Doktori (PhD) értekezés Tantos Ágnes 2002
Doktori (PhD) értekezés TERMÉSZETES NÖVEKEDÉSSZABÁLYOZÓ ANYAGOK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA A NÖVÉNYI SZÖVETTENYÉSZTÉSBEN Írta: Tantos Ágnes Témavezetõ: Dr Horváth Gábor A Biológiai Tudományok Doktora Dr. Lukács Noémi A Biológiai Tudományok Kandidátusa Szent István Egyetem, Kertészettudományi Kar Molekuláris Növénybiológia Tanszék Budapest 2002
A doktori iskola megnevezése: Multidiszciplináris Agrártudományi Doktori Iskola tudományága: A Kertészeti termesztés növényélettani-, talajtani-, agrokémiai és mûszaki alapjai vezetõje: Dr. Papp János Tanszékvezetõ Egyetemi Tanár Szent István Egyetem Kertészettudományi Kar, Gyümölcstermõ Növények Tanszék Témavezetõ: Dr Horváth Gábor Tanszékvezetõ Egyetemi Tanár Szent István Egyetem Kertészettudományi Kar, Molekuláris Növénybiológia Tanszék Dr Lukács Noémi Tanszékvezetõ Egyetemi Docens Szent István Egyetem Kertészettudományi Kar, Molekuláris Növénybiológia Tanszék Házivédésen elõadott, javított példány Az iskolavezetõ jóváhagyása A témavezetõ jóváhagyása
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke 4 Bevezetés 5 Irodalmi áttekintés 7 Triakontanol.........................................................7 Algák..............................................................14 Poliaminok..........................................................17 Anyagok és módszerek 24 Táptalajok..........................................................24 Triakontanol........................................................25 Algakészítmények.....................................................26 Putreszcin..........................................................26 A nevelés körülményei.................................................26 A vizsgált tulajdonságok................................................27 Fotoszintetikus pigment tartalom mérés....................................27 A fotoszintetikus aktivitás vizsgálata.......................................28 Endogén poliamin tartalom meghatározás..................................29 Az adatok statisztikai értékelése..........................................30 A kísérletekhez felhasznált növények......................................30 Eredmények 34 A triakontanol hatása a növények mikroszaporításában........................34 A triakontanol hatása a növények endogén poliamin szintjére...................53 Az algakészítmények hatása a növények mikroszaporításában...................64 A putreszcin hatása a fás szárú növények gyökeresedésére......................77 Új tudományos eredmények.............................................79 Következtetések és javaslatok 80 A triakontanol élettani hatásai...........................................80 Az algakészítmények hatása a növények fejlõdésére...........................83 A putreszcin hatása a fás szárú növények gyökeresedésére......................86 Gyakorlati alkalmazhatóság.............................................86 Összefoglalás 88 Summary 90 Mellékletek 92 Köszönetnyilvánítás 105
Rövidítések jegyzéke 2iP 9La ABS ACC ADC BAP DAO GS IES IVS KIN MS NES ODC PAO Put SAM SAMDC Spd Spm TRIA 2-izopentenil-adenin 9-béta-L (+)-adenozin Abszcizinsav 1-aminociklopropán-1-karboxilsav Arginin dekarboxiláz 6-Benzil-amino-purin Diamin oxidáz Gibberellinsav Indol-3-ecetsav B-Indol-vajsav Kinetin (6-furfuril-amino-purin) Murashige-Skoog Naftil-ecetsav Ornitin dekarboxiláz Poliamin oxidáz Putreszcin S-adenozil-metionin S-adenozilmetionin dekarboxiáz Spermidin Spermin Triakontanol
Bevezetés A XX. század második felére a mikroszaporítás világgazdasági jelentõségre tett szert a növénytermesztésben. Számos olyan fajról, fajtáról tudunk, melyek szaporítóanyagelõállítását szinte kizárólag ezzel a módszerrel oldják meg. A különféle szövettenyésztési módszereknek kiemelkedõ jelentõségük van a gyógynövény hatóanyag-elõállításban és az intenzíven kutatott, nagy lehetõségeket magában rejtõ génsebészeti módszerekben is. Az azonban, hogy egy adott faj, vagy fajta alkalmas-e folyamatos, nagy mennyiségû mikroszaporított anyag elõállítására, nagymértékben függ az adott faj, illetve fajta genetikai hátterétõl, és nem egy, elsõsorban fás szárú növény esetében még nem megoldott a megbízható mikroszaporítás. Nem egy olyan növénnyel találkozhatunk, mely nem, vagy csak nagyon kis hatásfokkal szaporítható az általánosan elterjedt hormonok segítségével. Maga a szövettenyésztés kiváló lehetõséget nyújt nem csak a gyors és biztonságos növényszaporításra, hanem a növények különbözõ életfolyamatainak tanulmányozására is. A kutatások elõrehaladtával bõvül azoknak az anyagoknak a köre is, melyeknek növényi növekedést befolyásoló képességet tulajdonítanak. Számos közleményben foglalkoznak ilyen anyagok, például a lepidimoid (HASEGAWA et al., 1992; YAMADA et al., 1996), a szalicilsav (SHETTY et al., 1992), a jázmonsav (KOVAC és RAVNIKAR, 1998) vagy a brasszinoszteroidok (BISHOP és YOKUTA, 2001) hatásával. Ebben a munkában elsõsorban a nehezen szaporítható fásszárú növények mikroszaporításának megkönnyítésével foglalkoztunk, és olyan anyagokat kerestünk, melyekrõl feltételezhetõ volt, hogy alkalmazhatóak lesznek ezen a téren. Három különbözõ jellegû anyagot vontunk be a vizsgálatokba. (i) A triakontanol egy hosszú, nyílt szénláncú alkohol, amely a növények epikutikuláris viaszanyagaiban fordul elõ. Biológiai aktivitását a XX. század közepe felé fedezték fel és azóta több közleményben foglalkoztak növényi növekedést befolyásoló hatásaival. (ii) A cianobaktériumokról és a mikroalgákról régóta tudják, hogy a növényi növekedésre kedvezõ hatással vannak és az utóbbi néhány év során kiderült, hogy számos fajuk növényi hormonokhoz hasonló anyagokat termel. Közülük néhányat már a kereskedelemben is forgalmaznak. Ebben a munkában két, különbözõ algafaj kivonatát tartalmazó, kereskedelemben is kapható készítmény hatásait vizsgáltuk. (iii) A putreszcin az egész élõvilágban elterjedt, nagyon sokféle folyamatban szerepet játszó, elsõsorban szignálmolekulaként számon tartott anyag. Közismert, hogy a különbözõ növényfajok egymástól igen eltérõen reagálhatnak bizonyos kezelésekre, például a növekedésszabályozó anyagok adagolására. Ezek a különbségek akár fajon belül, fajták között is nagy mértékûek lehetnek. Azért, hogy az eredmények minél szélesebb körben legyenek alkalmazhatók, és a gyakorlatba minél egyszerûbben lehessen átültetni õket, a kertészeti növények lehetõ legszélesebb skáláját vontuk be a vizsgálatokba. Így végeztünk kísérleteket citromfû, alma, meggy, spárga, burgonya, szegfû és gerbera növényeken, a mikroszaporítás minden szakaszában, a felszaporítástól az akklimatizálásig. 5
