GYULAI GERGŐ POLIMER TARTALMÚ FELÜLETI NANOSTRUKTÚRÁK ELŐÁLLÍTÁSA ÉS JELLEMZÉSE, VALAMINT A GYÓGYSZERHORDOZÓKÉNT VALÓ ALKALMAZÁS LEHETŐSÉGE DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Témavezető: Dr. Kiss Éva, egyetemi tanár ELTE TTK Kémia Doktori Iskola Iskolavezető: Dr. Inzelt György, egyetemi tanár Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia program Programvezető: Dr. Záray Gyula, egyetemi tanár Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar Kémiai Intézet, Fizikai Kémiai Tanszék Határfelületi- és Nanoszerkezetek Laboratóriuma Budapest, 2014
Bevezetés Az utóbbi években a gyógyszerhordozók kutatása egyre inkább előtérbe került. A hagyományos gyógyszerformulákkal szemben a kolloidális (nanométeres tartományba eső) gyógyszerhordozók számos előnnyel rendelkeznek. A nagy diszperzitásfok miatt növekszik a hatóanyag biohasznosulása, és a felület specifikus funkcionalizálása által lehetővé válik a hatóanyag irányított célba juttatása. Ezáltal hatékonyabb, kevesebb mellékhatással járó gyógyszeres terápiák lesznek elérhetőek. Gyógyszerhordozó rendszerként nagy jelentőséggel bírnak a különböző polimerek, akár hordozó molekulaként (konjugátum, komplex), akár nanorészecske, nanokapszula formájában. Különösen jelentősek a biodegradábilis hordozó anyagok, melyek a szervezetben is megtalálható, nem toxikus vegyületekké bomlanak le biológiai körülmények között, és kiürülnek a szervezetből. Ezen gyógyszerhordozók lebomlása, és így a hatóanyag-felszabadulás az anyagok kémiai összetételével és egyéb tulajdonságaik változtatásával programozható. A biodegradábilis poli(tejsav) (PLA), illetve a különböző összetételű tejsav-glikolsav kopolimerek (PLGA) különös szerepet játszanak az ilyen irányú felhasználásban, mert bomlási termékeik, a tejsav és a glikolsav a szervezetben előforduló, metabolizálható anyagok. PLGA nanorészecskék többek között a nanoprecipitációs módszerrel is előállíthatók. Az részecskék belsejébe különböző, vízben rosszul oldódó hatóanyag molekulák foglalhatók. A részecskék gyógyszerhordozó rendszerként való alkalmazását azonban nehezíti felületi hidrofóbicitásuk, melynek következtében a felületükön nem specifikus fehérje adszorpció megy végbe. Ezáltal aktiválják a mononukleáris fagocita rendszert, mely a véráramból való gyors kiürülésükhöz vezet. Felületmódosítással javítható a biokompatibilitásuk, így növelve meg a hatóanyag leadáshoz szükséges tartózkodási időt a véráramban. A poli(etilén-oxid)- poli(propilén-oxid)-poli(etilén-oxid) (PEO-PPO-PEO) blokk-kopolimerek, a Pluronic-ok felületmódosítóként megnövelik a PLGA hidrofilitását. A molekula hidrofób PPO lánca képes a PLGA részecske felületéhez rögzíteni a polimert, míg a mozgékony PEO láncok biztosítják a felületi hidrofilitást és a sztérikus stabilizálást. A részecskék sejtmembránnal való kölcsönhatásának, és így a sejtbe való bejutásuknak meghatározó jelentősége van a gyógyászati alkalmazásban esetén. Ahhoz, hogy adott feladathoz, tervezetten állíthassunk elő nanorészecskéket, szükséges ismerni, hogy mely felületi tulajdonságok, hogyan befolyásolják szervezetbeli eloszlásukat. Feladat lehet például, hogy a részecske ne lépjen kölcsönhatásba a sejtmembránnal, hanem a véráramban hosszan keringve, folyamatos hatóanyag leadással, állandó szinten tartsa a gyógyszer koncentrációt. 1
