Puskás István Oldott ciklodextrinek és makromolekulák hatása liposzóma-diszperziók kinetikai állandóságára Doktori értekezés tézisei ELTE TTK Kémia Doktori Iskola Vezetı: Dr. Inzelt György DSc., egyetemi tanár Analitikai, kolloid- és környezetkémia, elektrokémia program Programvezetı: Dr. Záray Gyula DSc., egyetemi tanár Témavezetı: Dr. Csempesz Ferenc CSc., habilitált egyetemi docens ELTE Kémiai Intézet 2008
Bevezetés és célkitőzések Kolloidok széles körben hasznosíthatók orvosbiológiai és gyógyszerészeti alkalmazásokban. Az utóbbi évtizedekben emiatt is megkülönböztetett figyelem irányult a nanométer mérettartományú részecskéket tartalmazó komplex rendszerekre. Vizsgálták a hatóanyagok megkötıdését a hordozókon, fizikai és kémiai sajátságaik változását, felszabadulásuk és célzott bevitelük lehetıségeit. Kolloid gyógyszerhordozók gyakorlati alkalmazását azonban korlátozza, hogy diszperzióik kinetikai állandósága általában csekély. Liposzómákat elterjedten használnak szabályozható és célzott hatóanyag felszabadulást biztosító hordozóként, valamint kísérleti biológiai membránmodellként. A foszfolipid kettısrétegek bipoláris karaktere miatt elvben lipofil és hidrofil hatóanyagok befogadására és szállítására is alkalmasak. Megfelelı terápiás hatás eléréséhez ezen szállító rendszerek kinetikai állandóságának, és a vezikulumok fizikai stabilitásának biztosítása egyaránt szükséges. Liposzómás gyógyszerkészítményekben ezért különféle stabilizáló adalékanyagokat, többnyire polimereket is alkalmaznak. A ciklodextrinek (CD) ciklikus oligoszacharidok, amelyek hidrofób karakterő belsı üreggel és hidrofil külsı felülettel rendelkeznek. A közel 1 nanométer üregmérető ciklodextrin molekulák alkalmas vendégmolekulákkal (vagy molekularészletekkel) ún. zárványkomplexeket képezhetnek. Ciklodextrinek gyógyszerészeti felhasználásának fontos oka, hogy komplexképzés következtében számos hatóanyag fizikai és kémiai sajátsága is elınyösen változhat, pl. vízben kevéssé oldódó hatóanyagok oldhatósága jelentıs mértékben megnövelhetı. Az értekezés alapját képezı kutatás dipalmitoil-foszfatidil-kolin (DPPC) liposzómák, vízoldékony makromolekulák és ciklodextrinek kolloid diszperz rendszereiben a komponensek közötti kölcsönhatások szisztematikus vizsgálatát foglalta magában. Azt szándékoztam felderíteni, hogy a liposzómák fizikai stabilitása és ezáltal diszperzióik kinetikai állandósága hogyan szabályozható a makromolekulák kémiai szerkezetének célszerő változtatásával, vagy különbözı kémiai felépítéső ciklodextrinekkel. 1
Vizsgálati módszerek Részecskeméret-eloszlás meghatározása és diszperzióstabilitás vizsgálata dinamikus fényszórásméréssel A részecskeméret, a méreteloszlás, a polidiszperzitás, illetve e paraméterek idıbeli változása kolloid diszperziók kinetikai állandóságának érzékeny jelzıi. DPPC liposzómadiszperziók ezen jellemzıit 25 C-on fotonkorrelációs spektroszkópiás módszerrel (PCS) Zetasizer 4 készülékkel (Malvern Inst., UK) határoztam meg. A vezikulumokról szóródó lézerfény intenzitásfluktuációiból származó autokorrelációs függvény alapján meghatározható a Brown-mozgást végzı liposzómák diffúzióállandója és mérete. A kísérletileg mérhetı szórt fény intenzitáseloszlásából a vezikulumok szám szerinti és térfogat szerinti méreteloszlásfüggvénye, átlagmérete, valamint a diszperzió polidiszperzitási indexe (PI) is kiszámítható. Szorpciós vizsgálatok 0,10 tömeg%-os DPPC liposzóma-diszperziókat állítottam elı ismert koncentrációjú ciklodextrin- (c CD ), és/vagy polimeroldatban (c Pol ). A diszperziókat két napig 25,0 C