BEVEZETÉS A fent felsoroltakat figyelembe véve, a szövettenyésztés ideális módszernek tûnt arra, hogy ezeknek az anyagoknak az élettani hatásait alaposabban megismerhessük, valamint, hogy a kereskedelmi mikroszaporítás számára alternatív növekedésszabályozó anyagokat ajánlhassunk. A munka megkezdésekor a következõ célokat tûztük ki: Megvizsgálni a fent említett növekedésszabályozó anyagok (triakontanol, mikroalgák és putreszcin) használhatóságát a növényi szövettenyésztés során Kiválasztani a pozitív hatást mutató anyagokat, s megállapítani ezek optimális koncentráció-tartományát Megvizsgálni a hatékony növekedésszabályozók által a növények fotoszintetikus aktivitására és endogén poliamin szintjére gyakorolt hatását, mert az irodalmi adatok alapján várható volt, hogy a kiválasztott anyagok jelentõsen befolyásolják ezeket a paramétereket Megvizsgálni két-két, egymástól eltérõ szaporodási és gyökeresedési jellegzetességeket mutató alma és cseresznye alanyfajta reakcióját a kiegészítésként alkalmazott növekedésszabályozókra Összehasonlítani a két-két alanyfajta endogén poliamin tartalmát és nyomon követni a poliaminszint változását a gyökeresedés folyamatában 6
Irodalmi áttekintés Triakontanol Elõfordulása és kémiai jellemzõi A triakontanolt elõször 1933-ban írták le, mint a lucerna egyik természetes alkotóelemét (CHIBNALL et al., 1933), s 1977-ben igazolták növényi növekedést serkentõ hatását (RIES et al., 1977). Azóta számos más növényben is megtalálták. Ilyenek például az áfonya (Vaccinium ashei) (FREEMAN et al., 1979), fehér here (Trifolium repens) (WALDRON et al., 1961), a tyúkhúr (Stellaria media) (ARCHANA-PANDE et al., 1995), a Cuscuta chinensis, (Szykula et al., 1994), különbözõ Rhododendron fajok (WANG-YUEFANG et al., 1999), melyeknél a növény epikutikuláris viaszanyagai között található meg, a Jatropha mollissima, melynek a gyökerébõl mutatták ki (SANTOS és MUKHERJEE, 1992), a Schorea robusta, melynek magja tartalmaz triakontanolt (BHATTACHARYA és SAHA, 1992). A triakontanol (TRIA) összegképlete: CH 3 (CH 2 ) 28 CH 2 OH, molekulasúlya 438,8, olvadáspontja pedig 88 C. Vízben és egyéb poláros oldószerekben gyakorlatilag oldhatatlan, ám az apoláros oldószerekben, például a kloroformban, jól oldódik. Hõstabil, ezért tisztán és oldatban is autoklávozható, ami alkalmassá teszi steril kultúrákban való egyszerû felhasználásra (RIES, 1985). Hatása a növények növekedésére A triakontanol hatását mind laboratóriumi, mind termesztési körülmények között számos növénynél vizsgálták. Egy krizantémmal folytatott üvegházi kísérletben (SKOGEN et al., 1982) azt tapasztalták, hogy a 100 µg/l koncentrációban a növények tápoldatához adagolt triakontanol hatására megemelkedett a növények szárazanyag tartalma és a virágzatok száma. Mindezeken túl a triakontanol erõteljesen befolyásolta a virágzatok minõségét is: a kezelt növényeknél megduplázódott az osztályon felüli minõségû virágzatok száma. A triakontanol ezt azáltal érte el, hogy hatására a növények erõteljesebbek lettek, és nagyobb számú virágzatot hoztak, mint a kontroll növények, anélkül, hogy veszítettek volna magasságukból vagy szárazanyag tartalmukból. A szerzõk azt is megfigyelték, hogy a rügyfakadás és a virágzás egy héttel korábban következett be a triakontanollal kezelt növényeknél, mint a kontroll esetében. A virágok tartósságában nem volt különbség. A szerzõk azzal magyarázták a magasabb számú virágzat megjelenését, hogy a triakontanol csökkenthette az apikális 7
IRODALMI ÁTTEKINTÉS dominanciát, és korábbi irodalmi adatokra hivatkozva (HENRY és GORDON, 1980) valószínûnek tartották, hogy a triakontanol az auxin lebomlását serkentette valamilyen módon. Lehetségesnek tartották továbbá, hogy a triakontanol hatására megváltozik az arány a fotorespiráció és a fotoszintézis között a fotoszintézis javára, így lehetõvé téve a nagyobb növekedési erélyt (ERIKSEN et al., 1981). Mindazonáltal a triakontanol szerteágazó hatásaira a nyert eredmények nem adtak kielégítõ magyarázatot. Négy napos vízkultúrában nevelt saláta levelére permetezve 10-7 M triakontanol 13-20 %- kal emelte a levelek, és 13-24 %-kal a gyökerek friss és száraz tömegét a kontroll (csak vízzel permetezett) növényekéhez képest. A triakontanol kezelés ismétlése nem befolyásolta az elérhetõ növekedés mértékét (KNIGHT és MITCHELL, 1987). A paradicsom növekedését és terméshozamát is pozitívan befolyásolta a triakontanol (SHARMA, 1995). Levélpermetezés formájában alkalmazott kezelés hatására megnõtt a növények magassága, megemelkedett a hajtások és a termések száma, valamint a magtermés nagysága is. A triakontanol kedvezõ hatással volt ezeken túl az ezermagtömegre és a magok csírázóképességére is. A kísérleti körülmények között az átültetés utáni negyedik héten alkalmazott triakontanol kezelés bizonyult a leghatékonyabbnak. Egy 1993-ban közölt kísérletben BARTOLINI et al. különbözõ növekedésszabályozó anyagokkal permeteztek olíva fákat a virágzás kezdetekor és teljes virágzásban. A vizsgált anyagok között egy állati eredetû aminosav-származék, bórsav, egy NES-B-vitamin keverék és triakontanol szerepelt. A vizsgált anyagok közül a triakontanol emelte meg legnagyobb mértékben a pollen csírázóképességét, és csak a triakontanollal kezelt fákon termett gyümölcsök esetében nõtt meg a hús/mag arány. Ezek a termések szignifikánsan nagyobbak is voltak, mint akár a kontroll, akár a többi növekedésszabályozóval kezelt fákon termett bogyók. Õszibarack esetében is megfigyelték a triakontanol kedvezõ hatását a gyümölcsök méretére (MEHTA et al., 1990). A Newcastle fajta állományában, két alkalommal (teljes virágzáskor és a csonthéj szilárdulásakor) végzett, 20 mg/l triakontanol koncentrációjú permetezéssel lehetett elérni a legnagyobb gyümölcsméretet, és ezzel párhuzamosan emelkedett a gyümölcsök tömege, cukortartalma és csökkent a savasságuk is. Különbözõ paprikafajtákon végzett laboratóriumi vizsgálatok tanúsága szerint a 0,5-3 mg/l koncentrációjú triakontanol oldattal permetezett növények növekedése és vízfelvétele kedvezõbben alakult mint a kontroll növényeké (RAY, 1991). Ebben a kísérletben a 0,5 mg/l triakontanol bizonyult a leghatékonyabbnak. Szabadföldi mérések során, ahol már csak a 0,5-1 mg/l triakontanol koncentrációkat alkalmazták, a triakontanollal kezelt növényeknek megemelkedett a szárazanyag tartalma, és a levélfelülete, valamint a relatív növekedési rátája is. Mindent egybevetve a triakontanollal permetezett növények jobb termést adtak, mint a kezeletlen kontroll. A triakontanol képes befolyásolni egyes gyógynövények hatóanyag tartalmát is. Az Artemisia annua cv. Washington növények artemizin tartalma szignifikánsan megemelkedett 1 és 1,5 mg/l triakontanol kezelés hatására (SHUKLA et al., 1992). A triakontanol kezelés után 8
