XIDREDUKTÁZ EZIMEK MDELLREAKCIÓIAK VIZSGÁLATA DKTRI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS Készítette: Baráth Gábor okleveles vegyész Témavezető: Dr. Kaizer József egyetemi docens, az MTA doktora PA EGYETEM KÉMIAI ÉS KÖRYEZETTUDMÁYI DKTRI ISKLA VESZPRÉM 2010
XIDREDUKTÁZ EZIMEK MDELLREAKCIÓIAK VIZSGÁLATA Értekezés doktori (Ph.D.) fokozat elnyerése érdekében Írta: Baráth Gábor Készült a Pannon Egyetem Kémiai és Környezettudományi Doktori Iskolájának keretében. Témavezető: Dr. Kaizer József Elfogadásra javaslom (igen/nem).. (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton... %-ot ért el. Veszprém,.... a Szigorlati Bizottság elnöke Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: Dr. Joó Ferenc Bíráló neve: Dr. Besenyei Gábor igen/nem. igen/nem... (aláírás)... (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján %-ot ért el. Veszprém,... a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (Ph.D.) oklevél minősítése:.... az EDT elnöke
Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Kaizer József egyetemi docensnek figyelméért, mindig hasznos gyakorlati és szellemi tanácsaiért. Köszönöm Dr. Speier Gábor egyetemi tanárnak munkám során nyújtott támogatását, valamint Dr. Pap József Sándor tudományos munkatársnak tanácsait és észrevételeit. Köszönettel tartozom Dr. Rockenbauer Antalnak és Dr. Korecz Lászlónak (MTA Kémiai Kutatóközpont) az ESR spektrumok felvételében és azok értékelésében nyújtott segítségét, Dr. Párkányi Lászlónak (MTA Kémiai Kutatóközpont) és Dr. Michel Giorginak (Spectropole, Université Aix-Marseille) a röntgendiffrakciós szerkezet-vizsgálatokért, valamint Dr. Larry Que Jr-nak (University of Minnesota) a rezonancia Raman vizsgálatokért. Köszönöm a Pannon Egyetem Szerves Kémia Intézeti Tanszéke minden dolgozójának önzetlen segítségét. Külön köszönet illeti Családomat, akik törekvéseimet mindvégig támogatták. Baráth Gábor
Kivonat Kivonat xidoreduktáz enzimek modellreakcióinak vizsgálata Készítette: Baráth Gábor, okleveles vegyész Témavezető: Dr. Kaizer József, egyetemi docens, az MTA doktora Az értekezésben bemutatott eredmények olyan enzimek modellezésére irányulnak, amelyek reakcióik során oxidálószerként dioxigént használnak fel. Ide sorolható a dioxigenázok közé tartozó flavonol 2,4-dioxigenáz, valamint az oxidázok közé sorolható pirokatechin oxidáz és 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz. A szervezetben az enzimek működése során melléktermékként reaktív oxigén származékok (RS: Reactive xygen Species) és hidrogén-peroxid keletkezik, amelyek számos káros folyamat inicializálásában vesznek részt, így végül betegségekhez vezethetnek. A szuperoxid dizmutáz és kataláz mint oxidatív stresszt csökkentő enzimek és enzimmodell rendszerek iránti tudományos érdeklődés ennek köszönhetően az utóbbi években jelentősen megnőtt. A disszertációban bemutatásra kerülő kutatómunka ezekhez az enzimekhez kapcsolódik. Az enzimek aktív helyeinek tulajdonságaihoz igazodva célul tűztük ki új vas- és mangántartalmú komplexek előállítását és az enzimatikus reakcióknak megfelelő ún. bioutánzó reakciók, továbbá különböző szubsztrátumok oxidációs reakcióinak vizsgálatát. Az előállított modellvegyületek szerkezetét különböző spektroszkópiai módszerek (UV-VIS, IR, ESR, Mössbauer) és röntgendiffrakció segítségével jellemeztük. Az elvégzett részletes reakciókinetikai mérések alapján és a reakciók során keletkező intermedierek valamint termékek azonosítását követően (UV-VIS, ESR, rezonancia Raman, GC-MS), minden enzimmodell rendszer esetében javaslatot tettünk az oxigénezési és oxidációs reakciók lehetséges mechanizmusára vonatkozólag.
Abstract Abstract Investigation of oxidoreductase mimics Written by: Gábor Baráth, Chemist Supervisor: Dr. József Kaizer, Associate Professor The presented work was carried out in order to get insight into the mechanism of the flavonol 2,4-dioxygenase, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase, catechol oxidase, superoxide dismutase and catalase enzymes which play key role in the biosynthesis of various molecules in metabolic pathways and protect cells against such hazards. ew manganese and iron complexes have been synthesized which were characterized with numerous spectroscopic (UV-VIS, IR, EPR, Mössbauer) and X-ray diffractometric methods. They served as good functional and structural models for the enzymes mentioned above. Various structural methods (UV-VIS, EPR, resonance Raman, GC-MS) were used to characterize the intermediates and products of the enzyme-like reactions. Detailed kinetic investigation of the catalytic reactions have been performed and reaction mechanisms were proposed.
Zusammenfassung Zusammenfassung Studien über funkzionelle Modellsysteme Enzymes xidoreductase Von: Gábor Baráth, Diplomchemiker Mentor: Dr. József Kaizer, Professor für Chemie Das Ziel der Doktorarbeit war die Untersuchung der Wirkungnsmechanismen von verschiedenen Metalloenzymen mit Hilfe von Modellverbindungen die zur Familie der xidoreduktasen gehören. Die Studien umfassten Untersuchungen von Flavonol 2,4- dioxygenase, 1-Aminociklopropane-1-karbonsäure xidase, Pyrokatechin Dioxygenase, Superoxide Dismutase und Katalase. Diese Enzyme spielen eine Schlüsselrolle in der Biosynthese von verschiedenen Molekülen uns schützen die Zellen gegen aussere, schadliche Stoffen. eue Mangan- und Eisen-Komplexe wurden synthetiziert, deren Struktur mit verschiedenen Methoden, wie UV-vis, IR, EPR und Mössbauer Spektroskopie sowie Röntgendiffraktion versichert wurde. Sie dienten als gute funkzionelle und strukturelle Modelle der genannten Enzyme. Diese analytische Methoden halfen auch die auftretende Intermediäre und Endprodukte zu identifizieren. Kinetische Untersuchungen von den Modellreaktionen wurden auch ausgeführt und Reaktionsmechanismen für die katalytische Reaktionen vorgeschlagen.
Rövidítések jegyzéke RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE T RS FD 2,3-QD ES Glu His (fla) salenh 2 -bsh dmf dmso thf ESR α-kgd TH taud P4H 4HPPD ACC acch Asp MCD -MeaccH acc-h 2 acc-me BDE aibh Asc DHAsc pa bpy átalakítási arány (egységnyi katalizátorra vonatkoztatva) reaktív oxigén származékok flavonol 2,4-dioxigenáz kvercetin 2,3-dioxigenáz enzim-szubsztrát (komplex) glutaminsav hisztidin flavonolát bisz(szalicilidén-etilén-diamin) -benzoil-szalicilsav,-dimetil-formamid dimetil-szulfoxid tetrahidrofurán elektron spin rezonancia α-ketosav-függő oxidázok/oxigenázok timin hidroxiláz taurin dioxigenáz prolil 4-hidroxiláz 4-hidroxi-fenil-piruvát dioxigenáz 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav aszparaginsav mágneses cirkuláris dikroizmus -metil-1-amino-ciklopropán-1-karbonsav 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav-amid 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav-metilészter kötésfelhasadási energia 2-amino-izovajsav aszkorbát dehidro-aszkorbát 2-pikolil-amin 2,2 -bipiridil
Rövidítések jegyzéke phen tacn P Cis SD EXAFS flah 4 MeflaH 4 ClflaH 4 Me 2 flah -MebsH Et 3 IR UV-VIS py GC MS BT TF alah 4Py m-cpba SIE PCET sz indh 4 MeindH 6 MeindH bim 2 indh 1 Me 2 bim 2 indh dbcath 2 cath 2 4Bu-catH 2 4Me-catH 2 1,10-fenantrolin 1,4,7-triaza-ciklononán pirokatechin oxidáz cisztein szuperoxid dizmutáz finomszerkezetű élközeli röntgenabszorpciós spektroszkópia 3-hidroxi-flavon 3-hidroxi-4 -metoxi-flavon 3-hidroxi-4 -klór-flavon 3-hidroxi-4 -dimetilamino-flavon metoxi--benzoil-szalicilsav trietil-amin infravörös spektroszkópia ultraibolya-látható spektroszkópia piridin gázkromatográfia tömegspektrometria nitroblue-tetrazolium átalakítási frekvencia (egységnyi katalizátorra vonatkoztatva) alanin,-bisz(2-piridilmetil)--di(2-piridil)metil-amin meta-klór-perbenzoesav kinetikus oldószerizotóp effektus protoncsatolt elektron transzfer szubsztrátum 1,3-bisz(2 -piridil-imino)-izoindolin 1,3-bisz(4 -metil-2 -piridil-imino)-izoindolin 1,3-bisz(6 -metil-2 -piridil-imino)-izoindolin 1,3-bisz (2 -benzimidazoil-imino)-izoindolin 1,3-bisz (1 metil-2 -benzimidazoil-imino)-izoindolin 3,5-di-terc- butil-pirokatechin pirokatechin 4-butil-pirokatechin 4-metil-pirokatechin
Rövidítések jegyzéke Cl 4 cath 2 dbsq.- bpmph hbhpmipo propéndiamin bbppnolh 2 tetrakloro-pirokatechin 3,5-di-terc- butil-szemikinon gyökanion 2,6-bisz[bisz(piridin-2-metilamino)metil]-4-metil-fenol,,, -bisz[(2-hidroxibenzil)(-metilimidazoil)]2-ol-1,3-, -bisz(2-hidroxibenzil)-, -bisz(pridilmetil)-2-hidroxi-1,3- propiléndiamin bisp tpa bpia salpnh 2 2-HsalpnH 2 salpenth Mebimap pa pah tpaa ntb big tpen (4Me) 4 tpen bqpa 6Me-bqpa 6Me 3 -tpa ET PT HAT 3,7-diazabiciklo[3,3,1]nonán trisz-2-piridilmetil-amin bisz-((pikolil)(-metilimidazol-2-il)-amin), -bisz(szalicilidén)-1,3-diamino-propán, -bisz(2-hidroxi-szalicilidén)-1,3-diamino-propán 1,5-bisz(szalicilidénamino)pentán-3-ol 1,4-di-(2 --metilbenzimidazolilamino)-ftalazin pikolinát pikolin trisz{2-[-(2-piridilmetil)amino]etil}amin trisz(2-benzimidazoil-metil)amin,-bisz[1-metil-2-imidazoil)metil]glicinát,,, -(2-piridilmetil)etiléndiamin,,, -(4-metoxi-2-piridilmetil)etiléndiamin bisz(2-kinolilmetil)(2-metilpiridil)amin bisz(2-kinolilmetil)-6-metilpiridil-2-metilamin trisz-2-(6 metil)-piridilmetil-amin elektrontranszfer protontranszfer hidrogénatom-transzfer; hidrogén absztrakció
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS... 1 2. IRDALMI ÁTTEKITÉS... 3 2.1. Enzimek, mint biokatalizátorok... 3 2.2. Enzimmodellek... 5 2.3. xigenáz és oxidáz enzimek... 6 2.4. A dioxigén reakciói... 7 2.5. Flavonoidok az élővilágban... 9 2.6. Flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek (FD)... 10 2.6.1. Réztartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzim és modellreakciói... 10 2.6.2. Különböző átmenetifém-tartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek... 15 2.7. -Ketoglutarát-függő oxidáz és oxigenáz enzimek ( KGD)... 17 2.7.1. 1-Amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz (ACC) enzim és modellreakciói... 19 2.8. Pirokatechin oxidáz (P) enzim és modellreakciói... 22 2.9. Szuperoxid dizmutáz (SD) enzimek és modellreakcióik... 26 2.10. Vas- és mangántartalmú kataláz enzimek és modellreakcióik... 27 3. EREDMÉYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK... 33 3.1. Vas- és mangántartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz modellek... 33 3.1.1. Szintetikus Fe(III)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése... 33 3.1.2. Szintetikus Mn(II)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése... 42 3.1.3. A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata... 45 3.1.4. A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata... 50 3.1.5. A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata... 65 3.2. ACC oxidáz modellek... 75 3.2.1. ACC oxidáz enzim modellreakcióinak vizsgálata... 75 3.3. Izoindolin-típusú ligandumok mangán- és vastartalmú komplexeinek előállítása... 84 3.3.1. Pirokatechin oxidáz modellek: 3,5-di-terc-butil-pirokatechin [Mn(6 R 2 indh)(h 2 ) 2 (MeC)](Cl 4 ) 2 -katalizált oxidációja... 96 3.3.2. Kataláz és szuperoxid dizmutáz modellek... 103 3.3.2.1. A [Mn II (ind) 2 ] és a [Mn II (4 Me 2 ind) 2 ] komplexek kataláz-aktivitásának vizsgálata... 104
Tartalomjegyzék 3.3.2.2. A [Mn II (ind) 2 ] és a [Mn II (4 Me 2 ind) 2 ] és [Fe II (1 Me 2 bim 2 ind) 2 ] komplexek szuperoxid dizmutáz aktivitásának vizsgálata... 108 3.4. [Fe II (indh)(h 2 ) 2 (MeC)](Cl 4 ) 2 komplex katalitikus aktivitásának vizsgálata alkoholok oxidációs reakcióiban... 110 4. ÖSSZEFGLALÁS... 116 5. KÍSÉRLETI RÉSZ..... 118 6. IRDALMJEGYZÉK...... 126
Bevezetés 1. BEVEZETÉS Az enzimek, mint a biológiai, biokémiai reakciók katalizátorai, szinte mindenütt megtalálhatók az élővilágban, működésükről azonban, csak az elmúlt évtizedek során szereztünk közelebbi ismereteket a mérés- és műszertechnika rohamos fejlődésének köszönhetően. A különböző vizsgálati módszerek (röntgendiffrakció, MR, EXAFS) azonban az enzimek nagy molekulatömegének, nehézkes tisztíthatóságának és nehéz kristályosíthatóságának következtében gyakorlatilag csak a metalloenzimek tanulmányozása során alkalmazhatóak, de ott is csak korlátozottan. Egy viszonylag fiatal tudományág, a bioszervetlen kémia (biokoordinációs kémia), amely egyszerűen előállítható szerkezeti és működési modellek vizsgálatán keresztül próbálja felderíteni az aktív centrumban, vagyis a fémion koordinációs övezetében lejátszódó folyamatokat és az aktív hely spektroszkópiai viselkedését, az utóbbi években nagyarányú fejlődésen ment át. A modellreakciók vizsgálata arra is lehetőséget ad, hogy úgynevezett bioutánzó reakciókat dolgozzunk ki, egyrészt a preparatív hasznosítás, másrészt a homogén katalízis jobb megértése céljából. Az értekezésben bemutatott eredmények olyan enzimek modellezésére irányulnak, amelyek reakcióik során oxidálószerként dioxigént használnak fel. Ide sorolható a dioxigenázok közé tartozó flavonol 2,4-dioxigenáz, valamint az oxidázok közé tartozó pirokatechin oxidáz és 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz. A témakörök kiegészülnek, egyrészt preparatív alkalmazások, másrészt a dioxigénaktiválás mechanizmusának megismerése céljából, ennek megfelelően kerülnek tárgyalásra a megfelelő szubsztrátumok vagy azokhoz szerkezetileg hasonló vegyületek átmenetifém komplexek által katalizált oxidációs és oxigénezési reakciói. Az élő szervezetben végbemenő oxidációs reakciók melléktermékeként reaktív oxigén származékok (RS: szuperoxid gyök-anion, hidroxil gyök stb.) és hidrogén-peroxid keletkezik. A szuperoxid dizmutáz és kataláz enzimek mint oxidatív stresszt csökkentő enzimek és enzimmodell rendszerek iránti tudományos érdeklődés ennek köszönhetően az elmúlt években nagymértékben megnőtt. A dolgozat felépítése a következő: az irodalmi részben a témakör nagysága és szerteágazó jellege miatt csak az áttekintést segítő, összefoglaló közlemények kerültek feldolgozásra. Különös hangsúlyt kaptak a biológiai oxidációs, oxigénezési reakciók alapproblémái és azok eddigi ismeretei. Ezt követi egy rövid összefoglaló a tudományos eredményekről és azok értékeléséről, melynek alapját képező kísérletek részletes leírása a 1
Bevezetés kísérleti részben található. Az egyes rendszerekkel kapcsolatban megfogalmazott célokat, az elvégzett vizsgálatok eredményeinek összefoglalását, a levonható következtetésekkel együtt az adott témakörben ismertetjük. 2
Irodalmi áttekintés 2. IRDALMI ÁTTEKITÉS 2.1. Enzimek, mint biokatalizátorok A biológiai katalizátorokat enzimeknek nevezzük. Működésük teszi lehetővé a kiválasztott kovalens kötések testhőmérsékleten történő felbontását és más, megfelelő kovalens kötések kialakítását. agyon specifikusan működnek, csak egy kiválasztott molekulatípusban egy adott kötést bontanak fel, a többit érintetlenül hagyják. Az élő szervezetekben minden anyag enzimreakciók sorozatán keresztül jön létre (anabolizmus), vagy bomlik le (katabolizmus). Érdekes, hogy még maguk az enzimek keletkezése is enzimek által katalizált. Az átalakulási folyamatok összességét metabolizmusnak, vagy anyagcserének nevezzük (1. ábra). Katabolizmus (lebontás) TERMÉK Energia TÁPAYAG Metabolizmus (átalakítás) Anabolizmus (elõállítás) Enzimatikus reakciók sorozata SZUBSZTRÁTUM 1. ábra Enzimreakciók szerepe az élő szervezetekben Az élőlények anyagcseréjében résztvevő szénvegyületek viszonylag egyszerűek, csak kevés tartalmaz 100-nál több atomot. Ha ezekre pontosan illeszkedő enzimfelületet akarunk elképzelni, akkor ennél lényegesen nagyobb méretre van szükség. Az enzimeknek szükségszerűen nagyságrendekkel nagyobb méretűeknek kell lenniük, mint amekkoráknak az anyagcserén átmenő anyagoknak. Ezek a molekulák lényegesen különböznek az átalakítandó vegyületektől, ezek a fehérjék. Amennyiben csak aminosavak alkotják őket, egyszerű fehérjékről beszélünk (proteinek, apoenzimek), ha nem fehérje természetű részt is tartalmaznak (prosztetikus csoport, koenzim), akkor összetett fehérjékről (proteidek, holoenzimek) van szó. Az enzimek aminosavakból épülnek fel, tehát a fehérjék családjába tartoznak. Molekulatömegük 1,2 10 4 5 10 5 Daltonig változhat [1]. Az enzimek alakfelismerő volta oly mértékben specifikus, hogy a reakcióban szereplő molekula teljes 3
