) óta még 47 ország vette fel hatóságilag engedélyezett gyógyszerei listájára [02Ká]. A vegyületet először 1970-ben állították elő vinkaminból félszintetikus módon [73Lő]. agyobb mennyiségű anyagot a vinkamin teljes szintézisének megoldása után sikerült produkálni [83Sz]. A vinpocetin 1970-ben kezdődött hatástani vizsgálatai még ma is tovább folynak. A Richter kutatói a vinkamin szerkezetének módosításával több, mint 100 vinkaminszármazékot állítottak elő, amelyeknek cerebrovaszkuláris hatásait mérni tudják. Míg a korai kutatások elsődleges célja a vegyületek szervezet- és szervszintű hatásainak feltárása volt, addig a mai vizsgálatok a hatásmechanizmus sejtszintű és molekuláris folyamatait tanulmányozzák. A vinpocetin farmakológiai tesztelésének eredményei 5 pontban összegezhetők [02Ká]: a) A vegyület hatásának specifikus területe a cerebrovaszkuláris rendszer, amelynek tágításával fokozza az agyi véráramlást [76Ká, 90We]. A vinpocetin ötször hatékonyabban növeli az agyi vérellátást, mint a vinkamin. A cerebrovaszkuláris hatás hordozója a cisz (3S, 16S)-eburnamin váz, amelynek C(14) szénatomjához oxigén atomot tartalmazó funkciós csoport is kapcsolódik. 10

11 b) A vinpocetin antianoxiás és antiischaemiás hatású az agyban, amit a vazodilatáció és a közvetlen neuronális citoprotekció együttesen hozhat létre [76Bi, 90 Ri, 96Ki]. Az antianoxiás hatáshoz az is hozzájárul, hogy a molekula csökkenti a vér viszkozitását és fokozza a neuronok glükóz-felvételét. c) Az agy kognitív folyamatait serkenti, sőt a hipoxia okozta amnéziát is kivédi [87De]. d) A vazoaktív dózisnál nagyobb vinpocetin adagok antikonvulzív hatásúak [87Ke]. e) A vinpocetin javítja a vér rheológiai tulajdonságait a vér viszkozitásának csökkentése és a vörösvérsejtek plaszticitásának növelése útján. Az utóbbi évek biokémiai, neurokémiai kutatásai a vinpocetin számos molekuláris támadáspontját tisztázták [96Ki, 00Bö, 02Ká]. a) A vazodilatáció az érfal simaizmainak kontrakciós rendszerére kifejtett hatás révén valósulhat meg. Az izmok kontrakciójának indító szignálja az intracelluláris Ca 2+ - szint növekedése. A Ca 2+ egy része a sejtmembrán feszültségfüggő Ca 2+ -csatornáin át jut a citoplazmába, a másik része pedig az intracelluláris Ca 2+ -raktárakból szabadul fel. A vinpocetin csökkenti a Ca 2+ -csatornák konduktanciáját, így megakadályozza a kontrakció megindításához szükséges Ca 2+ -szint kialakulását. A vinpocetin gátló hatású a sejtmembrán feszültségfüggő a + -csatornáira is [96Er]. Ezen kívül a molekula nem-kompetitív módon gátolja a Ca 2+ -kalmodulin függő foszfodiészteráz enzimet (PDE1), amely molekula a cgmp-t, mint másodlagos hírvivőt hatástalanítja [84Ha, 95Be]. b) A neuroprotektív hatás védi az idegsejtet a programozott sejthalál, az apoptózis beindulásától. A vinpocetin neuroprotektív hatásának komponensei a következők. A citotoxicitás első lépése a a + és Ca 2+ intracelluláris felhalmozódása. A vinpocetin a feszültségfüggő a + - és Ca 2+ -csatornákon átfolyó ionáramokat csökkenti és ezáltal elősegíti a neuron túlélését [02Dé]. A lecsökkent intracelluláris Ca 2+ -szint révén gátlódik az excitátoros neurotranszmitterek (pl. glutaminsav) felszabadulása, ezáltal csökken az általuk indukált excitotoxicitás mértéke. A molekula ezen kívül közvetlenül is képes bizonyos típusú glutamát receptorokat gátolni [91Ki]. A vinpocetin a szabad gyökök keletkezését is gátolja, vagyis antioxidánsként is működik [00Sa]. 11