IRODALMI ÁTTEKINTÉS emelkedett a gibberellinsav-szerû aktivitás és csökkent az abszcizinsav mennyisége a növényekben. A szerzõk szerint az artemizin szint emelkedését a triakontanol a növény növekedésének serkentésén keresztül éri el, nem pedig azáltal, hogy az artemizin bioszintézisét szabályozza. Mentha arvensis esetében 0,1g TRIA/m 3 levélre való permetezésével szignifikánsan emelni lehetett a növények friss és száraz tömegét, nettó fotoszintetikus rátájukat, klorofill tartalmukat, mikroelem felvételüket és esszenciális olaj tartalmukat (SRIVASTAVA és SHARMA, 1991). Magas, 4 g/m 3 triakontanol koncentrációjú permetezés már gátló hatásúnak bizonyult a növények produktivitása szempontjából. A kísérletekben nem tudtak közvetlen hatást kimutatni az olajok bioszintézisére, így az illóolaj tartalom emelkedését itt is a triakontanol egyéb hatásaival magyarázták. Kimutatták például, hogy a növények esszenciális olaj tartalma pozitív korrelációban áll a nettó fotoszintetikus rátával és a friss- és száraz tömeg alakulásával, melyeket a triakontanol kedvezõen befolyásolt. Gyakorlatilag ugyanezeket az eredményeket írták le a trópusi citromfû (Cymbopogon flexuosus) növényekkel (MEHTA és SRIVASTAVA, 1991) és mákkal (Papaver somniferum) (SRIVASTAVA és SHARMA, 1990) végzett kísérletekben is. Rózsaillatú muskátli (Pelargonium cv. Bourbon) triakontanolos permetezés után szignifikánsan kedvezõbb növekedési tulajdonságokat mutatott, mint a kontroll növények (BHATTACHARYA és RAO, 1996). Megemelkedett a hajtáshossz, a hajtásszám, a levél-, hajtás és gyökértömeg és az esszenciális olaj tartalom. A szerzõk megfigyelése szerint a gyökértömeg növekedést sokkal nagyobb mértékben serkentette a triakontanol, mint a hajtások tömegének gyarapodását, amibõl arra következtettek, hogy a triakontanol elsõsorban a gyökérnövekedésre hat. Ugyanebben a kísérletsorozatban a triakontanol serkentette a Pelargonium levéldugványainak gyökeresedését is. Egy 1999-es vizsgálatban RAJASEKARAN és BLAKE azt vizsgálta, hogy hogyan befolyásolja néhány új növekedésszabályozó anyag a Pinus banksiana magoncok növekedését szárazságstressz alatt. A mérések során 10 µg/l triakontanolt is alkalmaztak, és azt találták, hogy, habár kiváló membránvédõ hatással rendelkezett, a triakontanol nem volt képes fenntartani a növények növekedési erélyét. Ezt azzal magyarázták, hogy a triakontanollal elõkezelt növények feltehetõen képesek voltak ugyan a nettó fotoszintetikus ráta szinten tartására, tehát potenciálisan ellensúlyozni tudták volna a légzés, az ozmoreguláció és a regeneráció során bekövetkezett C veszteséget, ám ehhez a sztómák nyitva tartására volt szükség, ami a növények nagyfokú dehidratációjához vezetett. Paradicsomon is vizsgálták a triakontanol szárazságnak kitett növényekre gyakorolt hatását (THAKUR et al., 1993). Ebben a kísérletben hét napos vízhiány következtében lecsökkent a levélfelület és megemelkedett a savas foszfatáz aktivitása. Három további öntözés nélküli nap elteltével erõsödtek ezek a tünetek, ekkor a levélfelületben akár 71%-os csökkenés is megfigyelhetõ volt. Amennyiben triakontanol kezelést alkalmaztak a szárazság elõtt, akár 2, akár 4 µg/g töménységben, akkor a triakontanol a hetedik napig ellensúlyozni tudta a vízhiány 9
IRODALMI ÁTTEKINTÉS hatását, ami megmutatkozott a levélfelület csökkenésének mérséklõdésében és a savas foszfatáz aktivitásának csökkenésében is. A további, hetedik nap után bekövetkezõ károsodásokat azonban nem lehetett megakadályozni triakontanol elõkezeléssel. Egy másik vizsgálatban vízstressznek ( = -3.2 MPa) kitett Erythrina variegata magoncok hajtásnövekedése, klorofill tartalma és fotoszintetikus aktivitása lecsökkent, míg a gyökerek folytatták a növekedést. Ezeket a jelenségeket a Rubisco aktivitásának csökkenése kísérte, s emellett a CO 2 fixálás is sérült. Ha a növényeket a stresszhatás után triakontanollal permetezték, akkor mindezek a károsodások enyhébb mértékben jelentkeztek (MUTHUCHELIAN et al., 1997). A triakontanol kedvezõ hatásait írták le Vigna radiata magoncokkal kapcsolatban is (KUMARAVELU et al., 2000). A magoncokat 0; 0,5; 1,0 illetve 2,0 mg/l triakontanollal permetezték 15 és 25 nappal az ültetés után. 0,5 mg/l triakontanol hatására szignifikánsan megemelkedett a növények magassága és friss tömege. Ezen kívül klorofill, aminosav, szacharid, keményítõ és oldható fehérje tartalmuk is jelentõs mértékben meghaladta a kontrollokét. A levelek nitrát tartalma mind 0,5, mind 1,0 mg/l triakontanollal csökkenthetõ volt, amit a nitrát reduktáz aktivitásának emelkedése kísért. Triakontanollal eredményesen tudták kezelni a Morus alba fitoplazmás törpeségét is (DAI és SUN, 1995). A betegség miatt törpenövésû fákon 1 éven keresztül alkalmaztak triakontanolos kezeléseket, aminek hatására a tünetek megszûntek és nem is jelentek meg újra legalább három éven keresztül. Ez alatt az idõszak alatt a fitoplazmát mikroszkópos megfigyeléssel sem lehetett kimutatni a növényekbõl. Annak ellenére, hogy a szabadföldi kísérletekben ilyen biztató eredmények születtek, szövettenyésztésben, illetve mikroszaporításban alig néhány kutatócsoport vizsgálta a triakontanol hatását. Az elsõ ilyen munka 1977-ben jelent meg, amikor HANGARTER és RIES beszámolt arról, hogy a triakontanol kedvezõ hatással volt néhány növény kallusznövekedésére, s úgy találták, hogy a szövettenyésztés igen alkalmas módszer arra, hogy a triakontanol élettani hatásait vizsgálják. Ennek ellenére sokáig nem jelent meg ebben a témakörben publikáció és mind a mai napig mindössze egy új közlemény foglalkozott ezzel a témával. Abban a munkában a Fuji alma in vitro szaporításával foglalkoztak (MA et al. 1990), és ebben hatásosnak találták a triakontanolt, mint növekedésszabályozót. Hatásmechanizmusa RICHARD és RIES (1981) egy sor kísérletben próbálta felderíteni, hogy milyen módon indukálja a TRIA növények N tartalmának növekedését. Kísérleteikben rizs csíranövényeket és kukorica növények levelébõl készített homogenizátumot kezeltek 100 és 1000 µg/l triakontanol oldattal, 40 illetve 80 percen keresztül. A rizs esetében mind a friss tömeg, mind a N tartalom növekedését megfigyelték, ám a N tartalom növekedése meghaladta azt a mértéket, amit az adagolt N mennyiség indokolt volna. Hasonló vizsgálatokban a triakontanol 10