Irodalmi áttekintés térszerkezetét figyelembe véve fejtik ki hatásukat. Mindezen tapasztalatok alapján a 19. század végén alakult ki az enzimek "kulcs-zár" elmélete, amelyhez 1958-ban, Daniel Koshland javasolt módosítást [2, 3]. Az enzim molekula csak a kiválasztott molekulához illeszkedhet alak és töltéstérkép szerint. Az enzimek geometriai szerkezete biztosítja, hogy csak egyetlen egy kiválasztott kötést torzítsanak el, éppen annak az aktiválási energiáját csökkentsék le (2. ábra). Ezért van az, hogy a nagyon sokféle, az összegképlet alapján lehetséges izomer közül az élő természetben csak meghatározott típusok fordulnak elő. 2. ábra Enzimműködés folyamata Egy enzim elsődleges szerkezete n darab aminosavból épül fel, tehát 20 n féle variáció képzelhető el az aminosav-szekvencia kialakulásánál. Ha egy viszonylag kis fehérjét vizsgálunk, amelyet 100 aminosav alkot, a variációk száma 20 100 vagy 10 130, ami hatalmas szám, nagyobb, mint az összes molekula száma az univerzumban. em túlzás tehát azt állítani, hogy minden eddig ismert kémiai reakcióhoz létezik egy enzim, amely képes katalizálni azt. Természetesen megtalálni minden kémiai, biokémiai folyamathoz a megfelelő enzimet nem egyszerű feladat, valószínűleg nem is lehetséges. Az eddig ismert enzimek közel egyharmada fémiont (vagy fémionokat) tartalmaz, amelyek többféle módon kötődhetnek a fehérjéhez és többféle funkciót is elláthatnak. Ezeket két csoportra osztjuk: metalloenzimekre és fémionok által aktivált enzimekre. A metalloenzimekben a fémion az enzimmolekulába beépült alkotórész, a fémion és a fehérje sztöchiometrikus aránya meghatározott érték. Amennyiben a fémiont kiszakítjuk a metalloenzimből, az enzim elveszíti aktivitását. A fémionok által aktivált enzimek esetében egyensúly áll fenn a fémion és az enzim, továbbá a fémion aktiválta enzim között. Ennél az enzimcsoportnál a fémet egyszerű kémiai módszerekkel el lehet választani a fehérjétől anélkül, hogy az aktivitását teljesen elveszítené. A katalizált reakciók típusa szerint az enzimek az alábbi hat fő csoportba sorolhatók (1. táblázat) [4]: 4
Irodalmi áttekintés 1. táblázat Az enzimek csoportosítása a katalizált reakciók típusa szerint enzimcsoport hidrolázok oxidoreduktázok transzferázok izomerázok liázok ligázok katalizált reakció(k) fehérjék peptid kötésének, poliszacharidok glikozidkötésének, zsírok, foszfátok észterkötésének hasítása redoxireakciók, melyek során elektronok vagy hidrogénatom kerül át egyik molekuláról a másikra egy meghatározott atomcsoport átvitele egyik molekuláról a másikra különböző átrendeződéses reakciók a szubsztrátum egy adott csoportjának hidrolitikus eltávolítása két molekula összekapcsolása Az enzimek ipari folyamatokban biokatalizátorként történő felhasználása, napjainkban igen intenzíven kutatott terület. A legfőbb problémát az jelenti, hogy az iparban alkalmazott reakciókörülmények oly mértékben eltérnek a fiziológiás körülményektől, hogy legtöbb esetben az enzimek nem képesek kifejteni hatásukat. Az enzimek biokatalizátorként való felhasználásának előnyeit és hátrányait az 2. táblázatban foglaltuk össze [5-11]. 2. táblázat Enzimek biokatalizátorként való felhasználásának előnyei és hátrányai Előnyök nagy szelektivitás nagy aktivitás enyhe körülmények között nagy átalakítási arány (T) biodegradábilis általában természetes anyagok Hátrányok nagyon komplex molekulák magas előállítási költség belső fragmentálódás 2.2. Enzimmodellek Az enzimmodelleknek alapvetően két csoportját különböztetjük meg: vannak ún. szerkezeti és működési (funkcionális) modellek (3. ábra). Az enzimek szerkezeti modelljei az aktív centrum térbeli szerkezetének megismerését segítik elő, a modellek és az enzimek spektroszkópiai adatainak összehasonlításával. Mivel az alkalmazható ligandumok tárháza igen gazdag, azok felhasználásával egyre jobban megközelíthetővé válhat az enzim aktív 5
Irodalmi áttekintés centrumának felépítése. Azt azonban szem előtt kell tartani, hogy a szintetikus vegyületek gyakran túl stabilisak ahhoz, hogy katalitikus funkciókat lássanak el. A funkcionális (működési) modellek esetében nem a szerkezeti hasonlóság a meghatározó. A cél, az oxigénezési, oxidációs folyamat mechanizmusának megértése és ennek révén hasonló, mesterséges katalitikus reakciók kidolgozása. Az enzimek szelektivitását és aktivitását azonban nagyon nehéz reprodukálni, mivel a bioutánzó rendszerek gyakran a természetestől eltérő körülmények között működnek. em elképzelhetetlen azonban, hogy a gyors ütemben fejlődő modellek megközelítsék, illetve túllépjék a proteinek bizonyos tulajdonságait. Szerkezet Szerkezeti modellek Stabilis köztitermék Reakció mechanizmus Metalloenzim Fémkomplex Funkció Funkcionális modellek Instabilis köztitermék Katalitikus reakció 3. ábra A metalloenzimek szerkezeti és működési modelljei 2.3. xigenáz és oxidáz enzimek Az enzimek egy rendkívül fontos csoportját képezik az oxidáz és oxigenáz enzimek, amelyek többsége a metalloenzimek csoportjába sorolható. Széles körben megtalálhatók különböző élő szervezetekben, állatokban, növényekben és mikroorganizmusokban. Funkciójukat tekintve kulcsfontosságú szerepet töltenek be, a növényi és állati szervezetek számára mérgező anyagok, valamint esszenciális vegyületek mint a különböző aminosavak, cukrok, zsírsavak, vitaminok, lipidek, szteroidok aerob körülmények között lejátszódó lebontási folyamataiban, illetve bioszintézisében. A degradációs folyamatok reakcióhőjét a sejtek energiaforrásként, a keletkező termékeket pedig szénforrásként hasznosítják. Az oxidáz és oxigenáz enzimek közös jellemzője, hogy az általuk katalizált folyamatokban a dioxigén nélkülözhetetlen. Az oxigenáz enzimek aktív centrumukban többnyire rezet, vasat vagy mangánt tartalmazó metalloenzimek, amelyek a dioxigén molekula egy vagy két oxigénatomjának beépülését katalizálják a megfelelő szerves szubsztrátumba. Első esetben monooxigenázokról (1), utóbbi esetben dioxigenázokról (2,3) beszélünk. 6
Irodalmi áttekintés Dioxigenázok esetében további két alcsoportot is megkülönböztethetünk, az intrailletve az intermolekuláris dioxigenázokat. Az intramolekuláris enzimek közös jellemzője, hogy a dioxigén mindkét atomja ugyanazon szubsztrátumba épül be (2), az intermolekuláris dioxigenázok esetében pedig a dioxigén atomjai két szubsztrátum között oszlanak meg (3). Az utóbbi években karakterizált vastartalmú dioxigenáz enzimek két csoportra oszthatók, a Fe(III)-iont tartalmazó intradiol dioxigenázokra, amelyek aktiválják a szubsztrátumot mielőtt a molekuláris oxigén reakcióba lépne velük és a Fe(II)-iont tartalmazó extradiol dioxigenázokra, melyek esetében a molekuláris oxigén aktiválása a kulcs lépés. [12-14]. Készültek közlemények mangán- [15], magnézium- [16] és réztartalmú [17] dioxigenáz enzimekről is. Az oxidáz enzimek is aerob körülmények között fejtik ki hatásukat, de az oxigenázokkal ellentétben, itt az oxigén szubsztrátumba való beépülése nem játszódik le, az enzim a szubsztrátum oxidatív dehidrogéneződéséért felelős. A fenti reakciókban másodlagos termékként víz vagy hidrogén-peroxid keletkezik (4,5). S + 2 + 2e + 2H + = S + H 2 (1) S + 2 = S 2 (2) S + S + 2 = S + S (3) 2 + 4e + 4H + = 2H 2 (4) SH 2 + 2 = S + H 2 2 (5) 2.4. A dioxigén reakciói Az aerob élőlényekben a dioxigén felhasználása egy négyelektronos redukción keresztül megy végbe, melynek során egy mol oxigén molekulából 2 mol víz keletkezik (6) [18]. Elektrongazdag, szerves tápanyagok (pl. glükóz) oxidációjával összekapcsolva, ez a folyamat biztosítja az aerob előlények energiaellátását. A biológiai oxidációk ezen típusát légzésnek nevezzük. 2 + 4H + + 4e - E 0 = +0,815V 2H 2 (6) A triplett állapotú dioxigén két pártalan elektronnal rendelkezik, stabilis és ezért szingulett állapotú szerves szubsztrátumokkal szemben inert. A lényegesen nagyobb 7
Irodalmi áttekintés energiatartalmú, instabilabb szingulett állapotú dioxigén reaktivitása nagyobb és redoxirakciókban, valamint elektrociklikus reakciókban (pl. olefinekkel, Diels-Alder-típusú reakciókban) jól reagál (3. táblázat). 3. táblázat A dioxigén elektronállapotai és tulajdonságai [19-21] Elektronállapot HM orbitálok Relatív energia (kj) Élettartam (s) Gáz - folyadék 1 Σ g 1 g 3 Σ g 154,8 7,12 10-9 92,0 3000 10-3 0,0 Szerkezet = x * y A dioxigénnek a redoxireakciókban mutatott viszonylagos inertsége az első elektron termodinamikailag kedvezőtlen felvételével is magyarázható (E = -0,32 V) [22]. A szuperoxid aktivitása ennek megfelelően lényegesen nagyobb [23]. A dioxigént felhasználó metalloenzimek és modellvegyületeik vizsgálata kapcsán felmerül a kérdés, hogy a dioxigén aktiválása milyen módon, milyen lépéseken keresztül valósul meg. Ennek megértésében sokat segíthet az intermedier-kutatás, amelynek feladata, hogy az enzimfolyamatokban és az azokat modellező bioutánzó rendszerekben a reaktív intermedierek elkülönítésén, spektroszkópiai jellemzésén keresztül információt nyújtson a dioxigén- és rajta keresztül a szubsztrátumaktiválás mechanizmusáról. A dioxigén-molekula termodinamikai inertsége feloldható olyan átmenetifémek segítségével, amelyek dioxigénnel komplexet képeznek. Az oxidáz és oxigenáz enzimek esetében a dioxigén aktiválását reaktív peroxo- és oxo-intermedierek képződésén keresztül képzelik el, amelyek reakciója (C H aktiválás, oxigéntranszfer, stb.) a megfelelő szubsztrátum molekulával már könnyen értelmezhető (4. ábra) [24-28]. Az aerob élőlények a dioxigént több más reakcióban is felhasználják, többek között különböző molekulák bioszintézisében, továbbá molekulák vízoldhatóvá tételében a kiválasztást elősegítendő. A fenti reakciók legnagyobb része mono- és dioxigenáz enzimek által katalizált. A sejtek belsejében uralkodó reduktív környezetnek köszönhetően, az ott jelenlévő vegyületek az enzimek szabályozó hatását megkerülve, termodinamikailag képesek reakcióba lépni dioxigénnel, melynek során reaktív oxigén származékok (RS: szuperoxid gyök-anion, hidroxil gyök, stb.) és hidrogén-peroxid keletkezik [29]. 8
Irodalmi áttekintés Cu I Cu I Fe II Fe II Fe II Fe II Peroxo Cu II 2 Cu II Fe III 2 Fe III Fe III 2 (H +, e - ) (H) 2 kofaktor (ketosav) Fe III R xo Cu III Cu III Fe IV Fe IV (H) Fe IV Fe IV Hemocianin, Tirozináz Katekoláz Metán monooxigenáz Ribonukleotid reduktáz aftalin dioxigenáz TauD dioxigenáz Bleomicin 4. ábra Dioxigénaktiválás mechanizmusa átmenetifémek (Cu, Fe) jelenlétében 2.5. Flavonoidok az élővilágban A növényi flavonoidok szerepéről, kémiai szerkezetéről, élettani hatásáról az elmúlt negyven évben rendszeresen jelentek meg összefoglaló tanulmányok [30-32], de az emberi szervezetre gyakorolt hatásuk és jelentőségük még ma sem teljesen tisztázott. Szent-Györgyi és munkatársai már 1936-ban kimutatták, hogy a citrusfélékből származó két flavonoid (rutin, naringenin) csökkenti a kapillárisok törékenységét és permeabilitását [33]. A flavonoidokat P- vitaminnak nevezte el (P ~ permeabilitás), illetve C2-vitaminnak, mivel számos flavonoid képes a C-vitamint stabilizálni. Az 1950-es években a flavonoidok vitamin elmélete megdőlt. A hetvenes években felfedezték, hogy a növényekben az egyik leggyakrabban előforduló flavonoid, a kvercetin bizonyos körülmények között mutagén hatású, ezért nagy figyelem irányult a flavonoidok karcinogenitására, amelyet később nem sikerült egyértelműen bizonyítani. apjainkban e korai eredményeket kissé elfeledve a legtöbb kutatócsoport a flavonoidok egészségvédő és betegségmegelőző hatását helyezi előtérbe. Jelenlegi ismereteink szerint több ezer különböző szerkezetű flavonoid létezik, amelyek egymástól az alapszerkezethez kapcsolódó hidroxilcsoportok számában, helyzetében, 9
Irodalmi áttekintés valamint a C2 - C3 szénatomok közötti kettős kötés meglétében, vagy hiányában térnek el egymástól. Ezeken belül az alábbi főbb csoportok különíthetők el [31]: -Kalkonok -Auronok -Flavonok -Flavonolok -Flavononok (bioflavonoidok) -Antocianidinek -Izoflavononoidok A kalkonok és auronok jelenlegi ismeretek szerint kisebb jelentőséggel bírnak. A flavonok részt vesznek a növények színének és ízének kialakításában, a flavonolokat a növényvilág csaknem valamennyi tagja előállítja, legnagyobb koncentrációban a gyümölcsök héjában fordulnak elő. 2.6. Flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek (FD) 2.6.1. Réztartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzim és modellreakciói A dioxigenáz enzimek egy kisebb csoportját képezik a flavonol 2,4-dioxigenázok (FD = kvercetin 2,3-dioxigenáz (2,3-QD), vagy kvercetináz), amelyek a flavonolok gyűrűbontási reakcióját katalizálják, a megfelelő -benzoil-szalicilsavat és szén-monoxidot eredményezve (7) [34-38]. R R H R= H; H R R 2 FD enzim Az első enzimet, amely ezen átalakulásokat katalizálja, több mint négy évtizeddel ezelőtt ismerték fel az Aspergillus fajaiban [39]. Az Aspergillus-ból izolált, kvercetinázok [40-43] spektroszkópiai vizsgálatai alapján igazolták, hogy a fenti enzim aktív centrumában rezet tartalmaz [17,41,44]. Bár az Aspergillus flavus-ból és Aspergillus niger-ből nyert enzimek spektroszkópiai és biokémiai vizsgálata során számos hasznos információhoz jutottak, az igazi áttörést az Aspergillus japonicus-ból izolált enzim (FD) 1.6 Å felbontású röntgendiffrakciós szerkezet-meghatározása jelentette (5. ábra). A szerkezet alapján az enzim -C R R C C 2 H R R (7) 10
Irodalmi áttekintés ~100 kda molekulatömegű, két egyenként egy rezet tartalmazó alegységből álló homodimer. Az egymagvú centrumokat tekintve két egymástól eltérő geometria figyelhető meg [44]. 5. ábra Az Aspergillus japonicus-ból izolált FD enzim szerkezete és a réz(ii)ion koordinációs övezete: A) Torzult tetraéderes koordináció B) Torzult trigonális bipiramisos koordináció [44] Az irodalomban több réztartalmú enzim-szubsztrát (ES) röntgenszerkezet is a rendelkezésünkre áll, amely alapján az ES komplex kialakulásával kapcsolatosan számos információhoz juthatunk [45,46]. Torzult síknégyzetes piramisos szerkezet kialakulása figyelhető meg kvercetin és kamferol koordinációja esetében ( = 0,38 és 0,41), a síkban két hisztidin [(His66) és (His112)] és a glutamát [(Glu73)] ligandumok mellett a szubsztrát [(fla)] egyfogú koordinációja figyelhető meg, a harmadik hisztidin [(His68)] mindkét esetben apikális pozícióban van. Az ilyen módon kötött szubsztrátum jóval reaktívabb dioxigénnel szemben, mint a kelátban stabilizált forma (6. ábra). 6. ábra Az FD enzim kvercetinnel képzett komplexének szimulációs röntgendiffrakciós szerkezete [44] A szubsztrátum egy- vagy kétfogú koordinációját a 7- és 4 -hidroxi-csoportok megléte vagy hiánya határozza meg. A szubsztrátum 3 és a glutamát nem koordinálódó 2 atomja 11
