PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR, KESZTHELY NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Doktori iskolavezető: Dr. habil. Kocsis László egyetemi tanár DSc Témavezető: Dr. habil. Kocsis László egyetemi tanár DSc Társ témavezető: Dr. Füzi István Ph. D. Az Erysiphe necator QoI-fungicidekkel szembeni rezisztenciája szőlőültetvényekben Doktori (Ph. D.) értekezés Készítette: Taksonyi Péter Keszthely 2012. 1
Tartalomjegyzék 1. A kutatómunka előzményei... 3 2. Célkitűzések... 5 3. Alkalmazott vizsgálati anyagok és módszerek... 6 3.1. Az Erysiphe necator (Shwein) ellen alkalmazható QoI-hatóanyagok és fungicidek ültetvényben történő összehasonlító vizsgálata... 6 3.2. A szabadföldi kísérletekben használt QoI-fungicidek hatékonyságának in vitro vizsgálata... 11 3. 2. 1. A vizsgálat helye... 11 3. 2. 2. A vizsgálat anyaga... 11 3. 2. 3. A vizsgálat módszere... 12 3.3. Magyarország egyes borvidékeiről származó lisztharmatgomba-populációk in vitro vizsgálata QoI-rezisztenciára... 13 3. 3. 1. A kísérlet helye... 13 3. 3. 2. A kísérlet anyaga... 13 3. 3. 3. A vizsgálat módszere... 13 4. Eredmények és következtetések... 14 4. 1. Az Erysiphe necator (Shwein) ellen alkalmazható QoI-hatóanyagok és fungicidek szabadföldi összehasonlító vizsgálata.... 14 4. 2. A szőlőlisztharmat QoI-rezisztenciájának molekuláris genetikai háttere.... 15 5. Új tudományos eredmények... 16 6. Irodalom jegyzék... 17 7. Publikációs lista... 19 2
1. A kutatómunka előzményei A szőlőlisztharmat, melynek kórokozója az Erysiphe necator (Schwein.) Burr, ma a világ szőlőtermő vidékeinek talán egyik legismertebb és legelterjedtebb betegsége. Fellépésekor többek között csökken a fotoszintézis, ami közvetlen hatással van a termés mennyiségi és minőségi alakulására. Európai 1845-ös megjelenése óta a szőlészek a termés megóvása érdekében a betegség visszaszorítására törekszenek. Kezdetben megfigyeléseiket alapul véve a természetben rendelkezésre álló anyagokat használták kezdetleges védőeszközül. Az első ilyen hatóanyagot, a ként (bár nem a szőlőben) már 1802-ben gombaölő szerként használták. A kén a védekezés napjainkban is kiemelt jelentőségű eleme. A betegség elterjedésével folyamatosan bővült az eszközül használható vegyszerek sora. A fungicidek felhasználásának múltja 200 évre tekint ugyan vissza, de a rezisztencia kérdése csak a felszívódó tulajdonságú készítmények megjelenése óta vált kiemelt jelentőségűvé. A növénytermesztésben és a kertészetben a kontakt gombaölő szerek használata nem biztosított hosszú távú védelmet a kórokozókkal szemben, mivel hatástartamukat nagyban befolyásolták az időjárási tényezők. Szükség volt olyan hatóanyagokra, melyek ezeket a problémákat kiküszöbölve segítik a termelés folyamatát. Erre a szisztémikus fungicidek nyújtottak megoldást. A felszívódó szerek gyakorlati alkalmazását követően, azok különböző specifikus hatásmódja miatt, rövid időn belül megjelentek a kórokozóknak azon populációi is, melyek az alkalmazott hatóanyagokkal szemben rezisztensek. Ez eleinte a védekezések eredményességének csökkenésével, később elmaradásával járt. Az eredménytelen védekezés és a hatástalanság legfőbb oka a