Enzim-katalizált (biokatalitikus) reakcióutak tervezése Schönstein László Enzimtechnológiai Fejlesztő Csoport Debrecen, 2016. November 11.
ENANTIOMEREK JELENTŐSÉGE A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN Mik az enantiomerek? Egymással fedésbe nem hozható sztereoizomerek A racém elegy: az optikai izomerek 1:1 aranyú keveréke Enantiomerek tulajdonságai fizikai és kémiai tulajdonságaik megegyeznek, különbséget csak királis anyaggal, vagy behatással (pl. polarizált fénnyel) kerülve kölcsönhatásba mutatnak. Fontosságuk Limonén Thalidomid (contergan) Narancs illatú Nyugtató hatású Mutagén Fenyőtoboz illatú 2
3 Enantiomerek előállítása: - Természetes anyagokból chiral pool (pl. aminosavak, terpenek, szteroidok, alkaloidok) kiindulva - Aszimmetrikus szintézis, királis segédanyagokkal diasztereomerpár, ill. sópár képezhető, melyek fizikai, kémiai tulajdonságai már különbözőek, ennél fogva pl. frakcionált átkristályosítással szétválaszthatóak (azt követően a segédanyagot eltávolítják) - Kromatográfia optikailag aktív adszorbensen - Enzim-katalízis
3 Mik az enzimek és mire használhatóak a kutatásban? Az enzimek: egyszerű vagy összetett fehérjék, királis makromolekulák Enzimes rezolválás: a racém elegyet alkotó optikai izomerek (1:1 arany) elválasztása Enzim-katalizált reakciók jellemzői: - az enzimek a folyamatokat akár 10-12 nagyságrenddel gyorsíthatják - enyhe körülmények között működnek - a reakciókat képesek regio-, kemo-, enantioszelektiven irányítani Enzim csoport Az enzimek által katalizált reakció típusok Néhány példa 1. Oxidoreduktázok Redox reakciók: pl. C-H, C-C es C=C kötések oxidációja 2. Transzferázok Funkciós csoportok átvitele egyik molekuláról a másikra: pl. acil-, glikozil-, foszfátcsoportok, stb. Alkohol dehidrogenáz Transzamináz 3. Hidrolázok Hidrolitikus folyamatok: pl. eszter-, glikozid-, amid-, Lipázok 4. Liázok Addiciós-eliminációs folyamatok: pl. C=C, C=N és C=O Dekarboxilázok 5. Izomerázok Racemizáció, epimerizáció Racemáz 6. Ligázok ATP energia rovására végzett kötésképzés Ligázok
Enzimes reakciók kivitelezése Teljes sejtes (feltárás nélküli): Előnyök: - stabilabb az enzim - szélesebb a reakcióspektrum - kofaktor regenerálásra pl. oxidoredukciós enzimes reakcióknál - költségmegtakarítás (nincs szükség izolálásra) Hátrányok: - gyakoriak a mellékreakciók - az enzimes reakciót gátolja a diffúzió sebessége (a szubsztrátum illetve a termék átjutása a membránokon) - a feldolgozás bonyolultabb (DSP - downstream processing) - a szubsztrátum vagy a termék toxicitása csökkentheti a termelékenységet Izolált enzim: Előnyök: - nem jellemző a diffúziós limitáció - általában kevesebb mellékreakciót tapasztalunk - nagyobb produktivitást érhető el - több enzimes reakció is elvégezhető egy lépésben (enzimatikus kaszkád reakció) - könnyebb tárolhatóság, szállíthatóság Hátrányok: - kisebb lehet a stabilitás a teljes sejteshez képest. - magasabb költség: enzim izolálása ill. redox enzimatikus reakciók esetében a kofaktor regenerálása 5
6 Az enzim immobilizálása Legelterjedtebb immobilizalasi technikak: 1. adszorbcióval egy hidrofób vagy ionos felületre (Van der Waals, elektrosztatikus kölcsönhatások) 2. kovalens kötéssel nem oldodó felületre 3. polimer gélekbe vagy zselatin mikroemulziókba Miért van szükség az enzim immobilizálásra? Immobilzált enzimek: - stabilitás - aktivitás - szelektivitás
7 Enzim-katalizált fejlesztés lépései Modell vegyület Kiválasztás/szintézi Analitika (HPLC/GC) Hatóanyag tartalom/szennyező profil/optikai tisztaság Előkísérletek (mg) Enzimek Acildonor Oldószer (koszolvens) Kofaktor Hőmérséklet Additívek Optimális körülmények alkalmazása preparatív-mennyiségű rezolválás (g) Kilogrammos léptéknövelés Gyártás
Analitikai módszerfejlesztés jelentősége Enantiomerfelesleg (ee), konverzió (konv.) és enantioszelektivitás (E) meghatározása A 1 -A 4 az enantiomercsúcsok területintegráljait jelentik. E (szelektivitás) azt mutatja meg, hogy hányszor gyorsabban alakul termékké az egyik enantiomer, mint az antipodja. E > 100 8
Folyamatos áramú technológia alkalmazása az enzimkatalízisben 9 Primer alkoholok rezolválása Tetrahidroizokinolinvázas vegyületek farmakológiai jelentősége: köhögés csillapító noszkapin köptető hatású emetin daganat ellenes gyógyszer: trabectedin (Yondelis ) Zalypsis rosszindulatú hematológiai tumorok Yondelis + acildonor oldószer
Nyomás hatása a konverzióra és az enantioszelektivitásra 10
12 Primer alkoholok rezolválása S-N-Boc-3-hidroximetil-piperidin kulcs intermedier egy triptáz inhibitor szintézisében Melyik acildonort érdemesebb használni? Milyen előnnyel jár?
Szekunder aminok biokatalitikus rezolválása Potenciális gyógyászati alkalmazás: - Savas reflux (gastroesophagealis reflux disease GERD) - nyombélfekély Lehetőségek: 1. Kinetikus rezolválás Elméleti maximális hozam? 2. Dinamikus kinetikus rezolválás (DKR) Elméleti maximális hozam? 13
3,4-dihidroizokinolinok viszonylag könnyen előállíthatók szintetikus úton 3. Iminből kiindulva 4. Fordított reakció, aminból kiindulva: 14
Szekunder aminok biokatalitikus rezolválása - Mi változik a molekula kiralitása szempontjából, ha kialakul az imin? Boceprevir Hepatitis (hepatitis C virus) 15
Primer aminok biokatalitikus előállítása β-laktámok enantioszelektív gyűrűnyitása 2-es típusú cukorbetegség kezelése β-aminósav etilészter Direkt módszer Körülmények: 200 g/l keton ( 0.5 M) 1 M izpropilamin 50 % DMSO ph 8, 40 C 6 g/l enzim 16
Az eddigi tanulmányaik, tapasztalataik alapján Önök szerint melyik eljárás a célravezetőbb az ipar szempontjából: a szintetikus vagy a biokatalitikus? Miért? 17
Ajánlott irodalom:
Köszönöm a figyelmet!