(34) DENCSŐ I. 1, BARANYAI A. 2 Néhány fontosabb gyógynövény mikroszaporítása Micropropagation of some medical plants dencsoi@szolf.hu-baranyai 1 _andrea@freemail.hu 2 1 Szolnoki Főiskola, Műszaki és Agrárgazdálkodási Intézet Agrár- és Vidékfejlesztési Tanszék, főiskolai docens 2 Szolnoki Főiskola, III. évfolyamos mezőgazdasági mérnök BSc hallgató Összefoglalás Kísérleteinkben sikerült megoldani a som (Cornus mas) a homoktövis (Hippophae rhamnoides), a tavaszi kankalin (Primula veris) hajtáscsúcs kultúrából történő in vitro szaporításának egyes lépéseit, illetve a rózsagyökér (Rhodiola rosae) in vitro csíráztatásából nyert növények felszaporítását és felnevelését. Az alkalmazott alaptáptalajok az egyes növényeknél eltérőek voltak (MS, DCR, BTM) az alkalmazott hormonszint (GA, BA) tekintetében már nem adódtak nagy különbségek. A kultúrák indítását, felszaporítását és gyökereztetését is sikerült megoldanunk. Bevezetés A Szolnoki Főiskola növény-biotechnológiai laborja 2011 szeptemberében alakult, azóta folynak a kísérletek. Figyelmünk azért fordult a gyógynövények a som és a homoktövis felé mert ezzel a területtel hazánkban nagyon kevesen foglalkoznak. A rendelkezésre álló külföldi irodalom is kevés, csak néhány fajjal foglalkoznak (Arnica montana, Menta fajok, Echinaceae, stb.) A som a nehezen szaporítható fajok közé tartozik, a homoktövissel már többen foglalkoztak, de elsősorban filogenetikai vonatkozásúak (Sun, K et. al., 2002) illetve, csak részleges eredményt értek el. (Kovács E., 1989) A Primula veris-sel kapcsolatban nem találtunk szakirodalmat, a Rhodiola rosae-val viszont már többen kísérleteztek, (Furmanowa M., 1999), Ézsiás Anikó (2006). Az első szerző sejtkultúrában vizsgálta a rosavin termelését. Itt kell megjegyeznünk, hogy egyes gyógynövények in vitro kultúrában is termelnek növényi alkaloidokat, mások azonban nem. Néhány fontosabb gyógynövény, amelyeket in vitro tenyésztésbe vittek: Arnica montana, (Cassels, A. C., et. al 1999), Valeriana Jatamansii Kaur et.al.1999). Célkitűzésünk az volt, hogy első lépésként oldjuk meg a fent említett fajok in vitro tenyésztését (jelenleg sem a somé, sem a homoktövisé nem megoldott). Ezeknek, mint adaptogén növényeknek nagyon fontos a roboráló szerepük, és mint termesztésbe vont növények, a mikroszaporításnak gyakorlati jelentősége is van. A tavaszi kankalin, mint modell növény szolgálhat a szártalan kankalin /Primula vulgaris/ (védett növény) in vitro tenyésztésének kidolgozásához, a rózsagyökérnél pedig a sejtkultúrák létrehozásához vezető út első lépése az in vitro csíráztatás és szaporítás Anyag és módszer Kiinduló alapanyag Kísérleteinket 2011. szeptemberében kezdtük, tehát a legkedvezőtlenebb időpontban, mert megváltozik a fásszárú növények endogén hormonszintje. (Tudvalevő, hogy a fásszárú növények ilyenkor már készülnek nyugalmi állapotba vonulni, kultúrába vitelük optimális időpontja a tél vége, tavasz eleje lett volna, mikor a mélynyugalmi állapotuk vége felé járnak, és csak kényszer nyugalmi állapotba vannak.) A kiinduló szaporítóanyagot Kozák Antal rákóczifalvai kertész biztosította számunkra. A somnál a kiinduló alapanyag a kertjében található vadsom volt, homoktövisnél a kiinduló alapanyag a Hippophae rhamnoides var. carpatica kétéves gyökeres dugványa. A rózsagyökér magjait Dr. György Zsuzsa (Corvinus 126
