Kovács Csilla 1 - Peles Ferenc 2 - Balling Péter 3 - Bihari Zoltán 4 - Sándor Erzsébet 5 GTD tüneteket mutató és tünetmentes szőlőtőkék endofita mikroflórájának összehasonlítása Endophytes and GTD pathogens isolated from symptomatic and asymptomatic grapevine woody tissues k.csilla20@gmail.com 1 Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, PhD. hallgató 2 Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, adjunktus 3 Tokaji Borvidék Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, kutatóintézeti munkatárs 4 Tokaji Borvidék Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet, igazgató 5 Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, egyetemi docens Összefoglalás A szőlőtőkéből kiinduló megbetegedések (Grapevine Trunk Diseases -GTD), a tőke korai pusztulásához vezetnek. A betegség kialakulásában számos növényi kórokozó gomba vehet részt, emellett a tünetek kialakulását és a betegség súlyosságát az időjárási viszonyok is nagymértékben befolyásolják. A betegségek közös jellemzője, hogy az enyhébb tünetek megjelenése nem minden évben jellemző, illetve sokszor csak néhány évvel az első tünetek megjelenését követően figyelhető meg a tőke elhalása. A betegség kialakulásában valószínűleg biotikus és abiotikus tényezők egyaránt szerepet játszanak. Korábbi eredmények alapján a patogén gombák sok esetben a tünetmentes növényekből is kimutathatóak voltak, ezért célunk a tüneteket mutató és a tünetmentes tőkék mikroflórájának összehasonlítása volt. A vizsgálataink során Chardonnay ültetvényben végeztünk mintavételezést. A betegségben szerepet játszó kórokozók (Diplodia seriata és Diaporthe sp.) a GTD tüneteket mutató és a tünetmentes tőkékből egyaránt kitenyészthetőek voltak. Az egészséges és a betegséget mutató növények fás szöveteiben azonban nagy számban voltak jelen különböző, nem GTD patogén endofiták is (Epicoccum sp., Trichoderma sp., Mucor sp., Botrytis sp., Fusarium sp.) a GTD patogének mellett. Különbség mutatkozott a nekrotikus és nem nekrotikus szövetekből, illetve az eltérő növényi részekből kimutatható mikroflóra fajösszetétele között. Kulcsszavak: GTD patogén gombák, Chardonnay, endofita mikroflóra, Diplodia seriata, Diaporthe sp. 210
BEVEZETÉS A szőlőtőke korai pusztulásához vezető megbetegedéseket többféle, különböző betegség néven írják le kórokozó gombafajtól függően. A betegségek esetében több közös jellemző is megfigyelhető azonban, ami miatt a szőlőtőke fás betegségei (Grapevine Trunk Diseases -GTD) összefoglaló néven emlegetik világszerte (Bertsch et al., 2012). Bár a betegség kialakításában több kórokozó gomba szerepét is bizonyították, a tünetek nem minden esetben figyelhetőek meg a kórokozó jelenlétében. A betegségek közös jellemzője, hogy az enyhébb tünetek (1. kép) megjelenése nem minden évben újul ki, illetve sokszor csak néhány évvel az első tünetek megjelenését követően figyelhető meg a tőke teljes elhalása (Petit et al., 2006). A tünetek kialakulásában ezért valószínűleg egyéb tényezők is szerepet játszanak, melyek közül eddig az egyenlőtlen csapadékeloszlás szerepét bizonyították (Bertsch et al., 2012). A GTD világszerte, és Magyarországon is egyre nagyobb arányban jelentkező megbetegedés (Quéré és Sermier, 2015). 1. kép: Esca tünetek kialakulásának folyamata a Tarcal 7 levélen (az enyhébb tünetek a középső levélen láthatóak klorotikus érközi foltokként) Fotó: Sándor Erzsébet A növények belső szöveteiben található, endofita mikroflóra összetételével és változásával kapcsolatban, a növényi betegségek kialakulásában, illetve a növényi kórokozók terjedésének megakadályozásában játszott szerepéről egyre több eredmény lát napvilágot. Ma már egyértelmű, hogy mind a lágyszárú, mind a fás szárú növények belső szöveteiben jelentős számú, és változatos fajösszetételű mikroflóra található, melyek között nemcsak a növényi betegségek kialakításáért felelős, növényi patogén baktériumok és gombák találhatóak meg, hanem a növény számára hasznos, a betegségekkel szembeni ellenállást növelő mikrobák is jelen lehetnek (Stone et al., 2012). 21 1 211