12 c) A kognitív folyamatokat javító hatás valószínű oka az, hogy a vinpocetin fokozza a hippokampális neuronokban előidézett ún. hosszú-távú potenciáció -t (long-term potentiation, LTP), azaz a szinaptikus hatékonyság (plaszticitás) tartós megnövekedését, ami az emléknyom képződésének első, celluláris szinten megfigyelhető lépése [92Mo]. d) Antikonvulzív hatása szintén a sejtmembrán feszültségfüggő a + -csatornáira kifejtett gátló hatásával magyarázható. 2.5 Farmakokinetika és metabolizmus Farmakokinetika: A vinpocetin felszívódásának fő helye a vékonybél [93Pu], hiszen az itt uralkodó enyhén lúgos környezetben a molekula töltésmentes, igen lipofil formájának relatív koncentrációja sokkal nagyobb, mint a gyomorban. A vinpocetin maximális koncentrációja a vérplazmában a tabletta bevétele után 1 órával alakul ki [85Ve]. A molekula a vérben főleg plazmafehérjékhez kötődve van jelen. A vinpocetin jól átjut a vér-agy gáton, orális bevitel után 98 perc múlva alakul ki az agyi koncentráció maximuma, míg intravénás bevitel esetén 2 perc múlva [85Po]. Az orálisan bevitt vinpocetin eliminációs felezési ideje 1-2 óra. A teljes ürülési idő 8 óra, vagyis a szer felhalmozódásától nem kell tartani a terápiás alkalmazás során [87Mi]. A közelmúltban pozitron emissziós tomográfia (PET) segítségével vizsgálták a 11 C izotóppal jelölt vinpocetin eloszlását és farmakokinetikáját az emberi szervezetben [02Gu]. Metabolizmus: A vinpocetin fő metabolitja a cisz-apovinkaminsav, emellett megtalálható a 14-hidroxi-vinpocetin, 14-hidroxi-cisz-apovinkaminsav, dihidroxivipocetin-glicinát és ezek konjugátumai (glükuronidok és szulfátok) is [85Ve]. A vinpocetin degradációjának kinetikáját és mechanizmusát vizes közegben részletesen vizsgálták [88Mu]. A cisz-apovinkaminsav alacsony lipofilitása ellenére képes átjutni a biológiai membránokon. Felszívódásának fő helye a gyomor [93Pu]. Feltételezik, hogy a gasztrointesztinális rendszer endogén anyagaival, például a mucinnal képez ionpárt, ami aztán már passzív diffúzióval jut át a membránokon. 12

13 2.6 A protonálódási folyamatok szubmolekuláris jellemzése Egyetlen protonálható csoporttal rendelkező molekulák esetén a sav-bázis tulajdonságokat egyértelműen jellemzi a molekula protonálódási makroállandója. Tízes alapú logaritmusának számértéke (log K) ebben az esetben megegyezik a protonált forma disszociációs állandójának negatív tízes alapú logaritmusával (pk s, pk a ). Többcsoportos molekulákra a kumulatív β i protonálódási makroállandókat is célszerű megadni. Általánosságban, ha L jelenti a molekula legbázikusabb formáját, valamint K i és β i az i-szer protonált forma keletkezését jellemző lépcsőzetes és kumulatív makroállandót, az összefüggések a következő alakot öltik: LH i 1 + H + LH i [LH i] K i = (2.1) + [LH ][H ] i-1 L + ih + [LH i i] LH i β i = = Π K + i j (2.2) [L][H ] j= 1 Az egyszerűbb és általánosabb jelölés kedvéért a részecskék töltését a 2.1 és 2.2 egyenletekben a hidrogénion kivételével elhagytuk. A makroállandóknak csupán a felsorolása is táblázatos könyvek (illetve az utóbbi időben számítógépes adatbázisok) köteteit tölti meg [64Si, 75Sm, 79Se] és a gyógyszerkémiai tankönyvek fontos, vagy éppen egyetlen táblázatos melléklete a hatóanyagok protonálódási állandóit tartalmazza [91Wi]. A makroállandók hasznosak, ha a különböző mértékben protonált részecskék koncentrációjának kiszámolása a cél a ph függvényében, vagy ha a molekula izoelektromos pontjának illetve átlagos töltésének meghatározása a feladat. Ugyanakkor, a makroállandók igen fontos korlátja, hogy a molekula egészét jellemzik, az egyedi funkciós csoportok bázicitásáról azonban nem nyújtanak információt. A kísérletileg meghatározott és publikált egyensúlyi állandók döntő többsége makroállandó, ezért a makro- (vagy makroszkopikus) jelző rendszerint el is marad. A 10 észter rossz vízoldékonysága nem tette lehetővé, hogy a protonálódási makroállandók meghatározásának legelterjedtebb módszerét, a ph-potenciometriás titrálást alkalmazzuk [84Al]. Egy másik gyakori módszer, az UV-pH titrálás akkor alkalmazható, ha a protonálódó csoport egy kromofór csoport közelében helyezkedik el, vagyis az UV-spektrum a ph hatására változik [01Ta]. Ez utóbbi módszerrel olyan 13

14 molekulák is vizsgálhatók, amelyek oldhatósága vizes közegben csupán mol/dm 3. Mivel a 10 észter oldhatósága még ennél is kisebb lúgos közegben, így a protonálódási állandók meghatározására az oldószerelegyes módszert használtuk. Ez a módszer különböző összetételű víz-szerves oldószer elegyekben mért látszólagos protonálódási állandók meghatározásán alapszik (logaritmusuk jelölése: log S K, ahol s = solvent), amiből a vizes közegre érvényes állandó extrapolációval kapható meg. Ha a vegyületek oldhatósága lehetővé teszi, metanolt használnak szerves oldószerként, mert a szerves oldószerek között ez rendelkezik a vízhez leginkább hasonló szolvatációs tulajdonságokkal. Többcsoportos molekulák egyes funkciós csoportjainak sav-bázis tulajdonságai csoportállandókkal, mikroállandókkal vagy szubmikroállandókkal jellemezhetők [90o]. Ezen szubmolekuláris szintű egyensúlyi állandókban hordozott szerkezeti információ a fenti sorrendben egyre részletesebb. A csoportállandók az egyes funkciós csoportok bázicitását tükrözik, de a molekula többi részének protonáltsági állapotát figyelmen kívül hagyják, és csak speciális esetekben alkalmazhatók [86o1]. A mikroállandók (mikroszkopikus protonálódási állandók) az egyes funkciós csoportok bázicitását jellemzik a molekula összes többi csoportjának bizonyos, meghatározott protonáltsági állapotában [23Bj]. A szubmikroállandók mikroállandón felüli információja az, hogy még a molekula konformációs (rotációs) állapotát is tükrözik [02Kr]. A 2.4. ábra a cisz-apovinkaminsav mikroegyensúlyi sémáját mutatja be. Az ábrán látható a 4 mikrorészecske (a molekulának négyféle protonáltsági állapotú formája), a 4 mikroállandó ( k, k, k, k ) és a 2 lépcsőzetes makroállandó (K1, K 2 ). Az és indexek a nitrogén és oxigén atomok protonálódására utalnak. A k mikroállandó felső indexe az adott folyamatban protonálódó funkciós csoportot jelöli, az (esetleges) alsó index pedig a már protonált csoportot. A makro- és mikroállandók közötti kapcsolat kétcsoportos molekulákra a következő [23Bj]: β 1 = K 1 = k + k (2.3) β 2 = K 1 K 2 = k k = k k (2.4) 14