IRODALMI ÁTTEKINTÉS aktivitását tökéletesen gátolni tudták az oldathoz adott másik hosszú szénláncú alkohollal, a tetrakoszanollal. Kukorica levélhomogenizátum vizsgálatakor is hasonló eredményekre jutottak. Ezután egy sor kísérletben próbálták megállapítani, hogy a többlet N milyen forrásból származhatott, ám csupán azt sikerült bizonyítaniuk, hogy nem a levegõ nitrogénjét használták fel a triakontanollal kezelt növények, és nem is a növényben található egyéb N forrásokat alakították át. Végül arra a következtetésre jutottak, hogy a triakontanol olyan módon változtatja meg a növény anyagcseréjét, mely befolyásolhatja az általuk használt N meghatározási módszerrel kapható eredményeket. RIES és WERT egy 1988-as publikációban arról számoltak be, hogy a triakontanollal kezelt növényekben a kezeléstõl számított egy percen belül megjelenik egy másodlagos hírvivõ molekula, mely - a triakontanollal ellentétben - vízben oldható, és gyorsan mozog a növényen belül. Sötétben nevelt növények esetében a fény hiánya lelassította a molekula megjelenését, de nem akadályozta meg. Akkor úgy vélték, hogy a triakontanol az endogén növényi hormonok közé tartozik, mely a többi, általánosan elõforduló hosszú szénláncú alkohollal egyensúlyt tartva járul hozzá a növények növekedésének szabályozásához. Ennek a munkának folytatásaként, 1990-ben RIES et al. már a másodlagos messenger molekula kémiai mibenlétét jelentették. Leírták, hogy a triakontanol hatására 9-béta-L (+)- adenozin keletkezik (9La), s ez felelõs a triakontanol növekedésserkentõ hatásának kiváltásáért. Kísérleteikben több növény, például sárgarépa, uborka, kukorica és paradicsom esetében is igazolták elméletüket. Késõbb arra is fény derült (RIES, 1991), hogy a 9La teszi ki a a rizs növények teljes adenozin készletének 1 %-át. További vizsgálatokkal kimutatták (SAVITHIRY et al., 1992) hogy rizs magoncokban mind a triakontanol, mind a 9La hatására megemelkedik a malát-dehidrogenáz enzim aktivitása, és ezzel párhuzamosan megemelkedik a növények oldható fehérjetartalma is. Vizsgálataik egyik érdekes eredménye volt, hogy a 9-béta-D (-) adenozin semmiféle hatást nem fejtett ki sem az enzim aktivitására, sem a növények növekedésére. Rizzsel és kukoricával végzett mérések segítségével bebizonyították (RIES és WERT, 1992), hogy a 9La hatása és hatásának mértéke függ a megvilágítástól, melyet a növények a kezelés elõtt és után kapnak. Túl alacsony fényintenzitás (100 µmol/m 2 /s) mellett nevelt rizs növények csak akkor mutattak kedvezõbb növekedési paramétereket, ha kiegészítõ megvilágítást (250-300 µmol/m 2 /s) is kaptak. Rizs esetében a kezelés csak akkor volt hatásos, ha azt egy legalább 9-12 órás megvilágítási szakasz elõzte meg. Mivel a hõmérsékletnek nem volt befolyásoló szerepe, arra a következtetésre jutottak, hogy elsõsorban a fény az, ami szabályozza a b9la és így a triakontanol hatásának kialakulását is. Ezt az irányvonalat tovább kutatva, egy évvel késõbb azt is felfedezték (RIES et al., 1993), hogy a b9la hatására már mintegy 5 másodperccel a kezelés után megemelkedik a Ca 2+, Mg 2+ és K + koncentrációja a paradicsom levágott szárának exudátumában. Ugyanezt a változást a triakontanol csak 5 perc eltelte után indukálta, ami újabb bizonyítékként szolgált arra, hogy a triakontanol indukálja a b9la szintetizálását. A szerzõk feltételezték, hogy az apoplaszt 11
IRODALMI ÁTTEKINTÉS ionkoncentrációjának megváltozása, és elsõsorban a Ca 2+ koncentrációjának megemelkedése egy válaszreakció részeit képezik, melynek segítségével a növények külsõ hatásokra reagálva szabályozni tudják anyagcseréjüket és növekedésüket. Ezeket az eredményeket egy másik kutatópáros is megerõsítette, sõt tovább is fejlesztette. 1995-ben CURVETTO és DARJANIA Vicia faba sztómamozgását tanulmányozva leírta, hogy ha a Vicia faba epidermiszének nyúzatát 2 órán keresztül 9La oldatába áztatták, akkor a sztómák nyitottsága megemelkedett. Ugyanezt írták le a triakontanol minden koncentrációjáról, de míg sötétben serkentette a sztómák kinyílását, ugyanaz a koncentráció fényen enyhén gátló hatású volt. Sok más kutatócsoport foglalkozott a triakontanol és a fotoszintézis kölcsönhatásával. Több szerzõ is leírta, hogy triakontanol kezelés hatására megemelkedik a Rubisco aktivitása. NATH és MISHRA (1990) árpa növényekkel kísérletezve a triakontanol és más növekedésszabályozó anyagok (gibberellinsav és kinetin) hatását hasonlították össze, és bár minden kipróbált anyag hatásosnak bizonyult, a triakontanol volt a legkevésbé hatékony. Ugyanez a két szerzõ egy évvel késõbb arról számolt be, hogy a triakontanol hatására megemelkedik a fotoasszimilátum szállítása a fejlõdõ árpa növényekben (NATH és MISHRA, 1991). A növényeket 14 C jelölést tartalmazó szacharózzal táplálták, így megfigyelhették az asszimilátumok szállítását a forrás helyétõl a felhasználás helyéig. Megfigyeléseik szerint a triakontanol (csakúgy, mint a GS 3 ) hatására nagyobb mértékû volt az asszimilátum szállítás, mint a kezeletlen kontroll esetében. Érdekes, hogy ebben a vizsgálatban a triakontanol (10-8 M koncentrációban) hatásosabbnak bizonyult, mint a GS 3 (10-4 M koncentrációban). Hasonló eredményeket kaptak Cicer aurentinum csírázásakor végzett kísérletekben is (BHATIA et al., 1998). Triakontanol kezelés hatására csökkent a tápanyagraktárak oldható cukor, keményítõ, szabad aminosav és teljes oldható fehérje tartalma, melyet a hajtáscsúcsban ezzel párhuzamosan ugyanezen anyagok szintjének emelkedése kísért. 14 C jelölt arginin transzportjának serkentése is bizonyította, hogy a triakontanol elõsegíti a tápanyagok transzlokációját a forrás helyérõl a felhasználás helyére. Ugyancsak több közleményben találhatók bizonyítékok arra nézve, hogy a triakontanol hatására megemelkedik a levelek klorofill tartalma, a nettó CO 2 csere és a légzés, valamint a fotoszintetikus ráta (SRIVASTAVA és SHARMA, 1990; MISRA és SRIVASTAVA, 1991; SRIVASTAVA és SHARMA, 1991; ZHOU és XI, 1993; MUTCHUCHELIAN et al., 1994; KUMARAVELU et al., 2000). SHRIPATHI és SWAMY 1994-ben bebizonyította, hogy a triakontanol hatására megemelkedik a monoglaktozildiacilglicerol (MGDG) szintje. Errõl úgy tartják, hogy szerepet játszik az I-es fotokémiai rendszer fehérjéinek becsomagolásában (DOMINY és WILLIAMS, 1987). Mivel egy 2000-ben végzett kísérletben a triakontanol gátolta mind az enzimatikus, mind a nem enzimatikus lipid peroxidációt (RAMANARAYAN et al.), egy olyan elmélet is született, mely szerint a triakontanol az MGDG szintjének emelésén és a tilakoid membránok védelmén keresztül fejti ki a fotoszintézist serkentõ hatását. 12
