1 UNIVERSITÉ FRANCOIS RABELAIS TOURS Ecole Doctorale : Information Biologique Environnement et Santé Année Universitaire : 1998-1999 THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L UNIVERSITE DE TOURS Discipline : Sciences de la vie Par Fabrice BÉNÉDET Soutenance le 23 juillet 1999 Modalités de reconnaissance d un ravageur, Acrolepiopsis assectella, par son parasitoïde, Diadromus pulchellus : identification et perception d un signal polypeptidique FIGURES & TABLEAUX JURY : R. BROSSUT Directeur de Recherche - C.N.R.S. - Dijon Rapporteur Y. CARTON Directeur de Recherche - C.N.R.S. - Gif sur Yvette Rapporteur J. F. FERVEUR Chargé de Recherche - C.N.R.S. - Dijon Examinateur J. HUIGNARD Professeur - Université de Tours Examinateur S. RENAULT Maître de Conférences - Université de Tours Examinateur E. THIBOUT Directeur de Recherche - C.N.R.S. - Tours Directeur de thèse
1 2 3 1 2 28S a b Figure 29 : Hybridation du gène de séricine de Bombyx mori sur l ADN génomique (a) et les ARNs totaux (b) d Acrolepiopsis assectella. a) 10 g d ADN génomique d A. assectella ont été digérés par 3 enzymes de restriction, EcoR1 (ligne 1), BamH1 (ligne 2) et Pst1 (ligne 3), puis déposés sur gel d agarose 0,8 %, séparés par électrophorèse dans un tampon TAE 1X pendant 1h à 90 V, transférés sur membrane de nylon et hybridés à 65 C avec une sonde du gène de Ser 1 de B. mori. b) 15 g d ARNs totaux de larves (stade L4 et L5) (ligne 1) ou de chrysalides (ligne 2) d A. assectella ont été déposés sur gel d agarose en condition dénaturante, séparés par électrophorèse dans un tampon MOPS 1X, pendant 12 h à 25 V, transférés sur filtre de nitrocellulose et hybridé à 65 C avec la sonde du gène de Ser 1 de B. mori.
kb M 1 23,1 9,4 6,6 4,3 2,2 2,0 28S 16S 0,5 Figure 30 : Profil d électrophorèse des ARNs totaux des larves L4 et L5 d A. assectella. 10 g d ARNs totaux ont été déposés sur un gel d agarose 0,8%, séparés par électrophorèse dans un tampon TAE 1X pendant 1 h à 90 V et colorés au bromure d éthidium (0,5 g/ml de BET). M : marqueurs de taille (kb) correspondant à un phage digéré par HindIII ( HindIII).
CLUSTAL W (1.7) multiple sequence alignment AF095242 : Galleria mellonella sericin 2 m RNA partial sequence AF095241: Galleria mellonella sericin 1 m RNA partial sequence Z48802 : Bombyx mori Ser 1B mrna AF095242 AF095241 Z48802 SSSTNNSSGSSSTNNSSGSSSTNNSSGSSSTNNASGSSSSNNTSGSSRNNSS GSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSS GSS GSSTSGGSSTYGYSSDSRDGSVSSTGSSSNTDASTDLTGSSTSGGSSTYGYSSDSRDGSV.*....:.*:***...:*...:**.*.:. *..*.* AF095242 AF095241 Z48802 GSSSSN NSSSGSSAGNSSGSS SSNSSGSSGIGSLSRNSSSSSSSQAAGSSSSRRVSAD GSSGSS GSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSSGSS GSSSSSSSNGSGSSSGSSQSS SSTGSSSNTDASTDLAGSSTSGGSSTYGYSSSNRDGSVSATGSSSNTDASTTEESTTSAG.*:.*..:...:...** *. **. **.. *.::.***. :.::. *: AF095242 AF095241 Z48802 GSSSSSSASNSAAAQ GSQGGSSSTSSSNKT SSTEGYSSSSHDGSV.*. *::.. Figure 31 : Alignement à partir des banques entre les séquences partielles en acides aminés des séricines 1 et 2 de G. mellonella et la séricine 1 B de B. mori pour obtenir des motifs répétés proches. Les motifs sont indiqués en grisé.
