A martonvásári agrárkutatások hatodik évtizede SZAPORODÁSBIOLÓGIAI KUTATÁSOK A NÖVÉNYNEMESÍTÉS SZOLGÁLATÁBAN BARNABÁS BEÁTA, JÄGER KATALIN, AMBRUS HELGA, FÁBIÁN ATTILA, BAKOS FERENC, PÓNYA ZSOLT, DARKÓ ÉVA ÉS SÁGI LÁSZLÓ Növényi Sejtbiológia Osztály Bevezetés A humán élelmiszer- és állati takarmányforrásként szolgáló növények termésének mennyisége és minősége döntően a megtermékenyülési folyamat sikerességétől függ, melyet számos környezeti tényező befolyásol. Termesztett növényeink többsége virágzatokból alakítja ki termését, ezért a virágzás- és szaporodásbiológia a növénynemesítés (főként a keresztezéses nemesítés és a hibrid előállítás), valamint a vetőmagtermesztés egyik fontos alaptudományának tekinthető. A növényi gaméták egyesülése, a kettős megtermékenyítés folyamata eddig csak nagyon nehezen volt tanulmányozható, mivel a petekészüléket tartalmazó embriózsák a magkezdemény belsejében, mélyen az anyai szövetekbe ágyazottan helyezkedik el. A növényi biotechnológia módszerének és eszköztárának robbanásszerű fejlődése az elmúlt évtizedben új lehetőségeket teremtett a növényi szexuális folyamatok és az embriófejlődés tanulmányozásában, valamint a megszerzett ismeretek gyakorlati alkalmazásában egyaránt. Az évtizedet átfogó munkánk során beigazolódott, hogy a növényi ivaros folyamatok biotechnológiai célú felhasználása (mikrospóra-, illetve petesejt eredetű dihaploid növények előállítása, petesejtbe történő génbevitel, irányított in vitro fertilizáció, stb.) új, a nemesítés számára felhasználható genetikai alapanyagok előállítását eredményezheti. Dihaploid nemesítési alapanyagok előállítása A haploid, azaz csak az egyik szülő kromoszóma készletével rendelkező növények előállításával a jelenség felfedezése óta foglalkoznak a kutatók. A spontán vagy kolchicin kezeléssel megduplázott, kizárólag apai kromoszómákat tartalmazó, mikrospóra eredetű ún. dihaploid (DH) növények in vitro létrehozásával a kívánt homozigóta állapot egy generáción belül megvalósítható, szemben a hagyományos nemesítés több generációra (9-10) kiterjedő önmegporzásos módszerével. A mikrospórákból kiinduló androgenetikus haploid indukció erősen genotípus függő. Kukorica DH növények előállításához kezdetben csak a Kínából származó egzotikus genetikai anyagokkal lehetett sikeresen dolgozni. Az elmúlt tíz év során szisztematikus kutatómunkát folytattunk annak érdekében, hogy a hazai viszonyokhoz jól adaptálható, agronómiailag kedvező tulajdonságú egzotikus forrásanyagok kiemelkedő haploid indukciós képessége kialakítható legyen az egyébként portok-, vagy mikrospóra tenyészetekben nem reagáló genotípusokban. A Kukoricanemesítési Osztállyal együttműködve sikerült olyan vonalakat előállítanunk, amelyek ún. 93
BARNABÁS B. és mtsai male inducer -nek tekinthetők és a velük létrehozott hibridek portok tenyészetéből számos, nemesítési szempontból is figyelemre méltó DH vonal nyerhető (1. ábra). Munkánk során bebizonyítottuk, hogy az egyébként rekalcitráns elit vonalakban is kialakítható az in vitro haploid indukciós képesség. 1. ábra. Nemesítési értékű dihaploid vonalak szabadföldi kísérletben. Részletesen feltártuk az in vitro tenyésztés során a mikrospórák fejlődési folyamatait (2. ábra). 2. ábra. Növényregeneráció a mikrospórák aszimmetrikus osztódása útján kialakult kalluszokból. Megállapítottuk, hogy a kukorica esetében döntően a tenyésztett mikrospórák aszimmetrikus sejtmagosztódását követően kialakuló kallusz szövetben organogenezissel differenciálódnak a dihaploid növénykék. A mikrospórákból kifejlődő struktúrák közül a fehér színű kompakt kalluszok rendelkeznek a legjobb növényregenerációs képességgel (3. ábra). 3. ábra. Fehér színű kompakt kallusz (nyíllal jelölve) és annak szövettani metszete. 94