hatóanyagok egyoldalú alkalmazásában rejlett. A fungicidrezisztencia a gyakorlati növényvédelem hatékonyságát veszélyeztető jelenség. A specifikus hatásmóddal bíró fungicid-hatóanyagokkal szemben a legkülönbözőbb rendszertani helyű növénypatogén gombáknak a szer rövidebb-hosszabb ideig tartó rendszeres alkalmazása következtében rezisztens populációi szelektálódnak ki. A fungicidrezisztenciát az 1960-as években még alig említi a szakirodalom. Ezekre az évekre tehető a legtöbb új felszívódó hatású gombaölőszer megjelenése. Az 1970-es évektől azonban már gyakrabban találkozhatunk vele, napjainkra pedig valóságos fenyegetéssé nőtte ki magát a növényvédelmi gyakorlatban. Az Európai Unió szabályozásának következtében a korábban több száz növényvédelmi célra felhasználható hatóanyag néhány százra csökkent. Ennek oka az emberi szervezetre 3
különösen veszélyes hatóanyagok termelésből való kizárása volt. Többek között ezek az intézkedések vezettek oda, hogy a növényvédő szer-gyártó cégek egyre több hatóanyagot fejlesztenek ki a természetben megtalálható vegyületek mintájára. Így született meg a QoIfungicidek csoportja is. A QoI-fungicidek a gombák mitokondriális légzését gátolják. Nevüket is innen kapták: QoI = Quinone outside Inhibitors. A QoI-fungicidek egy hatáshelyű gombaölőszerek, ezért velük szemben nagy a rezisztencia kialakulásának esélye. A rezisztencia természetes mutáció eredménye. A rezisztens mutánsok arányának növekedése a gombaölő szer hatékonyságának csökkenését jelzi. Vizsgálatainkba bevontuk a szőlőtermesztésben jelenleg használt fungicidek releváns hatóanyagait és alkalmaztuk a gyártók technológiai ajánlásait. 4
2. Célkitűzések A Pannon Egyetem Georgikon Karán megkezdett kutatások a szőlőlisztharmat elleni védekezésre használt QoI-fungicidek hatékonyságának felmérésére és ezek ésszerű használatának, növényvédelmi technológiába illesztésének kidolgozására irányultak. Célul tűztük ki a rezisztencia kialakulásának és az egyoldalú szerhasználat következményeinek tanulmányozását, továbbá a QoI-rezisztencia gén szintű igazolását. Tudományos célkitűzéseinket az alábbiak szerint fogalmaztuk meg: -a QoI-fungicidek szőlőlisztharmat elleni hatékonyságának vizsgálata olyan területen, ahol az Erysiphe necator (Shwein) populációi e hatóanyagokkal szemben még szenzitívek, -az Erysiphe necator (Shwein) QoI-fungicidekkel szembeni rezisztenciája kialakulásának nyomon követése, -az E. necator QoI-fungicidekkel szembeni rezisztenciájának igazolása genetikai szinten, -a lisztharmatgomba QoI-fungicidekkel szemben rezisztens populációi magyarországi elterjedtségének felmérése, -a szőlőlisztharmat elleni eredményesebb védekezéshez hatékony technológiai javaslatok kidolgozásának megfogalmazása. 5