Irodalmi áttekintés közötti kölcsönhatások [2,43 Å (kamferol) és 2,66 Å (kvercetin)] azt sejtetik, hogy a glutamát protonált formában van jelen. A glutamát egyik lehetséges szerepe tehát a szubsztrátummolekula deprotonálása. A réz szerepét a kvercetin 2,3-dioxigenáz által katalizált enzimfolyamatokban, Simpson a következő általa feltételezett mechanizmusban vázolta fel (8) [42,45]: [ EZIM-Cu ] + H + 2 Cu-EZIM Cu-EZIM (8) C + C C 2 H Cu-EZIM Cu-EZIM Az első fémtartalmú modellek előállítása ishinaga és munkatársai nevéhez fűződik, akik [Co II (salen)], illetve [Cu II (acetát) 2 ] katalizátort alkalmaztak a flavonol-származékok dioxigénezési reakciójában [47,48]. Mivel a kobalttartalmú rendszer hatásosabbnak bizonyult a réztartalmú rendszernél (konverzió: ~37%), ezért a kiterjedtebb vizsgálatok ezen rendszerre irányultak. A reakcióban feltételezett [Co III (salen)(fla)] komplexet diklór-metánban [Co III (salen)(h)] és flavonol reakciójában állították elő, melynek szerkezetét röntgendiffrakciós méréssel meghatározták [49], majd vizsgálták oxigénezési reakcióját [50]. Megállapították, hogy a reakció oldószerfüggő, valamint hogy termékként az enzimatikus útnak megfelelő depszidet tartalmazó [Co III (salen)(-bs)] komplex keletkezik. Az oxigénezés dmf-ban és dmso-ban gyors, MeH-ban lassú, míg thf-ban és CH 2 Cl 2 -ban nem megy végbe. A szubsztituensek hatását vizsgálva azt találták, hogy a 7-es és 4 -es szénen lévő hidroxivagy metoxicsoportok megnövelik a szubsztrátum reaktivitását, ami összhangban van az enzimatikus reakcióknál tapasztaltakkal. A reakcióelegy (dmf) ciklikus-voltametriás vizsgálata alapján azt találták, hogy a komplex az oldószer hatására disszociál és a dioxigén az így képződő flavonolát-anionnal lép reakcióba [51,52]. Ennek bizonyítására elvégezték a flavonol terc-buk jelenlétében történő 12
Irodalmi áttekintés oxigénezését is. A fentiek ismeretében javasolt mechanizmus (7. ábra) kritikus lépése a flavonolátion és a dioxigén reakciója. ishinaga szerint ez egy közvetlen egylépéses, ún. koncertikus reakció, amely cikloaddíciós mechanizmussal, gyökintermedierek képződése nélkül játszódik le [53]. Mivel ezen reakció spintiltott (a szingulett állapotú szerves molekula nem képes reakcióba lépni az alapállapotú triplett dioxigénnel szingulett állapotú terméket eredményezve) [54], ezért ishinaga a látszólagos ellentétet triplett és szingulett állapotú töltésátviteli komplexek és a köztük fennálló ún. spinváltó átmenetek feltételezésével oldotta fel [55]. Ph [Co III (salen)(h)] Ph H -H 2 Co III (salen) dmf Ph Co III (salen) dmf Ph + [Co III (salen)(dmf) x ] 2 /dmf/ Ph + [Co III (salen)(dmf) x ] 1 Ph 3 1 M 3 Ph Ph M + 2 Ph 3 [CT] spinváltó átmenet 1 [CT] 7. ábra Flavonol báziskatalizált oxigénezésének javasolt mechanizmusa Összefoglalva tehát elmondható, hogy a ishinaga által vizsgált terc-buk és kobalttartalmú rendszerekben a fém szerepe a szubsztrátum aktiválásában van, amely deprotonálódáson keresztül valósul meg. Mivel a fém oxidációs foka a reakció során nem 13
Irodalmi áttekintés változik, valamint a fémnek csak a bázikus karaktere dominál, ezért ezen rendszereket ún. báziskatalizált, nem redoxaktív fémtartalmú rendszereknek nevezzük. Speier és munkatársai a 8. ábrán feltüntetett ligandumokkal alkotott Cu(I)- és Cu(II)- tartalmú komplexeket állítottak elő és alkalmaztak az enzimreakció vizsgálatára. Ezek során kiderült, hogy a fenti komplexek reakciói funkcionálisan jól modellezik az enzimet, tehát a megfelelő depszidet eredményezik, viszont csak kis sebességgel és erélyes körülmények között játszódnak le. Szerkezeti modellként ezek a rendszerek pedig még nem megfelelők, bár ennek a kísérletek elvégzésekor még gyakorlati akadályai voltak. Az enzim szerkezetéről ugyanis csak ezen komplexek vizsgálatát követően, krisztallográfiai mérések alapján kaptak pontos információt. Az enzimatikus tulajdonságoknak leginkább megfelelő komplexeket rézzel állították elő. Takeda és munkatársai flavonol származékok reaktív részéhez formailag hasonló 1,2- ciklohexándion (illetve annak enolos formája), mint modellvegyület oxigénezési reakcióját vizsgálták metanolban CuCl. 2 5H 2 katalizátor jelenlétében [56]. H 3 C CH 3 H P H 3 C CH H CH 3 3 C 3 H 3 C CH 3,,',' -tetrametiletilén-diamin [57] 1,10-fenantrolin [57] 2,2'-bipiridin [57] trifenil-foszfán [58] 3,3'-imino-bisz(,-dimetil-propil-amin) [59] H H H H H H 1,4-(di-2'-piridil)amino-ftalazin [60] 1,3-bisz(2'-piridil-imino)-izoindolin [61] 8. ábra Flavonol 2,4-dioxigenáz modellek előállításánál használt ligandumok 14
Irodalmi áttekintés 2.6.2. Különböző átmenetifém-tartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimek A réztartalmú FD enzim mellett az első vastartalmú kvercetináz enzimet 2003-ban izolálták. Az enzimológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy az enzim aktív centruma nagy hasonlóságot mutat a korábban vizsgált réztartalmú enziméhez. A vizsgálatok során azt tapasztalták, hogy az enzim katalizálja a flavonolok oxigénezési reakcióit, tehát flavonol 2,4- dioxigenáz aktivitást mutat. A spektroszkópiai vizsgálatok (ESR) alapján az aktív centrumban vas(ii)- és vas(iii)ion jelenléte is kimutatható volt [62]. Az inhibíciós vizsgálatok azonban arra utalnak, hogy a kvercetin átalakulásáért a vas(ii)ion felelős. A kísérletek során a Fe(II) specifikus inhibitorok 1,10-fenantrolin és 2,2 -bipiridin 50 százalékos inhibíciót okoztak mindössze 200 μm koncentrációban. Érdemes megjegyezni, hogy a Fe(III) specifikus inhibítor (Tiron) a kísérletek során növekedést eredményezett az aktivitásban, alátámasztva a vas(ii) szerepét [63]. A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FD) szerkezetét a 9. ábra szemlélteti. A vastartalmú FD enzimek a réztartalmúakhoz hasonlóan két, egyenként egy vasat tartalmazó alegységből álló homodimer. Mindkét alegységben melyek között csekély geometriai eltérés figyelhető meg a Fe(II)-ion pentakoordinált formában helyezkedik el. A szerkezetek között megfigyelhető eltérések a fémet megkötő glutamát nyílt és zárt geometriai formái közti különbségnek tulajdoníthatók (10. ábra) [64]. 9. ábra A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FD) szerkezete [64] Shaab és munkatársai Escherichia coli baktérium segítségével különböző kétvegyértékű fémet tartalmazó kvercetináz enzimeket állítottak elő. Mn(II), Co(II) és Cu(II) hozzáadása esetén aktív enzim keletkezett, míg Zn(II), Fe(II) és Cd(II) alkalmazása során nem 15
Irodalmi áttekintés volt szignifikáns aktivitás-növekedés. Az ily módon előállított Mn(II)- és Co(II)-tartalmú kvercetinázokat tisztították és jellemezték. Az ESR spektrumok alapján megállapították, hogy a Mn(II)-tartalmú enzimben a két mangánion oktaéderes koordinációjú. A kinetikai vizsgálatok során kimutatták, hogy a mangántartalmú enzim mintegy negyvenszer nagyobb aktivitást mutat, mint a Fe(II)-tartalmú kvercetináz és közel azonos aktivitású, mint a Cu(II)- tartalmú (4. táblázat), az eredmények alapján tehát a kvercetináz enzim aktív centruma feltételezhetően Mn(II)-tartalmú [65]. 10. ábra A Bacillus subtilis-ből izolált enzim (FD) szerkezete [64] 4. táblázat A kvercetináz enzimek kinetikai adatai: a) A kvercetináz enzim aktív centrumában lévő fém; b) [63] Fém a Atomok/alegység k kat (s -1 ) K M (µm) K M ( 2 )( µm) Mn 1,8 25±1 4,0±0,9 90±10 Co 0,65 6,7±0,2 7,5±0,5 79±5 Fe 0,80 b 0,65±0,02 5,2±0,6 150±9 16
Irodalmi áttekintés 2008-ban Merkens és csoportja egy új organizmusból, a Streptomyces baktériumból különítettek el FD enzimet Escherichia coli baktérium segítségével. A baktériumból kinyert természetes enzimhez különböző átmenteti fémeket adva vizsgálták az aktivitásokat, hasonlóan, mint a B. subtilis esetében. A i(ii) és Co(II) fémiont tartalmazó enzim a kinetikai mérések során nagy aktivitást mutatott a Mn(II), Fe(II), Cu(II), Zn(II) központi fémiont tartalmazó enzimekhez képest (5. táblázat) [66]. 5. táblázat A kvercetináz enzimek kinetikai adatai: a) A kvercetináz enzim aktív centrumában lévő fém; b) [67] Fém a Atomok/alegység k kat (s -1 ) K M (µm) K M ( 2 )( µm) Fe 0,44 b 1,5±0,1 b 14,1±0,7 b - Co 0,33 7,6±0,5 0,96±0,05 1230±310 i 0,55 40,1±3,4 5,75±0,12 256±45 Berreau és munkatársai vas-, mangán-, kobalt- nikkel- réz- és cinkartalmú flavonolát komplexeket állítottak elő, és vizsgálták, hogyan befolyásolja a központi fémion tulajdonsága a szerkezeti, spektroszkópiai és redoxi tulajdonságokat, valamint tanulmányozták a ligandumkicserélődési reakcióikat. A komplexek dioxigénnel való reakcióját csak a vas(ii)komplex esetében végezték el, amelynek során az enzimatikus úttól eltérően egy µ-vas(iii)komplex keletkezett [68]. Funkcionálisan működő vas-, mangán-, és nikkeltartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzimmodell-rendszerek az irodalomban eddig még nem ismertek, tehát ezen modellreakciókról szerzett tapasztalataink segíthetnek tisztázni a fém(ek) enzimben betöltött szerepét. 2.7. -Ketoglutarát-függő oxidáz és oxigenáz enzimek ( KGD) Az oxidoreduktáz enzimek fontos csoportját képezik az -ketoglutarát-függő oxidázok és oxigenázok [69], amelyek különböző, biológiailag fontos vegyületek, pl. aminosavoldalláncok hidroxilezési reakcióinak katalízisét végzik. Az -ketosav ebben az esetben kofaktorként, vagyis az enzim működését elősegítő csoportként funkcionál. Általánosságban elmondható róluk, hogy -ketosav jelenléte nélkül az enzimatikus reakció (kevés kivétellel) nem játszódik le. Másik fontos sajátságuk, hogy bár aminosav- 17
Irodalmi áttekintés szekvenciájuk jelentős változatosságot mutat, az aktív helyük szinte kivétel nélkül két hisztidines nitrogénnel és egy glutaminsavból, vagy aszparaginsavból származó karboxilátfunkcióval kötött vas(ii)iont tartalmaz. A 2, donoratom-csoport mellett még három vízmolekula kapcsolódik a vas(ii)centrumhoz (11. ábra) [70], így alakul ki a hatos koordináció. SH RCH C 2 (His) R (His) Fe II H 2 H 2 H 2 -KG (His) (Glu) (His) Fe II H 2 R SH (His) (Glu) (His) Fe II SH R 2 (His) (Glu) (His) Fe II SH C (His) R (His) (His) Fe IV R (Glu) (Glu) C SH (His) Fe IV R SH (His) (Glu) (His) Fe III 2 R SH 11. ábra A vastartalmú KG-függő dioxigenázok reakcióira javasolt általános mechanizmus A 11. ábrán látható javasolt mechanizmus [71] épp ezért szinte az összes KGD enzimre érvényes. Első lépésben az -ketosav kétfogú ligandumként való koordinációja történik öttagú kelátgyűrű képződése közben. Ezzel párhuzamosan két vízmolekula kiszorul a koordinációs övezetből. A szubsztrátum ezután megkötődik a vas(ii)ion közelében, kiszorítva a maradék vízmolekulát a vas(ii)ion mellől, utat nyitva egy dioxigén molekula koordinációjának. A vas(iii)hoz kapcsolódó szuperoxo-ligandum ezután már képes a ketosav ketonos szénatomját támadni, peroxo-vas(iv) intermedier kialakulását eredményezve. Az kötés felhasadásával végül létrejön az oxovas(iv) egység, amely a közelben rögzített szubsztrátum C H kötését támadja. A termékek (hidroxilezett szubsztrátum, szén-dioxid és karbonsav) a ciklus zárásaként elhagyják az aktív helyet. Az előbbi átmeneti állapotok közül többnek a röntgenszerkezete is ismert. A fenti mechanizmussal írható le többek között az alábbi enzimek működése, a nukleinsavak metabolizmusát katalizáló timin hidroxiláz (TH) (9) [72]; a taurin dioxigenáz (taud) (10), amelynek a szulfit metabolizmusban van szerepe [73]; a prolil 4-hidroxiláz (P4H) (11), amely a kollagént stabilizáló 4-hidroxi-prolint állítja elő [74]; a 4-hidroxi-fenil-piruvát dioxigenáz (4HPPD) (12), ahol maga a kofaktor a szubsztrátum is egyben [75]. A fenti kiragadott példákból látható, hogy ezen enzimek igen fontos szerepet játszanak az élő 18
Irodalmi áttekintés szervezetek anyagcsere folyamatainak szabályozásában. em csoda, hogy számos réz- és vastartalmú modell született működésük jobb megértésére, illetve hasonló, gyakorlati szempontból fontos reakciók katalizálására [76-80]. H H TH H H H TH H H CH TH H H C 2 H (9) H 2 S 3 H taud H 2 H S 3 H H 2 + H 2 S 3 (10) H R R' P4H R R' (11) H H H 4HPPD H H (12) 2.7.1. 1-Amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidáz (ACC) enzim és modellreakciói Az etilén növényi hormon, a gyümölcsök érését gyorsítja, és a növények virágzására hat, a magvak csírázását és a hagymák, gumók kihajtását befolyásolja. Az etilént a kertészetben és a gyümölcstermesztésben is felhasználják hormonhatása miatt, mivel a zölden szedett gyümölcsöknek (például a banánnak) segíti az utóérését, és időzíthető vele egyes dísznövények virágzása (bizonyos határok között). A növényekben az etilén bioszintézisének utolsó lépése az 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav (acch) átalakítása, melyet az ACC oxidáz enzim katalizál (13) [81-84]. C 2 - H 3 + ACC + HC + C 2 + 2H 2 (13) 2 H + + 2 e - A Petunia hybrida-ból izolált enzim (ACC) szerkezetét a 12. ábra szemlélteti. Röntgendiffrakciós mérések alapján megállapították, hogy a központi fémionhoz 2 hisztidin 19
Irodalmi áttekintés (His177, His234) és egy aszparaginsav (Asp179), (2, ) koordinálódik egyfogú ligandumként [85]. Fe 12. ábra ACC oxidáz enzim szerkezete [85] Az ACC oxidáz enzim eltérően a többi KGD proteintől, működéséhez nem 2- oxoglutarát, hanem aszkorbát koszubsztrát szükséges, emellett a szén-dioxid (vagy bikarbonát), mint aktivátor játszik szerepet az etilén szintézise során. Mágneses cirkuláris dikroizmus (MCD) vizsgálatokkal alátámasztották, hogy az enzim aktív centrumában jelenlévő vas(ii)ion alapállapotban hatos koordinációjú, hasonlóan a többi, ebbe a csoportba tartozó enzimhez. A szubsztrátum koordinációját tekintve szintén eltérés tapasztalható a többi KGD enzimtől. Míg utóbbi esetben az α-ketosav jobban kötődik a központi fémionhoz, mint az átalakítandó szubsztrátum, addig az ACC enzim esetében az szubsztrátum (acch) mind az amino-, mind pedig a karboxilát-csoportján keresztül közvetlenül koordinálódik a központi vas(ii)ionhoz. A szubsztrátum és a koszubsztrát hozzáadását követően az aktív helyen ötös koordináció alakul ki, amely elősegíti a dioxigén megkötődését és aktiválását. Ezen eredmények összhangban vannak a korábban elvégzett ún. steady-state kinetikai mérésekkel, ahol bebizonyították, hogy a szubsztrátum a dioxigén előtt koordinálódik a központi fémionhoz. Az azonban még nem tisztázott, hogy a koszubsztrát az acch előtt vagy a dioxigén után kordinálódik a vas(ii)ionhoz [82, 86-94]. 2006-ban Klinman és munkatársai 3 nyíltláncú, valamint 4 gyűrűs aminosavval végeztek mechanizmus vizsgálatokat. Megállapították, hogy a gyűrűs származékok esetében etilén keletkezett, az alifás aminosavak esetében pedig dekarboxileződés játszódott le. A kinetikai vizsgálatok eredményeit a 6. táblázatban foglaltuk össze. Az adatokból jól látható, 20
