Egészségtudományi Közlemények, 2. kötet, 1. szám (2012), pp. 11 19. KARBON NANOCSÖVEK ANALÍZISE: ELVÁLASZTÁSI LEHETŐSÉGEK RÉVÉSZ CSABA 1, KÉCSÁN KAMILLA 2, SZEBENI JÁNOS 2, ROSIVALL LÁSZLÓ 3, FODOR BERTALAN 4, BENEDEK KÁLMÁN 2,5 Összefoglalás: A karbon nanocsövek biológiai alkalmazása széleskörű, a nanorészecskék ezen csoportját alkalmazzák gyógyszerkutatásban, diagnosztikában. A karbon nanocsövek szerkezetükből kifolyólag nagy felülettel rendelkeznek, ezáltal alkalmasak különböző anyagok adszorpciójára. Fehérjemegkötésre csak a funkcionalizált (pl. karboxil, aminocsoporttal felületmódosított) karbon nanocsövek alkalmasak A szénalapú nanorészecskék azonban felhalmozódhatnak a szervezetben, ami egészségügyi problémák kialakulásához vezet. Ezért nagy figyelmet kell fordítani a nanorészecskék visszanyerésére. Munkánk során funkcionalizált karbon nanocsöveket vizsgáltunk különböző típusú fehérjét tartalmazó közegekben. Kulcsszavak: funkcionalizált karbon nanocső, nanocső diszpergálás, méretmeghatározás, nanocsövek szűrése, fehérjeadszorpció Bevezetés A gyógyszerkutatásban és diagnosztikumban hasznosított nanorészecskék [1 3], fizikai tulajdonságaik alapján két nagy csoportra oszthatók: kemény és lágy nanorészecskékre. A lágy részecskék szerves vegyületekből épülnek fel, molekuláris átrendeződés, illetve szerves szintézis vagy polimerizáció útján hozhatók létre, legjellegzetesebb képviselőik a liposzómák [4], micellák, dendrimerek és polimerszómák [5]. A kemény nanorészecskék szervetlen anyagokból készült kisméretű részecskék [2], mint a fém (arany és ezüst) [6], a szilika nanorészecskék vagy a szénből készült szénporok, illetve karbon nanocsövek [7, 8]. A szén alapú nanorészecskék fontos szerepet töltenek be, főleg mint gyógyszerhatóanyag hordozók [1, 9], illetve mint környezetvédelmi szempontból vizsgált, kedvezőtlen egészségügyi mellékhatásokkal jelentkező anyagok. A szén alapú nanorészecskék különösen fontos szerepet játszanak különböző pulmonáris eredetű betegségekben [10, 11]. Normális életvitel mellett nanorészecskék csak a légzés által kerülnek a szervezetbe, és pulmonáris gyulladásokban játszanak szerepet [12]. A szén nanocsövek egyik legnagyobb problémája a praktikus felhasználás szempontjából [13], hogy nem vagy csak nagyon lassan ürülnek ki a szervezetből, és így folyamatos egészségügyi problémák forrásai lehetnek. A karbon nanocsövek elválasztása biológiai mintákból egyre gyakrabban felmerülő problémát okoz. A nanocsövek fajsúlyuk és méretük alapján nem különíthetők el a biológiai, főleg 1 Seroscience Kft., Budapest 2 Nanomedicina Kutató és Oktató Központ, Semmelweis Egyetem, Budapest 3 Institute of Pathophysiology, Faculty of Medicine, Semmelweis University, Budapest 4 Miskolci Egyetem Egészségügyi Kar, Nanobiotechnológiai és Regeneratív Medicina Tanszék, Miskolc 5 igori, Thousand Oaks, CA, USA
