Ph.D. ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Polgár Tímea SZERKEZET ALAPÚ VIRTUÁLIS SZŰRŐVIZSGÁLATOK A GYÓGYSZERKUTATÁS KORAI FÁZISÁBAN Témavezető: Dr. Keserű György Miklós az MTA doktora Richter Gedeon Rt. 2006.
1. Bevezetés A gyógyszerkutatás kémiai szempontból egyik legnagyobb kihívása a kutatási program alapjául szolgáló vezérmolekula azonosítása. Kezdetben a vezérmolekula azonosítását javarészt in vivo kísérletek segítségével végezték, ez a megközelítés azonban napjaink üzleti elvárásainak nem tudott megfelelni, így az in vitro tesztek és a racionális megközelítések kerültek a kutatások középpontjába. A virtuális szűrővizsgálatok (virtual screening, VS) költség- és időtakarékos eljárások, amelyek a nagy áteresztőképességű in vitro módszerek sebességét (HTS) a számítógépes molekulatervezés racionális megközelítéseivel ötvözik. A virtuális szűrések ligandum, illetve szerkezet alapú megközelítés alapján dolgoznak. A szerkezet alapú eljárások a célfehérje 3D-s szerkezetének felhasználásával vizsgálják a potenciális ligandum és az aktív helyet alkotó aminosavak között kialakuló kölcsönhatásokat. Munkám során célul tűztem ki a virtuális szűrési eljárások megismerését, hátrányainak, előnyeinek feltárását, értelmezését és alkalmazhatóságának vizsgálatát. A vizsgálatokhoz a glikogén szintáz kináz 3β (GSK-3β), a β-szekretáz és a c-jun N-terminális kináz 3 (JNK-3) fehérjéket választottam ki. A virtuális szűrővizsgálatok teljesítőképessége legjobban a valós szűréssel összevetve mutatható meg, ezért tűztem ki célul egy választott példán a VS és a HTS tételes összehasonlítását. 2
2. Számítási módszerek A virtuális szűrővizsgálatokhoz felhasznált szerkezeteket a célfehérjék (GSK-3β, β-szekretáz és JNK-3) kristályszerkezeteinek felbontása és a fehérjelánc minősége alapján választottuk ki. A virtuális szűrővizsgálatok a SYBYL molekulatervező programcsomag FlexX Suite modulja (FlexX, FlexX- Pharm, FlexE) segítségével történtek. A tesztelendő adatbázis a hatásos (Prous Integrity adatbázis, szakirodalom) és a hatástalan (World Drug Index) molekulakészletet foglalta magában. A hatásos molekulák arányát, saját kísérleti tapasztalataink alapján, ~0,5%-ban állapítottuk meg. 3. Eredmények 3.1. Virtuális szűrővizsgálatok β-szekretáz inhibitorok azonosítására A β-szekretáz kristályszerkezetek elemzése során rámutattunk arra, hogy a FLAP régió (68-74) konformációja a ligandumkötés következtében megváltozik (1. ábra). A virtuális szűrővizsgálatokhoz a zárt (1FKN, ligandumkötött) és a nyitott (1SGZ, aposzerkezet) FLAP konformációjú csoportból egy-egy képviselőt választottunk. 3
FLAP 1. ábra. Az 1FKN (sárga), 1W51 (zöld), 1W50 (lila), 1SGZ (vörös) kristályszerkezetek aktív helyeinek sematikus ábrázolása. A β-szekretáz szerkezeteken végzett fél-empirikus és molekuladinamikai számítások a katalitikus aminosavak (Asp32, Asp228) protonálódásáról ellentmondásos eredményeket adtak. Az alkalmazott számítási eljárások legszembetűnőbb hibája az volt, hogy a protonálódás ph függését figyelmen kívül hagyták. Ezért a katalitikus Asp32 és Asp228 aminosavak pk a értékeit a fehérjekristályosítás során alkalmazott ph (1FKN: 7,4, 1SGZ: 6,5) értékeknél állapítottuk meg. Számításaink szerint a ligandumot nem tartalmazó szerkezetekben az Asp32 protonált állapotban van. A virtuális szűrővizsgálatokat a FlexX és a FlexX-Pharm algoritmusokkal, protonált és deprotonált Asp32 aminosavat tartalmazó kristályszerkezeteken (1FKN, 1SGZ) végeztük el. A rangsorolt adatbázis első 1%-ában (100 molekula) az aktív molekulák 42%-át (21 inhibitor) sikerült azonosítani a FlexX-Pharm és a protonált Asp32 aminosavat tartalmazó kristályszerkezet alkalmazásával. 4
Ezzel egy hatékony virtuális szűrési eljárást sikerült kidolgozni. Vizsgálataim során megállapítottam, hogy a β-szekretáz szerkezeten végzett virtuális szűrővizsgálatok teljesítőképességét a farmakofór megkötések és a titrálható aminosavoldalláncok helyes protonáltsági állapota javítja. 3.2. Virtuális szűrővizsgálatok GSK-3β inhibitorok azonosítására A GSK-3β kristályszerkezetek elemzése során megmutattuk, hogy a szerkezetek az aktív helyen található Gln185 aminosavoldallánc konformációjában különböznek jelentősen (2. ábra). A virtuális szűrővizsgálatokhoz a Gln185 aminosavoldallánc konformációja alapján meghatározott csoportokból választottunk egy-egy kristályszerkezetet: 1Q4L, 1Q3D, 1UV5. Egy hatékony virtuális szűrési eljárás kidolgozását követően a Richter vegyülettár egy 16299 molekulát tartalmazó alkönyvtárát szűrtük le. A 16299 molekulán végzett virtuális szűrővizsgálatok eredményeit összevetettük a 16299 molekula biológiai aktivitásmérésének (HTS) eredményeivel. 5
