A BIOTECHNOLÓGIAI MÛSZAKI HÁTTERE Gyors és egyszerű laktózkimutatás indikátorpapír-módszerrel Tárgyszavak: laktóz-túlérzékenység; laktázhiány; laktózkimuatás; indikátorpapír. A laktázaktivitás hiánya vagy csökkenése embereknél a laktóz-túlérzékenység klinikai tünetegyüttes kialakulásához vezet, ami a laktózlebontásra való képtelenséget jelenti. Ez a kórkép különböző fizikai tünetekkel jár (túlzott bélgázfejlődés, hányinger, görcsök, hasmenés). Jelenleg nincs módszer a betegség kialakulásának megelőzésére, de kiküszöbölhetők a tünetek a tejtermékek fogyasztásának elkerülésével. A laktóz kimutatására többféle bioérzékelő típus kapható, amelyek különböző enzimeken alapulnak. A laktózkimutatás kulcsenzime a különféle hőstabil forrásokból izolált β-galaktozidáz. Eddig már több immobilizációs módszert próbáltak ki, hogy különböző tesztek céljára indikátorpapírt (biocsíkokat) dolgozzanak ki. A laktózérzékenységnek rendkívüli egészségi következménye van, különösen a világ szegény populációja körében, ahol a tej gyakran az egyedüli, hozzáférhető tápanyagforrás. A kísérletek célja egy gazdaságos és egyszerű élelmiszerekben levő laktóz kimutatására alkalmas módszer kidolgozása. Anyagok és módszerek Enzimek készítése A β-galaktozidázból 2 U-t (egység), galaktóz-oxidázból 4 U-t és tormaperoxidázból U-t oldottak együtt µl,1 M citrátpufferben (ph = 6,2), majd erőteljesen rázták és 4 C-on tárolták. Kromogének készítése A kromogénoldathoz,1 M citrátpuffert (ph = 6,2) kevertek o-dianizidinnel (1 mg/ml), ABTS-sel 2,2 -azino-bisz(3-etil-benzotiazolin-6-szulfonsav) (2 mg/ml) és krezolzölddel (1 mg/ml). Ezután µl kromogénoldatot adtak ugyanannyi enzimkeverékhez a mátrixokon való rögzítés céljára.
Pufferek készítése Különböző ph-jú citrát- és foszfátpuffreket használtak az új módszer standardizálásához. Az indikátorpapír reakcióidejét ezalatt azonos szinten tartották. Laktózkimutató indikátorpapírok készítése Az enzim/kromogén oldatot Whatman-szűrőpapíron,,2%-os glutáraldehiddel immobilizálták egy páramentes kamrában.teljes megszáradás után a papírt 5 mm széles darabokra vágták. Ezután egy műanyag (PVC) lapot (1 mm vastag) 9 9 cm-es darabokra vágtak. A rögzített enzimmel bevont papírokat felragasztották a műanyag lap egyik pereméhez semleges ragasztóanyaggal. A lapot megszárították egy páramentes kamrában, 3 4 óra hosszat, majd,5 9 cm-es darabokra vágták úgy, hogy a papírcsík egyik végén volt az enzim, míg a másik vége megfogható volt. A csíkokat sötétbarna palackokba helyezték, amelyek SiO 2 -os zacskókat tartalmaztak, majd szobahőmérsékleten tárolták. Eredmények és értékelés Laktáz (4 U/ µl), galaktózoxidáz (4 U/ µl) és peroxidáz ( U/ µl) bizonyult optimálisnak a szín kialakulásához különböző laktózkoncentrációnál, állandó reakcióidő mellett (12 s). A különböző, kipróbált pufferek közül a citrátpuffer (,1 M, ph = 6,2) volt a legmegfelelőbb (1 3. ábra). 35 3 reakcióidő (s) 5 1 2 3 4 5 6 laktáz laktáz (U/ (U/ µl) ul) 1. ábra Laktázkoncentráció hatása a színgradiens kialakulási idejére
reakcióidő (s) 35 3 5 1 2 3 4 5 6 galaktózoxidáz (U/ µl) 2. ábra Galaktózoxidáz koncentrációjának hatása a színgradiens kialakulására 4 35 3 reakcióidő (s) 5 5 3 peroxidáz (U/ µl) 3. ábra Peroxidázkoncentráció hatása a színgradiens kialakulási idejére A tej és tejtermékek laktóztartalma különböző analitikai módszerekkel határozható meg. Ezek az eljárások szakképzett személyzetet és korszerű műszereket (spektrofotométer, bioérzékelő stb.) igényelnek, míg a most kidolgozott indikátorpapír módszer gyors laktózkimutatást eredményez. A papírcsíkot belemártják a tejbe vagy tejtermékbe, és a kialakuló szín egy színskálával öszszehasonlítható. A csíkon különböző színárnyalatok (világoskéktől a sötétbarnáig) jelennek meg a minta laktóztartalmától függően (1. táblázat). A tesztcsík érzékenysége 2 g laktóz/l. A csík színe nem változott szignifikánsan
