HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ARI VE ARI ÜRÜNLERİ UYGULAMA VE ARAŞTIRMA MERKEZİ 16.08.2010 TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNY Az organoszilikon kvaterner ammonium-klorid felszíni kötődése és antimikrobiotikus hatása az amerikai (nyúlós) költésrothadásra Kórokozó: Paenibacillus larvae ÖSSZEFOGLALÁS Egy kvaterner aminosav tartalmú organoszilikon-só (Si-QAC) hidrolitikus terméke, a 3- (trimethoxysilyl)-propyldimethyloctadecyl ammonium klorid, antimikrobiotikus hatást gyakorolt mikroorganizmusok széles skálájára, miközben kémiai kötődést képezett különböző felületekkel. Ebben a tanulmányban ennek a kémiai anyagnak a hatásmechanizmusát vizsgáltuk az amerikai nyúlós költésrothadással (American Foulbrood AFB, kórokozó Paenibacillus larvae) kapcsolatban. Az AFB a mézelő méh (Apis mellifera L.) súlyos betegsége, amely a törökországi méhcsaládoknál gyakori, így gazdasági veszélyt jelent a török méhészeti ipar számára. A Si-QACot 28 különböző helyi Paenibacillus larvae baktériumtörzsön vizsgáltuk, vegetatív és spóra formákon, valamint P. larvae ATCC 9545-referencia baktériumtörzsön. A Si-QAC (BeeGuard )- ot az isztambuli Nanotechnology Company állította elő. Az összes vizsgált baktériumtörzsetfolyékony táptalajon (Brain-Heart Broth Medium Sigma, 42gr/L) tenyésztettük ki, majd áthelyeztünk 0.1 ml-t (1x108 CFU/mL) MYPG közegbe. A kísérletet a vegetatív és spóra alakokon 4 részben végeztük: 1. P.larvae spóra/vegetatív beoltása BHB agar közegbe, amely korábban Si-QAC-kal volt kezelve. 2. Si-QAC hozzáadása a közeghez, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) val. 3. P.larvae (spóra/vegetatív) beoltása BHB agar közegbe, amelyet előtte Si-QAC-kal permeteztek be. 4. Si-QAC permetezése a közegre, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) val. Az eredmények azt mutatják, hogy a Si-QAC szignifikánsan gátolja a baktérium szaporodását in vitro körülmények között, valamint baktériumölő (baktericid) hatása van a P. larvae spórára is. A kiterjesztett vizsgálatokat zárkás kísérletekkel tettük teljessé hogy a toxicitás mértékét megállapítsuk. Nem volt észlelhető toxicitás a méheknél, melyek közvetlen vagy közvetett kapcsolatba kerültek a Si-QAC kal. Ezt tartjuk e termék legfőbb erősségének.
BEVEZETÉS A méhészet egyike a legfontosabb mezőgazdasági ágazatoknak nemcsak a méz és méhészeti termékek termelése miatt, hanem az összes mezőgazdasági területet érintő beporzás miatt is. A mézelő méheket folyamatosan sok betegséget hordozó kórokozó veszélyezteti. Az amerikai nyúlós költésrothadás (American foulbrood, AFB) a mézelő méhek (Apis mellifera L.) súlyos betegsége. Előfordulása nagyon gyakori a törökországi méhcsaládoknál, ahogy világszerte máshol is. Az AFB alapvető veszélytényező a törők méhészeti ipar számára. Az AFB kórokozója a Paenibacillus larvae, egy spórás, gram-pozitív, mikroaerofil baktérium. A P. larvae járványos megbetegedést okozó kórokozó a méhcsaládoknál az egész világon (Ozkirim and Keskin, 2002). Ezt az organizmust könnyen ki lehet tenyészteni Törökország méhcsaládjainak 20%-ánál. A P. larvae spórák életben maradnak a nyers és a feldolgozott mézben és így terjednek a méhek téli beetetése során. Megtalálhatóak a lépviaszban is. A méhviaszt Törökország-szerte évenként összegyűjtik, és egy helyen dolgozzák