Irodalmi áttekintés hogy nincs egyértelmű összefüggés a szubsztrátumok szerkezete, kötésfelhasadási energiái és a reakció sebessége között (k kat ). Ebből arra lehet következtetni, hogy a sebességmeghatározó lépés a szubsztrátum aktiválását megelőzően történik, melynek során egy oxovas(iv) részecske alakul ki. A reakciók feltételezett mechanizmusát a 13. ábra szemlélteti [95]. 6. táblázat ACC oxidáz enzim kinetikai vizsgálatának eredményei (BDE: kötésfelhasadási energia) Szubsztrátum k kat (s -1 ) K M (µm) BDE (kcal/kmol) acch 36,4±1,4 0,099±0,018 97,4 -MeaccH 12,2±0,5 0,107±0,021 91,4 acc-h 2 acc-me aibh D-alanin glicin 11,3±0,6 27,3±1,7 22,1±1,6 29,8±0,9 9,5±0,6 0,214±0,047 2,76±0,55 0,92±0,29 4,42±0,49 1,0±0,4 87,1 97,3 100,0 98,8 99,0 C C H H E - Fe(II) C C H H E - Fe(III) - 2 C R C 1 H 2 R 2 2-2 C R C 1 H 2 R 2 1 C C E - Fe(III) H - 2 C R C 1 H R 2 4 R 1, R 2 = C 2 R 1, R 2 = CH 3 C C E - Fe(III) C C H E - Fe(III) H - 2 C H H C R 1 R 2 C C H C C - 2 C R - 2 C E - Fe(III) C 1 R E - Fe(IV) C 1 H 2 R 2 H 2 2 H H 2 R 2 2 3 Asc DHAsc C C - 2 C R E - Fe(II) C 1 H 2 H R 2 2 5 13. ábra ACC enzim feltételezett működési mechanizmusa (Asc: aszkorbát; DHAsc: dehidro-aszkorbát) 21
Irodalmi áttekintés Első lépésként a szubsztrátum kétfogú ligandumként való koordinációja történik meg öttagú kelátgyűrű képződése közben. Ezt követően aszkorbát jelenlétében a dioxigén koordinálódik a központi fémionhoz (1). A vas(iii)hoz kapcsolódó szuperoxo-ligandum ezután már képes az aszkorbát szomszédos szénatomját támadni (2), a sebességmeghatározó lépésben oxovas(iv) intermedier kialakulását eredményezve (3), amely közvetlenül felelős a szubsztrátum aktiválásáért, melynek során egyelektronos oxidáción keresztül iminoil-gyök keletkezik (4). Aszkorbát felesleg esetén az oxovas(iv) intermedier reakciója a szubsztátummal és az aszkorbáttal kompetitív (egymással versengő) reakciót eredményez, amelynek során a kiindulási Fe(II)-komplex és víz keletkezik (5) [95]. Az irodalomban csupán néhány példa található réz-, vas-, mangán- és kobalttartalmú enzim-szubsztrát komplexekre, amelyek oxidációja etilént eredményez, katalitikusan működő rendszer azonban ezidáig nem ismert [96-98]. Simaan és munkatársai a 14. ábrán látható ligandumokkal és szubsztrátumokkal réz(i)-, réz(ii)- és vas(iii)tartalmú (ES) komplexeket állítottak elő, és vizsgálták reakciójukat hidrogén-peroxid oxidálószerrel. Azt tapasztalták, hogy minden esetben az enzimatikus útnak megfelelő termékek keletkeznek, tehát ezen komplexek funkcionálisan jól modellezik az ACC oxidáz enzimet. A vizsgálatok során megállapították, hogy bázis (ah) hozzáadásával lényegesen növelhető a képződő etilén mennyisége. Ezt azzal magyarázták, hogy bázis hatására a hidrogén-peroxid deprotonálódik, melynek következtében reaktív fém-peroxo komplex alakul ki [99-102]. pa bpy phen tacn H Ligandumok: H 2 H H aibh acch Szubsztrátumok: H 2 H 14. ábra ACC oxidáz modellek előállításánál használt ligandumok és szubsztrátumok (pa: 2-pikolil-amin; tacn: 1,4,7-triaza-ciklononán; aibh: 2-amino-izovajsav) H 2 H 2.8. Pirokatechin oxidáz (P) enzim és modellreakciói A pirokatechin oxidáz az oxidoreduktázok csoportjába tartozó kétmagvú rézcentrummal rendelkező metalloenzim, amely a pirokatechinek (o-difenolok) oxidatív 22
Irodalmi áttekintés dehidrogénezését katalizálja o-kinonná, melléktermékként vizet, vagy hidrogén-peroxidot szolgáltatva (14) [103]. H H 2 pirokatechin oxidáz + H 2 (H 2 2 ) (14) Az enzim növényi szövetekben, rovarokban valamint egyes rákfélékben egyaránt kimutatható. A pirokatechin oxidázt 1937-es első elkülönítése óta számos növényből és gyümölcsből (burgonya, spenót, alma, szőlő, licsi) sikerült kinyerni [104,105], de az enzim röntgendiffrakciós szerkezete csak pár évvel ezelőtt vált ismertté [106]. Az aktív centrumban lévő rézion szerkezete, spektroszkópiai sajátságai alapján három jellegzetes formát különböztethetünk meg: az enzim alapállapotához tartozó ún. met-formát, valamint az oxidált (oxi-) és redukált (deoxi-) formát (16. ábra). Az édesburgonyából (Ipomoea batatas) elkülönített enzimről megállapították, hogy monomer szerkezetű, molekulatömege 39 kda, ellipszoid alakú, és mérete hozzávetőlegesen 55 45 45 Å. A fehérje másodlagos szerkezetét hat α-hélix építi fel, amelyek által kialakított üregben, melyet két diszulfid-híd (Cis11 Cis28 és Cis27 Cis89) kapcsol össze a nitrogénben gazdag -terminális résszel, helyezkedik el az aktív centrum (15. ábra). Az aktív centrumban található réz(ii)ionok mindegyikéhez három hisztidin kapcsolódik. A Cu(A)ion a His88, His109 és a His118 imidazolos nitrogénatomjaihoz koordinálódik, a Cu(B)ion pedig a 15. ábra Az Ipomoea batatas-ból elkülönített pirokatechin oxidáz szerkezete [106] 23
Irodalmi áttekintés His240, His244 és a His274 aminosavakkal létesít koordinatív kötést. Az egymástól 2,9 Å távolságra lévő réz(ii)ionok hidroxo-hídon keresztül kapcsolódnak, trigonális bipiramisos geometriát kialakítva, ahol az apikális pozicióban a His109 és a His240 foglal helyet (15.ábra) [106]. Az enzimről nyert információk birtokában az enzim hatásmechanizmusa a fentiekben említett határformákon keresztül a 16. ábra alapján írható le. Az enzimfolyamat sztöchiometriáját tekintve elmondható, hogy az enzim egy molja két mol szubsztrátumot oxidál és ehhez egy mol dioxigént használ fel. A szubsztrátum oxidációja tehát kétféle módon valósul meg, egyik esetben anaerob, míg a másik esetben aerob körülmények között. A pirokatechin oxidáz enzim működésének megismerésére és megértésére irányuló tudományos közlemények számos szerkezeti és funkcionális modellt tartalmaznak. Ezen modellek többnyire egy- vagy kétmagvú rézkomplexekre épülnek, melyeket a legváltozatosabb tulajdonságokkal rendelkező ligandumok felhasználásával állítottak elő. Az enzim ismertetése során felvázolt három állapot közül a legtöbb tanulmány a met-formára (17. ábra) született. 3H + + H 2 His His His Cu II H met-forma Cu II His His His H H 2H + His His His Cu II Cu II His His His His His His Cu II H Cu II His His His 2H + H + H H His His His Cu II Cu II oxi-forma His His His 2 His His His Cu I Cu I His His His dezoxi-forma + H 2 16. ábra Pirokatechin oxidáz feltételezett hatásmechanizmusa A modellvegyületek között többnyire kétmagvú rézkomplexekkel találkozhatunk (7. táblázat), melyekben a réz(ii)ionok távolsága a ligandum tervezésével és a hídligandumok (µ- H, µ-r, µ-, µ-rc) helyes megválasztásával tetszés szerint változtatható (18. ábra). 24
Irodalmi áttekintés 17. ábra A met-forma aktív centrumában kialakuló koordinációs övezet H H L 1 L 2 H Br L 3 L 4 Br H H H L 5 L 6 L7 Et 2 Et 2 2 2 Me 2 2 H H H H H H Me 2 2 L 8 L 9 18. ábra Pirokatechin oxidáz modellek előállításánál használt ligandumok 25
Irodalmi áttekintés A pirokatechinek oxidációja során a legnagyobb katalitikus aktivitás abban az esetben volt megfigyelhető, amikor a rézionok távolsága kisebb, mint 5 Å. Ennek hátterében sztérikus okok állnak, nevezetesen a két réz(ii)ionnak olyan távolságban kell lennie egymástól, ami lehetővé teszi a pirokatechin koordinációját (μ-1,2-) és azon keresztüli oxidációját [113]. Ezt a feltételezést támasztja alá az a tapasztalat is, hogy a kétmagvú komplexek többnyire jobb katalitikus sajátságokkal rendelkeznek, mint egymagvú analógjaik [114,115]. Egyes tanulmányokban az oxidáció sebessége és a rézkomplexek redoxpotenciálja között fennálló kapcsolat lehetősége is felmerült, azonban direkt korrelációt egy esetben sem találtak [116]. Ennek egyik lehetséges magyarázata, hogy az enzimfolyamatban a dirézcentrumnak kétféle kritériumnak kell megfelelnie, a szubsztrátum által könnyen redukálhatónak, a dioxigén által pedig könnyen oxidálhatónak kell lennie. Az irodalomban mangántartalmú pirokatechin oxidáz modellre is található példa [117-119], ennek oka, hogy a pirokatechin dioxigenázoknak mangántartalmú képviselőjük is ismeretes. 7. táblázat Pirokatechin oxidáz funkcionális modelljei L Komplex Cu Cu (Å) K M (M) k kat (s -1 ) k kat /K M (M -1 s -1 ) L 1 [Cu 2 (L)(Ac)(H 2 )](Cl 4 ) 2 [107] 3,40 8,6 10-4 2,8 10-3 3,30 L 2 [Cu 2 (L)(Tf)](Tf) 2 [108] 3,70 2,9 10-3 3,3 10-2 11,4 L 3 [Cu 2 (L)(H)](Cl 4 ) 2 [109] 2,96 1,5 10-3 2,4 10-2 16,4 L 4 [Cu 2 (L)(H) 2 ](Cl 4 ) 2. H 2 [110] - 4.9 10-3 2,8 10-2 5,67 L 5 [Cu 2 (L)(H)(H 2 )(EtH)](Cl 4 ) 2 [111] 2,90 2,4 10-4 5,9 10-2 248 L 6 [Cu 2 (L)(Me)(MeH)(Cl 4 )]Cl 4 [111] 2,94 3,1 10-4 1,3 10-3 43 L 7 [Cu 2 (LH 2 )(MeC) 4 ](Cl 4 ) 6. 2H 2 [112] - 2,2 10-3 5,0 10-2 22,7 L 8 [Cu 2 L(Me)(MeH)](Cl 4 ) 2 [110] 4,53 7,9 10-5 6,3 10-5 8,0 L 9 [Cu 2 L(H)(BF 4 ) 2 ](BF 4 ) 2 [110] 3,45 8,9 10-5 7,8 10-1 8741 2.9. Szuperoxid dizmutáz (SD) enzimek és modellreakcióik A szuperoxid dizmutázok (SD) olyan metalloenzimek, amelyek a szervezetben lejátszódó oxidációs reakciók melléktermékeként keletkező szuperoxid gyök-aniont alakítják vízzé és hidrogén-peroxiddá (15) [120]. A szuperoxid gyök-anion önmagában is képes 26
Irodalmi áttekintés diszproporcionálódásra, ennek sebessége azonban nem elegendő ahhoz, hogy a termelődő gyök, károsító hatását megelőzze. A SD enzimek a diffúziós kontroll hatását elérő sebességgel reagálnak a szuperoxid gyök-anionnal, így ezek az enzimek jelentik az elsődleges védelmet a szervezet számára az oxidatív stressz ellen [121]. M (n+1)+ + 2 M n+ + 2 M (n+1)+ + 2 M (n+1)+ 2H + + + H 2 2 (15) 2 2H + 2 + H 2 2 + 2 A SD enzimek a bennük található fém minősége alapján három csoportba sorolhatók: vannak főként prokariótákban előforduló vas- (FeSD) [122,123], főként eukariótákban fellelhető réz/cink- (CuZnSD) [124] és minden élőlényben jelen lévő mangántartalmú (MnSD) [125] képviselőik. A mangánt illetve vasat tartalmazó enzimek szerkezetéről kiderült, hogy nagyon hasonlóak egymáshoz [126], míg a réz/cink szerkezete az előbbiektől jelentős mértékben eltér [127]. A természetes SD enzimek hiányos működését, ennek következtében a szuperoxid gyök-anion kumulálódását számos betegség (pl. rák, gyulladásos betgségek stb.) kiváltó okaként tartják számon [128]. Ennek eredményeképpen az utóbbi évtizedben jelentős érdeklődés irányult mesterséges helyettesítők előállítására és vizsgálatára [129-135]. Annak ellenére, hogy Fe, Mn és Cu/Zn tartalmú modelleket egyaránt előállítottak és teszteltek, in vivo helyettesítőként való alkalmazásra leginkább a MnSD utánzó vegyületek alakalmasak. Ez főként a szabad Mn(II)-ion kisebb toxicitásának köszönhető A helyettesített penta-azaciklusokkal és a salen-ligandumokkal képzett komplexek eljutottak a klinikai tesztekig. [136-139]. 2.10. Vas- és mangántartalmú kataláz enzimek és modellreakcióik Az élő szervezetekben felhalmozódó hidrogén-peroxid bomlási folyamatai a sejtfalra nézve káros, reaktív oxigén szármzékokhoz (szuperoxid, hidroxilgyök stb.) vezethetnek. Ennek kiküszöbölésére az élő szervezetekben ún. kataláz enzimek (19. ábra) szolgálnak, amelyek a hidrogén-peroxid vízzé és dioxigénné történő reakcióját katalizálják (16). Ezen enzimek a vas-, illetve mangántartalmú metalloenzimek csoportjába sorolhatók. 27
Irodalmi áttekintés A kataláz enzimek a szuperoxid dizmutázok mellett a szervezetünk első védelmi vonalát képezik a gyökökkel szemben. emcsak az oxidatív stressz ellen nyújtatnak védelmet, hanem megelőzik/megelőzhetik különféle degeneratív betegségek (pl. rák) kialakulását, valamint a sejtöregedést is [140, 141]. kataláz 2H 2 2 2H 2 + 2 (16) 19. ábra Az emberi kataláz enzim [142] A Fe-kataláz enzimek négy polipeptidláncból épülnek fel, egy tetramer molekulát képezve. Egyetlen lánc több mint 500 aminosavból áll. A tetrameren belül 4 hem található, csakúgy, mint a katalázokkal rokon hemoglobin, citokróm és klorofill molekulákban. A Fekatalázok enzimatikus aktivitásáért a hem felelős, amely egy prosztetikus csoport, a biológiai aktivitást ezen feszített szerkezetnek tulajdonítják. Valamennyi enzim közül a Fe-kataláz enzimek átalakítási aránya (T) a legmagasabb: egy molekula enzim 6 millió molekula hidrogén-peroxidot képes vízzé és dioxigénné bontani egyetlen perc alatt. A hem (20. ábra) egy protoporfirin gyűrűt tartalmaz, közepén egy vasionnal. A protoporfirin gyűrű négy pirrol gyűrűből épül fel melyeket metilén-csoportok kapcsolnak össze. égy metil, két vinil és két propionát oldallánc kapcsolódik a protoporfirin gyűrűhöz, a gyűrű közepén a vas Fe(II) és Fe(III) formában is megtalálható [143]. Arról, hogy a vas(ii)tartalmú komplexek miként bontják a hidrogén-peroxidot, a kutatók már több mint száz éve vitatkoznak, de még mindig nem létezik egységesen elfogadott elmélet. A rengeteg e témával foglalkozó publikáció és a sok elvégzett kísérlet 28
Irodalmi áttekintés ellenére, még az sem tisztázott, hogy a vas milyen oxidációs állapotain keresztül játszódik le a folyamat, illetve hogy gyökös, vagy ionos jellegű reakcióról van e szó (17-20). xigén Szén itrogén Hidrogén Vas 20. ábra A Fe-kataláz enzimekben található hem szerkezete [143] Fe(II)-Fe(IV) átmenet (ionos) [144]: Fe 2+ + H 2 2 Fe 2+ + H 2 2 Fe 2+ + H 2 Fe 2+ + H 2 + 2 (17) Fe(II)-Fe(III) átmenet (gyökös) [145] : Fe 2+ + H 2 2 Fe 2+ +. H Fe 3+ +. H + H 2 Fe 3+ + H 2 (18) Fe(II)-Fe(III)-Fe(V) átmenet (ionos) [146]: H + Fe 2+ + H 2 2 Fe 3+ H Fe 5+ = + H 2 (19) 29
Irodalmi áttekintés Fe(III)-Fe(V) átmenet (ionos) [147]: Fe 3+ + H 2 - [FeH] 2+ [FeH] 2+ H + Fe 3+ Fe 3+ + H 2 2 Fe 3+ + 2 + H 2 (20) A Mn-tartalmú kataláz enzimeket a Thermus thermophilus [148], a Lactobacillus plantarum [149,150] és a Thermoleophilum album [151] baktériumokból izolálták. Ezen enzimek röntgenszerkezete alapján megállapítást nyert, hogy az aktív centrum két egymástól 3,13 Å távolságra lévő mangániont tartalmaznak, melyek karboxiláthídon keresztül kapcsolódnak (21. ábra). 21. ábra A Thermus thermophilus -ból elkülönített kataláz enzim szerkezete [152] A Mn-katalázokban a két mangán-magot először ESR-spektroszkópiával mutatták ki. Ezzel a technikával jellemezték a hármas és négyes oxidációs állapotokat is [153-155]. A meghatározott antiferromágneses csatolási állandók alapján szerkezeti modellekkel összehasonlítva már a röntgenszerkezetek ismerete előtt valószínűsítették, hogy az aktív helyen a mangánionok (µ-h)(µ-karboxilát) híddal vannak összekapcsolva [156]. ESR-rel a Mn (II,II) katalázban található mangánionok antiferromágneses csatolását is sikerült igazolni. EXAFS spektroszkópiával vizsgálva az egyes oxidációs állapotokat a Mn Mn távolság észrevehetően lerövidül 2,7 Å-re a katalitikusan inaktív (III,IV) formában. Ez az alak valószínűleg bisz(µ-oxo)-hidat tartalmaz [157]. A Mn-katalázok fiziológiai aktivitását kizárólag csak a (II,II) és (III,III) oxidációs állapotoknak lehet tulajdonítani. A ping-pong 30
Irodalmi áttekintés ciklusú mechanizmus a két egymásba könnyen átalakítható oxidációs állapotnak köszönhető (22. ábra) [158, 159]. Glu His H Mn III H H Mn III 2 H 2 His Glu His H 2 H Mn II E H A H Mn II B His HH Glu H 2 His H 2 H 2 Mn II H H H Mn II His D C HH Glu H 2 His Mn III H Mn III His H 2 Glu H 2 His Mn II H 2 H H H Mn II His H 2 22. ábra A kétmagvú mangán-katalázok lehetséges mechanizmusa [160] A mangántartalmú katalázokról spektroszkópiai módszerekkel megállapították, hogy az enzimatikus reakció során redukált Mn(II,II), illetve oxidált Mn(III,III) formában vannak jelen. A vegyes oxidatív állapotok az enzimatikus reakcióban nem játszanak szerepet [158]. A reakció első lépésében a szubsztrátum közvetlenül az ún. terminális (szélső) oldali Mn(II)-t támadja meg, leszorítva onnan a vízmolekulát (A B, 22. ábra). Az internális (belső) oldali fehérjerész karboxilát csoportja protonpuffer funkciót tölt be, deprotonálja a H 2 2 -t, majd később átad egy protont, és ezáltal tud víz képződni. A koordinált peroxid terminális helyzetből (B) elfordul, majd a µ-η 2 peroxo-híd képződik (C). A szubsztrátum redukálódik, víz lép ki, és a mangánionok távolsága lecsökken ~3,6 Å-ről 3,1 Å-re (C D). A továbbiakban a µ-oxo-híd protonálásával a híd felhasad és újabb szubsztrátum molekula lép a koordinációs övezetbe (D E). Ezután intramolekulárisan két elektron kerül a dimangán(iii) centrumra a terminálisan koordinált peroxidról, ami dioxigén fejlődéséhez és az enzim redukált formájának visszanyeréséhez vezet (E A). Az enzimatikus reakció spontán lejátszódását biztosító negatív szabadenergia-változás az elektronátadásokat kísérő, azokkal 31