A legfontosabb szőlő tőkebetegségek, melyeket ma már a GTD betegségcsoportba sorolnak, a következőek: esca, Eutypa-, és a Botryosphaeria, illetve a Phomopsis fajok okozta tőkeelhalás, Petri-betegség, fekete kordonkar-elhalás (BDA, black dead-arm elnevezés is) (Kotze et al., 2011; Lehoczky, 1974, Úrbez-Torres, 2011, Varga, 2009, Bertsch et al., 2012). A Petri-kór kialakításában a Phaeomoniella chlamydospora vesz részt, mely az egy évnél fiatalabb hajtásokat megfertőzve alakítja ki a jellegzetes tüneteket (Bertsch et al., 2012; Gramaje és Armengol, 2011). Az eutypás tőkeelhalást az Eutypa lata kórokozó gomba okozza. Az eutypás tőkeelhalást előidéző más, új fajokat is leírtak már Ausztráliában (Trouillas et al., 2011). Ezek a fajok az Eutypella microtheca, az Eutypella citricola és a Diatrypella vulgaris. Az Eutypella leprosa fajt pedig Chilében írták le (Díaz-Latorre, 2013). Az esca világszerte elterjedt betegség. Kialakításában részt vehet a tömlős gombák közé tartozó Phaeomoniella chlamydospora és a Paeoacremonium aleophilum, míg a bazídiumos gombák közül legelterjedtebb a Fomitiporia mediterranea (Fischer, 2006, Kuntzmann et al., 2010). A betegség lefolyása több év is lehet. A tünetek először a fás részeken jelennek meg, majd ezt követően figyelhető meg a vegetatív részek pusztulása (Bertsch et al., 2012, Lima et al., 2010). A kórokozó gombák spórái valószínűleg a szőlőn ejtett metszési sebeken keresztül, a szél segítségével jutnak a növénybe (Díaz-Latorre, 2013). Az esca öt leggyakoribb tünete: barna csíkok (főleg a gyökeres szőlővesszők esetén), Petri-betegség, fiatal esca, esca és az esca proper (1. kép) (Bertsch et al., 2012; Surico et al., 2006). A Botryosphaeria okozta tőkeelhalás kórokozójaként eddig 21 különböző, a Botryoshaeriaceae családba tartozó fajt azonosítottak, melyek közül a Diplodia mutila (teleomorf: Botryosphaeria stevensii) mellett a Diplodia seriata (teleomorf: Botryosphaeria obtusa) jelenlétét mutatták ki leggyakrabban (Bertsch et al., 2012). A fekete kordonkar elhalást (black dead-arm, BDA) először Magyarországon a tokaji régióban írta le Lehoczky 1974-ben. Franciaországban 1999-ben azonosították először (Larignon et al., 2001). A betegség kialakulását a klorotikus pontok megjelenése jelzi, melyek később hervadásnak indulnak (Lehoczky, 1974, Rábai et al., 2005). A BDA betegség kórokozójaként korábban csak a Diplodia mutila (teleomorf: Botryosphaeria stevensii) fajt írták le, ma már azonban a Diplodia seriata és a Botryosphaeria dothidea kóroktani jelenlétét is igazolták (Andolfi et al., 2011, Kuntzmann et al., 2010, Phillips, 2002, Úrbez-Torres, 2011). A fás betegségek akut (gyors lefolyású megbetegedés (gutaütés (2. kép)) és krónikus (hosszabb lefolyású, több éven át tartó) formában is megjelenhetnek (Bertsch et al., 2012, Lima et al., 2010, Mikulás 2008). Gombák közül a Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora, Eutypa lata, Fomitiporia mediterranea, Diplodia seriata, Phomopsis viticola tartoznak a betegséggel kapcsolatban eddig leggyakrabban azonosított kórokozók közé (Bertsch et al., 2012). A kórokozók jelenlétében azonban nem minden esetben és nem minden évben jelentkeznek az esca betegség levéltünetei. 212