12 Révész Kécsán Szebeni Rosivall Fodor Benedek fehérjetartalmú közegtől [14]. Ugyanakkor a nanorészecskék sorsa, felhalmozódása a szövetekben, visszanyerésük és kvantitatív kiértékelésük fontos a biológiai hatásmechanizmus felderítése érdekében [15]. A jelen közleményben szén alapú nanorészecskék visszanyerésére centrifugális molekulaszűrőt alkalmaztunk. A biológiai közeget albuminnal és szérummal modelleztük, és a nanocsövek fehérjeadszorpcióját is megvizsgáltuk. Anyagok és módszerek Anyagok: Nanocsövek: Többfalú szén nanocsövek különböző funkciós csoportokkal: karboxil- (- COOH), amino- (-NH 2 ) vagy azok kombinációival, illetve a nem funkcionalizált ( Pristine ), Fehérjék: szarvasmarha szérum albumin (BSA, Sigma), humán szérum (egészséges önkéntesektől), Fehérjemérés: Bradford reagens (BioRad), Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific), Detergens: Tween-20 detergens (Sigma), Molekuláris szűrők (100, 300, 1000 kda, Sartorius Stedim). Eszközök: Branson-ultrahang szonikátor, Probe-type feltéttel, méretmeghatározás Zetasizer Nano S (Malvern) FluoStar Multiplate Reader 1. A nanocső diszpergálás módszere A szén alapú nanocsövek alkalmazása vizes közegben, szuszpenziók készítése nehézségekbe ütközik [8]. A hidrofób nanorészecskék a preparálás során összeálltak makroszkopikus részecskékbe. A szuszpenzió készítése érdekében a poralakban rendelkezésre álló kiindulási anyagokat diszpergálni kellett. A diszpergálásra ultrahangot használtunk, és a diszperziókészítés hatásfokát részecskeméréssel követtük. A nanocsöveket 0,04% Tween- 20 detergenst tartalmazó vízben 1 mg/ml koncentrációban ultrahangoztuk Eppendorfcsőben. A szonikálás 1 2 perces lépésekben történt, és a nanocsövek méretét az ultrahangos diszpergálás szüneteiben lézer diffrakciós módszerrel megmértük. 2. A nanocső méretmeghatározása A mérés során a részecskék méreteloszlásával, az egyes csúcsok átlagméretével és a polidiszperzitási indexszel (PDI) jellemeztük az egyes mintákat. A nanocsövek felépítéséből és alakjából adódóan nagyobb PDI-eket kapunk, mint szférikus részecskék mérése esetén, ezért a méretmeghatározáshoz 10 mérést végeztünk. 3. Fehérjekoncentráció mérése A minták fehérjetartalmának meghatározását két fotometriás módszerrel végeztük: Bradford-reagnessel [16] és BCA Kit-tel [17]. A Bradford fehérje meghatározás 5 mikroliter, a BCA fehérjemérés 25 mikroliter mintából, 200 mikroliter reagens hozzáadásával, 96 lyukú mikroplate-en, 595, illetve 562 nm-en történt.
Karbon nanocsövek analízise: Elválasztási lehetőségek 13 4. Fehérjeadszorpció mérése és szűrő kiértékelés A nanocsöveket 10 mg/ml koncentárciójú BSA-oldatban, illetve humán szérumban 20 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, általában mg/ml nanocső koncentrációban. Az inkubálás és így az esetleges adszorpció létrejötte után a fehérje- és fehérje-nanocső mintákat 100, 300 és 1000 kda-os centrifugális molekuláris szűrökön szűrtük 15 000 g-n 20 percig szobahőmérsékleten, majd a szűrőn maradt anyagot desztvízzel történő reszuszpendálása után újraszűrtük a fenti módon (Filtrátum 1 és 2). Ezután a szűrőn át nem ment anyagot 1% Tween-20 detergenssel mostuk át, majd újracentrifugáltuk a fenti módon. A detergenssel történő mosást még kétszer megismételtük (Filtrátum 3 5). A minták egyes szűrleteinek fehérjetartalmát Bradford- és BCA- fehérjeméréssel meghatároztuk. a 3. pontban leírt módon. Eredmények A nanorészecskék, így a szén alapú nanocsövek különleges