Irodalmi áttekintés csatolt protontranszfer-reakciók kedvező energiamérlegének tudható be. A protonpufferként jelen lévő nem koordinált karboxilát funkció pk a értéke ugyanis az elképzelések szerint a ciklust kísérő töltéseloszlás változások miatt megváltozik a két részfolyamatban (A B C D és D E A) [160]. Egy alternatív mechanizmus egymásba kölcsönösen átalakuló Mn II 2 (µ-h 2 ) és Mn III 2 (µ-) 2 intermedierekre alapozza a katalitikus ciklust [161]. A fenti enzimeknek direkt felhasználása gyógyászati célokra korlátozott, a sejtmembránok alacsony permeabilitása és a nagy molekulatömeg következtében. Az irodalomban számos példa található különféle átmenetifém-tartalmú (Cu, Fe, Mn) komplexekre, amelyeket a kataláz enzimek szerkezeti és/vagy működési modelljeiként vizsgáltak [162-172]. 32
3. EREDMÉYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 3.1. Vas- és mangántartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz modellek A 2.6. fejezetben felvázolt előzmények alapján célkitűzésünk az volt, hogy vas- és mangántartalmú funkcionális modelleket dolgozzunk ki, melyek tanulmányozásával betekintést nyerhetünk mind a szubsztrátum-, mind a dioxigénaktiválás mechanizmusába. A kapott eredmények összevetése a korábban vizsgált réztartalmú enzimmodell rendszerekkel az átmenetifémek enzimekben betöltött szerepére nézve is hasznos információt nyújthatnak. A növényi világban előforduló antioxidáns sajátságokkal rendelkező flavonolok komplexképző (kelátképző) sajátságáról szerzett ismeretek a fenti szempontok mellett mind az élelmiszeriparban, mind a gyógyászatban felhasználhatók, a szervezet számára nélkülözhetetlen nyomelemek (pl. vas, mangán) bevitelének tervezése során. 3.1.1. Szintetikus Fe(III)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése A korábbiakban (2.6. fejezet) ismertetett enzimológiai és modellvizsgálatok alapján valószínűsíthető, hogy a kvercetin oxidatív dekarbonilezési reakciója a szubsztrátum koordinációjával, majd az azt követő aktiválásával indul. A dioxigénezés feltételezések szerint az így kialakuló reaktív komplexen keresztül valósul meg. Ennek bizonyítása céljából vas(iii)tartalmú modellvegyületeket állítottunk elő, egy homoleptikus, [Fe III (4 Mefla) 3 ] és négy vegyesligandumú, [Fe III (4 Rfla)(salen)] (salenh 2 : bisz-szalicilidénetilén-diamin) összetételű komplexet. A [Fe III (-bs)(salen)] modellvegyületet direkt úton is előállítottuk, amelynek spektroszkópiai vizsgálata megkönnyíti, az oxigénezési reakciók termékeiként keletkező [Fe III (-bs)(salen)], és [Fe III (-Mebs) 3 ] komplexek fizikai jellemzését és szerkezeti azonosítását (lásd később 3.1.4.). A modellvegyületeket a (21-24) egyenletek alapján állítottuk elő. Me FeCl 3 + 3 MeH, 3Et 3 Ar H Fe III (4'Mefla) 3 (21) 33
Cl H H + FeCl 3 MeH Ar Fe III (22) salenh 2 Cl R Fe III MeH, Et 3 + 4'RflaH Ar R: H-, Me-, Cl-, Me 2 - Fe III (23) Cl Fe III MeH, Et 3 + -bsh Ar Fe III (24) A termékek összetételét elemanalízissel, szerkezetüket pedig IR és UV-VIS spektroszkópiai módszerek, valamint egykristály röntgendiffrakció segítségével jellemeztük (8. táblázat). A komplexek spektroszkópiai adatait tekintve a következőket emelnénk ki: Az UV-VIS spektrumon a szabad 4 R-flavonolhoz rendelhető abszorpció (340-350 nm) a komplexképződés következtében eltűnt, 407-445 nm-en új abszorpciós sávok jelentek meg. Ezen 60-100 nm körüli batokróm eltolódások a koordinálódott flavonolát ligandumok π- π * töltésátviteli sávjaihoz rendelhetők. A termékekről készült IR spektrum alapján a következő állapítható meg. A szabad flavonolban lévő 4-C= csoport intenzív C sávjának kb. 50 cm -1 értékkel eltolódik, ami a komplexképződés eredményeként létrejött öttagú kelátgyűrű kialakulására utal [173]. A salenh 2 ligandum koordinációját az 1629 és 1045 cm -1 körüli értéknél mejelenő C sáv támasztja alá. A [Fe III (-bs)(salen)] komplexről készült IR felvétel alapján megállapítható, hogy a flavonolra jellemző sáv eltűnt, helyette megjelentek az -benzoil-szalicilsav karboxilcsoportjára jellemző szimmetrikus illetve aszimmetrikus ν C2 rezgések 1600 és 1400 cm -1 körül, továbbá a ν C rezgés 1700 cm -1 körül. A karboxil csoport szimmetrikus és 34
aszimmetrikus rezgései közötti különbség alapján ( C = 159 cm -1 ), az -benzoilszalicilsav kétfogú koordinációja feltételezhető [61]. Az 1000 cm -1, valamint 1600 cm -1 körül lévő sávok a salenh 2 ligandum ν C vegyértékrezgéseihez rendelhetők, utalva annak koordinációjára. Az aromás gyűrű ν aromásch rezgéseihez rendelhető a 3000 cm -1 körül található sáv, ami ugyancsak a salenh 2 ligandum valamint az -bsh koordinációjára is utal. 8. táblázat A [Fe III (4 Mefla) 3 ] és a [Fe III (4 Rfla)(salen)] komplexek fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex IR (cm -1 ) KBr UV-VIS (dmf) p. ( C) Szín [Fe III (4 Mefla) 3 ] C: 1547 aromás CH-ek: 1491, 3065 alifás CH-ek: 2836 (CH 3 ) logε (411 nm) = 4,68 211-214 barna [Fe III (fla)(salen)] C: 1549 C: 1628, 1032 aromás CH-ek: 1491, 3064 logε (407 nm) = 4,25 257-260 barna [Fe III (4 Clfla)(salen)] C: 1547 C: 1627, 1034 aromás CH-ek: 1493, 3060 logε (411 nm) = 4,15 268-270 barna C: 1542 [Fe III (4 Mefla)(salen)] C: 1629, 1027 aromás CH-ek: 1493, 3062 logε (419nm) = 4,11 261-264 barna alifás CH-ek: 2799 (CH 3 ) C: 1542 [Fe III (4 Me 2 fla)(salen)] C: 1630, 1034 aromás CH-ek: 1493, 3056 logε (445 nm) = 4,25 220-222 barna alifás CH-ek: 2931 C: 1628, 1034 [Fe III (-bs)(salen)] C: 1731 C 2 : 1544, 1385 aromás CH-ek: 1492, 3010-243-2245 barna 35
23. ábra A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex röntgenszerkezete A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex dmf-ból éterdiffuzióval történő átkristályosítása után barna kristályokhoz jutottunk, melyek röntgendiffrakciós mérésre alkalmasnak bizonyultak. A komplexről készült röntgenszerkezet a 23. ábrán látható, a hozzá tartozó adatokat a 9. és a 10. táblázat tartalmazza. A szerkezet ismeretében megállapítható, hogy a központi ionhoz három 4 -metoxi-flavonolát ligandum kapcsolódik homoleptikus komplexet képezve. Az egyes ligandumok a vassal stabilis öttagú kelátgyűrűt képeznek, a Fe távolságok különbsége a részleges π- delokalizációval magyarázható. 9. táblázat A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex fontosabb geometriai jellemzői Kötés Kötéshossz (Å) Kötés Kötéshossz (Å) Fe1 2 1,955(7) 3 C8 1,373(13) Fe1 1 2,109(8) 3 C8 1,404(15) 1 C1 1,306(12) C9 C1 1,367(14) 2 C9 1,299(13) C1 C2 1,490(15) 3 C7 1,302(13) 2 Fe1 1 kötésszög 79,4(3)º 36
10. táblázat A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex krisztallográfiai adatai Komplex [Fe III (4 Mefla) 3 ] Összegképlet C 48 H 33 12 Fe Szín barna Molekulatömeg 646,2 g/mol Hőmérséklet 293 (2) K Besugárzási hullámhossz Mo-Ka, λ = 0,71073 Å Kristályrendszer hexagonális Tércsoport P 31c Elemi cella méretei a [Å] 15,4880(5) b [Å] 15,4880(5) c [Å] 19,9970(5) γ ( ) 120,00 Elemi cella térfogata [Å 3 ] 4154,2(2) Z 6 Sűrűség (számított) [Mg/m 3 ] 1,55 Abszorpciós koeff., μ [mm -1 ] 1,10 F(000) 3960 Kristály mérete [mm] 0,3 0,05 0,05 Abszorpciós korrekció nincs Max. és min. transzmisszió - Θ-tartomány [ ] 1,52 22,71 Index tartományok 0 h 16-14 k 0-20 l 21 Gyűjtött reflexiók 2081 Független refl. száma 1820 Végső R [I > 2σ(I)] R 1 = 0,0728; wr 2 = 0,1943 A [Fe III (fla)(salen)] komplex Mössbauer spektroszkópiai vizsgálatát elvégezve a szerkezetre nézve a következő megállapításokat tehetjük (24. ábra). 1. Az izomereltolódás értéke alapján (δ = 0,49 mm/s) megállapíthatjuk, hogy a központi vasion nagyspinszámú (S = 5/2) Fe(III)-ion formájában vesz részt a komplexképzésben. 2. A kvadrupólfelhasadás értéke (ΔE Q = 1,44 mm/s) alapján a vasion körül oktaéderes geometria kialakulása valószínűsíthető. 37
24. ábra A [Fe III (fla)(salen)] komplex Mössbauer spektruma δ = 0,49 mm/s; ΔE Q = 1,44 mm/s 25. ábra A [Fe III (fla)(salen)] komplex röntgenszerkezete A [Fe III (fla)(salen)] komplex CH 2 Cl 2 -os oldatából, éterdiffúziós eljárással sikerült röntgendiffrakciós mérésre alkalmas egykristályt növesztenünk, a komplex röntgenszerkezete 38
a 25. ábrán látható, a hozzá tartozó adatok a 11. és 12. táblázatban találhatóak. A szerkezet alapján megállapítható, hogy a flavonol kétfogú ligandumként stabilis öttagú kelátgyűrűt kialakítva koordinálódik a központi fémionhoz. 11. táblázat A [Fe III (fla)(salen)] komplex fontosabb geometriai jellemzői Kötés Kötéshossz (Å) Kötés Kötéshossz (Å) Fe1 1 1,899(4) Fe1 1_2 2,080(5) Fe1 1_2 1,935(4) 1A Fe1 2 kötésszög: 161,72(16)º Fe1 2 2,139(4) Fe1 3 1,955(4) Fe1 1 2,141(5) 3 Fe1 1 kötésszög: 158,85(19)º 1 Fe1 1_2 kötésszög: 158,29(19)º A [Fe III (-bs)(salen)] komplex esetében is sikerült egykristályt növesztenünk, amely röntgendiffrakciós vizsgálatán keresztül a 26. ábrán látható szerkezethez jutottunk. Az ábra alapján elmondható, hogy az -benzoil-szalicilsav kétfogú ligandumként koordinálódik a központi fémionhoz, ami alátámasztja az IR mérések eredményeit. A szerkezethez tartozó adatokat az 13. és a 14. táblázat tartalmazza. 26. ábra A [Fe III (-bs)(salen)] komplex röntgenszerkezete 39
12. táblázat A [Fe III (fla)(salen)] komplex krisztallográfiai adatai Komplex [Fe III (fla)(salen)] Összegképlet C 31 H 23 Fe 2 5 Szín piros Molekulatömeg 559,4 g/mol Hőmérséklet 293 (2) K Besugárzási hullámhossz Mo-Ka, λ = 0,71075 Å Kristályrendszer triklin Tércsoport P 1 Elemi cella méretei a [Å] 10,505(9) b [Å] 12,060(11) c [Å] 13,489(12) γ ( ) 85,29 (2) Elemi cella térfogata [Å 3 ] 1411(2) Z 2 Sűrűség (számított) [Mg/m 3 ] 1,317 Abszorpciós koeff., μ [cm -1 ] 0,576 F(000) 578 Kristály mérete [mm] 0,68 0,55 0,43 Abszorpciós korrekció nincs Max. és min. transzmisszió - Θ-tartomány [ ] 3,18 22,47 Index tartományok -11 h 11-12 k 12-14 l 14 Gyűjtött reflexiók 12569 Független refl. száma 2536 Végső R [I > 2σ(I)] R 1 = 0,0773; wr 2 = 0,1571 A komplexek szerkezetét tekintve, összességében megállapítható, hogy azok összhangban vannak a spektroszkópiai mérések eredményeivel, a vas körül kialakuló koordinációs övezet mindhárom esetben ([Fe III (4 Mefla) 3 ], [Fe III (fla)(salen)] és [Fe III (bs)(salen)]) leginkább torzult oktaéderes geometriával írható le. 40
13. táblázat A [Fe III (-bs)(salen)] komplex fontosabb geometriai jellemzői Kötés Kötéshossz (Å) Kötés Kötéshossz (Å) Fe1 1 1,897(2) Fe1 2 2,086(3) Fe1 2 1,912(2) 1-Fe1-2 kötésszög: 95,98(10)º Fe1 3 2,156(2) Fe1 4 2,106(2) Fe1 1 2,131(3) 2-Fe1-2 kötésszög: 86,43(11)º 1-Fe1-2 kötésszög: 161,33(12)º 14. táblázat A [Fe III (-bs)(salen)] komplex krisztallográfiai adatai Komplex [Fe III (-bs)(salen)] Összegképlet C 30 H 23 Fe 2 6 Szín fekete Molekulatömeg 563,4 g/mol Hőmérséklet 203 (2) K Besugárzási hullámhossz Mo-Ka, λ = 0,71073 Å Kristályrendszer monoklin Tércsoport P 2/n Elemi cella méretei a [Å] 22,501(3) b [Å] 10,164(1) c [Å] 25,507(4) γ ( ) 90 (2) Elemi cella térfogata [Å 3 ] 5562(13) Z 4 Sűrűség (számított) [Mg/m 3 ] 1,432 Abszorpciós koeff., μ [cm -1 ] 0,592 F(000) 2496 Kristály mérete [mm] 0,40 0,25 0,25 Abszorpciós korrekció nincs Max. és min. transzmisszió - Θ-tartomány [ ] 1,06 28,65 Index tartományok 0 h 30 0 k 13-34 l 32 Gyűjtött reflexiók 13979 Független refl. száma 8858 Végső R [I > 2σ(I)] R 1 = 0,0711; wr 2 = 0,1463 41
3.1.2. Szintetikus Mn(II)-tartalmú modellvegyületek előállítása és jellemzése A mangántartalmú flavonol 2,4-dioxigenáz enzim modellezése céljából piridin (py) ligandum, valamint egyszerű mangán(ii)vegyületek felhasználásával szintetikus enzim szubsztrátum komplexeket állítottunk elő (24, 25), melyek összetételét elemanalízissel, szerkezetüket spektroszkópiai (IR, UV-VIS) mérésekkel és röntgendiffrakcióval (15. táblázat) jellemeztük. Mn II (Cl 4 ) 2 + 2 H MeH, 2Et 3 Ar Mn (24) [Mn II (fla) 2 ] MeH + 2 [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] Ar (25) 15. táblázat A [Mn II (fla) 2 ] és [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplexek fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai Komplex [Mn II (fla) 2 ] [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] Szín zöld zöld p. ( C) 232-235 257-260 IR (cm -1 ) C: 1542 aromás CH-ek: 1491, 3048 C: 1542 aromás CH-ek: 1491, 3070 C:1032 UV-VIS (dmf) lg ε(424) = 4,36 lg ε(433) = 4,14 Az IR spektroszkópiai vizsgálat alapján látható, hogy a flavonol mindkét komplex esetében kelátligandumként kapcsolódik a mangán(ii)ionhoz ( C = 60 cm -1 ). Az a tény, hogy a C értékek megegyeznek, arra utal, hogy az axiális helyzetben koordinálódó piridin 42
ligandumok nem befolyásolják a kelátgyűrűben kialakuló delokalizációs viszonyokat. A 3000 cm -1 fölötti sáv a 2-fenilcsoport aromás C-H rezgéseihez tartozik, a piridilcsoportok koordinációját az 1032 cm -1 -nél jelentkező sáv bizonyítja. A komplexek UV-VIS spektrumán a szabad flavonolra jellemző elnyelés nem látható ~340 nm-nél, helyette 424- és 433 nm-nél találunk új sávokat, amelyek a koordinált flavonolát-ligandum * elektronátmenetéhez rendelhető. A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex metanolból éterdiffúzióval történő átkristályosítása során röntgendiffrakciós mérésre alkalmas kristályokat kaptunk. A röntgendiffrakciós méréshez tartozó krisztallográfiai adatokat a 16. táblázat, a fontosabb kötésszög és kötéstávolság értékeket a 17. táblázat tartalmazza. A komplex röntgenszerkezete a 27. ábrán látható. A mangánion körüli koordinációs övezet oktaéderes geometriával írható le. A mangánion síkjában a két flavonoláto-ligandum oxigénatomjai találhatók (1 és 3, illetve 1_2 és 3_2), axiális pozícióban a két piridin nitrogénatomja helyezkedik el (1 és 1_2). A két flavonol elhelyezkedése teljesen szimmetrikus a mangáncentrumra nézve, ami a kötésszögekből is jól látható (1 Mn1 3, 180 és 2 Mn1 2_2 180 ), a flavonolát ligandumok egymáshoz képest transz-helyzetben vannak. 27. ábra A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex röntgenszerkezete 43
16. táblázat A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex krisztallográfiai adatai Komplex [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] Összegképlet C 40 H 28 Mn 2 6 Szín zöld Molekulatömeg 687,51 Hőmérséklet 293 K Besugárzási hullámhossz Mo-K, = 0.71073 Å Kristályrendszer triklin Tércsoport P1 Elemi cella méretei a [Å] 8,310(6) b [Å] 10,095(6) c [Å] 11,167(5) ( ) 113,361(4) ( ) 97,542(4) ( ) 106,255(4) Elemi cella térfogata [Å 3 ] 1109,3 Z 2 Sűrűség (számított) [Mg/m 3 ] 1,438 Abszorpciós koeff., [mm -1 ] 0,470 F(000) 355 Kristály mérete [mm] 0,12 0,30 0,50 Abszorpciós korrekció nincs Θ tartomány [ ] 2,07 26,37 Index tartományok 0 h 10-12 k 12-13 l 13 Gyűjtött reflexiók 2882 Független refl, száma 2667 Végső R [I > 2 (I)] R 1 = 0,0444, wr 2 = 0,1354 17. táblázat A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex fontosabb kötésszögei és kötéstávolságai Atompárok Kötéshossz (Å) Atompárok Kötéshossz (Å) Mn1 2 2,127(9) C2 1 1,236(14) Mn1 3 2,183(8) C9 3 1,257(14) Mn1 1 2,348(9) C1 C2 1,385(14) C1 2 1,374(7) Atomok Kötésszögek ( ) Atomok Kötésszögek ( ) 1 Mn1 3 88,83(10) 2 Mn1 3 76,81(9) 1 Mn1 2 91,17(11) 1 Mn1 2 90,99(10) 1 Mn1 1_2 180,00(12) 3 Mn1 3_2 180,00(11) 2 Mn1 2_2 180,00(11) 2 Mn1 2_2 103,95(12) 44