2. kép: Akut fás betegség (gutaütés) Fotó: Sándor Erzsébet A vegetációs időszakban a lombozati tünetek megjelenése június és szeptember közötti időszakra tehető. A betegség megjelenésének fontos sajátossága az is, hogy nem minden szőlőtőkén, illetve nem minden levélen láthatóak a tünetek (Petit et al., 2006). Korábban jelentős eltérést találtak a GTD levéltüneteket mutató és tünetmentes tőkékből kimutatható gombák és baktériumok fajösszetételében Franciaországban (Bruez et al., 2014). Vizsgálatainkban magyarországi mintákban szerettük volna megvizsgálni az eltérő állapotú tőkék endofita mikroflóráját, hogy megállapítsuk a fertőzött és az egészséges növény egyes részeiben (gyökérzet, alanyra oltás, törzs, kordonkar) milyen mikroflóra található. ANYAG ÉS MÓDSZER Mintáinkat az összehasonlító vizsgálathoz a Tokaji borvidékről gyűjtöttük be. 2014-ben a márciusi rügyfakadást esős időszak előzte meg a virágzás előtt. A magas páratartalom és a változó hőmérséklet kedvezett a mikroorganizmusok növekedésének, így a tőkeelhalás (Grapevine Trunk Diseases-GTD) betegség kialakulásának is. 2014. júliusban 41 éves Chardonnay szőlőültetvényben először felmértük a tőkebetegség jelenlétét, ahol száz növény esetén vizsgáltuk a leveleken megfigyelhető tipikus tüneteket. Apoplexiára, vagy kordonkar elhalásra utaló tüneteket nem találtunk a felvételezés időpontjában a vizsgált területen. Néhány minta esetén mintavételezéssel vizsgáltuk a GTD patogének jelenlétét. A véletlen mintavételezést követően vizsgáltuk meg egy tünetes és egy tünetmentes tőkében a kitenyészthető mikroflóra összetételét. 21 3 213
2014. októberében egy GTD tüneteket mutató, és egy egész évben tünetmentes tőke fás szövetében található mikroflóra összetételét elemeztük a növény különböző részeiben: gyökérzet, alanyra oltás, törzs, kordonkar. A nekrotikus és az egészséges részekből egyaránt vettünk mintákat, melyeket Bruez et al. (2014) által leírt módszer alapján vizsgáltunk. EREDMÉNYEK A vizsgált ültetvényben a GTD jellegzetes tünetei a szőlőtőkék 13%-ában volt megfigyelhető. Vizsgálataink során egy egészséges és egy fertőzött növény különböző régióinak (gyökérzet, alanyra oltás, törzs, kordonkar) fás szövetéből történt a mintavétel (3. kép). Kordonkar Kordonkar Törzs Törzs Alanyra oltás Gyökérzet Gyökérzet Alanyra oltás A. B. 3. kép: A tünetmentes (A) és a tüneteket mutató (B) növények mintavételei helyei Fotó: Kovács Csilla 214
1. táblázat: Egészséges és egy levéltüneteket mutató tőkéből származó, különböző növényi részekből izolált endofiták Vizsgált növényi minta Tünetmentes tőke (5/24) Nem nekrotikus szövet Nekrotikus szövet KORDONKAR Diplodia seriata, Botrytis sp., Epicoccum sp., Diaporte sp., Trichoderma sp. Diplodia seriata, Fusarium sp. TÖRZS Levéltüneteket mutató tőke (5/31) baktériumok, Diplodia seriata baktériumok Diplodia seriata, Botrytis sp. Nem nekrotikus szövet Nekrotikus szövet Nem nekrotikus szövet Diplodia seriata, Mucor sp., Epicoccum sp., Botrytis sp., Diaporthe sp. Epicoccum sp., Botrytis sp., Diplodia seriata ALANYRA OLTÁS Diplodia seriata, Fusarium sp., Epicoccum sp. Botrytis sp., baktériumok, Diplodia seriata, Fusarium sp. Diplodia seriata, baktériumok, Fusarium sp. Botrytis sp., Fusarium sp., baktériumok Mucor sp. Nekrotikus szövet Botrytis sp., Diplodia seriata Mucor sp. Nem nekrotikus szövet Nekrotikus szövet GYÖKÉRZET Alternaria sp., Botrytis sp., Trichoderma sp., Diplodia seriata Epicoccum sp., Diaporthe sp, Diplodia seriata, Fusarium sp. Botrytis sp., Mucor sp., Trichoderma sp., baktériumok Diplodia seriata, Fusarium sp. Eredményeink (1. táblázat) alapján a GTD patogének (Diplodia serita és Diaporthe) kitenyészhetőek voltak, mind a tünetmentes, mind a tüneteket 2014-ben nem mutató tőkék esetében a nekrotikus, és az egészséges fás szövetből egyaránt. Feltűnő különbség volt, hogy az egészséges növény egyes régióiból kimutatható és beazonosított gombák között több esetben is jelen voltak potenciális biokontroll fajok (Epicoccum sp. és Trichoderma sp.) A beteg tőke esetén Epicoccum fajokat egyáltalán nem sikerült kimutatnunk, és a mikoparazita Trichoderma jelenléte is csak az alany gyökér régiójában volt megfigyelhető, az oltás feletti részben nem volt jelen. Az egyes növényi részekben más endofita gombákat is azonosítottunk (Fusarium sp., Botrytis sp.), valamint baktériumok jelenlétét is kimutattuk, melyek pontos azonosítását a későbbiekben tervezzük. 21 5 215