IRODALMI ÁTTEKINTÉS Árpa gyökérsejtjeinek plazmamenbránján végzett kísérletekben figyelték meg (LESNIAK et al., 1986), hogy a 2,3 nm TRIA hatására mind a Ca 2+ -függõ, mind a Mg 2+ -függõ ATPáz aktivitás megemelkedett és ez az emelkedés koncentrációfüggõ volt. A 2,3 nm triakontanol koncentrációt egy korábbi munkában (RIES et al., 1983) mint a növekedésserkentés optimális koncentrációját jellemezték. LESNIAK et al. azt is leírták, hogy a hõmérséklet emelkedése a triakontanol kezeléskor és azt megelõzõen, erõsítette a triakontanol hatását. Az ATPáz aktivitásának változásaiban ugyanúgy megfigyelhetõ volt a hõmérsékletfüggés, ám itt elsõsorban a kezelés pillanatában alkalmazott hõmérséklet bizonyult meghatározónak. Ugyanúgy, ahogy a teljes növénnyel végzett kísérletekben, az oktakoszanol itt is hatástalan maradt, és triakontanollal való együttes alkalmazása meggátolta az ATPáz aktivitás növekedését. Mivel a válaszreakció nagyon gyors volt, és nem lehetett cikloheximiddel gátolni, a szerzõk úgy gondolták, hogy ehhez a folyamathoz nem szükséges de novo fehérjeszintézis. Kimutatták azt is, hogy a triakontanol kapcsolódik a plazmamembránhoz, és bár a bejuttatott triakontanol kevesebb, mint 1 %-át sikerült a membránból izolálni, molekuláris szempontból ez is jelentõs mennyiségnek számított. Ugyanennek a kutatócsoportnak egy késõbbi munkájában (LESNIAK et al., 1989) arról számoltak be, hogy árpa gyökérprotoplasztok plazmamembránjában a triakontanol aktivitásának kifejtéséhez kalmodulinra volt szükség. Ehhez a megállapításhoz azon az érdekes jelenségen keresztül jutottak el, hogy az izolált vezikulumokban in vitro a triakontanol nem stimulálta a Me 2+ -ATPáz aktivitását. Mivel ismert, hogy a Me 2+ -ATPáz aktivitása függ a kalmodulintól (KUBOWICZ et al., 1982), és az izolációs eljárás során alkalmazott kelátképzõk eltávolítják a kalmodulin jelentõs részét, magától értetõdõ volt a feltételezés, hogy ez okozhatja a triakontanol hatásának eltûnését. Amikor kalmodulinnal együtt adagoltak triakontanolt a vezikulumokhoz, szignifikáns Me 2+ -ATPáz aktivitás emelkedést tudtak kimutatni, mely magasabb volt annál, melyet a kalmodulin önmagában képes volt kiváltani. További vizsgálatokkal az is nyilvánvalóvá vált, hogy míg a kalmodulin szükséges a triakontanol aktivitásának kifejtéséhez, addig a triakontanol nem változtatja meg érdemlegesen a kalmodulin fiziko-kémiai tulajdonságait. Mivel kimutatható volt, hogy az ATPáz aktiválásában csak a membránhoz kötõdõ triakontanol vett részt, a szerzõk azzal magyarázták megfigyeléseiket, hogy a triakontanol gyorsan beépül a membrán lipidfrakciójába, megváltoztatva ezzel kulcsfontosságú, kalmodulin-függõ membránkomponenesek reakcióit. Egy ilyen membránkomponens lehet a Me 2+ -ATPáz is. Annak, hogy ezirányban tovább vizsgálódjanak, gátat szabott a megfelelõképpen jelölt triakontanol hiánya, mellyel lehetõvé vált volna a triakontanol-membrán kölcsönhatások vizsgálata abban az alacsony koncentráció tartományban, ahol a triakontanol aktív. Azt is kimutatták, hogy a triakontanol képes megváltoztatni az uborka termésébõl készített protoplasztok membránjának viszkozitását (SHRIPATHI et al,. 1997), ami okozhatja a mások által korábban leírt membránhoz kötött ATPáz aktivitás növekedését (LESNIAK et al., 1986; 13
IRODALMI ÁTTEKINTÉS LESNIAK et al, 1989). Megvizsgálva a membránok zsírsavösszetételét és annak változásait triakontanol, valamint ABS kezelés hatására, azt találták, hogy az ABS hatására megemelkedett a 18:1 zsírsavak szintje, és lecsökkent a 18:3 zsírsavaké, ami összhangban áll a növények szárazságstresszre adott válaszreakcióival. Ezzel szemben a triakontanol megemelte a 18:3 zsírsavak mennyiségét, mely emelkedés nem jelentkezett ABS kezelést követõen. Végül arra a következtetésre jutottak, hogy a membrán viszkozitásának változása részben, de nem kizárólag a 18:3 zsírsavak szintjének megváltozásából következik. Algák A mikroalgák használata a mezõgazdaságban õsi hagyományokra tekint vissza, és elterjedt mindazokon a területeken, ahol algák bõséges mennyiségben állnak rendelkezésre. (FORNES et al., 1995). Bár legnagyobb jelentõségük természetesen a haltenyésztésben és tengerbiológiában van, számos kísérletet végeztek arra nézve, hogy miképpen hasznosíthatók az algák a modern mezõgazdaságban. A kísérletekbe nagyon sokféle mikroalgát vontak be, bár nem mindegyikbõl készült kereskedelmi forgalomban kapható készítmény. Az algák kedvezõ hatása elsõsorban a bennük található mikroelemeknek, vitaminoknak, hormonoknak köszönhetõ. A rizsültetvények talaját borító kékmoszatok nitrogénnel dúsítják a talajt és emelik a rizs terméshozamát (PÉTERFI, 1977). Elõnyös tulajdonságaik egyike, hogy növelik a talaj víztartó képességét és szervesanyag tartalmát. A mikro- és makroalgákban a magasabbrendû növényekével azonos növekedésszabályozó anyagokat találtak (auxinokat, citokinineket, gibberellinsavat, abszizinsavat és etilént), melyek között legnagyobb arányban a citokininek és auxinok fordulnak elõ (VAN STADEN, 1999). Arra nézve is egyre több bizonyíték áll rendelkezésre, hogy az algák egy része antimikrobiális és antivirális hatóanyagok termelésére is képes (ÖRDÖG, 1999, KIM et al., 1997, HUDSON et al, 1999). Az algák és cianobaktériumok növekedésszabályozó hatásai MOLNÁR (1999) vizsgálataiban 181 mikroalga és cianobaktérium auxin- és citokininjellegû hatásait tesztelte. A fagyasztva szárított mintákat desztillált vízben szuszpendálták, és ultrahangos feltárást alkalmaztak (ultraszonikálás). Az így kapott mintákkal uborka sziklevél gyökeresítési tesztet végeztek az auxin hatás kimutatása, és uborka sziklevél megnyúlási biotesztet a citokinin hatás mérése céljából. A vizsgált törzsek közül 29 mikroalga és 12 cianobaktérium törzs mutatott auxin jellegû hatást, és 12 mikroalga, illetve 15 cianobaktérium törzsnél citokinin hatás volt mérhetõ. Mindkét hormon együttes jelenlétét 7 mikroalga és 3 cianobaktérium törzsben mutatták ki. ÖRDÖG és PULZ (1995) 11 nitrogénfixáló (8 Anabaena és 3 Nostoc) törzset vizsgált meg különbözõ biotesztekkel és eredményeik szerint a Nostoc ellipsosporum auxin aktivitást 14