3.1.3. A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex dioxigénezési reakcióját,-dimetil-formamidban, 80, 85, 90 és 95 C-on végeztük. A reakció végén a termékkomplexet savval bontottuk és a termékek (-benzoil-szalicilsav és annak hidrolizált származékai: benzoesav, szalicilsav) mennyiségét diazometánnal történő kezelés után GC-vel határoztuk meg. A termékek azonosítása GC-MS módszerrel történt. A kapott termékek alapján megállapíthatjuk, hogy a komplex dioxigénezése az enzimatikus útnak megfelelő termékeket eredményezte, tehát a vizsgált reakció a flavonol 2,4-dioxigenáz enzim funkcionális modelljének tekinthető. 28. ábra A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex dioxigénezési reakciójának lefutása [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0 = 2,2 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,56 10-3 M; dmf; T = 90 C A reakció mechanizmusának tisztázása céljából részletes reakciókinetikai méréseket végeztünk. A reakciók időbeli lefutását UV-VIS spektroszkópiás módszerrel, a koordinált flavonolátra jellemző π-π * töltésátviteli sáv időbeli változásán keresztül követtük. A komplex aktuális koncentrációjának számolását a Lambert-Beer-törvény alapján végeztük. A 28. ábra a komplex dioxigénezése során kapott UV-VIS spektrumot szemlélteti. A kinetikai vizsgálatokat dmf oldószerben 90 C-on végeztük. A 29. ábrán egy tipikus oxigénezési görbét láthatunk, amely a komplex aktuális koncentrációjának időbeli változását mutatja. A komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében egyenest ad (30. ábra), ami arra utal, hogy a reakció részrendje a komplexre vonatkozóan egy (R = 99,78 %). 45
29. ábra A Fe III (4 Mefla) 3 koncentrációjának változása az idő függvényében [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0 = 2,2 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,56 10-3 M; dmf; T = 90 C 30. ábra A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0 = 2,2 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,56 10-3 M; dmf; T = 90 C A reakcióra a (26) általános sebességi egyenlet írható fel, melynek értelmében az egyes komponensek részrendjét különböző komplex (18. táblázat, 1-4. mérés), valamint dioxigén koncentrációk (18. táblázat, 1, 5-6. mérés) mellett történő mérésekkel határozhatunk meg. -d[fe]/dt = k [Fe] m [ 2 ] n (26) A (26) általános egyenlet állandó dioxigén koncentráció esetén a következő formára egyszerűsödik (27, 28). k = k [ 2 ] n [ 2 ] = állandó (27) 46
-d[fe]/dt = k [Fe] m (28) A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex részrendjének megállapítása céljából a (27, 28) egyenletek szerint ábrázoltuk a reakció kezdeti sebességét a komplex kiindulási koncentrációinak függvényében (31. ábra), amely eredményeként megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,94 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (m = 1). 31. ábra A reakciósebesség változása a kiindulási komplexkoncentráció függvényében [ 2 ] 0 = 1,56 10-3 M; dmf; T = 90 C Hasonló módszerrel állapítottuk meg, hogy a reakció első rend szerint függ a dioxigén koncentrációjától. A (26) általános egyenlet állandó komplex koncentráció esetén a következő (29, 30) formában írható fel: k = k [Fe] m [Fe] = állandó (29) -d[fe]/dt = k [ 2 ] n (30) A 32. ábrán látható, hogy az összefüggés lineárisnak adódott (R = 99,87 %), ami annyit jelent, hogy a dioxigén részrendje a sebességi egyenletben egy (n = 1). A kinetikai vizsgálatok alapján a (31) bimolekulás sebességi egyenlet írható fel. -d[fe III (4 Mefla) 3 ]/dt = k [Fe III 4 Mefla) 3 ] [ 2 ] (31) 47
32. ábra A reakciósebesség változása a dioxigénkoncentráció függvényében [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0 = 2,2 10-4 M; dmf; T = 90 C 33. ábra A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius-diagramja [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0 = 2,2 10-4 M; dmf 34. ábra A [Fe III (4,Mefla) 3 ] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring-diagramja [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0 = 2,2 10-4 M; dmf 48
18. táblázat A [Fe III (4 Mefla) 3 ] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai Mérés száma T ( C) [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0 (10-4 M) [ 2 ] 0 (10-3 M) -d[fe]/dt (10-7 Ms -1 ) k (M -1 s -1 ) 1 90 2,20 1,56 1,28 0,37±0,019 2 90 1,70 1,56 1,05 0,39±0,018 3 90 0,90 1,56 0,54 0,39±0,017 4 90 0,70 1,56 0,43 0,39±0,019 5 90 2,20 3,72 3,33 0,40±0,021 6 90 2,20 7,44 6,28 0,38±0,020 7 80 2,20 1,45 1,11 0,25±0,011 8 85 2,20 1,56 1,23 0,28±0,013 9 95 2,20 1,61 1,38 0,44±0,021 Különböző hőmérsékleten meghatározva (18. táblázat, 1, 7-9. mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (33, 34. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. E A = 2,303 R d lgk d(t -1 ) (32) H = 2,303 R d lg(kt-1 ) d(t -1 ) (33) S = 4,573 lg(kt -1 ) 49,17 + E A T -1 (34) G = H T S (35) Az aktiválási paraméterek 90 C-ra a következők: E A = 43 kj mol -1 ΔH = 40 kj mol -1 ΔS = -144 J mol -1 K -1 ΔG = 92 kj mol -1 A számolt értékek alapján megállapítható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS negatív értéke asszociatív mechanizmusú, bimolekulás reakcióra utal. ) nagy 49
3.1.4. A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakcióit,-dimetil-formamidban 90, 95, 100 és 105 C-on végeztük. A termékelegy összetételének meghatározása a 3.1.3. fejezetben leírtak szerint történt. Ennek eredményeként kijelenthetjük, hogy ebben az esetben is az enzimatikus útnak megfelelő (-benzoil-szaliciláto)-vas(iii)komplex keletkezett. A reakció mechanizmusának meghatározása céljából itt is részletes reakciókinetikai méréseket végeztünk. Az egyes reaktánsok részrendjének meghatározása céljából a reakciók vizsgálata különböző komplex- (20. táblázat, 1-4. mérés) és dioxigén-koncentrációknál (20. táblázat, 2, 5-6. mérés) történt. A sebességi egyenlet felírása a (26-31) egyenletekkel megegyező módon történt. A 35. ábrán a komplex aktuális koncentrációjának logaritmusát ábrázoltuk az idő függvényében. Látható, hogy a logaritmizált értékekre jó regressziójú egyenes illeszthető (R = 99,64 %), ami a komplex egyes részrendjére utal. A reakciósebességi értékeket a kiindulási komplex-koncentráció függvényében ábrázolva megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,40 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (36. ábra). A 37. ábra ahol a kezdeti reakciósebességi értékek szerepelnek a dioxigén koncentráció függvényében a dioxigén egyes részrendjét támasztja alá (R = 99,90 %). 35. ábra A [Fe III (fla)(salen)] koncentráció logaritmusának változása az idő függvényében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 2,50 10-4 ; [ 2 ] 0 = 1,64 10-3 M; dmf; T = 100 C 50
36. ábra A kezdeti reakciósebesség változása a komplex koncentráció függvényében [ 2 ] 0 = 1,64 10-3 M; dmf; T = 100 C 37. ábra Az oxigénezési reakció kezdeti sebessége az 2 koncentrációjának függvényében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; dmf; T = 100 C A kinetikai vizsgálatok alapján a [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciója a (31) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le, ahol mind a komplex, mind a dioxigén részrendje egy. -d[fe III (fla)(salen)]/dt = k [Fe III (fla)(salen)] [ 2 ] (36) Különböző hőmérsékleten meghatározva (20. táblázat, 2, 7-9.mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (38, 39. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. Az aktiválási paraméterek 100 C-ra a következők: 51
E A = 79 kj mol -1 ΔH = 76 kj mol -1 ΔS = -94 J mol -1 K -1 ΔG = 111 kj mol -1 A számolt értékek alapján elmondható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS negatív értéke asszociatív mechanizmusú, bimolekulás reakcióra utal. ) nagy 38. ábra A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius-diagramja [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; dmf 39. ábra A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring-diagramja [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; dmf A különböző flavonol származékokat tartalmazó komplexekkel elvégezve a dioxigénezési reakciót, a log (k A R / k A H )-t (ahol R = 4 helyen lévő szubsztituens) ábrázolva a szubsztituens állandók (σ) függvényében egyenest kaptunk (40. ábra), melynek meredekségéből a (37) Hammett egyenlet reakcióállandójának értéke -0,54-nek adódott (19. táblázat). dlog k A R / k A H = ρ σ (37) 52
Az a tény, hogy a Hammett-összefüggés lineáris azt mutatja, hogy a sebesség meghatározó lépés érzékeny a 2-es szénatom elektronsűrűségét befolyásoló tényezőkre. A σ állandó negatív előjele pedig arra utal, hogy elektrondonor szubsztituensek a központi fém redoxpotenciálját a negatívabb irányba eltolva megkönnyítik a dioxigén aktiválását, ezáltal növelik a reakció sebességét. Ezen folyamat a vas(ii)ion és a dioxigén közötti intermolekuláris elektronátmenettel értelmezhető. 19. táblázat A flavonol származékok szubsztituens állandói és a [Fe III (4 Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakcióinak sebességi állandói R (4 RflaH) Me 2 - Me- σ [174] -0,83-0,27 k A (10-2 M -1 s -1 ) 6,10 2,80 H- 0,00 2,07 Cl- 0,23 1,36 40. ábra A [Fe III (4 Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakciójának Hammett-diagramja [Fe III (4 Rfla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,64 10-3 M; dmf; T = 100 C Az elvégzett kísérletek eredményeként valószínűsíthető, hogy a [Fe III (4 Mefla) 3 ] és a [Fe III (4 Rfla)(salen)] komplexek dioxigénnel való reakciója amely a (38) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le azonos mechanizmus szerint játszódik le. -d[fe] / dt = k[fe][ 2 ] (38) 53
20. táblázat A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai Mérés T [Fe III (fla)(salen)] [ 2 ] -d[fe]/dt k száma ( C) (10-4 M) (10-3 M) (10-9 Ms -1 ) (10-2 M -1 s -1 ) 1 100 1,07 1,64 3,08 1,75±0,11 2 100 1,93 1,64 6,55 2,07±0,12 3 100 2,50 1,64 8,40 2,05±0,14 4 100 3,00 1,64 11,10 2,25±0,12 5 100 1,93 3,91 15,60 2,10±0,15 6 100 1,93 7,81 32,80 2,18±0,17 7 90 1,93 1,56 2,91 0,96±0,05 8 95 1,93 1,61 4,51 1,45±0,09 9 105 1,93 1,65 8,71 2,73±0,15 A vas(iii)komplexek esetében feltételezhető, hogy az oldatban a [Fe III (fla)(salen)] ([Fe III (4 Mefla) 3 ]) komplex egyensúlyban van egy (flavonoxi)vas(ii)vegyülettel. Ez az egyensúly, amely feltételezésünk szerint az alsó nyíl irányába tolódik el, intramolekulás elektronátmenettel írható le. A következő ún. sebesség-meghatározó lépésben a vas(ii)ion reagál a molekuláris oxigénnel és egy (szuperoxo)vas(iii)komplex képződik, amely trioxametallociklussá, majd a 4-es C-atomon bekövetkező nukleofil addíciós lépésben, endoperoxid szerkezetté rendeződik át. Ezt a lépést követi a heterociklusos gyűrű felhasadása és a szénmonoxid kilépése mellett kialakul a termék (-benzoil-szalicilát), továbbra is a központi 54
fémhez ligandumként kapcsolódva. A vas(iii)komplexek oxigénezésére javasolt mechanizmust a (39) egyenlet írja le. A komplexek dioxigénnel való reakcióját 18 2 -vel is elvégeztük. A reakciók eredményeként [Fe III ( 18 -Mebs) 3 ] és [Fe III ( 18 -bs)(salen)] komplexekhez jutottunk, melyek azonosítása az infravörös spektrumuk alapján történt. [Fe III ( 18 -Mebs) 3 ] IR (KBr): ν (C= 16 ) = 1734 cm -1 ν (C= 18 ) = 1714 cm -1 ν (C 16 ) = 1547, 1380 cm -1 ν (C 18 ) = 1514, 1364 cm -1 [Fe III ( 18 -bs)(salen)] IR (KBr): ν (C= 16 ) = 1736 cm -1 ν (C= 18 ) = 1711 cm -1 ν (C 16 ) = 1550, 1378 cm -1 ν (C 18 ) = 1512, 1363 cm -1 A termékek elhidrolizálása és diazo-metánnal történő kezelése után kapott reakcióelegyet tömegspektrométerrel összekötött gázkromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá, amely alapján kimutatható volt az 18 -benzoil szalicilsav metilésztere. m/e: 260(M +, 0,4); 229(0,11); 227(0,17); 225(1,0); 107(25); 105(100) Az 18 -benzoil szalicilsav metilészteréhez rendelhető molekulacsúcs (m/e: 260 (256 +4); C 15 H 12 2 ) alapján elmondható, hogy a dioxigén mindkét atomja beépült a komplexbe. Mivel a gázelegyben jelzett C nincs, ez azt jelenti, hogy a 3-C hasad ki, a C-ban lévő oxigén a flavonolból származik. A korábbi fejezetekben ismertetett modellvegyületek szerkezetének ismeretében megállapíthatjuk, hogy azok a szubsztrátum koordinációjának tekintetében lényegesen eltérnek az enzimológiai vizsgálatoknál tapasztaltaktól. A szubsztrátum az enzim aktív centrumában egyfogú, modellvegyületeink esetében pedig kétfogú ligandumként koordinálódik a központi fémionhoz stabilis öttagú kelátgyűrűt kialakítva, melynek következtében komplexeink viszonylag inertek dioxigénnel szemben (csak erélyes körülmények között játszódnak le a reakciók). Ennek magyarázata abban rejlik, hogy az enzim aktív centrumában fellépő van der Waals-kölcsönhatások és hidrogénkötések gátat szabnak az energetikailag stabilis, öttagú kelátgyűrű kialakulásának. Az ilyen módon kötött szubsztrátum lényegesen reaktívabb dioxigénnel szemben, mint a kelátban stabilizált forma. 55
Szintetikus modelljeink esetében a geometria tervezésével, az öttagú kelátgyűrűben kialakuló delokalizációs viszonyokat befolyásolhatjuk, de a szubsztrátum koordinációjának módját ( egyfogú/kétfogú) nem. H H K + C K + K + K + H acetát fenil-acetát difenil-acetát trifenil-acetát 41. ábra A dioxigénezési reakciókhoz használt karboxilát koligandumok Ph Ph Fe III +RC 2 Fe III R = Ph 3 C - ; Ph 2 CH - ; PhCH 2 - ; CH 3-42. ábra A flavonol koordinációs módjának megváltozása trifenil-acetát koligandum jelenlétében A 4 R szubsztituensek elektronikus hatásának reakciósebességre gyakorolt hatása mellett (40. ábra) vizsgáltuk, hogy különböző a 41. ábrán látható karboxilát koligandumok sztérikus hatása miként befolyásolja a [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakcióját (43. ábra). Az ábrán jól látható, hogy elektronküldő szubsztituens jelenlétében a reakció sebessége 2,5-szeresére növelhető, míg trifenil-acetát koligandum esetében ez az érték 171-szeres. Feltételezésünk szerint, a jelentős reaktivitás növekedés a flavonol koordinációs módjának megváltozásával magyarázható (42. ábra). Karboxilát koligandumok jelenlétében a dioxigénezési reakciókat,-dimetilformamid oldószerben, 35, 40, 45 és 50 C-on végeztük. A reakciók időbeli lefutását UV-VIS spektroszkópiás módszerrel, a koordinált flavonolátra jellemző π-π * töltésátviteli sáv időbeli változásán keresztül követtük. A komplex aktuális koncentrációjának számolását a Lambert- Beer-törvény alapján végeztük. A termékelegy összetételének meghatározása a 3.1.3. fejezetben leírtak szerint történt. 56 R