föl, növelve a spórák terjedését. A családok megkapják a P.larvae spórákat az újonnan készült, nem fertőtlenített műlépekkel (Ozkirim and Keskin,2005). Éveken keresztül végeztek kutatásokat az antibiotikumok kiiktatásával alternatív gyógymódokat keresve az AFB kezelésére. Egyes iparágakban több mint egy évtizede használnak alkoxilánokat (alkoxysilane) kapcsolt közegként arra, hogy kívánt tulajdonságokat/paramétereket közvetítsenek vagy rögzítsenek különböző anyagokhoz. Számos enzim biológiailag aktív maradt miután alkoxilánokkal szervetlen felületekhez kötődött. Aktivitásuk folytonos maradt ismételt lemosás után is. A 3- (trimethoxysilyl)-propyldimethyloctadecyl ammonium chloride (Si-QAC) egy alkoxyszilán csoport képviselője. A Si-QAC (BeeGuard ) ot a Nanotechnology Company, Istanbul állította elő. E vegyület csoport aktivitási helyét több különböző kutató membrán jelenséghez kapcsolódóként írta le pl.: membrán lízis, membrán enzim inaktiváció, vagy ion transzport interferencia (Lawrence, 1968). A Si-QAC antimikrobiotikus hatása a membrán funkció megzavarásának tudható be, amit a töltéssel rendelkező kémiai anyag (quaternary ammonium chloride) magas koncentrációja okoz a szubsztráton, lehetséges sejt lízis által (Vetter et al., 2009). Ebben a tanulmányban a Si-QAC antimikrobiotikus hatásmechanizmusát vizsgáltuk a P. larvae ra in-vitro és ketreces kísérletekben.
ANYAG-MÓDSZER Laboratóriumi kísérletek A Si-QAC-ot 28 különböző helyi Paenibacillus larvae baktériumtörzsön vizsgáltuk, vegetatív és spóra-vegetatív formákon, valamint P. larvae ATCC 9545-baktériumtörzsön (Table 1.). A Si-QACot az isztambuli Nanotechnology Company állította elő. Az összes vizsgált baktériumtörzset folyékony táptalajon (Brain-Heart Broth Medium Sigma, 42gr/l) tenyésztettük ki, majd áthelyeztünk 0.1 ml-t (1x108 CFU/ml) az agar közegbe. A kísérletet a vegetatív és spóra alakokon 4 részben végeztük: 1. P.larvae spóra/vegetatív beoltása agy-szív agar közegbe, amely korábban Si-QAC-kal volt kezelve. 2. Si-QAC hozzáadása a közeghez, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) val. 3. P.larvae (spóra/vegetatív) beoltása agy-szív agar közegbe, amelyet előtte Si-QAC-kal permeteztek be. 4. Si-QAC permetezése a közegre, majd száradás után beoltás P.larvae (spóra/vegetatív) val. A P. larvae minden törzsének vizsgálatához hármas csoportban voltak a Petri csészék felállítva, hogy a SI-QAC prevenciós működését a P. larvae mindhárom formáján vizsgálhassuk. A laboratóriumi kísérletek második fázisában a klasszikus antibiogram tesztet használtuk az antimikrobiotikus aktivitás inhibíciós zónájának mérésére. Steril abszorbens papírból készült, 3,5 cm átmérőjű antibiotikus korongokat használtunk. Az összes baktériumtörzset agyszövetből és szívizomzatból előállított folyékony táptalajon (Brain- Heart Broth Medium Sigma, 42gr/l) tenyésztettük ki, majd áthelyeztünk 0.1 ml-t (1x108 CFU/mL) BHB agar közegbe (Sigma, 42gr/l). Miután beoltottuk 0.1 ml P. larvae bakteriális oldattal, a papír korongokat a Petri csészék közepére helyeztük, majd e korongok 0.5 ml Si-QAC oldatot abszorbeáltak. Az összes csészét 24 órán keresztül 37 C-on inkubáltuk. Táblázat 1. 28 helyi P. larvae baktériumtörzs Törökország különböző területeiről P. larvae törzs kód Provincia 01/15 Adana 01/17 Adana 01/33 Adana 01/37 Adana 01/38 Adana 31/09 Hatay 31/28 Hatay 31/27 Hatay 31/08 Hatay 31/11 Hatay 01/41 Adana