KÖVETKEZTETÉS ÉS ÖSSZEFOGLALÁS A 2014-es csapadékosabb év hatására a betegség jelenléte alacsonyabb mértékű volt a szárazabb 2013 évihez képest a Tokaj-hegyaljai borvidéken található 41 éves ültetvényben(kovács et al., 2015). A kiválasztott ültetvényből származó, egészséges és a betegséget mutató növények fás szöveteiben több különböző, nem GTD patogén endofita gombát (Epicoccum sp., Trichoderma sp., Mucor sp., Botrytis sp., Fusarium sp.) sikerült azonosítani, illetve több estben megtalálhatóak voltak különböző baktériumok is. Korábbi eredményekkel összhangban, a GTD kialakításában a korábban leírt patogének megtalálhatóak voltak a vizsgált szőlőnövények eltérő növényi részeiben mind a nekrotikus, mind a nekrózist nem mutató, fás szövetekben, az egészséges és a GTD tüneteket mutató tőkékben egyaránt. A tőkeelhalásban szerepet játszó kórokozók közül a Diplodia seriata és a Diaporthe sp. fajokat azonosítottuk. Megállapítottuk, hogy az eltérő növényi részekből kimutatható mikroflóra fajösszetétele között különbség volt a nekrotikus és a nem nekrotikus szövetek között. A fajösszetétel változása, illetve a különböző fajok eltérő arányának eredményei segíthetik a GTD betegség kialakulásához vezető folyamatok megismerését. Az endofita mikroflóra szerepének jobb megértése, és befolyásolása lehetőséget teremt egy nem kémiai alapú védekezési technológia kidolgozásához, a patogéneket visszaszorító mikroflóra kialakításával, és fenntartásával. További vizsgálataink célja az izolált baktériumok pontos faji azonosítása a betegséggel szembeni védekezési lehetőségként való felhasználásuk céljából. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése konvergencia program című kiemelt projekt keretei között valósult meg. A publikáció elkészítését a TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0024 számú, valamint a TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KONV-2010-0007 számú projekt is támogatta. Sándor Erzsébet munkáját a Debreceni Egyetem belső kutatási pályázata támogatta. A kutatások a COST FA1303 keretében zajlottak. Prof. Patrice Reynek (Université de Bordeaux, ISVV, UMR1065 Santé et Agroécologie du Vignoble (SAVE), Bordeaux Sciences Agro, Villenave d Ornon, France; INRA, ISVV, UMR1065 SAVE, Villenave d Ornon, Franciaország) is köszönetet szeretnénk mondani, aki segítette a munkánkat. SZAKIRODALMI JEGYZÉK Abreo, E., Martinez, S., Bettucci, L. and Lupo, L. (2013): Characterization of Botryosphaeriaceae species associated with grapevines in Uruguay. Australasian Plant Pathology, 42. 241-249. Andolfi, A., Mugnai, L., Luque, J., Surico, G., Cimmino, A., Evidente, A. (2011): Phytotoxins Produced by Fungi Associated with Grapevine Trunk Diseases. Toxins, 3. 1569-1605. Bertsch, C., Ramírez-Suero, M., Magnin-Robert, M., Larignon, P., Chong, J.- Abou-Mansour, E., Spagnolo, A., Clément, C.- Fontaine, F. (2012): Grapevine trunk diseases: complex and still poorly understood. Plant Pathology, 62. 2. 243-265. 216