Irányított célba juttatás esetén éppen az adott sejtmembrán típuson való áthaladás képessége a fontos. Doktori munkám során PLGA-Pluronic rendszerek gyógyszerhordozóként való alkalmazhatóságát vizsgáltam. Különböző PLGA és Pluronic polimerek felhasználásával, nanoprecipitációs módszerrel állítottam elő Pluronic-kal stabilizált PLGA nanorészecskéket, melyeket méretük és kolloid stabilitásuk szempontjából jellemeztem. A részecskék felületi biokompatibilitásának vizsgálatához sík modell rendszert használtam. A kísérletek során tanulmányoztam a Pluronic jelenlétének a PLGA felületén bekövetkező fehérje adszorpcióra gyakorolt hatását. Ennek során különböző összetételű, illetve vastagságú rétegeket alkalmaztam. Az előzetes eredmények alapján kiválasztott PLGA50-Pluronic F127 rendszeren tanulmányoztam a részecskék felületi összetételének a hatását a méretükre, elektroforetikus mobilitásukra és kolloid stabilitásukra. Vizsgáltam továbbá a részecskék sejtmembránnal való kölcsönhatását modell rendszer felhasználásával. Kísérletet tettem a PLGA nanorészecskék membránaffinitásának szabályozására kationos felületmódosító adalékok alkalmazásával. Erre a célra egyrészt a polikationos poli(etilén-imin)-t (PEI) használtam, másrészt előállítottam a stabilizátor Pluronic láncvégi amin szubsztituált származékát (Pluronic-amin). A PLGA nanorészecskék gyógyszerhordozóként való alkalmazásának lehetőségeit több antituberkulotikus hatóanyag, hatóanyag konjugátum, származék, illetve hatóanyag jelölt formulázásával tanulmányoztam. Kísérleti módszerek A sík modellrendszeres vizsgálatokhoz forgótárcsás technikával állítottam elő a PLGA- Pluronic keverék rendszerek vékony rétegeit szilárd hordozón. A rétegek nedvesedését peremszög méréssel, felületi összetételét röntgen-fotoelektron spektroszkópiával vizsgáltam. A rétegek vízzel való kölcsönhatását és a fehérje adszorpciót in situ ellipszometriás mérésekkel követtem nyomon. Az előállított PLGA nanorészecskék méretét, polidiszperzitását dinamikus fényszórás és atomi erő mikroszkópiás méréssel, felületi összetételüket elektroforetikus mobilitás és röntgen-fotoelektron spektroszkópiás méréssel jellemeztem. Kolloid stabilitásukat növekvő elektrolit koncentráció hatására bekövetkező turbiditás változások alapján határoztam meg. A részecskék membrán affinitását Langmuir-mérlegben létrehozott lipid monorétegbe történő penetrációs mérésekkel vizsgáltam. 2
Tézisek 1. Megállapítottam, hogy a PLGA - Pluronic F127 keverék vékonyrétegekben a felületaktív Pluronic F127 jelentős mértékben dúsul a réteg-levegő határfelületen. A dúsulás mértékét a réteg vastagsága nagyban befolyásolja, a filmvastagság növelésével nő a felületi rétegben a Pluronic tartalom. Vízzel érintkezve a vízoldható Pluronic részleges kioldódása játszódik le, melynek következtében a felületi rétegben való dúsulás mértéke lecsökken az eredeti értékhez képest. A rétegvastagság növekedésével, a visszamaradó Pluronic mennyisége nő, és 90 nm, vagy annál nagyobb rétegvastagság esetén a homogén eloszláshoz képest továbbra is felületi Pluronic többlet figyelhető meg. 2. BSA-val végzett nemspecifikus fehérje adszorpció vizsgálatából megállapítottam, hogy a tiszta PLGA felületén nagy affinitású izotermával leírható adszorpció megy végbe, melynek eredményeként fehérje monoréteg alakul ki a felületen. A Pluronic F127 jelenlétében a fehérje megkötődés jelentősen csökken. Megállapítottam, hogy a megkötődött fehérje mennyisége csökken a rétegvastagság növelésével. Meghatároztam azt a minimális rétegvastagságot, ami a BSA adszorpció tartós visszaszorításához szükséges. 3. Nanoprecipitációs módszerrel Pluronic-kal módosított PLGA nanorészecskéket állítottam elő. Megállapítottam, hogy aceton oldószert felhasználva a PLGA50 polimer és Pluronic F127 stabilizátor a legalkalmasabb a 100-200 nm-es mérettartományba eső, nagy kolloid stabilitással rendelkező PLGA szolok reprodukálható előállításához. 4. Meghatároztam a PLGA kolloidok membrán affinitását. Lipid monoréteg modell rendszer segítségével megállapítottam, hogy a stabilizátor felhasználása nélkül előállított, tiszta PLGA részecskék membrán affinitása minimális, míg a Pluronic-kal módosított PLGA részecskék megnövekedett penetrációs képességet mutatnak. 3