des L5 Chr ysa li es L 4 et Lar v 28S Figure 32 : Hybridation de l oligonucléotide SERICI3R codant pour le motif oligopeptidique SGGSSS présent dans les séricines de B. mori et G. mellonella sur les ARNs totaux de larves (L4 et L5) et de chrysalides d A. assectella.
kb M 1 2 3 4 5 6 21,2 5,1 4,9 3,5 2,0 1,9 1,7 1,3 0,9 0,8 0,5 Figure 42 : Amplification PCR des ADNs complémentaires des ARNm en utilisant les amorces réo et soit B1oligoa1 (ligne 1), soit B1oligoa2 (ligne2), soit B1oligob1 (ligne3), soit B1oligob2 (ligne4), soit B2oligoc1 (ligne5), soit B2oligod1 (ligne6). 50 l des solutions d amplification sont déposés sur un gel d agarose 0,8%, séparés par électrophorèse dans un tampon TAE 1X pendant 1 h à 90 V et colorés au bromure d éthidium (0,5 g/ml de BET). M : marqueurs de taille (kb) correspondant à un phage digéré par EcoR1 et HindIII ( EcoR1-HindIII).
Clone 4 Clone 5 Clone 3 Clone 2 Signal positif peu spécifique Clone 6 Clone 1 a b Figure 43 : Autoradiographie de deux membranes de nylon contenant des phages recombinants de la banque «au hasard» après hybridation par les oligonucléotides B1oligo(b1 + b2) marqués (les plus probables). La température d hybridation choisie est le Tm moyen des oligonucléotides moins 4 C soit 46 C. a) Résultat positif du premier criblage (20 000 phages) montrant des plages de phages positives. b) Résultat positif peu spécifique du deuxième criblage après réétalement de l une des plages de lyse du criblage 1, transfère sur membrane et réhybridation avec les mêmes sondes.
kb M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 23,1 9,4 6,5 2,3 2,0 a b Figure 45 : a) Amplification PCR de l ADN des phages recombinants. L ADN de 6 plages de phages a été amplifié en utilisant les oligonucléotides complémentaires de l ADN du phage situé de part et d autre du site de ligation. L ADN amplifié est déposé sur un gel d agarose 0,8%, séparé par électrophorèse et coloré au BET (ligne 1 à 6). M : marqueurs de taille (kb) correspondant à HindIII. b) Autoradiographie après hybridation du gel sur membrane de nylon par les oligonucléotides B1oligo(b1 et b2) marqués radioactivement (température d hybridation = 46 C).