15 k - H + H C 2 H 5 + HA - k - H H H + H C 2 H 5 C 2 H 5 A 0 - k H H C 2 H 5 k H 2 A 0 + HA 0 0 K 1 K 2 A - HA H 2 A ábra A cisz-apovinkaminsav mikroegyensúlyi sémája Ahhoz, hogy a fenti összefüggésekben valamennyi paraméter értékét megadhassuk, három független információ ismerete szükséges, melyek közül kettő általában a phpotenciometriás technikával és megfelelő számítási módszerekkel meghatározható makroállandó. A harmadik információ származhat UV-pH [71Ma] vagy MR-pH [91o] titrálásokból, ha egy csoport protonálódása szelektíven nyomon követhető. A másik lehetőség a deduktív módszer alkalmazása, ahol a kétcsoportos molekula egycsoportos származékainak makroállandói segítségével számíthatók a kétcsoportos molekula mikroállandói [26Eb, 89Pa]. Egy csoport protonálódása megváltoztatja (általában lecsökkenti) a másik csoport bázicitását. Ez a bázicitás-módosító hatás a kölcsönhatási tényező számértékével jellemezhető. Ennek definíciója a fenti molekulára: logk = logk logk = logk logk (2.5) 0 + Az azonos összetételű töltésmentes HA 0 és ikerionos HA mikrorészecskéket protonáltsági izomereknek hívjuk. A protonálódási folyamatok a legtöbb oldószerben 15

16 pillanatszerűen gyorsak, így a mikrorészecskék egymásba pillanatszerűen átalakulnak. A protonáltsági izomerek mindig együtt fordulnak elő az oldatban, ezért az ismert elválasztástechnikai módszerekkel elkülöníthetetlenek. Tovább nehezíti meghatározásukat, hogy koncentrációarányuk a ph-tól független: [HA [HA ] k [HA ][H = ] k [HA ][H ] ] k = k (2.6) Ezért a protonáltsági izomerek individuális spektroszkópiai, kinetikai jellemzői közvetlenül nem tanulmányozhatók [90o]. Mivel a biomolekulák specifikus kölcsönhatásai a megfelelő finomszerkezetű (protonáltsági állapotú és konformációjú) mikroformáik révén valósulnak meg és a specifikus biokémiai reakciókban nem mindig a domináns mikrorészecske a reaktív [82o], szükség van valamennyi mikrorészecske koncentrációjának kiszámítására, ami az összes mikroállandó meghatározását igényli. A mikrorészecskék koncentrációinak és protonálódási egyensúlyi állandóinak meghatározását 1986 óta definíciószerűen mikrospeciációnak nevezzük [86o2]. 2.7 A kapilláris elektroforézis elválasztások elméleti háttere A kapilláris elektroforézis (CE) napjainkban talán az elválasztástechnika leggyorsabban fejlődő ága [93Ku, 98Kh]. A módszer előnye a kiemelkedő hatékonyság ( elméleti tányérszám), rövid analízisidő, kis (néhány nl) mintatérfogat, alacsony működtetési költség (vizes pufferek szerves oldószerek helyett), automatizálhatóság. A legnagyobb hátránya a vezető kromatográfiás technikákkal szemben egyrészt a kisebb érzékenységben mutatkozik: mivel maga a kapilláris a detektorcella, a fényút igen rövid. Másrészt, méreteiből adódóan, a kapilláris elektroforézis nemigen használható preparatív célokra. Gondot okoz továbbá a nehezen reprodukálható injektálási térfogat. A kapilláris elektroforézis legegyszerűbb és leggyakoribb változata, a kapilláris zóna elektroforézis (CZE) során az elválasztás a komponensek különböző mobilitásán alapszik. Egy komponens mobilitása (µ) elektroforetikus (µ e ) és elektroozmotikus (µ EF ) mobilitásának összege: µ = µ e + µ EF (2.7) 16