tulajdonsága a hatalmas felületük. A 600 900 m 2 /gramm felület rendkívül alkalmas lehet különböző, a biológiai közegekben előforduló anyagok adszorpciójára. Az ilyen méretű felülettel, ~2mg/m 2 albumin adszorpcióval számolva ~120mg albumin adszorpcióját várhatjuk grammonként. Ez hatalmas fehérjemennyiséget jelent, amit kényelmesen lehetne mérni nagyon alacsony karbon nanocső esetén is. A kérdés az, hogy ez a hatalmas felület hozzáférhető-e a fehérjéknek? A szén alapú nanorészecskék alapanyaguk természetéből eredendően hidrofób felülettel rendelkeznek, de kémiai módszerekkel változatos felületi tulajdonságokat lehet szintetizálni az inert felületen [8]. Ebben a munkában olyan szén alapú nanocsöveket is kiértékeltünk, amelyek felületét módosították. Detergensek használata a szuszpenzió stabilitás érdekében. Észrevételek Csak a felületi töltéssel rendelkező anyagokat lehetett tartósan homogén szuszpenzióba vinni. A hidrofób nanorészecskék kezelése hidrofil folyadékokban különös nehézségekbe ütközött. A töltéssel nem rendelkező részecskék kitapadtak a Falcon- és Eppendorf-cső falára, illetve kicsapódtak a vizes közegből. Ez a jelenség hosszabb idő után (több hét) a felületmódosított nanocsövek esetében is megfigyelhető volt. Fehérjeadszorpció nanocsöveken A fehérjeadszorpció vizsgálata különösen fontos a nanorészecskék biológiai környezetben való viselkedésének megértéséhez [18 20]. Feltételeztük, hogy a fehérjék adszorbenssel való érintkezés során adszorbeálódni fognak a nanocsövek felületén. A kísérlettervezés szerint a nanocsővel inkubált fehérjék egy része kötődni fog a nanocsövek felületén, és az inkubáló fehérjeoldat eltávolítása után is a felületen marad. A nanocsöveken visszamaradt fehérjéket megfelelő eluenssel eltávolíthatjuk, és az eluátumoldat fehérjetartalmát megmérhetjük. Az adszorpciós kísérletet mindegyik rendelkezésünkre álló karbon nanocsővel elvégeztük. A kifejlesztett módszert a későbbiekben adszorpciós izotermák mérésére használhatjuk. A fehérjeadszorpciós kísérletek körülményeit BSA-val és -COOH nanocsővel optimalizáltuk. A nanocsöveket szűréssel választottuk el a folyadékfázistól. A fehérje koncentrációt
14 Révész Kécsán Szebeni Rosivall Fodor Benedek Bradford-reagenssel mértük 595 nm hullámhossznál. Miután a nanocső szuszpenzió nagyon kis részecskéket is tartalmazhat, előfordulhat, hogy átmennek a szűrőn, és belezavarhatnak a fehérjemérésbe, ezért megmértük a nanocsövek abszorpcióját is 595 nm-nél. A nanocsövekre kapott kalibrációs görbét a 1. ábra mutatja be, a nanocső kalibrációs görbéje lineáris, jó regressziós koefficienssel. 1. ábra. CNT kalibrációs görbe A módszer a nanocsövek koncentrációjának mérésére is remekül használható. Jelen kísérleteink szempontjából ez a mérési módszer egy kritikusan fontos mérésnek bizonyult, mert a szűrők kiértékelését, nanocső elválasztó képességét, mérhetjük. A nanocsövek koncentrációmérésére szolgáló módszer kidolgozása után, következő lépésként megmértük a szűrők nanocsőáteresztő képességét. Szűrőválasztás Három, 100, 300 és 1000 MW pórusméretű szűrőt értékeltünk ki abból a szempontból, hogy melyiken marad vissza maradéktalanul a nanocső szuszpenzió.