Szaporodásbiológiai kutatások Áramlásos citometriás vizsgálataink igazolták, hogy a fenti struktúrákat alkotó sejtek kromoszóma készlete már az indukciós fázis kezdetén, spontán módon megduplázódott és ezekből fejlődött a legtöbb életképes, fertilis növény. Portoktenyésztési rendszerünk lehetővé teszi úgy a kukorica, mint a búza mikrospórák in vitro szelekcióját. A mikrospóra fejlődés korai szakaszaiban kezdik meg működésüket az abiotikus stressztoleranciáért felelős gének, így a mikrospórák egy adott stresszel szembeni ellenálló képességükre in vitro szelektálhatók és belőlük növények állíthatók elő. A búza mikrospórák in vitro szelekciójával Al-toleráns növényeket állítottunk elő. A növények utódainak vizsgálata során igazoltuk, hogy a szelektált vonalakban az Al-toxicitás mértéke kisebb, mint az Al-szenzitív növényekben. Ez összefüggésbe hozható kisebb Alfelhalmozódás mellett a növények nagyobb antioxidáns kapacitásával is. Oxidatív stresszt indukáló vegyületek felhasználásával, azaz paraquatot (Pq) tartalmazó táptalajról 5, tetra-butylhidroperoxidot (BHP) tartalmazó táptalajról 4 és metionin+riboflavint (M+R) tartalmazó táptalajról 3 olyan DH vonalat sikerült előállítanunk, melyek lényegesen megnövekedett oxidatív stressztűrőképességgel rendelkeznek, és közülük néhánynak az általános adaptációs képessége (pl. csírázáskori hidegtűrés) is jobb volt, mint a kontroll növényeké (1. táblázat). 1. táblázat. In vitro mikrospóra szelekcióval előállított DH vonalak csírázási képessége Genotípusok Kontroll hőmérséklet T 22 C Hidegkezelés T 8 C Hidegtolerancia Csírázási % Csírázási idő Csírázási% Csírázási idő index (nap) (nap) Hibrid(A-18) 98 3,5 53 13 1,18 DH Kontroll 50 6 15 15 1 R Pq 5 90 3,5 85 13 2,09 R Pq 10 75 4 60 14 1,9 R Pq 14 95 4 90 13 2,14 R BHP 1 89 3 80 13 1,72 R BHP 5 75 4 80 13 2,72 R M+R 5 80 4 50 13 2,0 R M+R 9 90 3 90 13 2,3 A búza petesejtek mikromanipulációja Az osztály fontos kutatási feladata a gabonafélék ivaros folyamatainak komplex vizsgálata. Az elmúlt évek során részletesen tanulmányoztuk a búza petesejt fejlődésének folyamatát a sejtfunkció változásokkal összefüggésben. Transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálataink során megállapítottuk, hogy míg a makrogametogenezis eredményeképpen létrejött női gaméta citoplazmájának perifériáján nagy számban találhatók vakuolumok, a petesejt érése során a citoplazma szerkezet átalakul: a nagyméretű, prominens sejtmagvacskát tartalmazó sejtmag körüli citoplazma gyűrűben fejlett 95
BARNABÁS B. és mtsai endoplazmatikus retikulum és számos sejtszervecske (főleg mitokondrium) található. A citoplazmában lévő vakuolumok mérete lényegesen csökken, ezzel párhuzamosan különböző tartaléktápanyagok felhalmozódása (lipid és protein testek, keményítőt tartalmazó amiloplasztiszok) figyelhető meg (4. ábra). Finomszerkezeti vizsgálataink azt bizonyították, hogy a búza petesejt az antézis idejére fejlődik ki teljesen és receptív állapotában egy metabolikusan aktív struktúra. Ha a megtermékenyülés elmarad, a petesejt fokozatosan elöregedik és két héttel a virágzás után a programozott sejthalál szimptómáit mutatja. Strukturális vizsgálatainkkal párhuzamosan tökéletesítettük a búza petesejt élve izolálásának (5. ábra) és in vitro, dajkakultúrában történő tenyésztésének módszerét (6. ábra). Mikromanipulációs laboratóriumunkban az izolált búza petesejtekbe mikroinjekciós módszerrel különböző géneket és fluoreszcens jelző anyagokat juttattunk be, egyrészt génfunkciós vizsgálatok, másrészt transzgénikus utódok előállítása céljából. Az SZBK Növénybiológiai Intézetével közös kísérletek eredményeképpen parthenogenetikus sejtmagosztódást sikerült indukálnunk a sejtciklus szabályozásában szerepet játszó gének megtermékenyítetlen búza petesejtbe történő injektálásával. Összehasonlítottuk a növényben természetes körülmények között, illetve az in vitro, dajkatenyészetben történő embriófejlődést. Ontogenezis vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a megtermékenyített petesejt a növényben szimmetrikusan, míg in vitro körülmények között aszimmetrikusan osztódott. A későbbiek során az in vitro környezetben fejlődő embriogén struktúrák az embriókra jellemző merisztematikus sejttípusok mellett, perifériájukon az endospermium szerkezetéhez hasonló (nagymennyiségű keményítőt és fehérje testeket tartalmazó) sejtekből épültek fel. Eljárást dolgoztunk ki a búza petesejtek és zigóták krioprezervációjára. A vitrifikációs tárolási módszer segítségével, propilénglikol krioprotektáns, valamint aszkorbinsav alkalmazásával közel 20% -os túlélést sikerült elérni a cseppfolyós nitrogénben történt tárolást követő lassú felolvasztás és rehidratáció után. Szárazságérzékeny és szárazságtűrő búza genotípusok ivaros folyamatainak vizsgálata során kimutattuk, hogy genotípustól függetlenül a termésmennyiség leginkább az együttesen alkalmazott hő- és szárazságstressz hatására csökkent. Hisztológiai vizsgálatok igazolták, hogy a terméscsökkenés oka a megtermékenyülés elmaradásán és a korai terméselhaláson kívül az endospermiumba történő tartaléktápanyag beépülés zavara volt. Aszályos körülmények között a szemtermések fejlődése felgyorsult, de a tápanyagraktárak kimerülése miatt kisebb méretű embriók és töppedt szemek fejlődtek. A szárazság-indukált génexpressziós változások alapján az SZBK Növénybiológiai Intézetével együttműködve megállapítottuk, hogy a stressz a szénhidrát anyagcsere enzimjeit kódoló gének működését befolyásolta elsődlegesen. 96