43. ábra 4 R szubsztituensek elektronikus és karboxilát koligandumok sztérikus hatása a [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójára [Fe III (4 Rfla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [RCK] = 1,93 10-3 M; [ 2 ] 0 = 1,64 10-3 M; dmf; T = 100 C A részletes kinetikai vizsgálatokat dmf oldószerben 40 C-on trifenil-acetát koligandum jelenlétében végeztük. A 44. ábrán egy tipikus dioxigénezési görbét láthatunk, amely a komplex aktuális koncentrációjának időbeli változását mutatja. A komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében egyenest ad (45. ábra), ami arra utal, hogy a reakció részrendje a komplexre vonatkozóan egy (R = 95,78 %). 44. ábra A [Fe III (fla)(salen)] koncentrációjának változása az idő függvényében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [Ph 3 CK] = 1,93 10-3 M; [ 2 ] 0 = 1,13 10-3 M; dmf; T = 40 C 57
45. ábra A [Fe III (fla)(salen)] komplex aktuális koncentrációjának logaritmusa az idő függvényében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [Ph 3 CK] 0 = 1,93 10-3 M; [ 2 ] 0 = 1,13 10-3 M; dmf; T = 40 C A reakcióra a (40) általános sebességi egyenlet írható fel, melynek értelmében az egyes komponensek részrendjét különböző komplex (22. táblázat, 2-5. mérés), valamint dioxigén koncentrációk (22. táblázat, 3, 11-12. mérés) mellett történő mérésekkel határozhatunk meg. -d[fe]/dt = k [Fe] m [ 2 ] n [karboxilát] o (40) A (40) általános egyenlet állandó dioxigén és koligandum koncentráció esetén a következő formára egyszerűsödik (41, 42). k = k [ 2 ] n [karboxilát] o [ 2 ] = állandó; [karboxilát] = állandó (41) -d[fe]/dt = k [Fe] m (42) A [Fe III (fla)(salen)] komplex részrendjének megállapítása céljából a (41, 42) egyenletek szerint ábrázoltuk a reakció kezdeti sebességét a komplex kiindulási koncentrációinak függvényében (46. ábra), amely eredményeként megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,66 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (m = 1). Hasonló módszerrel állapítottuk meg, hogy a reakció első rend szerint függ a dioxigén koncentrációjától. A (40) általános egyenlet állandó komplex és koligandum koncentráció esetén a következő (43, 44) formában írható fel: 58
k = k [Fe] m [karboxilát] n [Fe] = állandó; [karboxilát] = állandó (43) -d[fe]/dt = k [ 2 ] n (44) A. 47. ábrán látható, hogy az összefüggés lineárisnak adódott (R = 99,40 %), ami annyit jelent, hogy a dioxigén részrendje a sebességi egyenletben egy (n = 1). 46. ábra A reakciósebesség változása a kiindulási komplexkoncentráció függvényében [ 2 ] 0 = 1,13 10-3 M; [Ph 3 CK] 0 = 1,93 10-3 M; dmf; T = 40 C 47. ábra A reakciósebesség változása a dioxigénkoncentráció függvényében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [Ph 3 CK] 0 = 1,93 10-3 M; dmf; T = 40 C 59
Vizsgáltuk, hogy a reakció sebessége hogyan függ a trifenil-acetát koligandum koncentrációjától (22. táblázat, 3, 6-10. mérés). A (40) általános egyenlet állandó komplex és dioxigén koncentráció esetén a következő (25, 46) formában írható fel: k = k [Fe] m [ 2 ] n [Fe] = állandó; [ 2 ] = állandó (45) -d[fe]/dt = k [karboxilát] o (46) A 48. ábrán látható, hogy az összefüggés lineárisnak adódott (R = 96,50 %), ami annyit jelent, hogy a koligandum részrendje a sebességi egyenletben egy (o = 1). A kinetikai vizsgálatok alapján a (47) sebességi egyenlet írható fel. -d[fe III (fla)(salen)]/dt = k [Fe III (fla)(salen)] [ 2 ] [karboxilát] (47) 48. ábra A reakciósebesség változása a karboxilát koncentráció függvényében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,13 10-3 M; dmf; T = 40 C Különböző hőmérsékleten meghatározva (22. táblázat, 3, 13-15. mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (49, 50. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. Az aktiválási paraméterek 40 C-ra a következők: E A = 37 kj mol -1 ΔH = 35 kj mol -1 ΔS = -120 J mol -1 K -1 ΔG = 73 kj mol -1 60
A számolt értékek alapján megállapítható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS negatív értéke asszociatív mechanizmusú reakcióra utal. ) nagy 49. ábra A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius diagramja trifenil-acetát koligandum jelenlétében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [Ph 3 CK] 0 = 1,93 10-3 M; dmf 50. ábra A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring diagramja trifenil-acetát koligandum jelenlétében [Fe III (fla)(salen)] 0 = 2,2 10-4 M; [Ph 3 CK] 0 = 1,93 10-3 M; dmf A log (k A R / k A H )-t (ahol R = 4 helyen lévő szubsztituens) ábrázolva a szubsztituens állandók (σ) függvényében egyenest kaptunk (51. ábra), melynek meredekségéből a (37) Hammett-egyenlet reakcióállandójának értéke -0,78-nak adódott (21. táblázat). 61
21. táblázat A flavonol származékok szubsztituens állandói és a [Fe III (4 Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai trifenil-acetát jelenlétében R (4 RflaH) Me 2 - Me- σ [174] -0,83-0,27 k A (10 2 M -1 s -1 ) 19,09 6,48 H- 0,00 5,23 Cl- 0,23 2,61 51. ábra A [Fe III (4 Rfla)(salen)] komplexek dioxigénezési reakciójának Hammett-diagramja trifenil-acetát koligandum jelenlétében [Fe III (4 Rfla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,13 10-3 M; [Ph 3 CK] = 1,93 10-3 M; dmf, T = 40 C Az elvégzett kísérletek eredményeként valószínűsíthető, hogy karboxilát koligandumok jelenlétében a [Fe III (4 Rfla)(salen)] komplexek dioxigénnel való reakciója a (47) sebességi egyenlettel írható le. Feltehetően a fém oxidációfoka a reakció során nem változik, első lépésként a szubsztrátumról (flavonol) elektron lép át az oxigénre, szuperoxid gyök-aniont és flavonoxil gyököt eredményezve. Az alapvető különbség tehát a koligandumot nem tartalmazó rendszer mechanizmusához képest az, hogy míg abban az estben a szubsztrátum, addig ebben az estben a dioxigén aktiválása a kulcs lépés. A szuperoxid jelenlétét UV-VIS spektroszkópiával, BT (nitroblue-tetrazolium) hozzáadásával sikerült igazolnunk (53. ábra). A folyamat során a fém bázikus karaktere dominál, ezért ezen rendszereket ún. báziskatalizált, nem redoxaktív fémtartalmú rendszereknek nevezzük. A 52. ábra a [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési 62
reakcióinak mechanizmusát szemlélteti koligandum nélkül (A) és koligandum jelenlétében (B). 22. táblázat A [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai trifenilacetát koligandum jelenlétében Mérés száma T ( C) [Fe III (fla)(salen)] 0 (10-4 M) [ 2 ] 0 (10-3 M) [Ph 3 CK] (10-3 M) -d[fe]/dt (10-7 Ms -1 ) k (10 2 M -1 s -1 ) 1 40 1,93 1,13-0,0082 0,00004 2 40 1,07 1,13 1,93 1,32 5,67±0,34 3 40 1,93 1,13 1,93 2,12 5,02±0,35 4 40 2,50 1,13 1,93 2,70 5,05±0,31 5 40 3,00 1,13 1,93 3,38 5,17±0,41 6 40 1,93 1,13 0,96 0,74 3,52±0,23 7 40 1,93 1,13 1,35 1,24 4,20±0,30 8 40 1,93 1,13 1,54 1,37 4,08±0,22 9 40 1,93 1,13 2,31 2,90 4,35±0,28 10 40 1,93 1,13 3,86 4,09 4,86±0,33 11 40 1,93 2,69 1,93 4,05 4,05±0,24 12 40 1,93 5,38 1,93 9,75 4,12±0,28 13 35 1,93 1,08 1,93 1,63 4,06±0,32 14 45 1,93 1,23 1,93 3,07 6,71±0,40 15 50 1,93 1,41 1,93 4,13 7,86±0,51 A komplexek dioxigénnel való reakcióját 18 2 -vel is elvégeztük. A reakciók eredményeként [Fe III ( 18 -bs)(salen)] komplexekhez jutottunk, amelynek azonosítása az infravörös spektrum alapján történt. [Fe III ( 18 -bs)(salen)] IR (KBr): ν (C= 16 ) = 1732 cm -1 ν (C= 18 ) = 1708 cm -1 ν (C 16 ) = 1548, 1375 cm -1 ν (C 18 ) = 1515, 1368 cm -1 A termékek elhidrolizálása és diazo-metánnal történő kezelése után kapott reakcióelegyet tömegspektrométerrel összekötött gázkromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá, amely alapján kimutatható volt az 18 -benzoil szalicilsav metilésztere. 63
m/e: 260(M +, 0,4); 229(0,11); 227(0,17); 225(1,0); 107(25); 105(100) Az 18 -benzoil szalicilsav metilészteréhez rendelhető molekulacsúcs (m/e: 260 (256 +4); C 15 H 12 2 ) alapján elmondható, hogy a dioxigén mindkét atomja beépült a komplexbe. Mivel a gázelegyben jelzett C nincs, ez azt jelenti, hogy a 3-C hasad ki, a C-ban lévő oxigén a flavonolból származik. (A) Ph (B) Ph Fe III K 1 ' +RC 2 Fe III K 1 Ph Fe II R - - 2 + 2 Ph Fe III K 2 ' k lassú -C + 2 Fe III Ph R -C - + 2 Ph k' lassú Fe III R = Ph 3 C - ; Ph 2 CH - ; PhCH 2 - ; CH 3 - R 52. ábra [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának mechanizmusa, koligandum nélkül (A) karboxilát koligandum jelenlétében (B) 64
t (perc) BT + 2.- 53. ábra Folytonos vonal: [Fe III (fla)(salen)] komplex dioxigénezési reakciójának időbeli lefutása trifenil-acetát koligandum jelenlétében [Fe III (4 Rfla)(salen)] 0 = 1,93 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,13 10-3 M; [Ph 3 CK] 0 = 1,93 10-3 M; dmf; T = 40 C; szaggatott vonal: szuperoxid gyök-anion és BT reakciójában képződő diformazán abszorpciós sávja 3.1.5. A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójának vizsgálata A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakcióit dmf oldószerben 100, 105, 110 és 115 C-on végeztük. A termékelegy összetételének meghatározása a 3.1.3. fejezetben leírtak szerint történt. Ennek eredményeként kijelenthetjük, hogy ebben az esetben is az enzimatikus útnak megfelelő (-benzoil-szaliciláto)-mangán(ii)komplex keletkezett. A reakció mechanizmusának tisztázása érdekében indokolt volt részletes reakciókinetikai mérések elvégzése. Az egyes reaktánsok részrendjének meghatározása céljából a reakciók vizsgálata különböző komplex- (23. táblázat, 1-4. mérés) és dioxigénkoncentrációknál (23. táblázat, 3, 5-6. mérés) történt. A sebességi egyenlet felírása a (26-31) egyenletekkel megegyező módon történt. A komplex aktuális koncentrációjának kiszámolását a Lambert-Beer-törvény alapján végeztük. Az 54. ábra a komplex dioxigénezése során kapott UV-VIS spektrumot szemlélteti. A 55. ábrán a komplex aktuális koncentrációjának logaritmusát ábrázoltuk az idő függvényében. Látható, hogy a logaritmizált értékekre jó regressziójú egyenes illeszthető (R = 99,61%), ami a komplex egyes részrendjére utal.a reakciósebességi értékeket a kiindulási komplex-koncentráció függvényében ábrázolva megállapítható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,52 %), tehát a komplex részrendje valóban egy (56. ábra). 65
Az 57. ábra ahol a kezdeti reakciósebességi értékek szerepelnek a dioxigén koncentráció függvényében a dioxigén egyes részrendjét támasztja alá (R = 99,56 %). A kinetikai vizsgálatok alapján a [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakciója a (48) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le, ahol mind a komplex, mind a dioxigén részrendje egy. -d[mn II (fla) 2 (py) 2 ]/dt = k [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] [ 2 ] (48) 54. ábra A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójának lefutása [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0 = 1,50 10-4 ; [ 2 ] 0 = 1,64 10-3 M; dmf; T = 100 C 55. ábra A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] koncentráció logaritmusának változása az idő függvényében [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0 = 1,50 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,64 10-3 M; dmf; T = 100 C 66
56. ábra A kezdeti reakciósebesség változása a komplex koncentráció függvényében [ 2 ] 0 = 1,69 10-3 M; dmf; T = 110 C 57. ábra Az oxigénezési reakció kezdeti sebessége az 2 koncentrációjának függvényében [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0 = 1,50 10-4 M; dmf; T = 110 C Különböző hőmérsékleten meghatározva (23. táblázat, 3, 7-9. mérés) a k (sebességi állandó) értékét az Arrhenius- és az Eyring-összefüggés lineárisnak adódott (58, 59. ábra). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. Az aktiválási paraméterek 110 C-ra a következők: E A = 52 kj mol -1 ΔH = 49 kj mol -1 ΔS = -137 J mol -1 K -1 ΔG = 101 kj mol -1 67
A számolt értékek alapján elmondható, hogy az aktiválási entrópia (ΔS negatív értéke asszociatív mechanizmusú, bimolekulás reakcióra utal. ) nagy 58. ábra A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójának Arrhenius-diagramja [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0 = 1,50 10-4 M; dmf 59. ábra A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójának Eyring-diagramja [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0 = 1,50 10-4 M; dmf 23. táblázat A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai Mérés T [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0 [ 2 ] 0 -d[fe]/dt k száma ( C) (10-4 M) (10-3 M) (10-8 Ms -1 ) (M -1 s -1 ) 1 110 0,40 1,69 1,01 0,15±0,007 2 110 0,87 1,69 2,14 0,15±0,007 3 110 1,50 1,69 3,18 0,13±0,005 4 110 1,74 1,69 3,89 0,13±0,006 5 110 1,50 4,03 6,01 0,10±0,004 68
23. táblázat A [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénezési reakcióinak kinetikai adatai Mérés száma T ( C) [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0 (10-4 M) [ 2 ] 0 (10-3 M) -d[fe]/dt (10-8 Ms -1 ) k (M -1 s -1 ) 6 110 1,50 8,45 11,9 0,09±0,004 7 100 1,50 1,64 1,96 0,08±0,003 8 105 1,50 1,65 2,36 0,09±0,005 9 115 1,50 1,65 3,69 0,15±0,006 Az elvégzett kísérletek eredményeként valószínűsíthető, hogy a [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex dioxigénnel való reakciója a (48) bimolekulás sebességi egyenlettel írható le. A részletes reakciókinetikai méréseket követően a [Mn II (fla) 2 ] komplex esetében is vizsgáltuk, hogy különböző karboxilát koligandumok (41. ábra) hogyan befolyásolják a dioxigénezési reakció sebességét. Vizsgáltuk a reakciósebesség változását különböző koligandum koncentrációknál, melynek eredményeként, minden esetben telítési görbét kaptunk (60. ábra, 25. táblázat). A 24. táblázatban összefoglaltuk a karboxilát koligandumok reakciósebességre gyakorolt hatását (v r ). Az eredmények alapján megállapítható, hogy a reakciósebesség csak kis mértékben változik a [Fe III (fla)(salen)] rendszerhez képest. A 27. ábrán bemutattuk a [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] komplex röntgenszerkezetét, ami alapján megállapítottuk, hogy a mangánion síkjában a két flavonoláto-ligandum oxigénatomjai találhatók, axiális pozícióban a két piridin nitrogénatomjai helyezkednek el. A [Mn II (fla) 2 ] komplex esetében az axiális pozíciók üresek, oldatban az oldószer (dmf) koordinációja tételezhető fel. Karboxilát koligandumok jelenlétében a dmf kiszorul a koordinációs övezetből, helyette, a koligandum koordinálódik a központi fémhez. Ebben az esetben a karboxilát koligandumok sztérikus hatása nem érvényesül a flavonol koordinációjának módja nem változik a reakciósebesség növekedése a koligandumok elektronikus hatásával magyarázható. Különböző hőmérsékleten meghatározva a k (sebességi állandó) értékét az Arrheniusés az Eyring-összefüggés minden esetben lineárisnak adódott (karboxilát koligandumok jelenlétében). Az aktiválási paramétereket a (32-35) egyenletek felhasználásával határoztuk meg. A aktiválási entalpiát ábrázolva az aktiválási entrópia függvényében lineáris összefüggést kaptunk, amely alapján megállapítható, hogy a reakció során, karboxilát koligandum hozzáadásával sem változik meg a reakció mechanizmusa (izokinetikus reakciók) (61. ábra, 25. táblázat). 69
60. ábra A kezdeti reakciósebesség változása trifenil-acetát koligandum jelenlétében [Mn II (fla) 2 ] 0 = 1,50 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,69 10-3 M; dmf; T = 110 C 24. táblázat A karboxilát koligandumok reakciósebességre gyakorolt hatása a [Mn II (fla) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójában Koligandum v max ( 10-8 Ms -1 ) v r - 3,18 1 CH 3 C 2 - PhCH 2 C 2 - Ph 2 CHC 2 - Ph 3 CC 2-37,0 11,6 21,7 6,8 108,9 34,2 58,1 18,3 61. ábra Aktiválási paraméterek változása karboxilát koligandumok hatására [Mn II (fla) 2 ] 0 = 1,50 10-4 M; [ 2 ] 0 = 1,56 10-3 M; dmf; T = 90 C 70