3. Alkalmazott vizsgálati anyagok és módszerek 3.1. Az Erysiphe necator (Shwein) ellen alkalmazható QoI-hatóanyagok és fungicidek ültetvényben történő összehasonlító vizsgálata A vizsgálatokat a Pannon Egyetem Georgikon Nonprofit Kiemelten Közhasznú Társaság kísérleti szőlészetében jelöltük ki, mely a Dunántúli-középhegység természetföldrajzi nagytájon belül a Bakonyvidék középtáj, a Keszthelyi-hegység és azon belül a Keszthelyi-fennsík kistáj DNY-i peremén helyezkedik el Cserszegtomaj községtől ÉK-i irányban. A pontos helymeghatározás céljából a vizsgálatok GPS-koordinátái a következők: 1. kísérlet (Olasz rizling GK 1): 46.795307, 17.261017; 2. kísérlet (Merlot CI 181): 46.794768, 17.260771. A terület Észak-keleti lejtésű, minden második sor füvesített, a sorok alja vegyszeresen gyomirtott. A két tábla tájolását az 1. ábra szemlélteti. Az Olasz rizling GK 1 vizsgálati terület az uralkodó szélirányra (É) merőlegesen, míg, a Merlot CI 181 fajta vizsgálati területe azzal párhuzamos irányba helyezkedett el. 1. ábra. A vizsgálati terület és a parcellák elhelyezkedése Cserszegtomajon. A kísérletekben a két vizsgálati parcellán négy vizsgálati csoportot alakítottunk ki. Közülük az I. számú csoportban (1. táblázat) kizárólagosan QoI-fungicid hatóanyagokat alkalmaztunk. A II. számú csoport (1. táblázat) kialakításának elve a gyakorlatban is 6
alkalmazott QoI-fungicidek azon csoportját foglalta magába, melyek egyéb más hatóanyag csoporttal kerülnek alkalmazásra és Plasmopara viticola ellen is hatásosak. A III. számú csoport (2. táblázat) a II. csoport kiegészítése kontakt hatású Erysiphe necator ellen alkalmazott hatóanyagokkal. A IV. csoportban (3. táblázat) a --es években a BASF, a Bayer Cropscience és a Syngenta növényvédőszer gyártó cégek ajánlott védekezési programja alapján végeztük a permetezéseket. A permetezések során az adott cégek által forgalmazott vegyszereket használtuk fel az általuk javasolt sorrend és dózis betartása mellett. Kontrollként kezeletlen parcellákat jelöltünk ki a vizsgálati területen belül. A vizsgálati csoportokat és parcellákat az egymást követő években mindig ugyanazon parcellára helyeztük. A kijuttatáshoz SOLO 450 típusú 10 l-es tartállyal rendelkező motoros háti permetezőt használtunk. A hatóanyagok és vegyszerek megfelelő hektáronkénti dózisait alkalmaztuk a. évben melyet tömegkoncentrációban adtunk meg. A gyártói technológiáknál a permetlé mennyiségre vonatkoztatott hektáronkénti dózist mértük be. A 2009-es évben a korábban is alkalmazott hatóanyagokat használtuk. A vizsgálati területet azonban a gazdasági károk enyhítése érdekében csökkentettük. A gyártói programokban alkalmazott vegyszereknek hektáros dózisát, és a hatóanyagok oldat tömegkoncentrációját 2009-ben a mindenkori hektáronkénti mennyiség kétszeresére növeltük. A dózis emelésének oka a rezisztencia/tolerancia jelenlétének további igazolása és szabadföldi körülmények közötti határozottabb elkülöníthetősége volt. A -es évben a hatóanyagok és vegyszerek dozírozását a 2009-ben alkalmazottak szerint használtuk és juttattuk ki a tömegkoncentráció értékeken nem változtattunk. Tömegkoncentráció képlete: 7
1. táblázat Az önállóan alkalmazott QoI hatóanyagok (I.) és a peronoszpóra elleni hatóanyagokkal kombinált QoI hatóanyagok (II.) csoportja -. években. Védekezések száma Csoport Kezelés Vizsgálati év 1 2 3 4 5 6 7 8 ρ B (g/l) Hatóanyag 2009- I. QoI hatóanyagok 0,8 a 2009 Piraklostrobin 1,6 1,2 b 2009 Azoxistrobin 2,4 0,3 c 2009 Trifloxistrobin 0,6 II. a b c d 2009 2009 2009 2009 QoI hatóanyagok P. viticola elleni kiegészítő hatóanyagokkal Piraklostrobin + metiram Azoxistrobin + folpet Trifloxistrobin + cimoxanil Cimoxanil + famoxadon 8 2 4 2 4 0,5 1 0,4 0,8 Tőke / oszlopköz 33/7 31/7 32/7 n=96+ 28/7 30/7 23/7 29/6 n=110+