17 A Hückel modell alapján egy komponens elektroforetikus mobilitása a következő képlettel számolható [98Fu]: z µ e = (2.8) 6πηr ahol z a részecske ph-függő töltése, η a közeg viszkozitása és r a részecske hidrodinamikai sugara. Elektroozmotikus áramlásnak (EF) nevezzük a kapillárisban levő háttérelektrolit elektromos tér hatására történő áramlását. Előkezeletlen kapilláris esetén a szilanolcsoportokról hidrogénionok disszociálhatnak le, valamint a háttérelektrolit negatív töltésű ionjai is adszorbeálódhatnak a kapilláris belső falára. A negatív töltésű csoportokat a háttérelektrolit hidratált kationjai veszik körül, elektromos kettősréteget és így potenciálkülönbséget, az úgynevezett zéta-potenciált, kialakítva. Elektromos tér hatására a hidratált kationok a negatív elektród, azaz a katód felé áramlanak, és mozgásuk révén a kapillárisban levő egész folyadék áramlani kezd. Ez az áramlás az anionokat is magával viszi, annak ellenére, hogy azok saját elektroforetikus mobilitásuk alapján az anód felé vándorolnának. Tehát a µ EF konstansként hozzáadódik a részecskék saját elektroforetikus mobilitásához. A detektorablak előtt először a kationok, majd az EF-fel együtt haladó semleges molekulák, végül az anionok haladnak el. Az elektroozmotikus mobilitás függ az alkalmazott térerősségtől, a háttérelektrolit ph-jától és ionerősségétől (koncentrációjától). µ EF annál nagyobb, minél magasabb a háttér-elektrolit ph-ja, hiszen magasabb ph-n (ph 4 felett) egyre több hidrogénion disszociál le a szilanolcsoportokról. Lúgosabb oldatokban (ph 8 felett) a ph növelése már nincs befolyással az EF nagyságára, hiszen gyakorlatilag az összes szilanol csoport deprotonált állapotban van. A gyakorlatban µ e predikciója során a részecskék sugara helyett a könnyebben hozzáférhető moláris tömeg (M) adatot alkalmazzák, ugyanis a tapasztalat szerint gömb alakú részecskék esetén a molekulák sugara arányos M 2/3-adik hatványával. Az egyes komponensek elektroforetikus mobilitása az fford által bevezetett [66f] képlet szerint: z µ e = k 2 / 3 (2.9) M 17

18 ahol k egy arányossági tényező. Az elválasztás alapját képező mobilitáskülönbség a részecskék ph-függő töltéskülönbségének a függvénye, mely utóbbi a 4.1. fejezetben meghatározott protonálódási állandók ismeretében számítható. Egy részecske átlagos töltése a következő képlettel számítható: z = z 0 + n = z 0 n + i Σ iβi[h ] i= 1 + n + i 1+ Σ β [H ] i= 1 i (2.10) ahol z 0 a molekula legkevésbé protonált formájának a töltése, n pedig az adott ph-n átlagosan kötött protonok száma. Egy részecske töltése legérzékenyebben log K i értéke körül függ a ph-tól, a ph kis változtatása ebben az intervallumban drámai módon megváltoztathatja a komponensek felbontását, vagy akár a migrációs sorrendet. Az elektroforetikus mobilitás fordítottan arányos az ion hidrodinamikai sugarával. Az fford összefüggésben ezt egyszerűen a moláris tömeg hatványaként közelítik, ami egyértelműen számítható, ellentétben a számítógépes molekulamodellezéssel kapott paraméterekkel, amelyek értéke a felhasznált szoftvertől is függ [98Fu]. Az fford modell alkalmazhatóságát több vegyületcsaládra, így szulfonamidokra [97Li], nukleotid-monofoszfátokra [01Su], epesavakra [00Gy] is igazolták. Azonban ez az egyenlet nem tesz különbséget az azonos moláris tömegű, de eltérő alakú sztereoizomerek között. Így például két indolalkaloid epimer, a szerpentin és alsztonin elválasztható egymástól kapilláris zóna elektroforézissel [98Un]. Egy komponens elektroforetikus mobilitása kísérletileg a következő összefüggésből számítható [93Ku]: leff l 1 1 µ e = µ µ EF = ( ) (2.11) V t t EF ahol l a kapilláris teljes hossza, l eff a kapilláris hossza a detektorablakig, V az alkalmazott feszültség, t a komponens migrációs ideje és t EF az EF migrációs ideje. A kapilláris zóna elektroforézist kiterjedten használják indolalkaloidok elválasztására [96Ch, 97Un, 98Pe, 98Un, 02St], a közelmúltban jelent meg egy tanulmány Vinca alkaloidok nemvizes közegű elválasztásáról [02Ba], de a vegyületek között egyik esetben sem szerepelt a vinpocetin és általunk vizsgált származékai. 18