25. táblázat A [Mn II (fla) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai karboxilát koligandumok jelenlétében Mérés száma ko- ligandum T ( C) [Mn II (fla) 2 ] 0 (10-4 M) [ 2 ] 0 (10-3 M) [koligandum] (10-3 M) -d[mn]/dt (10-8 Ms -1 ) k ( M -1 s -1 ) 1-110 1,50 1,69-3,18 0,13±0,005 2 CH 3 C 2-3 CH 3 C 2-4 CH 3 C 2-5 CH 3 C 2-6 CH 3 C 2-7 CH 3 C 2-8 CH 3 C 2-9 CH 3 C 2-10 CH 3 C 2-11 CH 3 C 2-12 CH 3 C 2-13 PhCH 2 C 2-14 PhCH 2 C 2-15 PhCH 2 C 2-16 PhCH 2 C 2-17 PhCH 2 C 2-18 PhCH 2 C 2-19 PhCH 2 C 2-20 PhCH 2 C 2-21 PhCH 2 C 2-22 PhCH 2 C 2-23 Ph 2 CHC 2-24 Ph 2 CHC 2-25 Ph 2 CHC 2-26 Ph 2 CHC 2-110 1,50 1,69 0,75 6,91-110 1,50 1,69 1,50 10,9-110 1,50 1,69 3,00 20,2-110 1,50 1,69 4,50 28,8-110 1,50 1,69 6,00 33,0-110 1,50 1,69 7,50 35,7-110 1,50 1,69 9,00 36,9 1,45±0,09 110 1,50 1,69 11,00 37,0-80 1,50 1,47 9,00 10,9 0,49±0,008 90 1,50 1,56 9,00 17,9 0,76±0,011 100 1,50 1,64 9,00 27,1 1,10±0,07 110 1,50 1,69 1,50 5,1-110 1,50 1,69 3,00 9,01-110 1,50 1,69 4,50 11,6-110 1,50 1,69 6,00 16,0-110 1,50 1,69 7,50 19,4-110 1,50 1,69 9,00 20,9 0,79±0,013 110 1,50 1,69 11,00 21,7-80 1,50 1,47 9,00 5,0 0,23±0,005 90 1,50 1,56 9,00 9,1 0,39±0,007 100 1,50 1,64 9,00 12,9 0,52±0,006 110 1,50 1,69 0,15 15,1-110 1,50 1,69 0,30 31,4-110 1,50 1,69 0,45 45,1-110 1,50 1,69 0,75 72,3-71
25. táblázat A [Mn II (fla) 2 ] komplex dioxigénezési reakciójának kinetikai adatai karboxilát koligandumok jelenlétében Mérés száma ko- ligandum 27 Ph 2 CHC 2-28 Ph 2 CHC 2-29 Ph 2 CHC 2-30 Ph 2 CHC 2-31 Ph 2 CHC 2-32 Ph 2 CHC 2-33 Ph 3 CC 2-34 Ph 3 CC 2-35 Ph 3 CC 2-36 Ph 3 CC 2-37 Ph 3 CC 2 -- 38 Ph 3 CC 2-39 Ph 3 CC 2 -- 40 Ph 3 CC 2-41 Ph 3 CC 2 -- 42 Ph 3 CC 2 -- T ( C) [Mn II (fla) 2 ] 0 (10-4 M) [ 2 ] 0 (10-3 M) [koligandum] (10-3 M) -d[mn]/dt (10-8 Ms -1 ) k ( M -1 s -1 ) 110 1,50 1,69 1,50 105,3 4,16±0,11 110 1,50 1,69 2,25 107,2-110 1,50 1,69 3,00 108,9-80 1,50 1,47 1,50 17,7 0,81±0,009 90 1,50 1,56 1,50 33,7 1,44±0,08 100 1,50 1,64 1,50 53,3 2,17±0,09 110 1,50 1,69 0,15 13,0-110 1,50 1,69 0,30 26,5-110 1,50 1,69 0,45 39,1-110 1,50 1,69 0,75 47,8-110 1,50 1,69 1,50 56,7 2,24±0,10 110 1,50 1,69 2,25 57,2-110 1,50 1,69 3,00 58,1-80 1,50 1,47 1,50 23,8 0,94±0,05 90 1,50 1,56 1,50 32,1 1,27±0,09 100 1,50 1,64 1,50 46,1 1,82±0,08 A Mn(II)-komplex esetében feltételezhető, hogy a reakció a sebesség-meghatározó lépéssel indul, melyben a Mn(II)-ion reagál a molekuláris oxigénnel és egy (szuperoxo)mangán(iii)-komplex képződik, amely trioxa-metallociklus, majd a 4-es C- atomon bekövetkező nukleofil addíciós lépésben, endoperoxid szerkezetté rendeződik át. Ezt a lépést követi a heterociklikus gyűrű felhasadása és a szén-monoxid kilépése mellett kialakul a termék (-benzoil-szalicilát), továbbra is a központi fémhez ligandumként kapcsolódva. A mangán(ii)komplexek oxigénezésére javasolt mechanizmust a (49) egyenlet írja le. A komplex dioxigénezési reakcióját 18 2 -vel is elvégeztük. A reakció eredményeként [Mn II ( 18 -bs) 2 ] komplexhez jutottunk, melynek azonosítása az infravörös spektrum alapján történt. 72
[Mn II ( 18 -bs) 2 ] IR (KBr): ν (C= 16 ) = 1734 cm -1 ν (C= 18 ) = 1714 cm -1 ν (C 16 ) = 1547, 1380 cm -1 ν (C 18 ) = 1514, 1364 cm -1 A termékek elhidrolizálása és diazo-metánnal történő kezelése után kapott reakcióelegyet tömegspektrométerrel összekötött gázkromatográfiás vizsgálatnak vetettük alá, amely alapján termékként az 18 -benzoil szalicilsav metilészterét sikerült kimutatni: m/e: 260(M +, 0,4); 229(0,11); 227(0,17); 225(1,0); 107(25); 105(100) Az 18 -benzoil szalicilsav metilészteréhez rendelhető molekulacsúcs (m/e: 260 (256 +4); C 15 H 12 2 ) alapján elmondható, hogy a dioxigén mindkét atomja beépült a komplexbe. Ezt támasztja alá az is, hogy a reakció lejátszódása után a gázelegyben jelzett szén-monoxidot nem sikerült kimutatni. Mn II + 2 k 1 lassú Mn III k 2 k 3 Mn II (49) Mn II k 5 -C Mn II A u k 4 Mn II A funkcionális modellek vizsgálata alapján a következő megállapítások tehetők: Az elvégzett részletes reakciókinetikai vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a reakciók a flavonol 2,4-dioxigenáz enzim funkcionális modelljeinek tekinthetők. Az azonos összetételű (homoleptikus komplexek), de eltérő fémtartalmú modellrendszerek vizsgálata egyértelművé tette, hogy a fémnek kitüntetett szerepe van mind az enzim-, mind a modellreakciókban. A 26. táblázat az általunk vizsgált vas(iii)- illetve mangán(ii)tartalmú rendszerekre kapott k értékeket tartalmazza, összehasonlítva a [Cu II (fla) 2 ] komplexre korábban meghatározott értékkel [175]. A sebességértékeket összevetve megállapítható, hogy 73
a mangán(ii)- és vas(iii)komplexek esetében az oxigénezés sebessége körülbelül egy nagyságrenddel nagyobb, mint a réznél. A vas(iii)- és mangán(ii)tartalmú rendszereket összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy mindkét esetben az enzimatikus útnak megfelelő termékeket kaptuk, de eltérő mechanizmus szerint. Mn(II) esetében a dioxigén, míg Fe(III) esetében a szubsztrátum aktiválása a meghatározó lépés. A szubsztrátum fémhez történő koordinációjának módja nagymértékben kihat az oxigénezés sebességére. A szintetikus modellkomplexek dioxigénnel szembeni viszonylagos inertsége a stabilis öttagú kelátgyűrű kialakulásával magyarázható. Karboxilát koligandumok jelenlétében a dioxigénezési reakciók sebessége mintegy 2 nagyságrenddel növelehető, ami a flavonol koordinációs módjának megváltozásán keresztül értelmezhető. Karboxilát koligandum jelenlétében a reakció mechanizmusa is megváltozik, ebben az esetben a dioxigén aktiválása a kulcslépés, melynek eredményeként szuperoxid gyök-anion képződik, amit sikerült UV-VIS spektroszkópiai módszer segítségével igazolnunk. 26. táblázat A [Fe III (4 Mefla) 3 ], [Fe III (fla)(salen)], [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] és [Cu II (fla) 2 ] komplexek oxigénezési reakcióinak k értékei dmf-ban, 90 ºC-on Komplex k H (k 4 Me ) (M -1 s -1 ) [Fe III (4 Mefla) 3 ] 0,40 [Fe III (fla)(salen)] 0,01 (0,018) [Mn II (fla) 2 (py) 2 ] 0,07 [Cu II (fla) 2 ] 0,01(0,014) 74
3.2. ACC oxidáz modellek Az etilén, mint növekedési hormon fontos szerepet játszik a növények érési és más növekedési folyamataiban. A növényi sejtek a fenti folyamatokon kívül számos más esetben is termelnek etilént, pl. különféle stressz (fizikai sérülés, fagyás, kiszáradás, nehézfémsó mérgezés) esetén, ezért az ACC enzim által katalizált folyamat megértése potenciális mezőgazdasági és kereskedelmi fontossággal is kecsegtethet. Célunk volt, hogy a reakció termékeinek, intermedierjeinek azonosítása után az előállított komplexek felhasználásával katalitikus rendszereket dolgozzunk ki. Modellvegyületként az irodalomban már ismert [Fe III (salen)cl] komplexet választottuk [176]. A választást az indokolta, hogy a salenh 2 ligandum könnyen, olcsón előállítható, Fe(III)- komplexei nem érzékenyek, továbbá, számos salen-típusú ligandummal előállított, különböző átmenetifémet tartalmazó komplex (Mn, Co, Fe, Pd, i, Cu) bizonyult katalitikusan aktívnak szerves vegyületek oxidációs reakcióiban [177-179]. 3.2.1. ACC oxidáz enzim modellreakcióinak vizsgálata A funkcionális modellek kidolgozása során szubsztrátumként 1-amino-ciklopropán-1- karbonsavat (acch), 2-amino-izovajsavat (aibh) mint alternatív szubsztrátum és alanint (alah), oxidálószerként hidrogén-peroxidot, katalizátorként pedig [Fe III (salen)cl] komplexet használtunk. A komplex aktivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy katalizálja az aminosavak oxidációját (50-52), a reakciókat gázkromatográfiás méréssel követtük nyomon a termékek koncentrációjának időbeli változásán keresztül. - C 2 H 2 2 + + HC + C 2 H 3 [Fe III (salen)cl] acch (50) H 2 2 H + + H 3 + C 2 3 [Fe III (salen)cl] aibh C 2 - (51) H alah C 2 - H 3 + H 2 2 [Fe III (salen)cl] H + H 3 + C 2 (52) Az oxidációs reakciókat dmf/víz 3:1 arányú keverékében, 1:5000:5000 komplex, szubsztrátum, hidrogén-peroxid arány mellett, 25 ºC hőmérsékleten végeztük. Az oldószer- 75
elegy kiválasztását az indokolta, hogy míg a komplex dmf-ban, addig a szubsztrátum vízben oldódik jól. A megfelelő összetétel meghatározásához, különböző dmf/víz arányok mellett végeztük el az oxidációs reakciókat és azt találtuk, hogy 3:1 arányú dmf/víz elegyben érhető el a legnagyobb hozam (62. ábra). Az aminosavak oxidációs reakciói során elért TF (átalakulási frekvencia) és hozam értékeket a 63. ábra szemlélteti. 62. ábra A hozam változása a dmf/víz arány függvényében a 2-amino-izovajsav oxidációs reakciójában [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [aibh] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; T = 25 C 63. ábra Aminosavak oxidációs reakcióiban elért hozam és TF értékek [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [sz] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; [H4H] = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C; aibh* bázis nélkül A 63. ábrán látható, hogy a reakció csak a 2-amino-izovajsav esetén játszódik le bázis (H 4 H) hozzáadása nélkül. A 64. ábrán látható, hogy a reakció egy indukciós periódussal kezdődik, majd ezt követően telítésbe megy át, bázis hozzáadásával az indukciós periódus csökken. Feltételezésünk szerint a bázis az aminosav deprotonálásában játszik szerepet, 76
amelynek eredményeként könnyebben alakul ki a fém-szubsztrátum komplex, ezáltal gyorsítva a reakció lejátszódását. 64. ábra Bázis hatása 2-amino-izovajsav oxidációs reakciójában [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [aibh] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 1,13 10-2 M; bázis nélkül; [H 4 H] = 0,28 10-2 M; [H 4 H] = 1,80 10-2 M; [H 4 H] = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C A megfelelő körülmények meghatározását követően a 2-amino-izovajsav szubsztrátum esetében részletes reakciókinetikai vizsgálatokat végeztünk, melynek során vizsgáltuk a reakciósebesség változását a komplex, a szubsztrátum és a hidrogén-peroxid koncentrációk függvényében. 65. ábra A reakciósebesség változása a szubsztrátum kiindulási koncentrációjának függvényében [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C 77
A szubsztrátum részrendjének meghatározása során Michaelis-Menten-típusú összefüggéshez jutottunk (65. ábra), amely alapján valószínűsíthető a 2-amino-izovajsav koordinációja, amely a [Fe III (salen)cl] és a szubsztrátum közötti előegyensúlyi lépéssel írható le (53). A reakciósebességi értékek reciprokát ábrázolva a szubsztrátum koncentráció reciprokának függvényében az ún. Lineweaver-Burk egyeneshez jutottunk (R = 98,30 %), amelyből K M értéke 7,8 mmol-nak adódott (66. ábra). 0 66. ábra Lineweaver-Burk egyenes [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C A [Fe III (salen)cl] komplex részrendjének meghatározása érdekében, vizsgáltuk a reakciósebességi értékek alakulását a kiindulási komplexkoncentrációk függvényében (azonos szubsztrátum és hidrogén-peroxid koncentráció mellett). A 67. ábrán látható, hogy az összefüggés lineáris (R = 99,23 %), ami a komplexre nézve elsőrendű kinetikára utal. 67. ábra A reakciósebesség változása a komplex kiindulási koncentrációjának függvényében [aibh] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C 78
A reakciókat különböző H 2 2 -koncentrációk mellett elvégezve és a sebességértékeket meghatározva a hidrogén-peroxidra nézve is egyes részrendhez jutottunk (68. ábra; R = 99,60 %). 68. ábra A reakciósebesség változása a hidrogén-peroxid kiindulási koncentrációjának függvényében [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [sz] 0 = 3,60 10-2 M; [H 4 H] = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C; aibh* bázis nélkül A 68. ábrán látható, hogy a kísérleteket a többi aminosav esetében elvégezve is lineáris összefüggést kaptunk a hidrogén-peroxid koncentrációjának változtatása esetén (AIBH: R = 99,96 %; ALAH: R = 98,44 %; ACCH: R = 98,13 %). A részletes reakciókinetikai méréseket követően, különböző spektroszkópiai módszerek segítségével (UV-VIS, ESR) próbáltunk információt nyerni a reakció során esetlegesen kialakuló intermedierekről, azonban nem kaptunk értékelhető eredményeket. Rajagopal és munkatársai 2009-ben spektroszkópiailag bizonyították, hogy a [Fe III (salen)cl] komplexből hidrogén-peroxiddal egy [Fe IV =(salen)] + 79 reaktív intermedier keletkezik, szulfidok és szulfoxidok oxidációs reakcióiban [180]. Korábban van Eldik és csoportja hasonló eredményeket kapott a fenti reakciók vizsgálata során [181]. Annak eldöntése céljából, hogy a reaktív oxovas részecskék képesek-e az aminosavak oxidációjára, az irodalomban jól ismert [Fe II (4Py)(Cl 4 ) 2 ] komplexet választottuk modellvegyületként, amely jól meghatározott módon reagál különböző oxidálószerekkel (H 2 2, PhI, m-cpba), termékként szobahőmérsékleten is stabilis oxovas(iv) komplexet eredményezve [182-187]. A komplex aktivitását vizsgálva megállapítottuk, hogy katalizálja az aminosavak oxidációját. A 69. és 70. ábra az 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav és a 2-amino-izovajsav oxidációs reakciói során elért hozam és átalakítási frekvencia értékeket szemlélteti.
Megállapítható, hogy mindkét esetben a [Fe II (4Py)(Cl 4 ) 2 ] komplex aktívabbnak bizonyult, a [Fe III (salen)cl] komplexnél. 69. ábra 1-amino-ciklopropán-1-karbonsav oxidációs reakciójában elért hozam és TF értékek A: [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [acch] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; B: [Fe II (4Py)(Cl 4 ) 2 ] 0 = 7,20 10-6 M; [acch] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; [H 4 H] = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C 70. ábra 2-amino-izovajsav oxidációs reakciójában elért hozam és TF értékek A: [Fe III (salen)cl] 0 = 7,20 10-6 M; [aibh] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; B: [Fe II (4Py)(Cl 4 ) 2 ] 0 = 7,20 10-6 M; [aibh] 0 = 3,60 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 3,60 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C UV-VIS spektroszkópia segítségével sikerült kimutatnunk az aibh szubsztrátum oxidációs reakciója során kialakuló oxovas(iv) intermedier jelenlétét (71. ábra). A mechanizmus tisztázása érdekében vizsgáltuk, hogy nehézvízben (D 2 ), milyen sebességgel játszódnak le a reakciók. A 27. táblázatban összefoglaltuk a kapott SIE (oldószer izotóp effektus) értékeket, amelyek 1,3 és 3,9 értékek közé esnek. Látható, hogy a két komplexre kapott SIE értékek közel azonosak, ami alapján feltételezhető, hogy mindkét komplex 80
esetében azonos mechanizus szerint játszódnak le az oxidációs reakciók, tehát [Fe III (salen)cl] komplex esetében is feltételezhető, hogy egy reaktív oxovas(iv) gyök-kation keletkezik, ami összhangban van a korábbi irodalmi eredményekkel. t 71. ábra xovas(iv) intermedier bomlása 2-amino-izovajsav oxidációja során [Fe II (4Py)(Cl 4 ) 2 ] 0 = 1,00 10-3 M; [aibh] 0 = 1,00 10-2 M; [H 2 2 ] 0 = 1,00 10-2 M; dmf/víz; T = 25 C 27. táblázat ldószer izotóp effektus értékek aminosavak oxidációs reakcióiban Komplex Szubsztrátum SIE [Fe III (salen)cl] acch 3,9 [Fe III (salen)cl] alah 2,5 [Fe III (salen)cl] aibh 1,3 [Fe II (4Py)(Cl 4 ) 2 ] aibh 1,4. C 2 - H 3 + -H + C 2 +H + H 2 S - (53) [Fe] + S [Fe-S] (54) [Fe-S] + H 2 2 [=Fe IV -S] vagy [=Fe IV -S] (55) [=Fe IV -S] vagy [=Fe IV -S] lassú PCET (-H +, -e - ) H C 2 - (56) 81