5. Új felületmódosítási módszert dolgoztam ki azzal a céllal, hogy megnöveljem a PLGA részecskék nemspecifikus membrán affinitását. Ennek során egyrészt a kationos poli(etilén-imin) (PEI) hatását vizsgálva megállapítottam, hogy ha a részecskék felületi rétege Pluronic mellett PEI-t is tartalmaz, jelentős mértékben megnövelhető a membrán penetrációs képesség. Másik módszerként előállítottam a Pluronic láncvégi primer amint tartalmazó származékát, a Pluronic-amint. Megállapítottam, hogy a Pluronic-aminnal végzett stabilizálás olyan részecskéket eredményez, amelyek megnövekedett a részecske - lipid kölcsönhatást mutatnak, miközben a kolloid rendszer megőrzi a kinetikai stabilitását. 6. Több új, Mycobacterium tuberculosis ellenes hatóanyagjelölt molekula kapszulázását valósítottam meg PLGA nanorészecskékbe. Összehasonlító in vitro mérések igazolták, hogy a PLGA hordozó rendszer segítségével a hatóanyagoknak nagyobb a biohasznosulása, és használatukkal lehetséges az intracelluláris baktériumok elpusztítása is. 4
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények 1. Gyulai G, Pénzes CsB, Mohai M, Lohner T, Petrik P, Kurunczi S, Kiss É. Interfacial properties of hydrophilized poly(lactic-co-glycolic acid) layers with various thicknesses. J Colloid Interf Sci. 2011;362(2):600-606. IF: 3,070 2. Kiss É, Heine ET, Hill K, He YC, Keusgen N, Pénzes CsB, Schnöller D, Gyulai G, Mendrek A, Keul H, Möller M. Membrane affinity and antimicrobal properties of polyelectrolytes with different hydrophobicity. Macromol Biosci. 2012;12(9):1181 1189 IF: 3,472 3. Gyulai G, Pénzes CsB, Mohai M, Csempesz F, Kiss É. Influence of surface properties of polymeric drug delivery nanoparticles on their membrane affinity. Eur Polym J. 2013;49(9):2495-2503. IF: 2,562 (2012) 4. Kiss É, Gyulai G, Pénzes CsB, Idei M, Horváti K, Bacsa B, Bősze Sz. Tuneable surface modification of PLGA nanoparticles carrying new antituberculotic drug candidate. Elbírálás alatt (Colloid Surface A. 2014) Az értekezés témájához kapcsolódó konferencia közlemények 1. Gyulai G, Pénzes CsB., Petrik P, Lohner T, Kurunczi S, Kiss É. Polimer nanorétegek felületi és fehérjeadszorpciós tulajdonságainak jellemzése. In: Janáky Cs, Németh Z(szerk.). XXXIII. Kémiai Előadói Napok: Fókuszban a kémia és a gyógyszer. Szeged: JATEPress, 2010, pp 60-63, ISBN 978-963-315-020-7 2. Gyulai G, Pénzes CsB, Petrik P, Lohner T, Kiss É.Wettability and Protein Adsorption Properties of Biodegradable Polymeric Nanolayers. Eur Cell Mater. 2010;20(S3):98. 3. Gyulai G, Pribransky K, Horváti K, Bacsa B, Bősze Sz, Kiss É. Biokompatibilis gyógyszerhordozó kolloid részecskék előállítása és felületi tulajdonságaik jellemzése. In: Adányiné Kisbocskói Nóra, Wölfing János(szerk.). MKE. I. Nemzeti Konferencia. Budapest: Magyar Kémikusok Egyesülete, 2011, pp 268, ISBN 978-963-9970-11-3 4. Kiss É, Gyulai G, Pénzes CsB, Schnöller D, Kobzi B, Kabai-Faix M, Hórvölgyi Z. Membrane affinity in delivery of bioactive components. In: Gyarmati Benjámin Sándor, Sudár András, Szilágyi András (szerk.). Advanced Macromolecular Systems Across the Length Scales: "Smart, Nanostructured Systems for Controlled Molecular Release and Biological Interfaces". Budapest: Budapest University of Technology and Economics, 2012, pp 62, ISBN:978-963-313-056-8 5