Clone S23 Lgt10R TATGAGTATTTCTTCCAGGGTAAAAAGCAAAAGAATTCCGTTGCTGTCGAAAGACTAAAAGAATA CCGTGCCCGCCTCATTCTTTCCCGAAGCAAGAAGGTACTAAAGGGAGAAGCCAATGAGGAAGAGTG TAAGTTGGCTACTCAACTCCGTGGACCTTTGATGCCAGTGCAGCAACCAGCACCTAAGTCCATTGCT AGGGCTATCACTGAAGAGGAGAAGGACTTCAAGGCCTACCAATATTTGAGAGGGGCTCGTTCCATT GCCAAGCTTGTTGGTATTCGTGCTAAGCGGCTTAAGGATGCTGCTGAAAATCCAGATGATGTAACA AAGGCACCGACAGCAACGGAATTCAGCTTGGACTTAACCAGGCTGAACTTGCT Lgt10F Clone S30 Lgt10F AGCAAGTTCAGCCTGGTTAAGTCCAAGCTGAATCCCGTTGCTGTCGGGGAAGTTTCCTTCCTCAA ATTGCTGAATAGGAGGAGGTATGTCAACACCACTGACAGTAATCTCATGTTGATTTCGGTACTGCTC AACTTCGTACGGAGAACGATTCAGTACTGTGGCATGTGGGTTGTAAAAGTTTTTGTTAAATGGCTGT AGTGACATAGACTCCCAATTAGGACGGCGCATGTTTTGGCCTCCAGTGAAATCTTTTTTGCCACCAA AGCCTCCACCAGAATTTCCAAAGCGGTTGCCGCCGCCGCCACCGCCTCCACCGCCAAATCTTGAAC CACCGCCGCCACCACCACCTCCGCTACCGAATCGAGATGATCCACCGAATTTGGAGCACCACCGCT TCCGCGGCTATTGTTCCAGCTTCCAGACATGATGTGATCGATGTTTATTTGAAGATGTAACAGATTT ATACAGATTACTATCACTGTGTCGCAGGGTCGATCTAACAGGCATGTAACCGACAGCAACGGAATTC TTTTGCTTTTTACCCTGGAAGAAaTACTCATAA Lgt10R Clone S40 Lgt10F AGCAAGTTCAGCtTGGTTAagTCCAAGCTGAATTCCGTTGCTGTCGGTGTAAAGTAGCTAATCAG CTAAAATTTTAATTCCTGTTGGAACAGCAATGATTATTGTAGCAGAAGTAAAATATGCACGTGTATCA ATATCTATTCCTACTGTAAATATATGATGAGCTCAGACAACAAATCCTAATATTCCAaTAGCTATTATA GCATAAATTTAtTCCTAAACtTCCAAaAGTtTCTTTTTTTCCTCTTTCTTGAGATATAATATGAGATATTa TTCCAAATcCAGGTAAAATTAATATATTATCTTCGGGATGTCCAAAATATCAAAATAAATTGTGATATA ATATTGGGTCTCCTCCTCCAGCTGGGTCAAAAAAGGATGTATTTTGGTTTCGATCAGTTAATAATATA GTAATAGCACCTGCTAAAACAGGTAAAGATAAAGGTAATAATAGGCAGTAGTACCTACAGCTCAAAC AAATAAaGGTATTCGATCAAGATATTCCATTAGATCGTATATtAgTGAtTGTTGTGATAAgaTTAATTG CTCCTAAGATAGATGaTATTcCAGCTAAATGaAGGGgAAAAgtaGCTAATTTACTGatCTaGCTCTATG GGCATATTAGaTGaTATTGgGGGtATACTGtTCAaCTGtTCCTGCTCCATTTCtaCATaCTTgCGaCAGC AACGCATTCTTTTGCTTTTtAcCCtgGGaGGAtaCTCataAG Lgt10R Figure 46 : Séquence nucléotidique des clones S23, S30 et S40. Pour chacune des séquences sont indiqués l oligonucléotides correspondant aux oligonucléotides Lgt10(R et F).
kb M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6 23,1 9,4 6,5 2,3 2,0 a b Figure 47 : a) L ADN de 6 clones purifiés après digestion par EcoR1 a été déposé sur un gel d agarose 0,8%, séparé par électrophorèse et coloré au BET (ligne 1 à 6). M : marqueurs de taille (kb) correspondant à HindIII. b) Autoradiographie après hybridation du gel sur membrane de nylon par les oligonucléotides B1oligo(b1 et b2) marqués (température d hybridation = 46 C).
Clone SE2 ATGACCACTGGATCTCCTCTCATCGGACGAGGAGCTCCGATCACTGATCACATCCCTGATAAACGAT TTGACACGCGCGAgTCCATTCTGcTTGGGCGCTACACTAGGCTTATCCAATGAGCTCGAcAGCAACG GAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCAATTTGCCCTAT AGTGAGTCGTATTACGcGCGCTCACtGGCCGTCGTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGT TACCCAACTTAATCGTCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGTCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGg ACCGATCGTCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTG TTAAAAaTTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAA ATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCCAGTTTGGAACAAGGA GTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCC ACTACGTGAACCATCAcCCTAATCAAGTTTTTTGGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGAATTAAaTYGGAA CCCTTAAA Figure 48 : Séquence du clone SE2. Aucun des oligonucléotides n a été retrouvé.