hımérséklető termosztátban tároltam. A szorpciós idı letelte után a mintákat G 3170 típusú (MOM) ultracentrifugával 40 000 ford./perc sebességgel centrifugáltam. Ezáltal a diszperziós közegbıl eltávolítottam a vezikulumokat a foszfolipidhez kötıdı ciklodextrin- és/vagy polimermolekulákkal együtt. Az egyensúlyi oldatban levı szabad ciklodextrin töménységét ([CD]), és a polimer ([Pol]) koncentrációját spektrofotometriás analitikai módszerekkel határoztam meg. A kiindulási és az egyensúlyi ciklodextrin-koncentrációk ismeretében kiszámítható az 1 mol foszfolipidhez kötıdött ciklodextrin moláris mennyisége (Q): V Q = ( ccd [ CD]), ahol n DPPC V a diszperzió térfogata (dm 3 ), n DPPC a foszfolipid moláris mennyisége. A kiindulási és egyensúlyi polimer-koncentrációk ismeretében kiszámítható 1 gram foszfolipid membránon kötıdött polimer mennyisége (m σ ): m σ V = ( c pol [ Pol]), ahol m V a diszperzió térfogata (dm 3 ), m a DPPC tömege (gram). 2
Komplex stabilitási állandók számítása A DPPC-membránokon kötött CD moláris mennyiségeibıl (Q) meghatároztam az alábbi asszociációs folyamatban képzıdı komplexek stabilitási állandóit (K pq ): p DPPC + q CD (DPPC) p (CD) q [ ( DPPC ) ] p( CD) q K pq = [ DPPC] p [ CD] q A ciklodextrin és a DPPC össz-koncentrációjának (c CD, ill. c DPPC ), és a ciklodextrin oldatfázisban mért egyensúlyi töménységének [CD] ismeretében a stabilitási állandók értékeit a következı egyenletek alapján, iteratív algoritmussal számítottam ki: + p c = [ CD] [ DPPC ] [ CD] q CD qk pq, + p c = [ DPPC] [ DPPC ] [ CD] q DPPC pk pq. A számításokat különbözı stabilitási állandó sorozatokkal végeztem. Kiválasztottam azokat az asszociátum-képzıdési modelleket, amelyek alapján számított elméleti értékek a legjobb egyezést mutatták a kísérleti adatokkal. Foszfolipid-ciklodextrin kölcsönhatás vizsgálata IR spektroszkópiával A DPPC és ciklodextrin közötti molekuláris kölcsönhatás vizsgálatára infravörös spektroszkópiai vizsgálatokat is végeztem. A spektrumokat Fourier-transzformációs FT-IR Perkin Elmer model 1650 egysugárutas készülékkel vettem fel. A mintákat teflongyőrő alkalmazásával horizontális HATR (horizontal attenuated total reflection) feltétre helyeztem, melynek reflexiós eleme cink-szelenid kristály. A spektrum felbontása 2 cm -1, pontossága 1 cm -1 volt. A jel/zaj viszony növelése érdekében 64 felvételbıl átlagolt spektrumokat értékeltem ki. Membránszerkezet vizsgálata DSC-vel, Differenciális pásztázó kalorimetriás (DSC) módszerrel tanulmányoztam az oldott ciklodextrinek, valamint makromolekulák DPPC-kettısrétegek szerkezetére gyakorolt hatását. A vizsgálatokat módosított Perkin Elmer DSC-3 kaloriméterrel végeztem. 12,0 ± 1,0 mg tömegő, DPPC-re nézve 1,5 tömeg%-os diszperziókban meghatároztam a foszfolipid 3
kettısrétegek fázisátalakulási entalpiaértékeit. A méréseket 10 60 C hımérséklettartományban 5 C / perc főtési sebesség mellett végeztem. Tudományos eredmények I.) Ultrahangos besugárzással jól reprodukálható kondenzációs eljárást dolgoztam ki szők méreteloszlású kis unilamelláris DPPC liposzómák elıállítására. Különbözı kísérleti körülmények között elıállított liposzóma diszperziók kinetikai állandóságát a vezikulumok részecskeméret-eloszlásának idıbeli változásával jellemeztem. II. a.) Vizsgáltam természetes eredető ciklodextrinek hatását a liposzóma diszperziók kinetikai állandóságára. Kimutattam, hogy a ciklodextrinek adott CD/DPPC mólarány felett kémiai felépítésüktıl függıen különbözı mértékben csökkentik a foszfolipidmembránok stabilitását. II. b.) Tanulmányoztam a ciklodextrinek