Egyetem Kertészettudományi Kar), a tavaszi kankalin felszedett hajtásait László Bencsik Ábel (Gyógynövény Kutató Intézet) volt szíves rendelkezésemre bocsájtani. 2012 januárjában a som és a homoktövis esetében már fajtákat indítottunk, ezen növények már ekkorra átestek a nyugalmi állapoton. A som esetében 3 fajtát állítottunk be a kísérletbe: a bolgár tűz, a jolico, és a macrocarpa fajtákat (homoktövisnél a Jantarnaja, ill. német porzós és termős fajtákat a homoktövis kétlakisága miatt). Tenyészetek létrehozása, a mikroszaporítás szakaszai A rügykultúrák fertőtlenítési menete: 4x-es hígítású hypo 5 percig, előtte 30 mp 70 %-os alkoholos oldat, majd 4x5 perces steril vizes kimosás. Ugyanezt használtuk a rózsagyökér magvainál, de ott nem volt előzetes alkohol oldatos áztatás. A fertőtlenítés után mikroszkóp alatt leszedtük a rügypikkelyeket és minden esetben merisztémát (0.1-0.3 mm) helyeztünk el az alaptáptalajra. A Primula esetében ez nehezebb volt, mivel jórészt virágrügyek differenciálódtak, ezért több esetben nagyobb hajtáscsúcsokat tettünk le, de ahol tisztán látható merisztéma volt ott azt preparáltuk ki. Az alkalmazott alaptáptalajok MS, (Murashige-Skoog, 1962), DCR (Gupta Durzan, 1985) és BTM (Chalupa, 1981) valamint. ezek különböző hígításai voltak. A tenyészeteket fényszobában tartottuk, 23 fokon, 16 órás megvilágítás, és 8 órás sötét periódus mellett. A rózsagyökérnél a gyökeres hajtásokat Jiffy pogácsákba ültettük, két hétig fóliaborítás alatt voltak. Eredmények Som (Cornus mas) steril kultúra létrehozása A somnál a rügypikkelyek eltávolítása után a csúcsrügyből és az oldalrügyekből vegyesen preparáltuk ki a merisztémát. Fontos volt, hogy a rügypikkelyek eltávolítása után a merisztémát körbevevő seprűszerű képleteket is eltávolítsuk, mert ezek hajtást gátló anyagot tartalmaznak. A vadsomnál és a fajtáknál is fontos volt ezt a műveletet elvégeznünk. A fertőtlenített rügyek 70%-a steril maradt. Az alaptáptalajokhoz különböző hormonokat adtunk, benzyladenint, illetve gibberelinnt a nyugalmi állapot megtörésére. Mint az eredményekből kiderült a somnál az alacsonyabb sótartalmú táptalaj vált be (DCR) és az alkalmazott hormonok közül egyedül a gibberellin volt hatásos, citokinin tartalmu táptalajon a merisztémák nem indultak meg, nem fejlődtek hajtássá. (1. táblázat) 1. táblázat: Vadsom merisztémák megindulási aránya kipreparált merisztémák %-ban (20db/kisérlet) 1. táblázat: Vadsom merisztémák megindulási aránya kipreparált merisztémák % 1. táblázat: Vadsom merisztémák megindulási aránya kipreparált merisztémák % 1. táblázat: Vadsom merisztémák megindulási aránya kipreparált merisztémák % 1. táblázat: Vadsom merisztémák megindulási aránya kipreparált merisztémák % 1. táblázat: Vadsom merisztémák megindulási aránya kipreparált merisztémák % ban (20db/kisérlet) ban (20db/kisérlet) ban (20db/kisérlet) ban (20db/kisérlet) ban (20db/kisérlet) 127