IRODALMI ÁTTEKINTÉS mutatott az uborka sziklevél gyökeresedési tesztben. Az Anabaena torulosa citokinin aktivitásról tett bizonyságot az uborka sziklevél megnyúlási tesztben. Azzal a céllal, hogy a növénytermesztésben külsõ hormon forrásként felhasználható algatörzset találjanak, nyolc Anabaena törzset vetettek alá uborka zöldülési, búza levél klorofill retenciós, uborka sziklevél megnyúlási és szójabab kallusz növekedési biotesztnek, és ezek közül citokinin-szerû hatást mértek az Anabaena torulosa, az Anabaena variabilis és az Anabaena cylindrica egy-egy törzsénél (ÖRDÖG és MOLNÁR, 1995). WAKE et al. (1991) sárgarépa szomatikus embrióiból elõállított mesterséges magoknál vizsgálták a Synechoccus hatását. A Synechoccus egy cianobaktérium és hatására a mesterséges mag rendszerben a szomatikus embriók csírázása a kontroll 35 %-ról 90 %-ra nõtt. NORRIE és HILTZ egy 1999-es összefoglaló munkában megállapította, hogy az algakivonatok a mezõgazdaságban általánosan mint tápanyagforrások használhatók. Jótékony hatásukat nem csupán a bennük megtalálható természetes növekedésszabályozó anyagoknak tulajdonították, hanem egyéb biostimulátoroknak is, mint a betainok, a poliaminok és az oligoszacharidok. Ezek ellenállóbbá teszik a növényeket a károsító környezeti tényezõkkel szemben, ám ennek ellenére nem javasolták az algakivonatok önálló alkalmazását a terméshozam növelésére. Kelpak A Kelpak az Ecklonia maxima barnamoszat kivonatából elõállított növekedésszabályozó készítmény. Az Ecklonia maxima a barnamoszatok (Phaeophyta) törzsébe, annak Heterogeneratae osztályában a Laminariales rendbe tartozik. Az Ecklonia nemzetségbe 10 faj tartozik, melyek Dél-Afrika partjainak melegebb vizében fordulnak elõ (SENGE et al., 1977). STIK és VAN STADEN (1996) több kereskedelemben is forgalmazott mikroalga készítmény citokinin- és auxin-jellegû hatását vizsgálta. Eredményeik alapján valamennyi vizsgált készítmény citokinin-szerû aktivitással rendelkezett. A szója kallusz növekedését legnagyobb mértékben a Seamac nevû szer serkentette, míg a bab gyökeresedésére a Kelpak hatott a legkedvezõbben. FEATONBY et al. (1984) a Kelpak 66 hatását vizsgálták bab (Phaseolus vulgaris) növényeken és azt találták, hogy 1:500-as hígításban a szer serkentette a bab növekedését önmagában, levéltrágyaként alkalmazva csakúgy, mint a talajra, más növénytrágyával együtt kijuttatva. A kezelt növények endogén citokinin tartalma szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll növényeké. Ugyanez a kutatócsoport egy évvel korábban (FEATONBY et al., 1983) üvegházban nevelt cukorrépával (Beta vulgaris) végzett kísérleteket, ahol szintén a Kelpak 66 hatását vizsgálták. Ebben a kísérletsorozatban a Kelpak és mûtrágya együttes alkalmazása bizonyult a legkedvezõbb hatásúnak a növények levélszáma, összes levélfelülete és klorofill tartalma szempontjából. 15
IRODALMI ÁTTEKINTÉS Üvegházban, tápanyaghiányos körülmények között nevelt uborka növényeknél Kelpak 66 permetezés hatására emelkedett a szárazanyag tartalom, a hajtások foszfor tartalma, és kedvezõbb lett a hajtás:gyökér arányuk, ellenben nem változott a hajtások nitrogén tartalma. A növények gyökerének Kelpak oldatba mártása az átültetés elõtt nem bizonyult olyan hatékonynak, mint a permetezés, és érdekes módon a permetezés és a gyökérnedvesítés kombinálva szintén csökkent hatásfokú volt. 1989-ben BECKETT et al. kálium hiányos búzán vizsgálták a Kelpak hatását. Üvegházban nevelték a tavaszi búzát, és megfelelõ, enyhén, illetve súlyosan elégtelen kálium ellátást biztosítottak a növények számára. A növényeket desztillált vízzel, 25% Kelpak, illetve 25% elhamvasztott Kelpak oldattal, valamint 3,4 ng/l BAP-pal öntözték, mely utóbbi a Kelpak citokinin tartalmának megfelelõje. Az enyhén és súlyosan kálium hiányos növények esetében a Kelpak hatására megemelkedett a növények szemtermelése, ami a szemek nagyságában és számában is megmutatkozott. Meg kell jegyeznünk, hogy optimális kálium-ellátás mellett a Kelpak hatására általában csökkent a szemek N és K tartalma. BAP-pal nem lehetett ehhez hasonló különbséget elérni, és ebbõl a szerzõk azt a következtetést vonták le, hogy a Kelpak hatása nem kizárólag a benne található citokinineknek tulajdonítható. Nem csupán szabadföldön, hanem in vitro körülmények között is történtek vizsgálatok a Kelpak hatását illetõen. Egy 1999-es vizsgálatban KOWALSKI et al. burgonya mikroszaporításában tesztelték a Kelpakot. Amikor 0,25 % Kelpakot kevertek a táptalajba, jobb minõségû növényeket tudtak elõállítani, s ezek az akklimatizáció során is jobban teljesítettek, mint a kontroll növények. Ha a növényeket a kiültetés elõtt a Kelpakot tartalmazó táptalajról egy Kelpak nélküli táptalajra helyezték, akkor nem volt megfigyelhetõ a fent leírt hatás. A Kelpak akkor is hatástalan maradt, ha csupán a kiültetéskor alkalmazták 0,5 %-os töménységben. Maxicrop A Maxicrop az Ascophyllum nodosum tengeri alga kivonatából készített szer. Az Ascophyllum nodosum a barnamoszatok (Phaeophyta) törzsébe, annak Cyclosporae osztályában a Fucales rendbe tartozik. Az az Atlanti-óceán sziklás partjain és Kanada csendes-óceáni partjai mentén él (SENGE et al., 1977). BLUNDEN et al. (1996) az Ascophyllum nodosum vizes kivonatával kezeltek paradicsom, törpebab, búza, árpa és kukorica növényeket, és a kezelt növények mindegyikénél megemelkedett klorofill tartalmat tudtak kimutatni a kontrollhoz képest. Ugyanezt a hatást érték el akkor is, amikor nem a talajt öntözték az algakivonattal, hanem levélpermetezés formájában juttatták a növényekre. Csak a törpebab viselkedett eltérõen, mert ott mutatkozott eltérés a kontrollhoz képest. Amikor az algában található betainok keverékét juttatták a növények felületére, a korábbiakhoz nagyon hasonló eredményeket kaptak, és ebbõl arra a következtetésre jutottak, hogy valószínûleg ezek azok a komponensek, melyek az aktivitásért felelõsek. 16