Szaporodásbiológiai kutatások 4. ábra. Érett, receptív búza petesejtek struktúrája és ultrastruktúrája. a: félvékony metszet fénymikroszkópos képe; b: az elektronmikroszkópos felvételen jól megfigyelhető a kiterjedt, szemcsés endoplazmás retikulum (nyíl) és a nagy számban előforduló mitokondrium (csillag); c: a virágzás idején lipid cseppek (csillag) halmozódnak fel a citoplazmában. 5. ábra. Búza petesejtek izolálása. a: kalász a feltárás előtt; b: antézis korú búza virág; c: feltárt búza termő; d: a termőből eltávolított alsó ovulum fél; e: az alsó ovulumfélből kiszabadított petekészülék az izolálás közben; f: izolált búza zigóták. ao: az ovulum alsó része; ks: központi sejt; ps: petesejt;ss: segítő sejtek. 6. ábra. A mikroinjektált zigóták fejlődése. a: dajkatenyészetben fejlődő 21 napos struktúrák; b: 21 napos embrió; c: szilárd táptalajon fejlődő 5 hetes regeneráns; d: mikroinjektált zigótából fejlődő búza növény fertilis kalászai. Köszönetnyilvánítás Munkánkat az OTKA T46682, az OTKA TO37391, az OTKA K72542, Kukorica konzorcium OM-137/2002, NKFP-OM-00043/2004, NKFP-OM 00018/2004, OMFB 2467, OM- 00208/2001 és az AGRISAFE 203288 sz. pályázatok támogatták. 97
BARNABÁS B. és mtsai Megjelent publikációk Ambrus, H., Darkó, É., Szabó, L., Bakos, F., Király, Z., Barnabás, B. (2006): In vitro microspore selection in maize anther culture with oxidative-stress stimulators. Protoplasma, 228,(1-3) 87-94. Bakos, F., Darkó, É., Pónya, Z., Barnabás, B. (2003): Regeneration of fertile wheat (Triticum aestivum L.) plants from isolated zygotes using wheat microspore culture as nurse cells. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 74, 243-247. Bakos, F., Szabó, L., Olmedilla, A., Barnabás, B. (2009): Histological comparison between wheat embryos developing in vitro from isolated zygotes and those developing in vivo. Sexual Plant Reproduction, 22, 15-25. Barnabás, B. (2003): Anther culture of maize (Zea mays L.). In: Maluszynski, M., Kasha, K. J., Foster, B. P., Szarejko, I. (szerk.) Doubled Haploid Production in Crop Plants. A manual. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, pp. 103-108. Barnabás, B., Jäger, K., Fehér, A. (2008): The effect of drought and heat stress on reproductive processes in cereals. Plant Cell & Environment, 31, 11-38. Barnabás, B., Obert, B., Kovács, G. (1999): Colchicine, an efficient genome-doubling agent for maize (Zea mays L.) microspores cultured in anthero. Plant Cell Reports, 18, 858-862. Darkó, É., Ambrus, H., Stefanovits-Bányai, É., Fodor, J., Bakos, F., Barnabás, B. (2004): Aluminium toxicity, Al tolerance and oxidative stress in an Al-sensitive wheat genotype and in Al-tolerant lines developed by in vitro microspore selection, Plant Science, 166, 583-591. Fábián, A., Jäger, K., Darkó, É., Barnabás, B. (2008): Cryopreservation of wheat (Triticum aestivum L.) egg cells by vitrification. Acta Physiol. Plant., 30, 737-744. Jäger, K., Kőszegi, D., Barnabás, B. (2005): Regeneration capacity of microspore-derived structures in anther cultures of maize. Acta Physiologiae Plantarum, 27, (4B) 621-629. Obert, B., Szabó, L., Mitykó, J., Pretova, A., Barnabás, B. (2005): Morphological events in cultures of mechanically isolated maize microspores. In Vitro Cell Development-Plant, 41, 775-782. Pónya, Zs., Finy, P., Fehér, A., Mitykó, J., Dudits, D., Barnabás, B. (1999): Optimisation of introducing foreign genes into egg cells and zygotes of wheat (Triticum aestivum L.) via microinjection. Protoplasma, 208, 163-172. Spitkó, T., Sági, L., Marton, L. Cs., Barnabás, B. (2006): Haploid induction capacity of maize (Zea mays L.) lines of various origin and of their hybrids. Maydica 51, 537-542. 98