2. ábra. A ligandumkötésben résztvevő aminosavak és a kötött ligandumok az 1Q5K (narancssárga), 1Q4L (sárga), 1Q3W (kék), 1PYX (zöld), 1UV5 (bíborvörös), 1Q41 (vörös) és 1Q3D (ibolya) kristályszerkezetekben. Az összehasonlító vizsgálat során elvégeztük: 1) a dúsulási faktorok elemzését, 2) a hamis negatív/pozitív találatok elemzését, 3) és a találatként azonosított szerkezeti csoportok összehasonlítását. A dúsulási görbék összevetésével (3. ábra) megmutattuk, hogy a virtuális szűrés a rangsorolt adatbázis első néhány százalékában hatékonyabb, azonban nem képes az összes inhibitor azonosítására. A HTS, bár azonosította a hatásos molekulák 100%-át (a biológiai mérés hibájától eltekintve) a véletlenszerű szűrésével összevethető dúsulási görbét mutatott. 6
Találatok % 100 90 HTS 80 Véletlenszerű szűrés 70 VS 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 Rangsorolt adatbázis % 3. ábra. A VS és a HTS dúsulási görbéje. 2000 0 Gátlás % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 5 - - 0 + + -5-10 -15-20 -25-30 -35-40 FlexX értékelőfüggvény 0 2000 4. ábra. A gátlás% ábrázolása a FlexX pontszámok függvényében. A kék pontok a nem hitelesített HTS találatokat jelölik. A piros karika a valós +/- találatokat, a zöld a hamis +/-találatokat jelzi. A hamis negatív találatok elemzésével rámutattunk arra, hogy ezekért egyrészt a farmakofór megkötések, másrészt az értékelőfüggvények a felelősek. A leghatékonyabb VS módszer a 90 hitelesített találatból 21 molekulát azonosított (4. ábra). 7
A HTS 90 hitelesített találatát hat szerkezeti csoportba soroltuk. A virtuális szűrési eljárás a hat csoportból négyet azonosított. A vizsgálataink rámutattak arra, hogy a virtuális szűrési eljárások valós pozitív találati aránya a rangsorolt adatbázis első néhány százalékában meghaladja a valós szűrését. Így a VS költség- és időtakarékosabbá válik, azonban az eredmények nagy számú hamis pozitív és negatív találattal terheltek. 3.3. Virtuális szűrővizsgálatok JNK-3 inhibitorok azonosítására A JNK-3 kristályszerkezetek összehasonlító elemzése az 1PMU szerkezet Gly-gazdag láncának (71-78) eltérő konformációjára hívta fel a figyelmet (5. ábra). A virtuális szűrővizsgálatokat a FlexX, FlexX-Pharm és FlexE algoritmusokkal összesen öt szerkezeten végeztük el. Az 1PMU szerkezeten végzett virtuális szűrővizsgálatok kiemelkedő hatékonyságát az aktív helyének eltérő konformációjával magyaráztuk. A FlexE algoritmus használatával a fehérje flexibilitását kíséreltük meg figyelembe venni. Az eljárás hatékonysága a legkedvezőbb esetben a FlexX algoritmuséval összemérhető volt. Vizsgálataink során megállapítottuk, hogy ha a kristályszerkezetek oldallánc konformációinak kombinálásával (FlexE) vesszük figyelembe a fehérje flexibilitását, az eljárás hatékonysága nem javul a FlexX algoritmuséhoz képest. 8
Gly-gazdag hurok 5. ábra. Az 1PMV (lila), 1JNK (sárga, AMP-PnP), 1PMN (kék), 1PMU (vörös) és 1PMQ (zöld) szerkezetek aktív helye. 4. Alkalmazási lehetőségek Az eljárásokat gyógyszergyári környezetben felmerülő problémák megoldására dolgoztuk ki. Az alkalmazott módszerek a Társaság kutatási programjaiban rutinszerűen kerülnek felhasználásra. 9
Az értekezés alapját képező közlemények: Polgár, T.; Keserű, G. M. Virtual Screening for β- Secretase (BACE1) Inhibitors Reveals the Importance of Protonation States at Asp32 and Asp228. J. Med. Chem. 2005, 48, 3749-3755. Polgár, T.; Baki, A.; Szendrei-Ignácz, G.; Keserű, G. M. Comparative Virtual and Experimental High- Throughput Screening for Glycogen Synthase Kinase- 3β Inhibitors. J. Med. Chem. 2005, 48, 7946-7959. Polgár, T.; Keserű, G. M. Ensemble docking to flexible active sites. Critical evaluation of FlexE against JNK-3 and β-secretase, J. Chem. Inf. Model. 2006, 46, 1795-1805. Polgár, T.; Keserű, G. M. Virtual Screening. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 3E. 2005. Taylor&Francis, LLC. Polgár, T.; Keserű, G. M. 7th International Conference on Chemical Structures, The Netherland, Noordwijkerhout, 2005, előadás: An effective screening protocol for β-secretase (BACE1) Polgár, T.; Keserű, G. M. SBS' 11th Annual Conference & Exhibition, Geneva, 2005. Poszter: Comparative Virtual and Experimental High- Throughput Screening for Glycogen Synthase Kinase- 3β Inhibitors. 10