\ J AZ EISENIA FETIDA SZTOMATOGASZTRIKUS IDEGRENDSZERE (Immunhisztológiai és farmakológiai vizsgálatok) Barna János PhD értekezés tézisei Pécs 2001.
1. BEVEZETÉS A gerinces állatokban az autonóm idegrendszer három részre osztható, nevezetesen a szimpatikus-, a paraszimpatikus- és a bélidegrendszerre (ENS). Bár mind a szimpatikus, mind a paraszimpatikus idegrendszer részt vesz a bélcsatorna beidegzésében, mégis működésének szabályozásában a bélidegrendszer a legfontosabb azokkal a reflexkörökkel, melyek neuronjai az emésztőkészülék falában találhatók. Ez a rendszer a gerinctelen állatokban a sztomatogasztrikus idegrendszemek (SmS) felel meg, ami általában a bélcsatorna elülső részén helyezkedik el, a garat körül egy vagy több ganglionáris gyűrűt formálva. A sms a bélperisztaltikának, a bélcsatorna enzimszekréciójának, továbbá víz- és iontranszportjának szabályozásában vesz részt. A gyfuűsférgek (Annelida) törzsén belül az Oligochaeták rendelkeznek a legfejlettebb SmS-el. Három részét különböztethetjük meg, nevezetesen 1./ a garat falába ágyazott 6 pár sztomatogasztrikus gangliont (STG), 2.1 a STa-okat a garatkonnektivumokkal összekötő rövid idegeket, 3.1 a garat falába futó és a bélfonadék kialakításában résztvevő idegeket. Az Oligochaeták közé tartozó fóldigiliszták, különösen az Eisenia fetida SmS-ének vizsgálatára vonatkozóan szórványos adatokkal rendelkezünk. Az adatok további bővítését az indokolja, hogy ezek kvalitatív és kvantitatív elemzésével megértsük a rendszer pontos felépítését és funkcióit. 2. CÉLKITŰZÉS Az Eisenia fetida SmS-én végzett vizsgálataink során a következő kérdésekre kerestünk választ: - Van-e és ha igen, milyen fokú az anatómiai hasonlóság a fóldigiliszták és más gerinctelen állatok S JNS-e között? - Milyen egyezések találhatók a gerinces állatok ENS-e és a trágyagiliszta SJNS-e között? - Az Eisenia fetida STG neuronjai milyen morfológiai és neurokémai jellemzőkkel rendelkeznek? - Milyen mennyiségi. morfológiai és rendelkeznek, és hogyan oszlanak bélcsatorna teljes hosszában? - Milyen hasonlóságok és különbségek ismerhetők fel összevetve a bélfonadékot más, föleg ÍZeltlábú és puhatestű állatok hasonló rendszerével? - Mi jellemző a bél epithélsejtjei között előforduló eltérő szignálmolekula tartalmú sejtek eloszlására? - Az acetilkolin (ACh), a szerotonin (5-RT), a dopamin (DA), az oktopamin (OA), a gamma-amino-vajsav (GABA) és a proktolin szignálmolekuiák befolyásolják-e az előbél perisztaltikus mozgásait és ha igen milyen neurokémiai tulajdonságokkal el a különböző idegelemek a módon?