2. táblázat A QoI-hatóanyagok peronoszpóra és lisztharmat ellen hatásos hatóanyagokkal kiegészített kombinációja (III.) -. években. Csoport Kezelés III. a b c Vizsgálati év 2009 2009 2009 Védekezések száma 1 2 3 4 5 6 7 8 ρ B (g/l) Hatóanyag 2009- QoI hatóanyagok P. viticola E. necator elleni kiegészítő hatóanyagokkal (2) + 4 (Piraklostrobin + metiram) + kén (4) +8 (Trifloxistrobin + cimoxanil) + kén (Azoxistrobin + folpet) + penkonazol (0,5) + 4 (1) +8 (2) + 3 (4) +6 Tőke / oszlopköz 29/7 35/7 33/7 n=97+ 9
3. táblázat A gyártók komplex védekezési programjai (IV.) -. években. Védekezések száma Csoport IV. Kezelés Vizsgálati év 1 2 3 4 5 6 7 8 Dózis (ha) Hatóanyag Gyári komplex technológia /10 l 2009- /5l Tőke / oszlopköz Kumulus S 5 kg/ha + Delan 700 WG 0,5 kg/ha Vivando 0,25 + Acrobat MZ 2,0 kg/ha Cabrio Top 2,0 kg/ha + Flamenco 0,5 Vivando 0,25 + Forum R 3,0 kg/ha Cabrio Top 2,0 kg/ha + Kumulus S 5,0 kg/ha Vivando 0,25 + Forum RézoxikloridWP 3,0 kg/ha Kumulus S 5 kg/ha Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha Mythos 30 SC 2,5 + Kumulus S 5 kg/ha Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha a (BASF) b (BAYER) c (SYNGENTA) 2009 Kumulus S 5 kg/ha + Delan 700 WG 0,5 kg/ha Kumulus S 5 kg/ha + Delan 700 WG 0,5 kg/ha Kén 5kg/ha 2009 Kén 5kg/ha Kén 5kg/ha 2009 Thiovit Jet 10,0 kg/ha Topas 100 EC 0,3 + Ridomil Gold MZ 68 WG 2,5kg/ha Vivando 0,25 + Acrobat MZ 2,0 kg/ha Vivando 0,25 + Acrobat MZ 2,0 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Bravo 500 2,5 + Topas 100 EC 0,3 Quadris Max 2,0 Cabrio Top 2,0 kg/ha + Flamenco 0,5 Cabrio Top 2,0 kg/ha + Collis 0,4 Eclair 0,5 kg/ha Eclair 0,5 kg/ha Eclair 0,5 kg/ha Ridomil Gold MZ 68 WG 2,5 kg/ha + Topas 100 EC 0,3 Topas 100 EC 0,3 + Pergado F 2,5kg/ha Vivando 0,25 + Forum R 3,0 kg/ha Vivando 0,25 + Forum R 3,0 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Quadris Max 2,0 Quadris Max 2,0 Cabrio Top 2,0 kg/ha + Kumulus S 5,0 kg/ha Cabrio Top 2,0 kg/ha + Collis 0,4 Eclair 0,5 kg/ha Eclair 0,5 kg/ha Eclair 0,5 kg/ha Quadris Max 2,0 Quadris Max 2,0 Vivando 0,25 + Forum RézoxikloridWP 3,0 kg/ha Vivando 0,25 + Forum+ Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Falcon 0,3 + Melody Compact 1,5 kg/ha Quadris Max 2,0 Topas 100 EC 0,3 + Pergado F 2,5kg/ha X Kumulus S 5,0 kg/ha + Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha X X Kén 5,0 kg/ha + Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha Ridomil Gold MZ 68 WG 2,5 kg/ha + Topas 100 EC 0,3 + Chorus 75 WG 0,6 kg/ha X Cantus 1,0 kg/ha + Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha Cantus 1,0 kg/ha + Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha Kén 5,0 kg/ha + Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha + Teldor 1,0 Kén 5,0 kg/ha + Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha + Teldor 1,0 Kén 5,0 kg/ha + Rézoxiklorid WP 3,0 kg/ha + Teldor 1,0 Thiovit Jet 10,0 kg/ha + Ridomil Gold MZ 68 WG 2,5 kg/ha + Chorus 75 WG 0,6 kg/ha Thiovit Jet 10,0 kg/ha + Ridomil Plus 4,0 kg/ha + Chorus 75 WG 0,6 kg/ha 26/7 31/7 30/7 Topas 100 EC 0,3 + Ridomil Gold MZ 68 WG 2,5kg/ha Quadris Max 2,0 + Thiovit Jet 8,0 kg/ha Topas 100 EC 0,3 + Pergado F 2,5kg/ha Quadris Max 2,0 + Thiovit Jet 8,0 kg/ha Quadris Max 2,0 + Thiovit Jet 8,0 kg/ha Topas 100 EC 0,3 + Pergado F 2,5kg/ha Thiovit Jet 10,0 kg/ha + Ridomil Plus 4,0 kg/ha Thiovit Jet 10,0 kg/ha + Ridomil Plus 4,0 kg/ha + Chorus 75 WG 0,6 kg/ha 10 n=87+