DPPC-membránon való megkötıdését. A kölcsönhatást 25 C-on, egyensúlyi körülmények között meghatározott kötıdési izotermákkal jellemeztem. A kötött CD mennyisége a stabilitásvizsgálatok eredményeivel teljes összhangban γ-cd < β-cd, (DIMEB) < α-cd sorrendben nı. III.) Kolloid rendszerekre korábban nem alkalmazott iterációs módszerrel kiszámítottam a természetes ciklodextrinek DPPC-vel képzett asszociátumainak stabilitási állandóit és megbecsültem a komplexek valószínő moláris összetételét. A szorpciós izotermák telítési szakaszaihoz tartozó összetételeknél γ-cd-vel 1:1, β-cd-vel 1:2, α-cd-vel 1:8 mólarányú asszociátumok képzıdnek a legnagyobb valószínőséggel. A CD-molekulák lehetséges felfőzıdése a DPPC-molekulák apoláris láncrészeire, szupramolekuláris szerkezető asszociátumok kialakulására vezethet. IR spektroszkópiás vizsgálataim eredményei is alátámasztják a ciklodextrinek kötıdését a DPPC láncok metiléncsoportjaihoz. 4
IV.) Megállapítottam, hogy foszfolipid kettısrétegekbe beépülı vízoldható homopolimerekkel és kopolimerekkel megnövelhetı a vezikulumok fizikai stabilitása oldott ciklodextrinek jelenlétében is. Neutrális makromolekulákkal hatékonyan gátolható a ciklodextrinek DPPC-membránok szerkezetét károsító hatása. A foszfolipid kettısrétegeken szorbeálódó polimerréteg sztérikus stabilizáló hatást fejt ki a liposzóma-diszperziókra. A stabilizáló hatás jelentısen függ a polimer kémiai összetételétıl és molekulatömegétıl. V.) DSC-vizsgálatokkal kimutattam, hogy a DPPC-kettısrétegek fı fázisátalakulásához rendelhetı entalpiaváltozás α-cd molekulák jelenlétében (1:7 DPPC-CD mólaránynál) eltőnik, ami azt mutatja, hogy a foszfolipid-membránokhoz kötıdı ciklodextrinmolekulák megszüntetik a vezikulumokat összetartó kooperatív kölcsönhatásokat. A termikus vizsgálatokat olyan diszperziókkal is elvégeztem, amelyek közege a liposzómák készítésekor a ciklodextrin mellett polimert is tartalmazott. Az így készült liposzóma-diszperziók és az adalékanyag-mentes minták termikus adatai között csak csekély mértékő eltérés tapasztalható. Ez az eredmény egyértelmően jelzi, hogy a vezikulumokhoz kötıdı makromolekulák hosszabb ideig stabilizálják a membrán rendezett szerkezetét. VI.) Megállapítottam, hogy a makromolekulák DPPC-kettısrétegek szerkezére kifejtett stabilizáló hatása egyaránt függ a beépülı polimer molekulák mennyiségétıl és a beépülés mechanizmusától. Hatékony stabilizáló hatás abban az esetben mutatható ki, ha a makromolekula láncok a kettısrétegek kialakulásával egyidejőleg épülnek be a liposzóma membránba. A foszfolipid kettısrétegekbe beépülı polimer molekulák nem gátolják a kismérető CD-molekulák kötıdését a DPPC-molekulák apoláris láncain. Következtetések Doktori kutatómunkám egyik fontos eredménye, hogy neutrális polimerekkel jelentısen gátolható az oldott ciklodextrinek DPPC-membránokat károsító hatása. A liposzóma membránokba beépülı makromolekula láncok olyan védıréteget képeznek, amelyek hatékonyan akadályozzák a DPPC-kettısrétegek rendezett szerkezetének megbontását, a liposzómák dezintegrációját és aggregációját ciklodextrinek jelenlétében is. 5