48/38 Muğla 31/18 Hatay 48/35 Muğla 31/32 Hatay 01/29 Adana 48/07 Muğla 31/24 Hatay 31/02 Hatay 01/19 Adana 48/27 Muğla 01/23 Adana 31/26 Hatay 48/31 Muğla 01/40 Adana 31/21 Hatay 01/43 Adana 31/16 Hatay 9545 ATCC Zárkás kísérletek Zárkánként 50 fiatal méhet használtunk a zárkás kísérletekben. Mielőtt a zárkákat használtuk Si- QAC oldatot permeteztünk 10 ml Si-QAc / 200cm 2 felület arányban a fa alapanyagú zárkák minden oldalfalára. 10 perc várakozási idő eltelte után 50 fiatal méhet helyeztünk a zárkákba. Összesen 20 zárkát használtunk, 10 zárka volt a kezeléses / kísérleti csoport, 10 zárka pedig kontrol csoportként szolgált. Ezeknél nem alkalmaztunk semmilyen kémiai anyagot, fertőtlenítőszert. A zárkákat 18 napon keresztül tartottuk megfigyelés alatt. A zárkákban lévő méheket naponta 5 ml cukorsziruppal és 3 g pollen lepénnyel etettük. Az elhullást regisztráltuk. A zárkás kísérletek célja a Si-QAC toxicitás méheknél való előfordulásának determinálása volt. EREDMÉNYEK A laboratóriumi kísérletek eredményei A laboratóriumi kísérletek eredményei igazolják, hogy a Si-QAC szignifikáns antimikrobiotikus hatást gyakorol a P. larvae tenyészetek bármely (spóra, spóra-vegetatív, vegetatív) formájára. Az
eredmények statisztikai analizálását a One Way ANOVA és a Mann-Withney Test rendszerekkel végeztük. Ahhoz, hogy a Si-QAC P. larvae ra gyakorolt megelőző/prevenciós hatásmechanizmusát mérni tudjuk, a Petri csészéket 1ml steril sóoldattal (0.9% NaCl) mostuk le majd steril vattával töröltük. Miután a baktériumtenyészetnek a sóoldatban lévő összes sejtjét a mikro-tubusba gyűjtöttük, a vattákat az oldatba tettük. Az oldatból kivettünk 0.1 ml-t, majd ismételten heamocytométeres sejtszámlálást végeztünk, hogy a baktériumok számának növekedését vagy csökkenését meghatározzuk (Figure1). (A számláláshoz használt heamocytometer, Figure 2. A baktériumszámlálásra használt területek, Figure 3. BHI Petri csészék a laboratóriumi kísérletekben) Kép 1. Neubauer heamocytometer Kép 2. A heamacytométer számláláshoz használt területei Kép 3. A Si-QAC gátló zónája a P. larvae spóra és vegetatív formáira (VK: Vegetatív Kontrol, V1, V2, V3: Si-QAC-al kezelt vegetatív forma: három ismételt kísérlet, SK: Spóra Kontrol, S1, S2, S3: Si-QAC-al kezelt spóra alak: három ismételt kísérlet) Táblázat 2. Sejtszámok a Si-QAC al kezelt Petri csészékben (CFU/ml) P. larvae tenyészet Kód Spóra alak Spóra-vegetatív alak Vegetatív alak 01/15 310 303 225 01/17 348 308 223 01/33 220 309 276 01/37 245 344 253 01/38 318 22 251 31/09 356 277 224 31/28 344 256 223 31/27 256 324 227 31/08 238 356 219 31/11 267 322 250
01/41 332 244 263 48/38 355 213 216 31/18 343 244 218 48/35 326 255 291 31/32 287 231 235 01/29 267 278 281 48/07 265 300 227 31/24 301 277 216 31/02 255 212 212 01/19 286 200 209 48/27 299 210 207 01/23 381 233 229 31/26 305 212 45 48/31 365 276 249 01/40 356 298 273 31/21 377 301 232 01/43 311 306 261 31/16 254 220 251 9545 201 225 183 All Strains (Median) % Csökkenés 99 99 99 % Csökkenés = Kontrol- minta / kontrol x 100 Zárkás kísérleti eredmények A zárkás kísérletek nem mutattak statisztikailag kimutatható eltérést a Si-QAC-al kezelt, és a kontrol zárkákban észlelt elhullási ráták között (One way ANOVA, Mann-Withney Test P 0.005).