- Kifejtheti-e az ACh hatását muszkarin típusú receptoron keresztül a bélizomzatán? - A muszkarin receptor antagonista atropin kompetitív vagy nem kompetitív módon kötődik a receptorához? 3. ANYAG ÉS MÓDSZER Vizsgálatainkat ivarérett trágyagilisztákon (Eisenia fetida, Oligochaeta, Annelida) végeztük. A szövettani preparátumok készítéséhez az állatok elülső(1-20 szelvények), középső- (30-40 szelvények) és hátulsó- (utolsó 10 szelvény) testrészét fooiltuk. A rögzítést követően a testdarabokat Paraplasztba ágyaztuk, majd 7 _-os sorozatmetszeteket készítettünk. A metszeteken általános hisztológiai festéseket (hematein-eosin és toluidinkékes festés), valamint 5-HT, tirozin-hidroxiláz- (TH), OA-, GABA-, proktolin-, FMRFamid-, Eisenia tetradekapeptid- (ETP) és neuropeptid Y (NPY) immunfestést végeztünk. Az előhívás ExtrA vidin-peroxidáz komplexszel történt. Képanalizáló rendszer segítségével meghatároztuk a neuronok számát, eloszlását és méretét. A sejtszám korrigált értékét az Abercrombie féle korrekciós módszerrel (AK) számoltuk ki. Az Eisenia előbelének perisztaltikus mozgásváltozásait, ACh, 5-HT, DA, OA, GABA és proktolin adagolás után"vizsgáltuk. A statisztikai kiértékeléseknél számtani átlagot és a szórás standard hibáját vettük figyelembe, az összehasonlításokhoz a kétmintás t-próbát használtuk. 4. EREDMÉNYEK 4.1. A sztomatogasztrikus ganglionok morfológiai és neurokémiai jellemzői A STG-okban unipoláris, kisebb szá!j1ban multipoláris idegsejtek vannak, melyek perikarionjai a dúcok perifériás kérgi részében helyezkednek el általában szórtan, csupán néhány sejt rendeződik kisebb csoportba. Egy STG-ban 23,0 :1: 2,4 sejt (Ak: 18,29 sejt) van, a rendszerben összesen 276 neuron található. Az idegsejtek kis méretűek, átlagosan 10,4:1: 1,2 J.UD-sak. A sejtek különböző transzmitter/modulátor anyagokat tartalmaznak, melyek közül legnagyobb mennyiségben a GABA-immunreaktív (IR; 5 sejt; 21,7%; Ak: 3,96 sejt) sejtek fordulnak elő, ezt követik a 5-HT-IR (3 sejt; 13%; Ak: 2,4 sejt), TH-IR (3 sejt; 13%; Ak: 2,3 sejt), proktolin-ir (3 sejt; 13%; Ak: 2,5 sejt) és ETP-IR neuronok (3 sejt; 13%; Ak: 2,3 sejt). Kisebb százalékos arányt képviselnek az FMRFamid-IR (2 sejt; 8,7%; Ak: 1,6 sejt) és az NPY-IR (2 sejt; 8,7%; Ak: 1,5 sejt) sejtek. A legkisebb menyiségben az OA-IR (1 sejt; 4,3%; Ak: 0,81 sejt) neuronok találhatók. A ganglionok neuropil állománya gazdag IR rostokban. Ezek a STGokhoz érkező, a garatkonnektívumokból kilépő kis idegekben, továbbá a S1NS-t a bélfonadékkal összekötö idegrostnyalábokban is megfigyelhetök. 4.2. A bélfonadék általános morfológiája és immuncitokémiai tulajdonságai Eltéröen a gerinces állatokétól az Eisenia fetida bélcsatornájában egy szubepithéliális helyzetű fonadék található, ami a nyelöcsöi mészmirigynél két részre tagolódik.