IRODALMI ÁTTEKINTÉS Egy másik kísérletben, ahol különbözõ anyagok nematocid hatását vizsgálták, TARJAN és FREDERICK (1985) kimutatták, hogy a Maxicroppal kezelt gyep növekedési erélye jelentõsen megnõ, de maga a szer nem rendelkezik nematocid aktivitással. A Maxicrop készítmény alapjául szolgáló alga, az Ascophyllum nodosum aktív komponensét keresve 1986-ban SANDERSON és JAMESON zeatinhoz, zeatin-ribozidhoz, izopentenil adeninhoz és izopentenil adenozinhoz hasonló aktivitású, citokinin-szerû anyagok jelenlétét mutatták ki. Ugyanezekkel a módszerekkel IVS-szerû aktivitást is ki tudtak mérni. Egy törökországi vizsgálatban a szõlõültetvényre permetezett Maxicrop és Proton (ugyancsak algakivonat) hatását vizsgálták az étkezési szõlõ minõségére (KOSE et al., 1999), és azt figyelték meg, hogy a bogyórepedés aránya a Maxicrop hatására szignifikánsan alacsonyabb volt. Egyes szerzõk a növekedésserkentõ hatást az antioxidáns tulajdonságokkal hozzák összefüggésbe. ZHANG és SCHMIDT (2000) például két pázsitalkotó fûféle, a Festuca arundinacea és az Agrostis palustris kéthetes csíranövényeit kezelték Ascophyllum nodosum kivonatával illetve huminsavval, majd 5 héten keresztül alacsony, illetve magas talajnedvesség mellett nevelték õket. Mindkét kezelés szignifikánsan javította a levelek vízállapotát, hajtásés gyökérnövekedését mind kedvezõ vízellátottságú, mind vízhiányos körülmények között. A két fûfélénél pozitív korrelációt mutattak ki az antioxidánsok mennyisége és a hajtás- és gyökérnövekedés között. Ezeknek némileg ellentmond az az eredmény, amit MOLLER és SMITH közölt 1998-ban, õk ugyanis csak az algák ásványi anyag tartalmának tulajdonították kedvezõ hatásaikat. Vizsgálataikban két algakivonat is szerepelt, az Ascophyllum nodosum és a Laminaria hyperborea kivonata, melyeknek a saláta csíranövények növekedésére gyakorolt hatását mérték. Eredményeik szerint az algakivonatok hatását helyettesíteni lehetett KCl kezeléssel, amibõl arra következtettek, hogy nem az algákban található növekedésszabályozó anyagok a felelõsek a növények növekedésének serkentéséért. Poliaminok Elõfordulásuk és bioszintézisük Az utóbbi pár évtizedben egyre több kutató foglalkozott a poliaminok növényi növekedés és fejlõdés során kifejtett hatásával. A poliaminok a növényvilág minden képviselõjének sejtjeiben megtalálhatók, és a feltételezések szerint számtalan élettani folyamatban játszanak szerepet az organogenezis irányításától a stresszhatások elleni védekezésig (WALDEN et al., 1997). A poliaminok szintézisét meglehetõs alapossággal ismeri a tudomány, és a szintézisben résztvevõ enzimek gátlószerei is hozzáférhetõek. A putreszcin keletkezhet közvetlenül 17
IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. Ábra A poliaminok szintézisének vázlatos összefoglalása és kapcsolata az etilén bioszintézissel. Rövidítések: ACC: 1-aminociklopropán-1-karboxilsav, ADC: Arg dekarboxiláz, dsam: S- adenozilmetionin, ODC: ornitin dekarboxiláz, SAMDC: S-adenozilmetionin dekarboxiláz. Az inhibitorok: AVG: aminoetoxivinilglicin, DFMA: DL-Ü- difluorometilarginin, DFMO: DL-Üdifluorometilornitin, MGBG: metilglioxál-bisz(guanizilhidrazone). (Walden et al., 1997) ornitinbõl ornitin dekarboxiláz közremûködésével, vagy közvetetten argininbõl arginin dekarboxiláz segítségével. A spermidin és a spermin a putreszcinbõl keletkezik, és ennek a lépésnek a szabályozását a SAM dekarboxiláz enzim (SAMDC) aktivitása határozza meg. A poliaminok szintézisútját az 1. ábra mutatja be. Mivel a SAM az etilén szintézisének is kiindulási molekulája, feltételezik, hogy a poliamin bioszintézis emelkedése, elsõsorban a SAMDC aktivitásán keresztül hatással lehet az etilén bioszintézisére is (APELBAUM et al., 1981; BIONDI et al., 1990; LEE et al., 1997). Így aztán több kutató is valószínûnek tartja, hogy a poliamin bioszintézis manipulálásával ellentétes hatást lehet elérni az etilén bioszintézisében (SHIH et al.; 1982; HAGEGE et al., 1994; WALDEN et al., 1997), mely lehetõség komoly biotechnológiai érdeklõdésre tarthat számot. 18
IRODALMI ÁTTEKINTÉS A poliaminok ebomlását a diamin oxidázok (DAO) és poliamin oxidázok (PAO) katalizálják (SLOCUM et al., 1984). A legtöbb növénybõl olyan DAO enzimeket izoláltak, melyek igen széles szubsztrát-skálával rendelkeznek, s a diaminokon kívül a spermint és a spermidint is oxidálják. A fûfélékben olyan specifikus PAO-kat találtak, melyek a poliaminokat H 2 O 2 és pirrolin (a spermin esetében szubsztituált pirrolin) felszabadulása közben 1,3-diaminopropánra bontják. Egyelõre nem ismert, hogy a poliamin szintézisért felelõs enzimek a sejt melyik részében találhatók, habár gyakorlati megfigyelések arra utalnak, hogy kompartmentációjuk megtörténik (LERUDULIER és GOAS, 1977). GALSTON és KAUR-SHAWNEY (1995) megállapítása szerint a szabad poliaminok szintje az osztódó sejtben megemelkedik, és a megnyúlás idõszaka alatt lecsökken. Kölcsönhatásaik a membránokkal A poliaminok kötõdnek a foszfolipidek negatív töltésû fejcsoportjaihoz, vagy a membrán más anionos helyeihez, megváltoztatva ezzel a membránok stabilitását és permeabilitását (SLOCUM et al., 1984). A poliaminok membrán stabilizáló hatását több növényben is megfigyelték (REDDY és VAJRANABHAIAH, 1996; RAJASEKARAN és BLAKE, 1999). COHEN et al. (1979) szerint a poliaminok a kloroplasztiszok tilakoid membránjainak stabilitását is képesek fenntartani az öregedõ árpalevél szövetekben, sõt, a klorofill-veszteséget is csökkentették, habár a plasztisz integritását nem tudták megõrizni. A poliaminok membránhoz való kötõdése megváltoztatja a membrán fluiditását is, ami indirekt módon magával vonja egyes membrán-kötött fehérjék aktivitásának megváltozását. Elképzelhetõ, hogy efféle kapcsolat áll fenn az etilén szintézisért felelõs enzimkomplex mely a plazmamembránhoz kötött és a poliaminok között is. Szerepük a növényi növekedésben, kölcsönhatásaik az egyéb növekedésszabályozókkal TIBURCIO et al. (1989) vizsgálatai szerint a putreszcin fontos szerepet játszik a dohány növények gyökérdifferenciálódásának folyamatában. RUGINI 1992-ben végzett kísérleteiben a külsõleg adagolt poliaminok, elsõsorban a putreszcin, elõsegítették az olíva hajtásainak gyökeresedését, megemelték a gyökeresedési százalékot és serkentették a hajtások alapi részén a kallusz képzõdését, ám mindezt csupán auxinnal kölcsönhatásban. Mivel gyökeresedést serkentõ hatásukat a hajtások alapi részének sötétben tartásával részben meg lehetett gátolni, és az endogén poliamin szint is lecsökkent a második napra, a szerzõ szerint a sötétség elõsegítette a poliaminok gyors lebomlását. Ugyanezekben a vizsgálatokban a poliaminok nem voltak hatással a mandula és a pisztácia gyökeresedésére, és csak minimális serkentés volt kimutatható az alma esetében. Azt mindenesetre megállapította a szerzõ, hogy a poliaminok jelenléte a hajtásokban létfontosságú a gyökeresedésükhöz. 19