19 2.8 A megoszlási hányados meghatározásának módszerei A lipofilitás a biológiailag aktív vegyületek egyik legfontosabb fizikai-kémiai tulajdonsága, amely szerepet játszik a hatás farmakokinetikai és farmakodinámiás fázisában egyaránt [96 Pl, 01Te]. A lipofilitás optimalizálása kulcsfontosságú az igen lipofil központi idegrendszerben ható szerek esetén. A lipofilitás számszerű jellemzésére a gyógyszerkémiai szerkezethatás-összefüggésekben az oktanol/víz megoszlási hányados logaritmusa (log P) vált általánosan elfogadottá [94Ha]. A nernsti definíció szerint, egy anyag megoszlási hányadosán két egymással nem elegyedő oldószerben, azonos molekuláris állapotban (protonáltság, asszociáció mértéke, tautomer formák) mért aktivitásainak arányát értjük, mely adott hőmérsékleten és nyomáson, az egyensúlyi állapot elérése után konstans érték. Híg oldatok (c<10 2 mol/dm 3 ) esetében az aktivitások helyett az egyensúlyi koncentrációkkal is kifejezhetjük a megoszlási hányadost. Konvencionálisan a szerves fázisban mérhető koncentráció a számlálóban szerepel, így a megoszlási hányados minél nagyobb számérték, annál nagyobb lipofilitást jelöl. A megoszlás számos kromatográfiás és nagy teljesítőképességű osztályozó (high throughput screening) módszer elméleti hátterét képezi. A töltésmentes, monomerformák megoszlása mellett bizonyos mértékben az ionos formák is megoszlanak. Ezek megoszlási hányadosa több nagyságrenddel alacsonyabb, mint a töltésmentes formáé, és függ az oldatban jelen levő egyéb ionok koncentrációjától, amelyek ionpárképzés [99Ta], vagy a két fázis Galvani-potenciál különbségének módosítása [01Re, 01Bo] révén befolyásolják az ionos formák megoszlási hányadosát. Az ionizációra képes molekulák esetén a vegyület protonálódási állandói és a vizes fázis ph-jának ismeretében meghatározható az egyes makrorészecskék relatív koncentrációja, aminek révén a kísérletileg mérhető, úgynevezett látszólagos megoszlási hányados (disztribúciós hányados) a következő összefüggésből számolható [97Pa]: D = Σ x i P i (2.12) ahol x i az egyes makrorészecskék relatív koncentrációja a vizes fázisban, P i pedig azok megoszlási hányadosa. A log D - ph függvényt lipofilitás-ph profilnak nevezik. 19

20 Egyértékű savak és bázisok esetén a disztribúciós hányados abban a ph-tartományban maximális, ahol a töltésmentes forma koncentrációja meghaladja az ionos formáét (ekkor log D megegyezik a töltésmentes forma log P értékével). Ikerionos vegyületek lipofilitás profilja mutathat maximumot és minimumot is az ikerionos forma lipofilitásától és a protonáltsági izomerek relatív koncentrációjától függően [97Pa]. A megoszlási hányados kísérleti meghatározására alkalmazott módszerek két csoportba sorolhatók. A direkt eljárások a megoszlási hányados közvetlen meghatározását teszik lehetővé. Ide tartoznak a rázótölcséres, keverőedényes módszerek, a centrifugális megoszlási kromatográfia, a kétfázisú potenciometriás titrálás és a ciklikus voltametria [97Tak, 01Co]. Az indirekt módszerekkel (fordítottfázisú kromatográfiás technikák) a megoszlási hányadossal arányos retenció határozható meg. Ha a retenciós paraméter és más, lehetőleg hasonló szerkezetű vegyületek log D értéke között lineáris kapcsolat van, kalibrációs egyenest felállítva lehet a keresett vegyület megoszlási hányadosát számítani [94Bi]: log D = a R M + b (2.13) ahol R M a kromatográfiás retenciót jelző érték, a retenciós faktorból (R F ) számítható az alábbi összefüggés segítségével: R M = log (1/R F 1) (2.14) A fordítottfázisú vékonyréteg-kromatográfia (RP-TLC) számos előnnyel rendelkezik: gyors, könnyen kivitelezhető, kis anyagigényű és lehetővé teszi a vegyületek egyidejű vizsgálatát. További előny, hogy a vizsgált anyagnak nem kell feltétlenül tisztának lennie és a koncentráció meghatározása (ami gyakran jelent problémát a direkt módszereknél) sem szükséges [96Wa]. 20

21 3 KÍSÉRLETES RÉSZ 3.1 A vizsgált anyagok előállítása A vinkamin és apovinkaminsav-származékok szintézise és tisztítása a Richter Gedeon Vegyészeti Gyárban történt [98Szá]. Az UV-pH titrásásoknál alkalmazott metanol spektroszkópiai tisztaságú (Chemolab) volt. A kapilláris elektroforézis méréseknél háttérelektrolitnak használt MES (2-[-morfolino]-etán-szulfonsav) és TRIS (Tris-(hidroximetil)-aminometán) a Sigma-Aldrich cégtől származott. A vékonyréteg-kromatográfiás mérésekhez használt pirido[1,2-a]pirimidineket a Chinoin Gyógyszergyárban szintetizálták [83He], a progeszteron és klórpromazin gyógyszerkönyvi (Ph.Hg.VII) minőségű volt. A többi vegyszer analitikai tisztaságú volt. A vizes oldatok készítéséhez frissen kiforralt desztillált vizet használtunk. 3.2 A protonálódási állandók meghatározása UV-pH titrálással Az UV-spektrumok felvételéhez Perkin-Elmer Lambda 15 UV/VIS és Hewlett- Packard 8452A diódasoros spektrofotométereket és 1 cm optikai úthosszú kvarc küvettákat használtunk. Az oldószerelegyekben a p S H (s = solvent) mérése Radiometer phc2406 kombinált üvegelektróddal és Radiometer phm93 ph-mérővel történt 25 Cra termosztált üvegcellában. Az egyes oldószerelegyekben az elektród kalibrálása két lépésben ment végbe. Az elektródválasz meredekségét 4 BS (ational Bureau of Standards) pufferrel állapítottuk meg vizes oldatokban. Majd az elektródot egy napig a megfelelő metanol-víz elegyben áztattuk és a p S H skála egy adott pontjának a 0,05 mol/kg molalitású, deklarált p S H-jú kálium-hidrogén-ftalát oldatot választottuk [86Lo]. 3-6 különböző összetételű elegyet használtunk, kezdve a lehető legkevesebb metanolt tartalmazó eleggyel, amely biztosította azt, hogy a teljes UV-pH titrálás során ne váljon ki csapadék az oldatból. A molekulák oldhatóságától függően az elegy metanol tartalma 42,5; 36,0; 28,9; 20,4; 10,0 és 0,0 tömeg% (t%) volt. Az oldott anyag koncentrációja 7, mol/dm 3 volt mindegyik titrálás során. Az oldatok p S H értékét Hamiltonfecskendővel adagolt 0,1 mol/dm 3 koncentrációjú HCl és KH oldatokkal állítottuk be, az extrém savas ph-tartományban tömény kénsavat is használva. A hozzáadott erős sav vagy lúg térfogata nem haladta meg az adott oldat térfogatának ezredrészét, tehát az 21