1 2 Figure 50 : Amplification PCR de l ADNc des phages recombinants de la banque «au hasard» en utilisant un des oligonucléotides Lgt10 (F) complémentaires de l ADN du phage et soit l oligonucléotide B1oligob1 (ligne1) ou soit l oligonucléotide B1oligob2 (ligne2). 50 l des solutions d amplification sont déposés sur un gel d agarose 0,8%, séparés par électrophorèse et colorés au BET.
clones b1f24 Ac. Aminés K V L P P K R K R S K Nucléotides AAGGTGTTGCCGCCGAAGAGAAAGAGATCGAaATGAGTGCTGAAAACTCACCAAATACCTCGAGATTCGCCGACTTGTCGTCCCGCGCCGCATCGCCCGCGAAGACTCAAAT AGCTCGAGTAGCTCTGAGCTCAAGAACcCCAAACCTGCCCAGACTCTGCCATAGACCTCACCAAGAAGATTACCAGAACCGCCAACTTCTACCAGGAGACCCTAAACCTAGA AGAAACCCCGCACGCGAGGTCATCCAACCCAATCCTATATACACCGCGCAACCtTCAACGTCATACATGGATAAGATCACCAAACCGTTGAACAATAACAGTGTACCGACGG CGCCCGTAACGCCGGTGTTAAATATAGATTTCAGTAAGAACCCAGCGTTACCAGAGATTAAAGTCTTAGACGCGGGTTTGGGGGCCCCGAAAGCGTTCAAAGCGGTGTCGAG ACAGAATTCGCGGCAGAAAACCGAAGTGAAAAAGCCTGAGCCGAAACCGACAGCAACGGAATTCAGCTTGGACTTAACCAGGCTGAACTTGCTAATCACTAGTGAATTCGCG GCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCT GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTaCACACAACATACGAGNCGGGAAGCATAAAGTGTAAAGaCTGGGGGTGcCTAATGAGTGAGCTAACTCACAYTAATTGNGGTGNG gtcactgnccgnttttnccagtcgggnaaactgtcgtgccactgcaataatgaatcggncaacgcgcgggnagagcggttttncgtawtagggggctcttacgntttcttgn TCAMTNACTCGNTGNGNTCGGTCGtTTCGGNTGcGGgGGAGGGGTATtANTNATNAANNGTATAG b1f32 Ac. Aminés Nucléotides K V L P P N. R D N R S L AAAGTGTTGCCGCCGAACTGAAGAGACAATCGGAGTTTGTcTTATACTCCGAACCCATTTTTGGAGCAGAAGGAGGTTTCCCGAAAGAGTTCGCTGAAAGAGTAGCCGCAAA GAGTATGGAACAAGGCTTCCCCAGGTCTCGCCTGCCAGAATTCACTGATGAAGAAAGGGAATTTGTCCGCGGCGCTTCTGATTTCTTTGGAGTTAATCATTACACTGGAAGT TACATCTCTGCTACAGAGAATTTAGGACAGCACCCAGTTCCTTCTTTACTGGATGACGTGAACGTGGGATTCGTCACACCAGCTGAGTGGGCATCGTCTGCATCTTCCTGGC TTAAGTTAGCGCCTAACAGCATCTTGAACACCCACGACAGCAACGGAATTCAGCTTGGACTTAACCAGGCTGAACTTGCTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGT CGACCATATGGGAGAGCTCCACACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGT TATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGACTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTc TCCACTCGcGAaACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCACGCGCGgGGAGAGGCGGttTGCGTATTgGGCGCTCTTCCGCTTtCTCGCTCACTGACTCGCTGCGC TCGGTCGcTCCGGCTGCGNCGAGCGGTATCAACTCACTCAAAGGCGGTAATACGGNTATCACAGAAATCAGGGGATAACGCAGNAAAGNACATGTGAGCAAAAGGCCAgCAA AAGgcCAGGAACCcTAAAAAGACCcCgNTTNCTgGCGTTTTTTCATAGgCTCCgCCCCCCCaACGAGCAT b1f45 Ac. Aminés K V L P P N. N K S R R K P N S Nucléotides AagGTGTTGCCGCCGAACTAGAACAAGAGCAGAAGGAAGCCCAACTCTAACAGCAGAAGAAGTAGCACAGAAGCAACAAGAGACCACCGCCGCGGTCAGTAACATTCGGGAC AAGCTCAAGAGAAAGGGCAGTCCAGAAGCAGAAGAGATCAAGAAGAGTAAACcGGAGAGTGAGAGTgGGAGTgAGGAAGAAGAGTATTACTTGGGGAAGGAGAAAGATGATg CTAGAAGGAAGGAGACGACAGCAACGGAATTCAGCTTGGACTTAACCAGGCTGAACTTTCTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCcTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTC CCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAaATTGTTATCCGCTCACAATTCCAC ACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGgGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAcTCGGGaAACCTGTC GTGCCAGCTGCATTAATGaATCGGCCAACGCGCGgGGAGAGGCGGTTTgCGTATTgTGCGCTCTTCGCTTCCTCGCTCACTgACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCtGC GAGCGGTATCATCTCACTCAAGgCGgTAATACGGtTATCCACAGAATCACGGGATAACGCAGNAAAAGACAT b1f62 Ac. Aminés Nucléotides K V L P P K P. G S G P. AAGGTGTTACCGCCGAAGCCATAGGGATCCGGACCGTGAATCTTAACATATTCTCTCTCCATCTCCTGAGTCCACGTGGTATCCGTTTCGTCTGGCAGCATCCAGTCTTCGC AGTACTGAGCGTGTTTGAAGCATATCCCGTTGAGCGCATCCGGCATGACGTCATCCTCCGGCCGGTCTTTGTACATGTCTATGATTTCGTCCTCGTTGGCCTCGAACATACG CTCACAATAATACTCCAAGCTCTTGTTAAGATCGTCATCAGTGACGAAGGTTGTCTTACTGAACTCCGGGTTCATACCGCCCCCTGGTGTCATGAGCTGCATAATCGCTAAC TTGCCGGTCGATTTGTAGTACACGCGAACGTAGTCGTCCATCTTCTTGCAAATGGTATCAACCATCTCGGAGATGTGCACAGCGGAGNNTGGGCGGGCACTTTGTCCTGCAT TGTGTTGCCGTCCGCGTCCATTCTGAAGTTGCCCACATCAATGGTTTTCCATTTATCTATCTTTTTTATCGCATCATTAAGCTCTTCGAAGGTTGTTCGACATACAAGGCAC TTGAGATTTTTCGGATCGATTTTCGCCGATACTACGGCAATAGTTGCTAGAAGTATTAATGAAACTGCATCTTAATCGcACAAGTTATTAATTTCCGACAGCAACGGAATTC AGCTTGGACTAACCAGGCTGNACTTGCTAaTCGaANTTCCGCGNCGCATGCSGNGAGCATCGaCGTCGGCCATTCGCCTATAGTGAGTCGTATACATTCACTGGGCGTCGTT