Karbon nanocsövek analízise: Elválasztási lehetőségek 15 1,2 1 0,8 ug/ml 0,6 0,4 0,2 0 100k 300k 1000k 2. ábra. Nanocső koncentráció a szűrletekben A 2. ábrán látható, hogy a nanocső mennyiség mérhető az 595 nm abszorpció mérésével, és így meghatározhatjuk azt a nanocső koncentrációt, ahol a fehérje-mérés nem zavarja a nanocső meghatározást, illetve a nanocső koncentráció nem zavarja a fehérjemérést. A nanocső filtrátumainak mérésekor a 1. táblázatban megjelenített értékeket kaptuk. Nanocső koncentráció (ug/ml) a szűrletben 1. táblázat Centrifugálás 5 min Szűrőméret g/ml 100k 0,101 300k 0,157 1000k 1,056 Az adatok alapján az 1000 MW pórusméretű szűrő a felvitt nanocsövek kb. 10 %-át engedi át, míg a 300-as és 100-as csak 1 1,5%-át, így nagymértékben visszatartja a nanocsöveket. Mivel a 10 ug/ml nanocső szuszpenzió OD595 értéke 0,0045 0,0055 a 100k és 300k szűrés után, amennyiben a fehérjemérés nagyságrenddel nagyobb OD-értéket mutat ennél, a szűrletben esetlegesen megjelenő nanocsövek nem zavarják a mérést. A 300k és
16 Révész Kécsán Szebeni Rosivall Fodor Benedek 100k filterek minimálisan engedik át a nanocsöveket, tehát ezen két filter használható lehet a nanocsövek eltávolítására. A filterek fehérjeáteresztése A következő kísérletben ugyanezt a mérést ismételtük szérummal (3. ábra). 90 mg/ml protein 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Serum Serum 1000k Serum 300k Serum 100k 3. ábra. Szérumfehérje koncentráció a különböző pórusméretű filtereken átment szűrletekben A kérdés az volt, hogy a szérumfehérjék vajon átmennek-e a szűrökön. Az eredmények azt mutatják, hogy a 300 MW szűrő átengedi a fehérjéket, a 100 MW nem. Az előzőekben leírt kísérletek alapján úgy tűnik, hogy a 300-as szűrő lenne az optimális azokban a kísérletekben, ahol a nanocsöveket szeretnénk visszanyerni biológiai mintákból. Fehérje adszorpció Az első kísérletsorozatban a nanocső elválasztás körülményeit vizsgáltuk. A mintaviszszanyerésnél fontos tudni, hogy a biológiai mintából származó nano-csövek megkötik-e a fehérjéket vagy sem. A következőkben a fehérjeelúció körülményeit és a nanoszuszpenzió preparálása során fellépő fehérje veszteséget vizsgáltuk. Először állandó nanocső mennyiség mellet változtattuk a fehérje koncentrációt, és eluens jelöltekkel mostuk át a nanocső szuszpenziót. Az inkubálás után a mintát centrifugáltuk, és a filtrátumot (Filtrátum 1) félretettük fehérjemérésre. A filteren maradt nanocsöveket desztillált vízzel újraszuszpendáltuk, majd ismét centrifugáltuk (Filtrátum 2). A szűrön maradt nanocsöveket a különböző eluens oldatokkal ismételten szuszpendáltuk és centrifugáltuk. Az eluálási lépést még egyszer megismételtük (Filtrátum 3 és 4), majd meghatároztuk a filtrátumok fehérje koncentrációját. A fehérje koncentrációt a Bradford-módszerrel mértük, 96-well platen. A második ábra a fehérjemennyiséget mutatja a különböző filtrátumokban, különböző kiindulási fehérje koncentrációnál. Látható, hogy az első és második filtrátumban az eredeti nanocső-fehérje
Karbon nanocsövek analízise: Elválasztási lehetőségek 17 szuszpenzióban levő fehérjék nagy része megjelenik, és a második két mosás (elúció) nagyon kevés vagy semmi fehérjét nem tartalmaz. Úgy tűnik, hogy kísérleti körülmények között, a BSA nem adszorbeálódik szignifikánsan a -COOH nanocsövekhez. Szérumfehérjék adszorpciója A BSA-val folytatott kísérletek a módszer beállítására és standardizálására szolgáltak egy jól ismert modellfehérje felhasználásával. Az albumin már nem ment át a 100-as szűrőn, és a 300-as valószínűleg visszatartotta az albuminnál nagyobb fehérjéket. Az igazán fontos kérdés az, hogy mi történik a nanocsövekkel, ha szérummal kerülnek kölcsönhatásba. A szérumfehérjék mind méret, mind koncentráció megoszlás tekintetében nagyon széles spektrumot képviselnek. Úgy tűnik, hogy hiába van a nanocsöveknek hatalmas felülete, kis méretük miatt nem szükségszerűen adszorbeálnak szignifikáns mennyiségű fehérjét. A következő kísérletben a szérumfehérjék adszorpcióját vizsgáltuk. Összefoglalás Szeparálási és mérési metodikákat dolgoztunk ki a nanocsövek biológiai közegbeli kimutatására. A kísérletek alapján a 300 kd centrifugális molekulaszűrő tűnik a legjobbnak az általunk vizsgált paraméterek