Ez a fonadék a gerinces állatok bélplexusaitól abban is különbözik, hogy nem ganglionált, magányos sejtek között, csak néha figyelhetök meg 2-3 sejtböl álló kis neuroncsoportok. A neuronok uni- és bipolárisak, de van közöttük néhány multipoláris forma is. Az idegsejtek kisméretűek (a rövidebb átméröjűk 4-9 f.u1l, míg a hosszabb 8,7-13,8 Ilm). A neuronok igen kis számban vannak jelen a bélfonadékban, ezért az egyes bélszakaszokban csak relatív gyakoriságukat tudtuk megadni. Ennek alapján a legtöbb idegsejt a garatban található, számuk az utóbél felé haladva fokozatosan csökken. _Méreteit tekintve a különbözö kémiai karakterű neuronjai közül a proktolin-ir sejtek a legkisebbek (8,7 :!: 1, 1 f.u1l). Közepes mérettartományba tartoznak a 5-HT-IR (11,3 :!: 1,5 f.u1l), TH-IR (11,2 :!: 2,0f.U1l), OA-IR (10,6 :!: 2,2f.U1l), GABA-IR (10,4:!: 1,5Ilm), FMRFamid-IR (10,4:!: 1,4f.U1l) és a NPY-IR (9,6:!: 0,6f.U1l) neuronok. Legnagyobbak az ETP-IR sejtek (13,8 :!: 2,5f.U1l). A garatban, annak dorzális falánál a GABA-IR és TH-IR neuronok mélyen lehúzódnak az izomrétegbe is. A mészmirigy belső plexusában a vizsgált immunpozitív idegsejtek és rostok mindegyike előfordul, a külső idegfonadékban csak ETP-IR sejteket és rostokat, valamint FMRFamid-IR rostokat figyeltfink meg. 5-HT-IR neuronok csak az utóbéli fonadékban mutathatók ki. Az idegsejtekhez hasonlóan a fonadék idegrostjai is magányosak, csak ritkán figyelhető meg néhány rostból álló, kisebb nyaláb ott ahol a bélszakasz izomrétege fejlett. 4.3. A bélepithél immunpozitfv sejtjei A bél epithéliális rétegében, különösen a garatban, mirigysejtekre emlékeztető, OA-IR (6,3 :f: 0,3J.UIl) és TH-IR (11,9 :f: 1,5J.UIl) sejteket, valamint ETP-IR (13,9 :f: 2,2J.UIl) és GABA-IR (6,2 :f: 0,6 J.UIl) szenzoros sejteket különítettünk el. 4.4. Az előbél mo_ásainak vizsgálata Az izolált előbél rendszertelen spontán mozgásokat mutat, ami Eiseniafelicia esetében alacsony amplitúdójú (4,4 :f: 0,8% a félmaxirnális kontrakciókhoz viszonyítva) összehúzódástjelent. Ez az alaptónus különböző drogokkal módosítható. 4.4.1. Az acetilkolin hatása Növekvő koncentrációjú (10-8 M - IQ-2 M) ACh adagoláskor megállapítható: - a küszöbkoncentráció általában 10-7 M; az ennél alacsonyabb koncentráció (10-8 M) hatástalan. - 10-6 M az a legalacsonyabb dózis, amelyhez a legnagyobb mértékű hatásnövekedés tartozik. (Ezt a koncentrációt alkalmaztuk előkontrahált preparátumok esetében is, így a relaxációs válaszok kifejezettebbé váltak.)- 10-5 M-os koncentrációja félmaximális összehúzódást vált ki. (Ehhez viszonyítottuk a különböző transzmitterek / modulátorok serkentő hatását.) - a maximális amplitúdójú kontrakció 10.3 MACh-nal váltható ki, ami további 10-2 MACh hozzáadásával nem fokozható.