4. Kép: zárkás kísérlet Megfigyeléseink szerint a zárkánként elhelyezett 50 fiatal méh kb. 3,5 ml cukorszirupot és 1,8 g pollen lepényt fogyasztott el naponta. Két csoport összehasonlításának eredményei azt mutatták, hogy korreláció áll fenn minden adat között, és a Si-QAC-nak nincs toxikus hatása a mézelő méhekre (Table 2). Kép 1. A Si-QAC-al kezelt és a kontrol zárkák összehasonlítása Ki kell hangsúlyoznunk, hogy a Si-QAC a bakteriális szaporodást csak azokon a helyeken akadályozza csíraölő/biocid és biofizikai hatásmechanizmusával, ahova felhordták. Felületmegkötő és vízálló tulajdonságai miatt a Si-QAC-ot nem ajánlott közvetlenül lárvákra, vagy kifejlett méhekre juttatni. Másrészről az eredmények azt mutatják, hogy a Si-QAC-nak fontos szerepe lehet a P. larvae szaporodásának megakadályozásában, amely egyébkent képes a kaptárokban vagy a földben akár 30-100 évig fennmaradni. Habár akár egyetlen spóra önmagában is szaporodni képes, az AFB fertőzés kialakulásának esélyét csökkenti a Si-QAC használata a kaptárokban. Az organoszilikon anyagok prevenciós működésmechanizmusa a fa alakváltozásaival és a páratartalommal kapcsolatos problémákat is kedvezően befolyásolja (Vetter et al., 2009). Ez a Si-QAC gombásodást gátló hatását is sugallja a világon általánosan használt fa alapanyagú kaptároknál. A Si-QAC antimikrobiotikus hatását ismertette Walters et al 1973-ban. FELHASZNÁLT IRODALOM Lawrence, C.A. (1968), Quaternary ammonium surface-active disinfectants. In disinfection, Sterilization and Preservation (C.A Lawrence and S.S Block, Eds.), pp.430-452. Lea and Febiger Philadelphia. Ozkirim, A., Keskin, N., (2002), Distribution of the major bacterial brood diseases diagnosed in Ankara and its surroundings, Mellifera, 2-4: 40-44. Ozkirim, A., Keskin, N., (2005), The Culture of Bacillus spp. From Comb Foundation, Hacettepe Journal of Biology and Chemistry, 34:37-41. Vetter, D. L., Bulcke, J. W. D., Imke D. W., Stevens, Acker, J. V.,(2009), Preventive Action of organosilicon treatments against disfigurement of wood under laboratory and outdoo conditions, International Biodeterioration and Biodegrradation, 63 : 1093-1101.
Analysed and written by Dr. Aslı Özkırım Hacettepe University Bee Health Laboratory Beytepe-Ankara-TURKEY Phone:00 90 312 297 80 43 Fax: 00 90 312 299 20 28 e-mail: ozkirim@hacettepe.edu.tr Dr. Aslı Özkırım Assoc. Director of Bee and Bee Product Research and Application Center (HARUM) www.harum.hacettepe.edu.tr