mellett. A szűrő sikeresen visszatartja a nanocsöveket, és a fehérjéket két mosásban visszanyerhetjük. A kísérletek egyik nagyon érdekes eredménye, hogy a vizsgált fehérjék nem kötődnek a nanocsövekhez, noha a kísérlettervezés során szignifikáns fehérje-adszorpcióra számítottunk. Az adszorpció hiányának vizsgálata következő munkáinkban történik meg. Úgy tűnik, hogy bár a felület hatalmas, de nem hozzáférhető a fehérjék számára. A kifejlesztett módszer ígéretesnek tűnik, és további kísérleteinkben ezzel a módszerrel vizsgáljuk a nanocsövek adszorpciós tulajdonságait. Köszönetnyilvánítás Jelen munka a TÁMOP-4.2.1.B-10/2/KONV-2010-0001 jelű projekt részeként az Új Magyarország Fejlesztési Terv keretében az Európai Unió résztámogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg. Irodalomjegyzék [1] des Rieux, A., et al.: Nanoparticles as potential oral delivery systems of proteins and vaccines: A mechanistic approach. Journal of Controlled Release, 2006, 116(1), 1 27. p. [2] Almeida, A. J., E. Souto: Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins. Advanced Drug Delivery Reviews, 2007, 59(6), 478 490. p. [3] Bhattacharya, M., et al.: Carbon nanotube based sensors for the detection of viruses. Sensors and Actuators B: Chemical, 2011, 155(1), 67 74. p. [4] Moghimi, S.M., et al.: Complement activation cascade triggered by PEG PL engineered nanomedicines and carbon nanotubes: The challenges ahead. Journal of Controlled Release, 2010, 146(2), 175 181. p.
18 Révész Kécsán Szebeni Rosivall Fodor Benedek [5] Kumari, A., S. K. Yadav, S. C. Yadav: Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010, 75(1), 1 18. p. [6] Goyal, R. N., et al.: Effect of gold nanoparticle attached multi-walled carbon nanotubelayered indium tin oxide in monitoring the effect of paracetamol on the release of epinephrine. Analytica Chimica Acta, 2011, 693(1 2), 35 40. p. [7] Foldvari, M. and M. Bagonluri: Carbon nanotubes as functional excipients for nanomedicines: II. Drug delivery and biocompatibility issues. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2008, 4(3), 183 200. p. [8] Valentin N, P.: Carbon nanotubes: properties and application. Materials Science and Engineering: R: Reports, 2004, 43(3), 61 102. p. [9] Cai, C., et al.: Charged nanoparticles as protein delivery systems: A feasibility study using lysozyme as model protein. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2008, 69(1), 31 42. p. [10] Hirano, S., et al.: Uptake and cytotoxic effects of multi-walled carbon nanotubes in human bronchial epithelial cells. Toxicology and Applied Pharmacology, 2010, 249(1), 8 15. p. [11] Jos, A., et al.: Cytotoxicity of carboxylic acid functionalized single wall carbon nanotubes on the human intestinal cell line Caco-2. Toxicology in Vitro, 2009, 23(8), 1491 1496. p. [12] Schulze, C., et al.: Interaction of metal oxide nanoparticles with lung surfactant protein A. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2011, 77(3), 376 383. p. [13] Semete, B., et al.: Effects of protein binding on the biodistribution of PEGylated PLGA nanoparticles post oral administration. International Journal of Pharmaceutics, (0). [14] Labarre, D., et al.: Interactions of blood proteins with poly(isobutylcyanoacrylate) nanoparticles decorated with a polysaccharidic brush. Biomaterials, 2005, 26(24), 5075 5084. p. [15] Zhao, X. and R. Liu: Recent progress and perspectives on the toxicity of carbon nanotubes at organism, organ, cell, and biomacromolecule levels. Environment International, 2012, 40(0), 244 255. p. [16] Marion M, B.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1 2), 248 254. p. [17] Smith, P. K., et al.: Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry, 1985, 150(1), 76 85. p. [18] Patil, S., et al:, Protein adsorption and cellular uptake of cerium oxide nanoparticles as a function of zeta potential. Biomaterials, 2007, 28(31), 4600 4607. p. [19] Song, L., et al.: Human fibrinogen adsorption onto single-walled carbon nanotube films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2006, 49(1), 66 70. p. [20] Wu, X. C., et al.: Non-functionalized carbon nanotube binding with hemoglobin. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 65(1), 146 149. p.