A felvételezések során egy 0-tól 5-ig terjedő skála alapján osztályoztuk a levelek fertőzöttségét azok lisztharmattal való borítottsága szerint, majd megállapítottuk a Townsend Heuberger betegségfokot (Gartner 1971). Az egyes parcellákon 50-50 levelet vizsgáltunk. A fertőzöttségi értékek alapján a %-os értékek is leírásra kerültek. A fertőzésmentes leveleket 0-ás szintnek, azaz 0 %-os fertőzöttségnek vettük. Ennek megfelelően az 1-es szintnek tekintettük a 0-5%-os fertőzöttséget, a 2 es szintnek az 5-25 %-os fertőzöttséget, a 3-as 25-50 %, a 4-es 50-75 % és az 5-ös szintnek a 75-100 %-os fertőzöttséget. A fertőzöttségi adatokat évenként, kezelésenként és fungicidcsoportonként átlagoltuk. A fungicidcsoportok átlagait az SPSS 13.0-ás verziójú statisztikai szoftverrel kéttényezős variancia analízisnek vetettük alá, ahol meghatároztuk a 95%-os konfidenciaszintet, majd ezt követően az egyes fungicidcsoportok egymáshoz viszonyított szignifikancia szintjét. A vizsgált fajták esetében szintén meghatároztuk a 95%-os konfidencia szintet és az egyes fajták fertőződésének szignifikanciáját. A fajták és a kezelések közötti összefüggéseket is hasonló módon vizsgáltuk. 3.2. A szabadföldi kísérletekben használt QoI-fungicidek hatékonyságának in vitro vizsgálata 3. 2. 1. A vizsgálat helye A Cserszegtomaji Tangazdaságban beállított és között végzett kísérletek önálló QoI-hatóanyagokkal permetezett parcelláiból begyűjtött levélmintákat in vitro vizsgálatoknak vetettük alá. Ezeket a vizsgálatokat a Pannon Egyetem Georgikon Karának Kertészeti Tanszékén és a Kar Biotechnológiai Csoportjánál végeztük. 3. 2. 2. A vizsgálat anyaga A mintákat a vegetációs periódus végén gyűjtöttük mindkét fajta ( Olasz rizling GK 1 és Merlot CI 181 ) esetében, miután kialakult a végleges fertőzöttségi szint a lombozaton. A mintákat a parcellák középső tőkéjének középső termőalapjairól gyűjtöttük. A mintavételi hely meghatározásánál szempont volt, hogy minél jobban kizárjuk az esetleges permetlé- 11
elsodródásból eredő hibás mintavétel lehetőségét. A szabadföldi vizsgálatoktól eltérően a vizsgálatnál fertőzött fürtöket is begyűjtöttünk. 3. 2. 3. A vizsgálat módszere A hajtások 3 különböző levél emeletéről összeválogatott fertőzőképleteket viselő leveleket feldaraboltuk. A feldarabolás során használt ollót az egyes hajtások és kezelési csoportok különböző parcelláiról származó minták feldolgozása között 80%-os etanolos oldattal és annak leégetésével fertőtlenítettük. A feldarabolt levelek fertőzött részeit ezek után fertőtlenített csipesszel 2 ml-es Eppendorf csövekbe helyeztük. A lezárt, katalogizált mintákat folyékony nitrogénben fagyasztottuk és az elemzésig -80 C-on tároltuk, majd DNS tisztításnak vetettük alá. A DNS tisztítást a -ben gyűjtött