2 g laktóz/l alatti laktózkoncentráció esetében. Kontrollként laktózmentes tejet használtak, amellyel különböző laktózkoncentrációjú oldatokat készítettek. A csík reakcióideje 12 s volt. Ebben a laktózos csíkban az együtt rögzített enzimek (β-galaktozidáz, galaktózoxidáz és peroxidáz) és a kromogének reagálnak a mintában levő laktózzal, ami a csík enzimes végén a megfelelő szín kialakulását eredményezi. A kifejlődő szín intenzitása arányos a laktózkoncentrációval. A laktózkimutatással járó színek tej és tejtermékek esetében 1. táblázat Laktóz (g/l) 2 4 6 8 Szín világoskék sárgásbarna világosbarna barna sötétbarna Az enzimek rögzítéséhez különböző típusú mátrixokat (Whatmanszűrőpapír, Millipore-szűrőpapír, nejlonpapír) próbáltak ki és a Whatman-papír bizonyult legalkalmasabbnak, mert ez nem reagált az enzimekkel és kromogénekkel, ezenkívül a legjobb színgradienst adta. Az indikátorpapír szobahőmérsékleten egy évig stabil száraz körülmények között tárolva. A papír alkalmazása megelőzheti a laktóz-túlérzékenységi szindróma kialakulását. Mivel vizuális értékelési módszer, nincs szükség speciális képzettségre vagy bonyolult műszerekre. A próba gazdaságos és alkalmazható tejüzemekben, kórházakban és olyan távoli helyeken, ahol költséges felszerelés nem áll rendelkezésre. (Dr. Pálfi Ágnes) Sharma, S. K.; Sehgal, N.; Kumar, A.: A quick and simple biostrip technique for detection of lactose. = Biotechnology Letters, 24. k. 2. sz. 2. okt. II. p. 1737 1739. Furlan, S. A.; Schneider, A. L. S. stb.: Formulation of lactose-free low-cost culture medium for the production of β-galactosidase by Kluyveromyces marxianus. = Biotechnology Letters, 22. k. 7. sz.. ápr. p. 1737 1739. Tkac, J.; Sturdik, E.; Gemeiner, P.: Novel glucose non-interference biosensor for lactose detection based on galactose oxidase-peroxidase with and without co-immobilized β- galactosidase. = Analyst, 125. k. 9. sz.. p. 1285 1289.
Röviden GMO-mentes takarmányok ellenőrzése Világviszonylatban nagy jelentőségű feladat adatbanki háttérrel követni a takarmánytermelést az elvetett magtól kezdve és tanúsítvánnyal szavatolni GMO-mentességét. Ennek 5-től érvényes feltételei és a feladat elvégzésének módozatai körvonalazódtak a Vitacert (a Müncheni Egyetem és a délnémetországi TÜV, azaz Műszaki Felügyelet közös vállalata) és a Cert ID cég (a GMO-analitika úttörője, a Genetic ID és a brit Law Laboratories élelmiszervizsgáló labor által alapított vállalat) takarmánygyártókkal folytatott vitái és egyeztető munkája nyomán. A megbeszélések egyik célja az iparágat előkészíteni arra a 5-ben hatályba lépő EU-törvényre, amely előírja a GMO-mentesség hitelt érdemlő deklarálását, a másik a fogyasztók és a kereskedők kielégítő és folyamatos ellátása nem-gmo -takarmányokkal, valamint ilyenekkel táplált állatok húsával és termékeivel. Ez utóbbiak kínálatát ezideig csak a brit szupermarketek tudják felmutatni. A fenti tárgyaló vállalat ügyfelei a két nagy cég adatbankjának köszönhetően már ma abban a helyzetben vannak, hogy a termelő országokban (Brazília, India) tanúsított nyersanyagig visszamenve, az európai jogszabálynak megfelelő szójatakarmányt kínálhatnak. A kereskedő rendelkezésére állnak a felügyeleti és auditálási jelentések a vetőmagtól a lisztig (ill. a takarmánymalomig), továbbá mindenkor lehívhatók a GMO-elemzések eredményei is. Egy ilyen, minden érintett számára kötelező, ill. hozzáférhető rendszernek mostantól számítva két brazíliai betakarítás után már állnia és működnie kell. A követhetőséget biztosító rendszernekmostantól számítva két brazíliai betakarítás után már állnia és működnie kell. A követhetőséget biztosító rendszer, a termelő- és feldolgozóüzemeken kívül magába foglalja a teljes logisztikát, a raktáráruházaktól a közlekedési eszközökön át a kikötői létesítményekig. Az ilyen átlátható lánc végén álló ügyfél a hatóságnak és a lakosságnak is igazolhatja áruja nem-gmo voltát, és ezt marketingjében, reklámjában is felhasználhatja. A Cert ID már 4 Mt szójadaráról beszerzett ilyen értelmű környezetvédelmi tanúsítványt. Ezeket a feldolgozó Indiából és Brazíliából lehívhatja. A cég ezzel elsősorban brit kereskedők és élelmiszergyártók kívánságának tett eleget. A Vitacert, amely az európai piacon a kiváló minőséget jelző TÜV által vizsgált élelmiszercímkével szerzett igényes vevőkört és elismerést, szolgáltató spektrumát újabban kiegészítette a TÜV által vizsgált takarmány címkéjű termékkel. (Mühle + Milschfutter, 139. k. 12. sz. 2. jún. 6. p. 354.)