A kísérletekből egyértelműen kiderült, hogy a DCR jobb táptalaj a somnál mint az MS, érdekes hogy próbáltuk a BTM-et is mint alaptáptalaj (ez összetételében hasonlít a DCR-hez, de egyértelműen a DCR volt a jobb). (1-2. kép) 1-2. kép: A megindult és differenciálódott som merisztémák Felszaporítási fázis A szaporító táptalajt ennek megfelelően választottuk ki, az alaptáptalaj a DCR volt, az alkalmazott hormon a benzylaminopurin 0.2-0.6 mg/l cc.-ban. A kísérletek során kiderült, hogy az alacsonyabb cc. a jó, magasabb BA üvegesedést eredményezett, és ha MS volt az alaptáptalaj a növények kisebbek voltak, nem fejlődtek úgy, mint a DCR táptalajon. (2. táblázat) 2. táblázat: Vadsom szaporodási rátája DCR táptalajon kül. BAP cc. mellett (4x25 növény) Alkalmazott táptalaj BA 0.2 mg/l BA 0.6mg/l DCR 3.8 1.4 MS 1.5 1.2 Amennyiben kevés auxint (0.01 mg/l) NES-t illetve IVS-t adtunk a táptalajhoz a növények felüvegesedtek. A DCR+0.2mg/l BAP tökéletes növényeket eredményezett, volt olyan lombik ahol 3 növényből 18 oldalhajtást szedtünk le.(3.kép) 3. kép: Szaporodó som hajtás 4. kép: Nyugtató táptalajon meghosszabbodott somnövények 128
A somnál nemcsak de novo képződtek hajtások, hanem egyrészt a főhajtáson lévő alvó rügyek is kihajtottak, másrészt amint az 3. kép kis növényén látjuk a képződött oldalhajtások oldalrügyei is kihajtanak. Ezeket un. nyugtató táptalajra tesszük DCR+GA 0.1mg/l), ahol megnyúlnak, így alkalmasakká válnak további passzálásra. Gyökereztetés A gyökereztetési kísérletek sokáig folytak, a korábban alkalmazott táptalajokon a somot nem sikerült legyökereztetni, pedig a szakmában eddig használt összes gyökereztetési eljárást kipróbáltuk, macro és microelemek felére, háromnegyedére csökkentése, cukor csökkentése 1%-ra, auxinok alkalmazása IVS,IES,NES/0.01-0.5mg/l, aktív szén, ph levitele 4.8-ra, mind eredménytelen volt. (A som dugványról is nehezen gyökeresedik.) 2012 márciusában Marks,T és Simpson,S /2000/ kisérletei alapján új módszert próbáltunk ki. Nevezetesen a gyökereztetésre letett növényeket 3 csoportba osztottuk, úgymint a gyökereztetésre letett osztódó növény főhajtásának felső 2-2.5 cm-es része, a levágott főhajtás alsó része, a harmadik csoportba az oldalhajtásokat tettük le gyökereztető táptalajra. Három különböző gyökereztető táptalajt használtunk, a..10mg/l NES, b.10mg/l IVS, ill.c. IVS+IES+NES 3+3+3 mg/l kombinációja. A hormontartalmú táptalajokon 1 hétig voltak a növények, majd hormonmentes DCR alaptáptalajra tettük őket. A gyökereztetést a 28. napon néztük (alaptáptalajra történő áttétel után). Az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. 3. táblázat: Somhajtások gyökeresedése /letett növények százalékában az inkubáció 28. napján Hormon tipusa mg/l Főhajtás felső része Főhajtás alsó része Oldalhajtás 10 mg/l NES 0 75 25 10 mg/l IVS 37 23 63 NES+IES+IVS3+3+3 20 30 60 A legyökeresedett növényeket vizuálisan értékelve egyértelműen az auxin kombináció volt a legjobb, ezen a táptalajon igazi gyökerek fejlődtek, a másik két táptalajon az erősen elkalluszosodott alapból eredtek az un. léggyökerek, ezeket a növényeket nem is lehetett akklimatizálni. A legyökeresedett növényeket aztán sikeresen akklimatizáltuk. 129
Homoktövis steril kultúra létrehozása A homoktövisnél a kísérletek a carpatica alfajjal indultak meg, ezeket jól sikerült fertőtleníteni, a letett explantok 80%-a steril maradt. Az indító táptalajnak itt a BTM bizonyult a legjobbnak, szintén GA kiegészítésével, a BA itt sem eredményezte a letett merisztémák hajtássá történő fejlődését. (4. táblázat) 4. táblázat: A Hippophae rhamnoides var.carpatica merisztémák hajtássá fejlődési aránya a letett merisztémák %-ában kül. táptalajokon (20 kipreparált merisztéma) Alkalmazott táptalaj MS+BA 0.2 mg/l 12 MS+GA 1mg/l 23 BTM+BA 0.2mg/l 37 BTM+GA 1mg/l 86 Hajtássá fejlődött %-ban Ha az alaptáptalajokhoz auxint adtunk kis mennyiségben/0.001mg/l/ ez is üvegesedést okozott, ha a BTM helyett DCR-t alkalmaztunk az sem volt jobb, a homoktövis számára az optimális táptalaj a BTM.A carpatica mellett a Jantarnaja fajtát, ill. a német porzós és termős fajtákat is ezen a táptalajon indítottuk. (7. kép) 130