A muszkarjn típusú ACh receptorok előfordulását előkontrahálatlan preparátumon receptor antagonista atropin adagolás sal ellenőriztük. 10-6 M atropin adagolást követően a 10.1-10-3 MACh hatása az előbélre jelentősen csökkent. Annak eldöntésére, hogy a muszkarin típusú receptoron az atropin áttörhető, vagy áttörhetetlen gátlást hoze létre, az atropin kezelést követően, növekvő koncentrációban (10-8 - 10-3 M) ACh-t adagoltunk. Az így kapott összesített válaszok kezdeti mértéke mindig kisebb, mint az atropin kezelés nélküli preparátumoknál. Ha az összesített kontrakciós válasz után, nagyobb koncentrációban (10-2 M) adagoljuk az ACh-t, akkor a válasz közel azonos ahhoz, mint amit a dózishatás görbe maximum értékénél megfigyeltűnk. 4.4.2. A dopamin és oktopamin hatása Az ACh-nal előkezelt, és előkezelés nélküli preparátumokhoz növekvő dózisban (10.1 M - 10-4 M) DA-t, illetve OA-t adva megállapítható, hogy csak nagy koncentrációban (10-6 - 10-4 M) tapasztalható kontrakció. Annak megállapítására, hogy ezen drogok a bélizomzatra közvetlenül vagy más (esetleg kolinerg) idegelemen keresztül fejtik ki hatásukat atropint (10-6 M), valamint gyors feszü1tségfiiggő Na+ csatorna blokkoló tetrodotoxint (TTX; 5xlO.7 M) külön-külön, illetve együtt adagoltunk. Úgy a DA, mint az OA kontrakciós válaszaiban változást nem tapasztaltunk. 4.4.3. A szerotonin hatása 1007 illetve 10-6 M 5-RT az ACh-nal előkezelt preparátumokon kis mértékű relaxációt vált ki, míg előkezeletlen készítményeken változást nem okoz. Magasabb, 10.5 M koncentráció értéknél a kapott válaszok a két kísérlettípusban nem egyértelműek. A 10-4 M 5-RT mindkét típusú preparátumon enyhe kontrakciót idéz elő. 10-6 - 10-4 M 5-RT hatására bekövetkező válaszokat sem az atropin (10-6 M), sem a TTX (5xl0.7M) nem befolyásolja. 4.4.4. A gamma-amino-vajsav és a proktolin hatása Exogén GABA adagolás után mind kontrakciós, mínd relaxációs válaszok is megfigyelhetők. A válaszok szórásának mértéke azonban olyan nagy, hogy a GABA hatását nem lehet értékelni. A proktolin (10-7 - 10-4 M) nem mutatott hatást, ezért kontrollként egér ileumon is teszteltük, ahol kontrakciót váltott ki. 5. KÖVETKEZTETÉSEK Eredményeinket az irodalmi adatokkal összevetve a következő megállapításokat tehetjük: Az Eisenia felicia hat pár STG-jában összesen 276 sejt található. Ezek a sáskákkal sejtszámban, míg a rákokkal és az éticsigákkal morfológiájukban mutatnak hasonlóságot. Az immuncitokémiai vizsgálatok kvantitatívanalizisekor megáuapíthatók, hogy a STG-ban a legmagasabb a
GABA-IR sejtek száma. Csökkenő sorrendben a 5-RT-IR, TR-IR, proktolin-ir és az ETP-IR sejtek következnek, míg legkevesebb a FMRFamid-1R, NPY-IR és az OA-IR neuronok száma. A különböző transzmitter / modulátor anyagok esetleges kolokalizációját jelenleg vizsgáljuk. Az Eisenia STG-jaiban előforduló 5-RT -IR neuron szám közelít a tücskök hasonló dúcaiban található sejtszámhoz. Az Eisenia többi IR sejtjének összehasonlítására a rovarok STG-ában lévő hasonló kémiai. természetű sejtjeinek számával az irodalmi adatok hiányában nincs lehetőség. A bélcsatorna egyetlen fonadékában az idegsejtek szórtan találhatók. Gyakoriságuk alapján a puhatestűek (csigák) és az ízeltlábúak (rovarok) közé sorolhatók. Az Eisenia tápcsatomájának epithél rétegében az OA-IR és TH-IR sejtek endokrin-, míg a GABA- és az ETP-pozitív neuronok primér érzékhámsejtek. A 10-7 - 10-3 MACh jelentősen