mintákból végeztük el. A választás a Cserszegtomaji hatóanyag-vizsgálatok eredményei alapján esett erre az évre. A DNS tisztítást cetiltrimetilammónium bromidos (CTAB) módszerrel (Doyle és Doyle 1990) végeztük, amelyet a jó minőségű DNS kivonásának érdekében tovább optimalizáltunk. Annak érdekében, hogy a mintáink gomba DNS tartalmának megfelelő minőségét és mennyiségét ellenőrizzük gomba specifikus ITS1-ITS4 primerekkel PCR-t végeztünk. A QoI-rezisztencia kimutatására irányuló molekuláris vizsgálathoz a jó minőségű és detektálható mintákat választottuk ki. A rezisztencia kimutatás céljából primer szekvenciákat terveztünk. A primer tervezés kiinduló pontja a citokróm b gén 329. nukleotid pozíciójában lévő és a QoI fungicidekkel szembeni rezisztenciáért más fajokban felelős mutációs pont kimutatása volt, melynek érdekében a mutációs pont két oldalára ún. belső, valamint e ponttól néhány száz bázispárral távolabb mindkét irányban ún. külső primereket terveztünk. A PCR reakciókban a citokróm bc1 gén 653 bázispár (bp) méretű pontmutációt tartalmazó szakaszát és a rezisztensekre jellemző 216 bp hosszúságú DNS fragmentumokat a BluGra124 (F) (5 -GGATGATTAATACGTTACATACA-3 ), CBR3 (R) (5 - CCTAATAATTTATTAGGTATAGATCTTA-3 ), és Enec1 R (5 - TAGTAATAACTGTTGCTG-3 ) primerek egyidejű alkalmazásával szaporítottuk fel. A PCR termékeket GeneGenius Bio-Imaging System (Syngen, UK) géldokumentációs rendszerrel detektáltuk. 12
3.3. Magyarország egyes borvidékeiről származó lisztharmatgomba-populációk in vitro vizsgálata QoI-rezisztenciára 3. 3. 1. A kísérlet helye A begyűjtött mintákat a Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar, Biológiai Intézet, Általános és Környezeti Mikrobiológiai Tanszékén monospóráztuk, majd a mintákat a Pannon Egyetem Georgikon Karának Kertészeti Tanszékén dolgoztuk fel tárolásra alkalmas formára. Az in vitro vizsgálatokat a Pannon Egyetem Georgikon Karának Biotechnológia Csoportjánál végeztük. 3. 3. 2. A kísérlet anyaga A mintavételezést 2009 júliusában végeztük a szőlő tenyészidőszakának közepén, kevéssel a lisztharmatfertőzés bekövetkezése után. Magyarország 22 borvidéke közül csupán kettőről nem sikerült mintákat gyűjtenünk. A minták feldolgozása során kilenc borvidékről származó mintát alkalmatlannak találtunk, ezért csak a legmegfelelőbb és nagyszámban rendelkezésre álló mintákkal folytattuk a vizsgálatot. Az Egri és Szekszárdi borvidék azon két szőlőültetvényét is megmintáztuk, ahol hazánkban a lisztharmatgomba QoI-fungicidekkel szembeni rezisztenciáját először észlelték (Füzi 2007). Minden ültetvényből 4 db 4-6 leveles hajtást gyűjtöttünk. A mintákat károsodásuk megakadályozására párás környezetben tároltuk, amit nedves vattapamaccsal ellátott megfelelő méretű (30x50 cm) félig felfújt nylon zacskókkal biztosítottunk. A szállítás és a feldolgozás idejére a mintákat hűtőtáskában tároltuk. A monospórázási eljárások megkezdése előtt binokuláris mikroszkóp segítségével ellenőriztük, hogy a gomba penészgyepe alkalmas-e a további vizsgálatokra. 3. 3. 3. A vizsgálat módszere A vizsgálati módszereket a 3.2.3. pontban leírtak alapján végeztük el. 13