7. kép: Kipreparált Jantarnaja merisztéma Felszaporítási fázis A homoktövis felszaporítását a BTM+0.2mg/l BAP tartalmú táptalajon végeztük, ha növeltük az alkalmazott BAP szintet, vagy alacsonyabb cc.-ju auxinnal egészítettük ki (0.001mg/l NES vagy IVS), vagy alaptáptalajt változtattunk (MS,DCR) a szaporodási ráta lecsökkent, a növények nem fejlődtek. (5. táblázat) 5. táblázat: A homoktövis szaporodási rátája kül. táptalajokon (4x25 növény) Alkalmazott táptalaj BAP 0.2 mg/l BAP 0.6 mg/l BTM 2.4 1.8 MS 1.1 0.9 MS tartalmú táptalajon a növények kisebbek voltak, ha megemeltük a BAP szintjét, bármelyik táptalajnál erős kalluszosodás indult meg. A homoktövisnél BTM+0,2 mg/l táptalaj tökéletes a klónok felszaporítására. (8. kép) 8. kép: Szaporodó homoktövis növények 9. kép: Kallusból fejlődő hajtások A homoktövisnél a hajtások levágása után a kalluszt újból hormontartalmú táptalajra, vagy nyugtató táptalajra helyezve új hajtások fejlődtek ki. (9. kép) 131
10. kép: Német porzós fajta szaporító táptalajon Gyökereztetés A somhoz hasonlóan itt is még megoldásra váró probléma a gyökereztetés. A növények annyira érzékenyek hogy AC (aktív szén) illetve 0.5 mg/l IVS-t tartalmazó táptalajon el is haltak a növények, a táptalaj bármilyen megváltoztatására a növények deformálódtak, vagy nem gyökeresedtek le..a somhoz hasonlóan itt is kipróbáltuk az un.pulse kezelést, vagyis nagy koncentrácioju auxin tartalmu táptalajon tartottuk a növényeket egy hétig. Egy hét után hormonmentes alaptáptalajra tettük vissza őket, és a 28. napon értékeltük a gyökeresedést. A kezelések a következőek voltak: a.btm+ 10mg/l NES, b.10 mg/l IES, c. NES+IVS+IES 3+3+3 mg/l. Itt csak a fő és oldalhajtásokat tettük le. Az eredményeket a 6.táblázat tartalmazza. 6.táblázat Homoktövis hajtások gyökeresedése a letett növények százalékában az inkubáció 28.napján Hormon tipusa mg/l főhajtás oldalhajtás NES 10mg/l 30 10 IES 10mg/l 0 0 IVS+IES+NES 3+3+3 0 0 Vizuálisan is értékelve a legrosszabbnak itt a hormonkombináció bizonyult, csak elvétve találtunk gyökérprimordiumokat amelyekből később gyökér fejlődött. A kísérleteket folytatni kell. 11. kép: Gyökérképződés homoktövisen Eredmények megbeszélése: A homoktövisnél, és a somnál sikerült kidolgoznunk az indító- és a felszaporító táptalajt mind a vad, mind a kultúrfajok esetében. A somnál az indító táptalaj DCR+1mg/l 132
GA, a felszaporító a DCR+0.2 mg/l BAP, a homoktövisnél az indító a BTM+ 1mg/l GA, a szaporító a BTM+0.2 mg/l BAP, gyökereztetést a homoktövis esetében még meg kell oldanunk A rózsagyökér és a tavaszi kankalin mikroszaporítása Rhodiola rosae steril kultúra létrehozása Steril csíráztatást végeztünk, ahol a DCR+ 1mg/l GA-t tartalmazó táptalajon 100%-os csírázást kaptunk. (12. kép.) A rózsagyökér esetében a további in vitro felszaporításhoz a legmegfelelőbb az MS táptalaj volt, BAP 0.2mg/l hozzáadásával. Ezen a táptalajon a növények számos oldalhajtást képeztek. (13-14. kép) Ezeket a növényeket hormonmentes táptalajon legyökereztettük (15. kép) majd kiültettük Jiffy pogácsákba, ahol szépen akklimatizálódtak, majd fejlődésnek indultak (16. kép) 12. kép: Csírázó rózsagyökér magvak 13. kép: szaporodó rózsagyökér 14. kép: Rózsagyökér tömegméretű mikroszaporításaű 133