TNACAACGTCGTGACTGGGaAAAACCTGGCGNTACCCAACTTaATCGNCTTGCAGCACATTCCCCTTTTCGGCAGCNTGCGTAANTAGCGNAGAgGgcCCGCACCGNaTCGN CCNTTTCCAACAGNTGC b1f64 Ac. Aminés s Nucléotide K V L P P K T V I A T V I AaAGTCTTGCCGCCGAAgACGGTGATAGcgACGGtgATACGCGAATaATGAaAGTGTTAAACCCGCTCAGACCAAGGGAAATaAAAaATTAGCAGTAGCATCTgATGATAGT gatgatgaaaagccaaaagcaaataataaacataaaaagtctgtggatgaagatgtcaaagaagtcacaaaaaatatcaagaatgtctctatttcaaacaaatcgcagaaaa AGAAAACAGAaATCAGTAGTAATGAAGATTCAgATGAAGAACCTATGACTAAGCCCAAAaAGGGTAAAAAGAAAGAGGACAAGAaAAGTGCTTTTTCTCTCTTGGACATAGA AGATGCTGATATTTtACCTCCAGAAGCACAACCTTcATCTGAAGATGACACACAGGCTCAaaaWACTCAaAAAAAGGCTAATGATAAGAaAGATGCCTCTGGTAAGAtAGGC AAAATAGCAAAAAGGAGAAAAGACGACAGTGATGAAGATTTAGAAAAAGTTCTAGCTGAATTAGAtATGGGATATTCTGGGGTTAAAAAGGAACCACGCCTCCAGCTCCGGC ACCGGAACAACCAACTGAACCAGCTGAAGAGAACCTAAaAAAAGATAAAAGCCAAGCCTGAGCCAGAACCTACTACAGAAGCAGTTGATGGCAGTTACAATGAGCGGAGGTG ATGTGATTATTAAACTCCGACAGCTaCGGGATTCAGCTTGaCTTTACCAgGCTGACTTGCTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGcCTGCAGGTCGACCATATGTAGAGCTCC AACGCGTTGGaTGCATAGCTTgAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGCGTAATCATGGTCATAACTgTTTCCTgTGTgATaATTNTTATCCGCTCACAATTCCACAC AACATACGAGCCGGAaGCATAAAAGTGTAAAaCTgGGGGTGCCTaATGAGTTGAGCTANCTCACATT Figure 51 : Séquences oligonucléotidiques des clones b1f24, b1f32, b1f45, b1f62 et b1f64. Pour chaque séquence ont été indiqués l oligonucléotide B1oligob1 et les acides aminés correspondant à chaque codon. Les quelques acides aminés qui suivent sont également indiqués.
kb M 1 2 23,1 9,4 6,5 4,3 2,3 2,0 Figure 52 : Amplification PCR (Expand Long Template PCR System, Boehringer Mannheim) des ADN des phages recombinants de la banque «polya» en utilisant les amorces Lgt10(F ou R) et soit B1oligoc1 (ligne 1), soit B1oligod1 (ligne2). 50 l des solutions d amplification sont déposés sur un gel d agarose 0,8%, séparés par électrophorèse dans un tampon TAE 1X pendant 1 h à 90 V et colorés au bromure d éthidium (0,5 g/ml de BET). M : marqueurs de taille (kb) correspondant à un phage digéré par HindIII ( HindIII).