4. Eredmények és következtetések 4. 1. Az Erysiphe necator (Shwein) ellen alkalmazható QoI-hatóanyagok és fungicidek szabadföldi összehasonlító vizsgálata. A hároméves szabadföldi vizsgálatunk során különböző QoI-hatóanyagokat és vegyszereket teszteltünk Erysiphe necator ellen. A vizsgálati évek alatt a szernyomás hatására potenciális QoI-rezisztens vonalak jelentek meg a vizsgálati területen. A rezisztencia kialakulása a tesztelt hatóanyagcsoportra sokkal gyorsabban alakult ki, mint az SDHIfungicidek csoportja ellen, annak ellenére, hogy mindkettő az egyhatáshelyű gombaölő szerek közé tartozik (Scheinpflug 1988; Tiemann et al. 1997). A rezisztencia legtöbb esetben akkor jelent meg, amikor azonos vegyszereket használtak éveken keresztül (Steva és Clerjeau, 1990; Redl és Steinkeller, 1996; Halleen and Holz, 2001; Miller és Gubler, 2004; Wong és Wilcox, 2002). Az eredményeink megmutatták, hogy akár két-három év QoI-hatóanyagokkal történő (a lehető legszélesebb Magyarországon engedélyezett hatóanyagok felhasználásával) blokk kezelés hatása is elegendő lehet a rezisztens törzsek megjelenésére. A legtöbb E. necator QoI-hatóanyag elleni rezisztenciáról megjelent közlemény abból a megállapításból indul ki, hogy rezisztens törzseket találtak (Fernandez-Ortuno et al., ; Ishii et al., 2001). A szabadföldi vizsgálataink megmutatták mi vezethet a rezisztencia kialakulásához. A QoIhatóanyagok kombinációja penkonazollal és kénnel lelassíthatja a rezisztencia kialakulását (II. csoport). Steva (1992) antagonista észrevételeit a triadimenol és a kén között, mi nem tapasztaltunk a QoI-hatóanyagok esetében. A Plasmopara viticola elleni kombinációk (II. csoport) nem csökkentették a rezisztencia kialakulás esélyét. A gyártók által javasolt technológiák mindhárom vizsgálati évben megfelelő védelmet nyújtottak a lisztharmatfertőzésekkel szemben. A technológiai javaslatokban a vegyszerek és hatóanyagok kombinálva, illetve rotációban kerültek felhasználásra így a területen megjelent rezisztens törzsek ellenére is magas hatékonyságot adtak. Ezek alapján a gyártói javaslatok követése a célszerű, azaz a QoI-fungicideket a permetezések között maximum 25-30%-ig érdemes alkalmazni. Egyetértünk a FRAC (1997) megállapításával, mi szerint a QoI-kezeléseket mindenképpen más hatásmechanizmusú gombaölő szeres kezeléseknek kell követnie, azonban ezt a megállapítást mi kiegészítenénk a kén alkalmazásával. 14
4. 2. A szőlőlisztharmat QoI-rezisztenciájának molekuláris genetikai háttere. QoI-rezisztenciát 23 kórokozónál állapitották meg (Fraaije et al. 2005; Kim et al. 2003), melyek között négy lisztharmatfaj szerepel: a Blumeria graminis f. sp. tritici (Fraaije et al. 2002), a B. graminis f. sp. hordei, a S. fuliginea és az Erysiphe necator. A B. graminis- ben található pontmutációt tartalmazó citokróm bc 1 gén szekvenciájára tervezett primerek segítségével az E. necator-ban is ki tudtuk mutatni a gén pontmutációt tartalmazó 653 bp-os szakaszát, majd a szekvenálás eredményei alapján azt is, hogy a QoIrezisztenciát az E. necator-ban is a G C pontmutáció okozza. A rezisztens és a szenzitív allélokat hordozó egyedek elkülönítésére egy gyors PCR alapú módszert dolgoztunk ki, PASA primerek tervezésével. A