IRODALMI ÁTTEKINTÉS FRIEDMAN et al. (1985) szintén a poliaminok és az auxin kölcsönhatását vizsgálták a bab hipokotil gyökeresedésében, s megállapításaik szerint a poliaminoknak az auxinokkal együtt szabályozó szerepe lehet a gyökeresedéskor. A poliaminok szintézisének mértékét radioaktív arginin és ornitin poliamin molekulákba való beépülésének mérésével követték. A kapott eredményekbõl arra a következtetésre jutottak, hogy a putreszcin szintézisének mértéke emelkedik a gyökeresedés folyamán. Az IVS-sel kezelt hajtásoknál a kezeléstõl számított különbözõ idõpontokban végzett mérésekkel az IVS gyökeresedésben játszott szerepét igyekeztek megvilágítani. Eredményeik szerint az IVS kezelés utáni elsõ öt órában az IVS gátolja a poliaminok szintézisét, 24 órával késõbb azonban nagymértékben segíti a prekurzorok putreszcinbe való beépülését. Így aztán a kezelt hajtásokban sokkal magasabb Put/Spd arány alakul ki, mint a kontrollokban. Mindebbõl a szerzõk arra következtettek, hogy a putreszcin bioszintézise a gyökeresedõ szervekben játszódik le, mégpedig a gyökeresedés korai szakaszában, és mivel a nem IVS-sel indukált gyökeresedéskor ez a szintézis sokkal kevésbé intenzív, úgy vélték, hogy az IVS által kiváltott putreszcin szintézis emelkedése kapcsolódhat az IVS által kiváltott gyökeresedés serkentéséhez. Törpe borsó növényekben 5 µg/l GS 3 -mal való permetezés hatására háromszorosára emelkedett az ADC aktivitása, míg az AMO-1618, egy gibberellinnel ellentétesen ható szer enyhe csökkenést eredményezett az enzim aktivitásában (DAI et al., 1982). Az ODC aktivitását mindkét szer gátolta, így a szerzõk arra a következtetésre jutottak, hogy a törpe borsó esetében az ADC az, amely a gibberellin hatását közvetíti. Ugyanebben a kísérletben megállapították azt is, hogy a GS 3 által kiváltott hossznövekedés szorosan kapcsolódik a szervek poliamin tartalmához, és a legfontosabb szerepet a putreszcin és a spermidin tölti be. Az is bizonyosságot nyert, hogy az ADC aktivitásának emelkedése megelõzi a GS 3 által kiváltott hossznövekedést, ami ok-okozati viszonyra enged következtetni a két jelenség között. A fejlõdés során a friss-, illetve szárazsúly egységre vonatkoztatott poliamin tartalom meglehetõsen állandó volt, ám az egy szervre, vagy kiindulási szövetre vetített poliamin tartalom drámai változásokat mutatott, ami a poliaminok szabályozó szerepére utal a növekvõ szövetekben. Szintén borsón végzett vizsgálatok eredményeképp SMITH et al (1985) megállapította, hogy a különbözõ genotípusú borsó fajták esetében a poliamin tartalom követte az internódiumok hosszának alakulását, és a fiatal internódiumokban magasabb volt a poliamin koncentráció, mint az idõsekben. Ugyancsak megállapították, hogy a GS adagolás direkt, vagy indirekt módon serkenti a poliaminok szintézisét, de a poliaminok nem lehetnek kizárólagos okai a GS hatásának. Azt, hogy mégis van szerepük a GS által kiváltott növekedésben, azzal bizonyították be, hogy a poliamin szintézis gátlókkal gátolni lehetett a GS hatását. Mivel a GS a sejtek megnyúlására és osztódására is hatással van, és a poliaminok több szerzõ szerint is részt vesznek a sejtosztódás irányításában, arra a következtetésre jutottak, hogy valószínûleg ez az a pont, ahol a kétféle növekedésszabályozó hatásai kapcsolódnak. Egy 1995-ös munkában BARALDI et al. két, eltérõ gyökeresedési tulajdonságokkal rendelkezõ körtefajtának a poliamin és auxin tartalmát hasonlították össze. A könnyen 20
IRODALMI ÁTTEKINTÉS gyökeresedõ Conference fajtánál megállapították, hogy a gyökereztetés kezdetén az endogén auxin tartalom erõteljesen megemelkedik, majd visszatér a kezdeti alacsony szintre, míg a nehezen gyökeresedõ Doyenne d Hiver fajtánál efféle változás nem volt megfigyelhetõ, és az auxin szintje mindvégig igen alacsony maradt. A szabad putreszcin tartalom a Conference esetében gyakorlatilag nem változott a gyökereztetés folyamán, míg a Doyenne d Hiver esetében mintegy hétszeresére emelkedett a szintje. A Conference hajtások spermidin tartalma az auxin tartalom emelkedésével egyidõben mintegy kétszeresére növekedett, míg a spermin szintben semmiféle következetes változás nem volt megfigyelhetõ egyik fajtánál sem. A szerzõk szerint, mivel anatómiai akadálya nem volt a gyökeresedésnek, és az auxin metabolizmus sem volt sérült a nehezen gyökeresedõ Doyenne d Hiver fajtánál, az ebben a körte fajtában található magas szabad putreszcin tartalom a felelõs a hajtások gyenge gyökeresedéséért. Hasonló vizsgálatot végeztek gesztenye (Castanea sativa) gyökeresedése folyamán is, ahol az idõsebb (nehezen gyökeresedõ) és a fiatalabb (könnyen gyökeresedõ) mikrodugványok IES és poliamin tartalmát hasonlították össze (BALLESTER et al., 1999). Ez a kutatócsoport azt állapította meg, hogy 48 órával a gyökérindukciós kezelés után mindkét típusú hajtásban intenzív sejtosztódás figyelhetõ meg, de merisztemoidok és gyökérkezdemények csak a fiatal hajtásoknál jelennek meg. Az idõs hajtások endogén IES tartalma magasabb volt a teljes gyökereztetési idõszak alatt, és a poliaminok (Put, Spm, Spd) szintjét is magasabbnak találták, mint a fiatal hajtások esetében. NAG et al. (2001) bab hipokotillal végzett vizsgálataiban szintén az endogén IES és putreszcin szint erõteljes emelkedését figyelték meg 24 órával a gyökérindukciós kezelés után, majd 96 óra után egy második csúcs alakult ki. IVS, illetve putreszcin kezelés hatására magasabb putreszcin szint volt mérhetõ a hipokotilban, mint a kontrollok esetében, azonban a többi poliamin szintje nem változott szignifikánsan. Úgy tûnik, hogy a putreszcin az auxinokkal együttesen játszik meghatározó szerepet a gyökérdifferenciálódás korai szakaszában. Az ezután bekövetkezõ csökkenés a putreszcin szintjében valószínûleg a gyökérnövekedés elõtt bekövetkezõ degradáció eredménye. Mivel a második putreszcin csúcs az IVS-sel, illetve putreszcinnel kezelt hajtásokban hamarabb következett be, mint a kontroll növényekben, valószínû, hogy ezek a kezelések lerövidítik a teljes iniciáció és expresszió idõtartamát. Hasonló változásokat figyeltek meg TONON et al. (2001) Fraxinus angustifolia gyökeresedésekor, és az õ eredményeik szerint a külsõleg adagolt IVS emelte ugyan az endogén IES szintet, de nem volt hatással a poliaminok elszlására és a peroxidáz aktivitásra. A putreszcin és a spermidin önmagában adagolva megemelt gyökeresedési százalékot eredményezett, ám IVS-sel kombinálva már gátló hatásúak voltak, csakúgy, mint a spermin önmagában. Mindezekbõl azt a következtetést vonták le, hogy a poliamin katabolizmus fontos szabályozó szerepet tölt be a gyökérképzõdésben és megnyúlásban is. Populus hajtások gyökereztetésekor HAUSMAN et al. (1995) némileg eltérõ eredményeket kapott. Hormonmentes táptalajhoz adagolva a putreszcin elõsegítette a gyökeresedést, ám a 21