15. kép: Gyökeres rózsagyökér 16. kép: Akklimatizált rózsagyökér Tavaszi kankalin steril kultúra létrehozása Tavaszi kankalin esetében nehéz volt hajtásmerisztémát találni, mivel a fejlődésnek indult növényekben már elsősorban virágrügyek differenciálódtak. A fertőtlenítés 80-90%-ban eredményes volt, annak ellenére, hogy föld alatti részekből kellett a merisztémát kipreparálni. 17.kép: Kipreparált kankalin merisztéma Felszaporítási fázis 18. kép: Szaporodó kankalin hajtások A Primula szaporításánál az MS és a DCR táptalaj is megfelelőnek látszik 0.2mg/l BAP hozzáadásával. (18. kép) Gyökereztetés Sikerült megoldanunk a gyökereztetést, akár hormonmentes akár auxin tartalmú /IES, IVS/ tartalmú táptalajon a kankalin legyökeresedett. 19. kép: Gyökeresedés hormonmentes táptalajon 20. kép: Gyökeresedés hormontartalmú táptalajon 134
21. kép: Akklimatizált kankalin növények Következtetések A kankalinnál az indító táptalaj a DCR+1mg/l GA, a szaporító az MS vagy DCR+0.2mg/l BAP.A Rhodiola rosae esetében is sikerült az in vitro csíráztatott magvakból kiültetett növényeket nevelnünk. Mivel a kísérletek még csak fél éve folynak, remény van arra, hogy belátható időn belül a köztermesztés számára megfelelő és hatékony technológiát dolgozzunk ki. Összefoglalás Kísérleteinkben sikerült megoldani a tavaszi kankalin (Primula veris) hajtáscsúcs kultúrából történő in vitro szaporításának egyes lépéseit, illetve a rózsagyökér (Rhodiola rosae) in vitro csíráztatásából nyert növények felszaporítását és felnevelését. Az alkalmazott alaptáptalajok az egyes növényeknél eltérőek voltak (MS, DCR, BTM) az alkalmazott hormonszint (GA, BA) tekintetében már nem adódtak nagy különbségek. A kultúrák indítását, felszaporítását és gyökereztetését is sikerült megoldanunk. Felhasznált irodalom CASSELS, A. C. et.al (1999) Establishment of plantation fro micropropagated Arnica chamissionis a pharmaceatical substitute for the endangared A.montana. Plant Cell, Tissue and Organ culture vol.56 No.2 139-144 CHALUPA, V.(1981) Clonal propagation of broadleaved forest trees. Comm. Inst. For. Res. Cech. 12 255-271 GUPTA, P. K. - DURZAN, D.J. (1985) Shoot multiplicattion from mature Douglas fir. Pl. Cell. Report 4. 177-179 KAUR, R. et. al (1999) In vitro propagation of Valeriana jatamansii Plant Cell, Tissue and Organ culture 59 3 227-229 KOVÁCS, E. (1989) Homoktövis in vitro és in vivo szaporítása Diploma dolgozat Kertészeti Egyetem MARKS, T. SIMPSON, S.(2000) Interaction of explant type and indole-3-butyric acid during rooting in vitro in a range of difficult and easy-to-root woody plants.. Plant Cell Tissue and Organ Culture 62 65-74 MURASHIGE, T. SKOOG. F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobocco tissue culture. Physiol. Plant 15 473-479 135
136 SUN, K. et. al (2002) Molecular phylogenetics of Hippophae L. based on the internal transcribed spacer (ITS) sequences of nrdna. Plant Syst. Evol. 235 121-134