Bruez, E., Vallance, J., Gerbore, J., Lecomte, P., Da, Costa, J.P., Guerin-Dubrana, L. and Rey, P. (2014): Analyses of the Temporal Dynamics of Fungal Communities Colonizing the Healthy Wood Tissues of Esca Leaf- Symptomatic and Asymptomatic Vines. Plos One. Vol. 9. Issue 5. 15. Díaz, G.A., Latorre B.A. (2013): Efficacy of paste and liquid fungicide formulations to protect pruning wounds against pathogens associated with grapevine trunk diseases in Chile. Crop Protection, 46. 106-112. Fischer, M. (2006): Biodiversity and geographic distribution of basidiomycetes causing esca-associated white rot in grapevine: a worldwide perspective. Phytopathologia Mediterranea, 45. 30-42.Kotze, C., Gramaje, D., Armengol, J.:(2011): Fungal Trunk Pathogens in the Grapevine Propagation Process: Potential Inoculum Sources, Detection, Identification, and Management Strategies. Plant Disease, 95. 9. 1040-1055. Niekerk, J.V., Mostert, L., Halleen, F., Fourie, P.( 2011): Evaluation of biocontrol agents for grapevine pruning wound protection against trunk pathogen infection. Phytopathology Mediterranea, 50. Supplement S247 S263. Kovács, Cs., Peles, F., Xie, H., Szojka, A., Hajdu, G., Bihari, Z., Sándor E. (2014): A fertőző tőkeelhalásban szerepet játszó gombák izolálása és azonosítása hagyományos és molekuláris biológiai módszerekkel a Tokajhegyaljai borvidéken. Agrártudományi Közlemények, 56. 4. 153-159. /ISSN 0133-0829/ Cs., Kovács, P., Balling, E. Sándor, Z., Bihari, P., Rey, F., Peles (2015): Endophytes and pathogens isolated from symptomatic and asymptomatic (Grapevine Trunk Diseases) woody tissue of Chardonnay from Tokaj wine region in Hungary. "Search for applied solutions to control grapevine trunk diseases" Funded by Jas HENNESSY & Co. Abstract book. Cognac, France 14. Kuntzmann, P., Villaume, S., Larignon, P., Bertsch, C. (2010): Esca, BDA and Eutypiosis: foliar symptoms, trunk lesions and fungi observed in diseased vinestocks in two vineyards in Alsace. Vitis, 49. 2. 71-76. Larignon, P., Fulchic, R., Cera, L., Dubos, B. (2001): Observation on black dead arm in French vineyards. Phytopathologia Mediterranea, 40. Supplement S336-S342. Lehoczky, J.(1974): Black dead arm disease of grapevine caused by Botryosphaeria stevensii infection. Acta Phytopathologica Academie Scientiarum Hungaricae, 9. 319-327. Lima, M.R.M., Mafalda, L., Felgueiras-Graçxa, G., Rodrigues, J.E.A., Barros, A., Gilana, M., Dias, A.C. (2010): NMR metabolomics of esca disease-affected Vitis vinifera cv. Alvarinho leaves. Journal of Experimental Botany, 61. 14. 4033-4042. Mikulás, J. (2008): Korai tőkeelhalással (Esca) kapcsolatos feladatok szüret környékén. Agrofórum: a növényvédők és növénytermesztők havilapja, 19. 10. 42-45. Petit, A. N., Vaillant, N., Boulay, M.,, Clément, C., Fontaine, F (2006): Alteration of Photosynthesis in Grapevines Affected by Esca. Ecology and Epydemiology, Phytopatology, 96. 10. 1060-1066. Phillips, A.J.L. (2002): Botryosphaeria species associated with diseases of grapevines in Portugal. Phytopathologia Mediterranea, 41. 3-18. Quéré, C., Sermier J.-M. (2015): Rapport d information n 2946 Les maladies de la vigne et du bois. Assemblée Nationale XIV. Législature. 123. Rábai, A., Morvai, Sz., Ember, I., Fischl, G. (2005): Szőlő-tőkepusztulás Veszprém megyében. Növényvédelem, 10. 41. 461-466. Stone, J.K., Polishook, J.D., White, J., F. Jr. Endophytic fungi. DOI: 10.13140/2.1.3835.2169. 241-270. 21 7 217
Surico, G., Mugnai, L., Marchi, G.(2006): Older and more recent observations on esca: a critical review. Phytopathologia Mediterranea, 45. 68-86. Trouillas, F.P., Pitt W.M., Sosnowski, M.R., Huang, R., Peduto, F, Loschiav, A., Savocchia, S., Scott, E.S., Gubler, W.D. (2011): Taxonomy and DNA phylogeny of Diatrypaceae associated with Vitis vinifera and other woody plants in Australia. Fungal Diversity, 49. 203-223. Úrbez-Torres, J.R. (2011): The status of Botryosphaeriaceae species infecting grapevines. Review. Phytopathology Mediterranea, 50. Supplement. 5-45. Varga, Z. (2009): Vitis fajok és fajták tőkepusztulásának összehasonlító vizsgálata és a védekezési lehetőségei, PhD dolgozat. 113. 218