22 oldott anyag koncentrációja nem változott a p S H beállítása során. A maximális oldhatóság biztosítása érdekében nem használtunk indifferens elektrolitot a konstans ionerősség beállítására. Az 3.1. ábra a transz-apovinkaminsav UV-spektrumának ph-függését mutatja be vizes közegben, az áttekinthetőség kedvéért csak néhány ph-értéken bemutatva. A 3.2. és 3.3. ábra különböző hullámhosszakon felvett UV-pH titrálási görbéket mutat. Az ábrákból látható, hogy az UV-spektrum 2, egymástól jól elkülönülő phtartományban változik: egy gyengén lúgos (ph = 6 10) illetve egy savas (ph = 0 4) tartományban. Az is látható, hogy bizonyos hullámhosszakon (így 260 nm-en) az UVspektrum mindkét ph-intervallumban változik, míg más hullámhosszakon (így 285 nmen) csak az egyik intervallumban. A legnagyobb mértékű abszorbancia változás a savas tartományban 260 nm-nél, míg a lúgos tartományban 285 nm-nél volt tapasztalható. Az inflexiós pontok helyzete az UV-pH titrálási görbéken a mérési hibahatáron belül (néhány század ph) nem függött a kiválasztott hullámhossztól. Ezek a spektrális 0 változások alátámasztják azt az elgondolást, hogy a minor protonáltsági izomer ( HA 0 ) koncentrációja bármely ph-értéken több nagyságrenddel a major protonáltsági izomer + ( HA ) koncentrációja alatt lesz, így hozzájárulása bármilyen spektroszkópiai jelhez ph1,38 ph2,49 ph6,18 ph7,43 ph9,20 1,5 abszorbancia 1 0, hullámhossz (nm) 3.1. ábra A transz-apovinkaminsav UV-spektrumának ph-függése vizes közegben 22

23 260 nm 0,80 0,75 abszorbancia 0,70 0,65 0,60 0, ph 3.2. ábra A transz-apovinkaminsav UV-pH titrálási görbéje 260 nm-en 285 nm 0,45 abszorbancia 0,40 0,35 0, ph ábra A transz-apovinkaminsav UV-pH titrálási görbéje 285 nm-en 23

24 elhanyagolható. A protonáltsági izomerek koncentrációja közötti nagy különbség oka az amino és karboxilát funkciós csoportok közötti jelentős bázicitáskülönbség. Tehát a protonálódás fő útvonala a k és k mikroállandók mentén vezet, ami más szavakkal k k azt jelenti, hogy k >> k és >>. Az ilyen esetben, amikor az egyik útvonal túlnyomóan domináns, a főútvonalhoz tartozó mikroállandók értéke a (3) és (4) összefüggésekből látható okból gyakorlatilag megegyezik (legalább 4 értékes jegyig, tehát jóval a mérési hibahatáron belül) a megfelelő lépcsőzetes makroállandók értékével ( k K2 és k K 1 ) de azzal elvileg, természetesen nem azonos. Ahogy a közeg dielektromos állandója csökken (metanol tartalma nő) úgy válik a két protonáltsági izomer koncentrációja egyre inkább összemérhetővé. A 4.2. fejezetében bemutatott deduktív módszerrel számolt mikroállandók azonban bizonyítják, hogy még a nagyobb metanol-tartalmú közegekben is az ikerionos formán át vezető útvonal dominál, tehát továbbra is k K2 és k K 1. A fenti megfontolások alapján a ph = 0 4 intervallumban (260 nm) kapott görbe inflexiós pontja a megegyezik a log k = log K2, míg a ph = 6 10 intervallumban (285 nm) kapott inflexiós pont a log k = log K 1 protonálódási állandók logaritmusaival. Az egyes ph-intervallumok pontjaira az alábbi függvény illeszthető: ph = 0 4 A ph = A + HA + A + α HA HA = A HA + A + + HA (logk ph) 0 10 (log k ph ) (3.1) ph = 6 10 A ph = A 0 HA + A + α + = A 0 HA + A + HA HA HA (logk ph) 10 (logk ph) (3.2) ahol A, A és α az alsó indexeknek megfelelő mikrorészecskék abszorbanciáját, a képződésüket kísérő abszorbancia változást és relatív koncentrációjukat jelölik. A nemlineáris paraméterbecsléssel (Statistica programcsomag) kapott állandók értékei a 4.1. fejezetben kerülnek bemutatásra, míg a mérési pontokra illesztett görbék a 3.2. és 3.3. ábrán láthatók. A cisz-apovinkaminsav UV-pH titrálási görbéi hasonló lefutásúak voltak, így a protonálódási állandók számítása a 3.1 és 3.2 egyenletek alapján történt. A 10 észtermolekula titrálási görbéje csak a lúgos tartományban mutatott abszorbancia változást, ezekből a görbékből a 3.2 egyenlettel analóg módon a K makroállandó (ami ezeknél a vegyületeknél megegyezik a k mikroállandóval) volt meghatározható. 24