5. Gyulai G, Pénzes CsB, Kiss É. Adjusting the surface properties of drug delivery polymeric nanoparticles. In: Gyarmati Benjámin Sándor, Sudár András, Szilágyi András (szerk.). Advanced Macromolecular Systems Across the Length Scales: "Smart, Nanostructured Systems for Controlled Molecular Release and Biological Interfaces". Budapest: Budapest University of Technology and Economics, 2012, pp 132, ISBN:978-963-313-056-8 6. Pénzes CsB, Gyulai G, Kabai-Faix M, Hórvölgyi Z, Kiss É. Visualisation of interactions of nanoparticles with cell membrane in model systems. In: Gyarmati Benjámin Sándor, Sudár András, Szilágyi András (szerk.). Advanced Macromolecular Systems Across the Length Scales: "Smart, Nanostructured Systems for Controlled Molecular Release and Biological Interfaces". Budapest: Budapest University of Technology and Economics, 2012, pp 135, ISBN:978-963-313-056-8 7. Gyulai G, Pénzes CsB, Csempesz F, Kiss É. Surface properties and membrane affinity of drug delivery polymeric nanoparticles. 10 th Conference on Colloid Chemistry, Program & Book of Abstracts. Budapest, 2012, pp 94, ISBN 978-963- 9970-26-7 8. Pénzes CsB, Gyulai G, Sliwa K, Heine E, Keul H, Moeller M, Kiss É. Evaluation of membrane affinity of novel antimicrobial polymers. 10 th Conference on Colloid Chemistry, Program & Book of Abstracts (2012) Budapest, 2012, pp 104, ISBN 978-963-9970-26-7 Az értekezés témájához kapcsolódó poszterek 1. G. Gyulai G, Simándi J, Petrik P, Lohner T, Kiss É. Surface Properties of Biodegradable Polymer Blend Films with Pharmaceutical Relevance. 2 nd NanoCharM European School on Ellipsometry, 2009, Belgrád, Szerbia 2. Gyulai G, Pribranski K, Horváti K, Bacsa B, Bősze Sz, Kiss É. Preparation and surface properties of drug carrier nanoparticles. EuroNanoForum, 2011, Budapest 3. Gyulai G, Pribransky K, Horváti K, Bacsa B, Bősze Sz, Kiss É. Biocompatible and biodegradable drug delivery system for encapsulation of antituberculotic agents. 25th ECIS meeting, 2011. szeptember 4-9., Berlin, Németország, P-413 4. Kiss É, Pénzes CsB, Gyulai G. Membrane affinity of antibacterial polymers. Innovation Convention 2011, Brussel, 2011. 12. 05-06. 5. Gyulai G, Pénzes CsB, Sliwa K, Heine E, Keul H, Moeller M, Kiss É. Novel Antibacterial Polymers with Enhanced Membrane Affinity. NanoFormulation 2012. 05.28-06.01. Barcelona, Spanyolország, pp 103 6
6. Gyulai G, Pénzes CsB, Śliwa K, Heine E, Keul H, Moeller M, Kiss É. Interaction of antibacterial polymers with lipid nanolayers. Nanomaterials for Biomedical Technologies (Nanobiomed) Frankfurt, 2012. 03. 05-08. P-45 7. Pénzes CsB, Gyulai G, Pribransky K, Horvati K, Bősze Sz, Kiss É. AntiTB drug conjugates encapsulated into PLGA nanoparticles. Nanomaterials for Biomedical Technologies (Nanobiomed) Frankfurt, 2012. 03. 05-08. P-46 8. Gyulai G, Pénzes CsB, Dobrádi A, Szabó R, Bősze Sz, Kiss É. Surface modification of drug carrier PLGA nanoparticles to enhance their cell membrane affinity. FORMULA VII. Mulhouse, 2013. 07. 01-04. P-7 Egyéb publikációk Jurecska L, Barkács K, Kiss É, Gyulai G, Felföldi T, Törő B, Kovács R, Záray Gy. Intensification of wastewater treatment with polymer fiber-based biofilm carriers. Microchem J. 2013;107:108-114 IF: 2,879 (2012) 7