fokozza előbél mozgásait. Az atropin (muszkarin receptor antagonista) az előbélen hatástalan. Mivel az ACh serkentő hatása jelentősen csökken atropin kezelést követően, az Eisenia fetida előbélizomzata valószínűleg tartalmaz muszkarin típusú receptorokat. Feltételezzük, hogy az atropin kompetitív antagonistaként viselkedik, mivel az atropin kezelést követően csak megnövelt ACh koncentrációval lehet elérni az atropin kezelés nélküli maximális kontrakció mértékét. Az Eisenia előbéli izomzatára a DA és OA serkentő hatású. Ezen szignálmolekulák, továbbá a 5-RT kettős, serkentő {10-5 - 10-4 M) és gátló {10-710-5 M) hatását sem az atropin kezelés, sem atropin és TTX együttes adagolása nem befolyásolja. Ebből arra következtetünk, hogy a DA, OA és a 5-RT hatását közvetlenül az izomzatra fejti ki. A GABA és a proktolin az alkalmazott koncentrációk (10-7 - 10-4 M) mindegyikében hatástalan. Eredményeink alapján bizonyítottnak tűnik, hogy a transzmitter /modulátor anyagok közül egyesek (DA, OA, 5-RT) közvetlenül hatnak bélizomzatra; mások, mint pl. a GABA intemeuronokban lehetnek jelen, de pl. a proktolin a bél szekréciós aktivitását befolyásolhatja. A közvetlen izomhatások arra engednek következtetni, hogy a perisztaltikus körök nem olyan fmoman szabályozottak, mint ahogy azt a gerinces állatoknál tapasztalhatjuk. 6. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 6.1. Publikációk referált tudományos folyóiratokban Csoknya, M., Barna, J., Bánvölgyi, T., Hiripi, L., Eckert, M., Hámori, J., Elekes, K. (1997): Octoparnine-containing neurons in the alimentary tract of the earthwonn (Eiseniafttida). Brain Res., 778,414-417. Csoknya, M., Matsushima, O., Barna, J., Hámori, 1., Elekes, K. (2000): Distribution of Eisenia tetradecapeptide immunoreactive neurons in the nervous system ofearthworms. Acta Biol. Hung., 51, 395-408. Barna, J., Csoknya, M., Lázár, Zs., Barthó, L., Hámori, J., Elekes, K. (2001): Distribution and action of some putative neurotransmitters in the stomatogastric nervous system of the earthwonns, Eisenia fttida (Oligochaeta, Annelida).
J. Neurocytol., 30, (in press). 6.2. Teljes szöveggel megjelenített konferencia előadás Barna, J., Bánvölgyi, T. (1999): Neurochemical organization of the enteric plexus in annelids (Eisenia fetida). Proc. 2nd Intern. Conf. PhD students, Miskolc, 65-71. 6.3. Konferencia szereplések Barna, J., Bánvölgyi, T., Kiss, E., Csoknya, M., Elekes, K., Hámori, J. (1997): Neurochemical organization of the stomatogastric nervous system in Oligochaetes. IV. Com. Hung. Neurosci. Soc., Gödöllő (poster, abstract). Barna, J., Bánvölgyi, T., Csoknya, M., Hámori, 1., Elekes, K. (1998): Peptidergic nervous elements in the enteric nervous system of the earthworm. V. Conf. Hung. Neurosci. Soc., Debrecen (poster, abstract). Barna, J., Bánvölgyi, T., Csoknya, M., Hámori, J., Elekes, K. (1998): The neurochemical organization of the stomatogastric nervous system in Oligochaeta. Forum Europ. Neurosci., Berlin (poster, abstract). Csoknya, M., Matsushima, O., Barna, J., Elekes, K. (1999): Distribution of Eisenia tetradecapeptide immunoreactive elements in the nervous system of earthworms. VI. Com. Hung. Neurosci. Soc., Budapest (poster, abstract). Barna, J., Bánvölgyi, T. (1999): Neurochemical organization of the enteric plexus in annelids (Eisenia fetida). 