25 3.3 Molekulamechanikai számítások A cisz- és transz-vinpocetin, valamint a négy vinkamin diasztereomer konformereinek geometria-optimalizálását vizes és oktanolos közegben MMFF94s erőtérben Rácz Ákos kollégám végezte el. A vinpocetin cisz és transz D/E anellációjú epimerjének optimalizált és az SGI Media Recorderrel megjelenített térszerkezete a 2.2. ábrán látható. 3.4 Kapilláris elektroforézis elválasztás Az elválasztás tervezése során elkészítettük a 12 molekula fford egyenlet (2.9) alapján számolt relatív mobilitásának ph-függését bemutató diagramot, ahogy azt a 3.4. ábra mutatja. relatív mobilitás 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000-0,005-0,010-0,015-0,020-0, ph ca ta C tc E DE P DP V tv ev tev 3.4. ábra A 12 molekula relatív mobilitásának ph-függése. A molekulák rövidítései: ca: cisz-apovinkaminsav, ta: transz-apovinkaminsav, C: vinpocetin, tc: transzvinpocetin, E: (2-acetoxi)-etil-transz-apovinkaminát, DE: (2-hidroxi)-etil-transzapovinkaminát, P: (3-acetoxi)-propil-transz-apovinkaminát, DP: (3-hidroxi)-propiltransz-apovinkaminát, V: vinkamin, tv: transz-vinkamin, ev: epivinkamin, tev: transzepivinkamin. Az ábrából látszik, hogy a legnagyobb mobilitáskülönbség az egyes vegyületek között a ph = 6 9 tartományban van. A 3.5. ábra csak ezt a szűkebb ph-intervallumot mutatja be. 25

26 relatív mobilitás 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000-0,005-0,010-0,015-0,020-0, ,5 7 7,5 8 8,5 9 ph ca ta C tc E DE P DP V tv ev tev 3.5. ábra A 12 molekula relatív mobilitásának ph-függése. A molekulák rövidítései megegyeznek a 3.4. ábráéval. Látható, hogy a ph = 7,0 7,5 tartományban van a legnagyobb mobilitáskülönbség a komponensek között. Azonban az is megfigyelhető, hogy néhány molekula relatív mobilitás görbéje teljesen együtt halad, vagyis elválasztásuk egymástól nem várható. Ezek azok a molekulák, amelyek bázicitása, és így töltése, valamint moláris tömegük is nagyon hasonló. Ide tartozik a vinkamin és transz-vinkamin, az epivinkamin és a transz-epivinkamin, a két acetoxi- és a két hidroxiszármazék. Ezt az előrejelzést az előkísérletek is igazolták: nem tudtuk mind a 12 vegyületet egymástól alapvonalig elválasztani. em segített sem szerves adalékanyagok (metanol, acetonitril), sem a micelláris elektrokinetikus kromatográfia alkalmazása. A 3.6 ábra a 12 vegyület elektroferogramját mutatja be foszfát pufferben. Ezért a 12 vegyületből kiválasztottuk azokat, amelyek valamilyen szempontból különösen fontosak (terápiás használatban vannak pl. vinpocetin és vinkamin; vagy gyógyszerjelölt vegyületek pl. (2-acetoxi)-etil-transz-apovinkaminát és (2-hidroxi)-etiltransz-apovinkaminát), illetve azokat, amelyek elválasztása nem okozhat problémát az ábra szerint (a két apovinkaminsav). Ehhez a 6 vegyülethez hozzáadtuk még a transz- vinkamint, aminek mobilitása eléggé különbözik az eddig felsorolt vegyületekétől. A továbbiakban a háttér elektrolit paramétereinek megváltoztatása mellett e 7 vegyület 26

27 elválasztását tanulmányoztuk. Elméleti háttérként az fford egyenlet alkalmazásának lehetőségét vizsgáltuk részben nemvizes közegekben ábra A 12 molekula elektroferogramja foszfát pufferben (ph=7,0, U=15 kv, I=27,0 µa) A módszer fejlesztése során kiderült, hogy a ph = 7,0 7,5 tartományban a MES és TRIS tartalmú pufferekkel a csúcsok félértékszélessége sokkal kisebb, mint foszfát pufferek esetén. A MES/TRIS pufferrendszer választásának több oka is volt. Egyrészt logk értékeik alapján (MES esetén 6,1, TRIS esetén 8,0) ebben a ph tartományban elegyük jó pufferkapacitással rendelkezik. Másrészt nagy méretük és kis töltésük miatt mobilitásuk alacsony, így a kialakuló áram sem jelentős. Harmadrészt a két szilárd pufferkomponens megfelelő arányú elegyítésével a ph jól szabályozható volt, nem kellett azt további erős sav vagy lúg hozzáadásával beállítani. Az elválasztásokat a fenti ph-intervallumban végeztük és a kísérleti körülményeket az alábbi paraméterek szerint változtattuk a trianguláris (háromszöges) felbontás-térképezés [97Su] felhasználásával. 1. A futtató puffer összkoncentrációja, ami az oldat ionerősségét is meghatározta. Az összkoncentrációt mmol/dm 3 tartományban változtattuk. Töményebb oldatokat nem használtunk, ugyanis ekkor az áramerősség túlságosan megnövekedett volna. övekvő áramerősség mellett a fejlődő Joule hő miatt hőmérséklet gradiensek alakulhatnak ki, ami a viszkozitás lokális megváltozásához és csúcsszélesedéshez vezethet. 27