Clone 20 Ac. Aminés A I P H P D T G L A S G Nucléotides GCCATACCGCATCCGGATACAGGCCTCGCTTCCGGCAATACTCGTAAACCATATCAACCAGCTCGCTGACGTTTGGCAGTCCGGCGGTAACGGATGCT TCTTCCCGGCACCATGCAACAAACTGCCCGGGTGATGGCAGAGATGGTCGATTCTGCCGACGGGCTACGCGCATTCCTGCGTTAACCTGTTCCATCGT GGTGATCCCGTTTTCCCGAAAAGCCAGAACCCACTGGCGACGGATTTGGTTCACGTCGTTCTGGTCACGGTTAGCCAGGCTCGCCGGGAAAGTGGCCA GTAACKGGCTGAACACACCGTTGATGATCTGCGCTACCTGCTGTACCGGCGGCTTTTGGTCGTACTGTTCCGGCATGTTGTTGGCGATCCGACGGATC TGCTCACGGTCAAAGTTAACCATCTGTGCGGCGATGTTTTTGATAGAGCCACCCCGTAAATGCAGTCTGTGTTTGTGAGGGCGAGTTTTGGTTTGCTG GGTGGCACGCCTGCCTG. Lgt10F AGCAAGTTCAGCCTGGTTAAGTCCAAGCTGAATTCCGTTGCTGTCGCGACAGAAcGAATTCTTTTGCTTTTTACCCtGGAAGAAATACTCATAAGCCA CCTCTGTTATTTACCCCCAATCTTCACAAGAAAAACTGTATTTGACAAACAAGATACATTGTATGAAAATACAAGAAAGTTTGTTGATGGAGGCGATA TGCAAACTCTTTCTGAACGCCTCAAGAAGAGGCGAATTGCGTTAAAAATGaCGCAAACCGAACTGGCAACCAAAGCCGGTGTTAAACAGCAATCAATT CAACTGATTGAaGCTGGCGTAACCAAGCGACCGCGCTTCTTGtTTGaGATTGCTATGGCGCTTAACTGTGAtCCGGTTTGGTTACAGTACGGACTAAA ACGCGGTAAAG.. Clone 30 Ac. Aminés E Q F K D V E N A R H S F Nucléotides GAGCAGTTCAAAGATGTGGAAAATGCACGTCATTCATTTCGTCATTAATTATCACTGTGCTCATTAATTAACAGAACACGTATAATGAGAGCCATCTC GCAAAAATGAAAAAACGTTTTATAAAATCATCACTTCATCATGAATTCAAATTCATTGATTAATATCAACAAGATACAAAAAGCACTATCATTAAAAT TCATTGCAGTTACATTGATTTCATCAATGAAATGTAAAAATATATAAACTTGATGATTTAAGCATTTTCTTATACCCGTTCAGACGTTATTCTTATTT CAGATCATCGTCAGAATTGACTCCACGATCACATTTCGGACCGGCAGAAAGGAATTATTCTGCAAAACAGTAATTATGGTGTTTTGATTTATCTTGCA CCTCTCCACTTCTGGATATAAGGATATTAGGTATGGCAACCGCTGGAATGCTTCTCAAACTCAACTCTCAAATGAACCGCGAGTTTTACGCATCCAAT CTCTACCTTCACCTGAGTAACTCGTGTTCTGAACAGAGTCTGAACGGCACCCCACTTTCCTTCGCGCCCAGGCACAGAGT.. Ac. Aminés E Q F K D V P P A I C Nucléotides GaGCAGTTCAAGGaCGTACCGcCAGCAATATGTTCCGaTAACAAAAAACCGGCTCCGGCAGTTTTTTTTGTGTCCTGaTGACGGTGGaTGTGACTTCG ctgaagatgtgaagtcgctactataacggctttcaaaatgctatcaggagtttacgatgtcccagccgttgaatgccgagcaggaattggtttcgatg TGGTTGCTTGCCTAGTTGGTTATCAAACAAATTCTGGATGNCTCGATGTAATCGCGCTCCGTTGAAGTTCGTGAAAAAATGTCCAGTCAGCTGaaGAA TATCGaCTtTACTAACCATCCCGTCGTCGTAGACCCGGTCACCATGCGGGCAATCCAAAAAGCCATCGTGCTTATTGAACTCAAGTTTACCCCACAGG GTGAATCCCATTAAAAAAACCGTTGcTTTAAACAGATGTGGTAGCG. Figure 53 : Séquence des clones 20 et 30. Pour le clone 30, deux séquences sont indiquées, elles correspondent aux séquences des deux extrémités du fragment. Pour chaque séquence ont été indiqués l oligonucléotide B1oligob1 et les acides aminés correspondant à chaque codon. Les quelques acides aminés qui suivent sont également indiqués.