Az ismertett eredmények alapján elvi lehetıség kínálkozik megfelelı stabilitású, komplex gyógyszerhordozók kifejlesztésére, amelyek ciklodextrin nanokapszulákat és kolloidális foszfolipid vezikulumokat egyaránt tartalmaznak. A komplex diszperziók stabilizásában alapvetı fontosságú a foszfolipid és ciklodextrin molekulák közötti kölcsönhatások célszerő szabályozása. Vizsgálataim alapul szolgálhatnak természetes sejtmembránok lipid komponensei és ciklodextrin molekulák közötti kölcsönhatások részletesebb megismeréséhez. Közlemények: 1. I. Puskás, L. Barcza, L. Szente and F. Csempesz: Features of the interaction between cyclodextrins and colloidal liposomes, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 54, 89-93 (2006) (IF: 0,846) 2. I. Puskás, F. Csempesz: Influence of cyclodextrins on the physical stability of DPPCliposomes, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, Volume 58, Issue 2, 218-224 (2007) (IF: 1,586) 3. F. Csempesz, I. Puskás: Controlling the Physical Stability of Liposomal Colloids, Colloid Stability and Application in Pharmacy, Vol. 3 (Ed. Th. F. Tadros), Wiley- VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim (2006) ISBN: 978-3-527-31463-8 4. Puskás I., Szente L., Csempesz F.: Ciklodextrinek kölcsönhatása kolloidokkal, Magyar Kémiai Folyóirat, 111 (1), 33-37 (2005) 5. I. Puskás, F. Csempesz: Pharmaceutical relevance of complex formation between cyclodextrins and phospholipids, Cyclodextrin News, Volume 21(9), 1-5 (2007) 6. I. Puskás, F. Csempesz: Characterization of Possible Colloidal Drug Carriers, Extended Abstracts, 9 th International Symposium on Particle Size Analysis, Environmental Prot. and Powder Technology, Balatonfüred, Elektronikus kiadvány, 5 (2004) 6
Poszter elıadások: 1. Puskás I., Csempesz F.: Ciklodextrinek hatása liposzómák fizikai stabilitására, Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok, Budapest, 2005. április 14-15. 2. I. Puskás, F. Csempesz: Controlling the physical stability of DPPC vesicles, Pharmacy: smart molecules for therapy, Semi centennial conference of Semmelweis University, Faculty of Pharmacy, Budapest, Magyar Tudományos Akadémia, 2005. október 12-14. 3a. Puskás I., Csempesz F.: DPPC-liposzómák fizikai stabilitásának szabályozása, Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok, Budapest, 2006. április 13-14. 3b. Puskás I., Csempesz F.: DPPC-liposzómák fizikai stabilitásának szabályozása, Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIII. Budapest, 2006. május 25-27. 4. I. Puskás, F. Csempesz: Effect of cyclodextrins on the stability of colloidal liposomes, 20th conference of the European Colloid and Interface Society and 18th European Chemistry at Interfaces Conference, Budapest, Magyar Tudományos Akadémia, 2006. szeptember 17-22. 5. I. Puskás, F. Csempesz: Enhancement of the Kinetic Stability of DPPC-liposomes, 12th International Conference on Surface and Colloid Science, Peking, 2006. október 15-20. Szóbeli Elıadások: 1. Puskás I., Süle A., F. Csempesz: Ciklodextrinek kölcsönhatása kolloidokkal, Semmelweis Egyetem Orvos- és Gyógyszerésztudományi Diákköri Konferencia, Budapest, 2003. február 12-13. 2. I. Puskás, F. Csempesz: Characterization of Possible Colloidal Drug Carriers, 9 th International Symposium on Particle Size Analysis, Environmental Prot. and Powder Technology, Balatonfüred, 2004. szeptember 5-8. 7
3. F. Csempesz, I. Puskás, A. Süle, L. Szente: Efficiency of Macromolecular Colloids in Supramolecular and Liposomal Drug Delivery Systems, 12th International Conference on Surface and Colloid Science, Peking, 2006. október 15-20. 4. I. Puskás, F. Csempesz: Kinetic stability of liposomal dispersions in the presence of cyclodextrins and macromolecules, Working Committee for Carbohydrate Chemistry of Hungarian Academy of Sciences, Mátrafüred, 2007. május 22-24. 5. F. Csempesz, I. Puskás, A. Süle: Physical stability of colloidal liposomes in complex delivery systems, 9th Conference on Colloid Chemistry, Siófok, 2007. október 3-5. 8