28 2. A puffer komponensek (MES és TRIS) aránya, ami az oldat p S H értékét is meghatározta. Az arány 13/12 és 12/13 között változott, így az oldat p S H-ja a 7,00-7,36 tartományban mozgott. 3. A hozzáadott metanol (szerves módosító) tömegszázaléka. A metanol hozzáadásának három oka volt. Egyrészt meg akartuk vizsgálni, hogy a 3.2 pontban meghatározott log S K értékek felhasználhatók-e a migrációs sorrend predikciójára részben nemvizes közegben is. Másrészt meg akartuk vizsgálni, hogy a metanol hozzáadása megnöveli-e az egyes csúcsok közötti felbontást. Harmadrészt, a metanolt használtuk EF markerként is. Mivel az oldat metanol tartalmának növekedésével az analízis idő is növekedett, max. 10 tömegszázalék metanolt tartalmazó oldatokat használtunk. A fenti intervallumok alapján hét különböző összetételű futtató pufferoldatot állítottunk össze, amelyekben az egyes paraméterek relatív hozzájárulása (X i ) a 3.1. táblázatban látható táblázat Kísérleti körülmények és az egyes paraméterek relatív hozzájárulása (X i ) a 7 futtató pufferben. puffer metanol X 1 MES/TRIS koncentráció-arány X 2 összkoncentráció X 3 t% (mmol/dm 3 ) (mmol/dm 3 ) / / / ,5 12,5/12,5 0, ,5 19,5/ ,5 0, ,75/18,75 0,5 37,5 0,5 7 3,3 0,33 16,89/16,44 0,33 33,3 0,33 A hét anyagot egyenként mol/dm 3 koncentrációban tartalmazó törzsoldat metanollal készült. Az injektálás előtt 0,8 ml törzsoldatot 1,6 ml-re higítottunk a futtató pufferrel. Minden oldatot használat előtt 0,2 µm pórusátmérőjű filteren átszűrtük. Az elválasztásokat egy Crystal CE 300 (ATI, Unicam, Cambridge, UK), Unicam 4225 UV detektorral felszerelt kapilláris elektroforézis készülékkel végeztük. A detektálás hullámhossza 200 nm volt. Az elektroferogramokat Unicam 4800 szoftverrel gyűjtöttük és értékeltük ki. 75 µm belső átmérőjű kvarc kapillárist (Beckman, Fulleron, USA) használtunk, aminek hossza a detektorablakig 67,5 cm, teljes hossza 79,5 cm 28

29 volt. Minden futtatás előtt a kapillárist 2000 mbar nyomással mostuk fél percig 0,2 mol/dm 3 KH oldattal, majd fél percig ioncserélt vízzel, majd egy percig az aktuális futtató pufferrel. A mintákat hidrodinamikai injektálással juttattuk a kapillárisba, 0,2 percig 20 mbar nyomást alkalmazva. Konstans 30 kv feszültséget használtunk. A méréseket szobahőmérsékleten (22 ± 1 C) végeztük. Az oldószerelegyekben az elektród kalibrálása és a futtató puffer p S H-jának mérése a 3.2 fejezetben leírt módon történt. 3.5 A megoszlási hányados meghatározása vékonyréteg-kromatográfiával Célul tűztük ki a 10 észter lipofilitásának jellemzését. Mivel a rossz vízoldékonyság miatt nem tudtuk valamennyi molekulánk lipofilitását direkt módszerekkel jellemezni, a fordítottfázisú vékonyréteg-kromatográfiát választottuk, ami a retenciós értékek egyidejű meghatározása révén a számított log P értékek összehasonlíthatóságát biztosítja. A kalibrációs egyenes felállításához használt vegyületek a következők voltak: 5 pirido[1,2-a]pirimidin, ezeket kiegészítettük a progeszteronnal és a klórpromazinnal. A pirido[1,2-a]pirimidinek korábbi RP-TLC log P meghatározásoknál jól beváltak [99Al2], a lipofil progeszteron és klórpromazin bevonása [01Tak] a kalibrációs egyenletbe lehetővé tette, hogy a kalibrációs tartományt lipofil irányba nagyságrendekkel kitoljuk. A 3.7 ábra bemutatja a kalibrációhoz használt 7 vegyület szerkezetét és rázótölcséres módszerrel meghatározott, megbízható irodalmi log P értékeiket [99Al2, 01Tak]. Bár a kalibrációhoz ideálisabb lett volna ismert lipofilitású, hasonló szerkezetű indol származékokat felhasználni, megbízható log P-jű vegyületek hiányában ezeket a már jól ismert, három különböző szerkezeti osztályba sorolható standardokat választottuk, majd a kapott eredmények megalapozottságát néhány, vízben viszonylag jól oldódó származék direkt log P-jével (3.6 fejezet) való összevetéssel igazoltuk. 29