2nd Intern. Com. PhD students, Miskolc (előadás). Barna, J., Csoknya, M., Bánvölgyi, T., Hámori, J., Elekes, K. (1999): Neurochemical organization of enteric plexus in annelids (Eisenia fetida). X. Cong. Hung. Anat. 80C., Budapest (poster, abstract). Csoknya, M., Matsushima, O., Barna, J., Hámori, J., Elekes, K. (1999): Distribution of Eisenia tetradecapeptide immunoreactive neurons of the nervous system earthworms. 9th 8ymp. Neurobiol. Invertebr., (18IN) Tihany (poster, abstract). Barna, J., Csoknya, M., Lázár, Zs., Barthó, L., Hámori, J., Elekes, K. (2001): Neurochemistry of the enteric nervous system in earthworms and action of some neurotransmitters. VIII. Com. Hung. Neurosci. 80c., Szeged (poster, abstract). Barna, J., Csoknya, M., Koza, A., Elekes, K. (2001): The neurochemical organization of stomatogastric nervous system in earthworms. XI. Cong. Hung. Anat. Soc., Debrecen (poster, abstract). 1. EGYÉB PUBLIKÁCIÓK 1.1. Publikációk referált tudományos folyóiratokban Bánvölgyi, T., Barna, J., Csoknya, M., Lengvári, 1., Hámori, J. (1994): The number of ganglion cells in the intact and regenerated nervous system in the earthworm (Lumbricus terrestris). Acta Biol. Hung., 45, 119-181. Bánvölgyi, T., Barna, J., Csoknya, M. (2000): Reorganization of the peptidergic system during brain regeneration in Eisenia fetida (Oligochaeta, Annelida). Acta Biol. Hung., 51, 409-416. 1.2. Konferencia szereplések Bánvölgyi, T., Barna, J., Scheider, A., Lengvári, 1. (1992): Quantitative analysis of nervous elements of the earthworm, Lumbricus terrestris L. XXth Cong. Hung. Biol. Soc., Kecskemét (előadás, abstract).
Bánvölgyi, T., Barna, J., Csoknya, M., Lengvári, J., Hámori, J. (1994): Quantitative analysis of the intact and regenerated nervous system of the earthworm. XXIst Cong. Hung. Biol. Soc., Pécs, (előadás, abstract,). Csoknya, M, Telkes, 1., Bánvölgyi, T., Barna, J., Elekes, K., Hámori, J. (19%): Regeneration of the central nervous system in Oligochaetes. 3. Proctolinimmunoreactive elements. ID. Com. Hung. Neurosci. Soc., Balatonfi!red (poster, abstract). Bánvölgyi, T., Barna, J., Telkes, 1., Csoknya, M., Elekes, K., Hámori, J. (1997): Effect of GABA-treatment on the regeneration of the brain of Eisenia fetida (Oligochaeta, Annelida). 25th Neurobiol. Conf., Göttingen (poster, abstract). Csoknya, M., Barna, J., Bánvölgyi, :r., Kiss, E., Telkes, 1., Hámori, J., Elekes, K. (1997): The chemical and neuroanatomicai characterization of the brain regeneration in earthworms (Eisenia fetida). IX. Cong. Hung. Anat. Soc., Szeged (poster, abstract). Telkes, 1., Csoknya, M., Barna, J., Bánvölgyi, T., Hámori, J., Elekes, K. (1997): Description of the stages of brain regeneration in earthworms (Eisenia fetida). 27th Ann. Meet. Soc. Neurosci., New Orleans (poster, abstract). Bánvölgyi, T., Barna, J., Csoknya, M., Hámori, J., Elekes, K. (1998): Regeneration of FMRFamide-immunoreactive and proctolin-immunorective neurons in the brain of Eisenia fetida. V. Com. Hung. Neurosci. Soc., Debrecen (poster, abstract). Bánvölgyi, T., Barna, J., Csoknya, M., Hámori, J., Elekes, K. (1998): Peptidergic and aminergic neurons in the regenerating brain of the Eisenia (Oligochaeta). Forum Europ. Neurosci., Berlin (poster, abstract). Markovits, Z., Barna, J., Csoknya, M., Elekes, K. (2000): Distribution of vertebrate-type Ca2+ -buffer proteins in the nervous system of Eisenia fetida. IDR()"Hung. Neurosci. Sac. Milleneum Conf., Budapest (poster, abstract).