PCR reakció segítségével el tudtuk különíteni a rezisztens és a szenzitív allélokat tartalmazó egyedeket. A rezisztens egyedekben a szenzitív egyedekre jellemző fragmentumot is ki tudtuk mutatni, ez alapján arra tudunk következtetni, hogy a rezisztens egyedekben a citokróm bc 1 gén heteroplazmásan van jelen. Az általunk kifejlesztett PASA primerek alkalmazásával a QoI-rezisztencia nagy mintaszám esetén is gyorsan kimutatható. Továbbá a módszer segítségével a rezisztens és szenzitív egyedek egyértelműen elkülöníthetőek. A nagyüzemek védekezési programjaiban egyre nagyobb szerepet kapnak a felszívódó hatású hatóanyagok. Költséghatékonysági megfontolás alapján, a hatóanyagoknak a munkaerő hiányát kell kompenzálniuk azáltal, hogy egyre nagyobb idő intervallumokat áthidalva kell védelmet nyújtaniuk a permetezési fordulók között. Az egyre nagyobb permetezési fordulók miatt a rezisztencia megjelenése ilyen esetekben nagyarányú terméskiesést okozhat. Az általunk kidolgozott gyors rezisztencia teszt segítségével hatékonyabbá és biztonságosabbá tehetjük a nagyüzemi szőlőültetvényekben történő védekezést, mivel a teszt segítségével akár vegetációs időn belül (két permetezési forduló között) ki tudjuk mutatni az esetlegesen megjelenő rezisztenciát hordozó mutáns típusokat. Az elvégzett gyorsteszt segítségével kiküszöbölhetővé válik a rezisztens egyedek számának növekedése az ültetvényben, mivel a rezisztencia kimutatás után azonnal megváltoztathatóak a permetezési terv további kezeléseinek összetételei. Kihagyva ezáltal a QoI-hatóanyagokat a további kezelésekből, más hatásmechanizmusú szisztémikus szereket alkalmazva, valamint az általunk javasolt nagy arányú kénnel kiegészítve. Az elvégzett teszt eredményét figyelembe véve optimalizálhatóvá válik a vegetáción belüli gombaölő szerekre fordított költség, 15
kiküszöbölhető a hatástalanságból fakadó anyagi veszteség mind a termék (szőlő) előállításában, mind a ráfordított eszközök (fungicidek) esetében is. Az eredmények arra figyelmeztetnek minket, hogy a jövőben a technológiai javaslatok figyelmen kívül hagyása a QoI-rezisztencia erősödését eredményezheti Magyarországon. 5. Új tudományos eredmények 1. A QoI-hatóanyagok egyoldalú használata révén kialakuló rezisztenciamechanizmus tanulmányozására modell-rendszert dolgoztunk ki. 2. Molekuláris genetikai gyorsteszt kifejlesztésre a QoI-fungicidekkel és azok homológjaival szemben rezisztens lisztharmat törzsek szabadföldi megjelenésének igazolására. 3. A kifejlesztett gyorsteszt alkalmazása a szabadföldi kísérletben előforduló rezisztens lisztharmattörzsek kimutatására. 4. A genetikai gyorsteszt alkalmazásával QoI-hatóanyagokra rezisztens Erysiphe necator törzsek jelenlétét mutattuk ki Magyarország borvidékei közül a Cserszegtomajiborvidéken, valamint korábban már QoI-fungicid rezisztenciára utaló jeleket mutató Szekszárdi és Egri-borvidékek ültetvényeiben. Ezzel a gyakorlati használhatóságát bizonyítottuk az új módszernek. 5. Az egyoldalú kezelések hatására kialakuló rezisztenciát megelőző szőlővédelmi technológiák megalapozása, hátterének bemutatása. 6. E. necator ellen felhasználható hatóanyagcsoportok közötti hatékonyságbeli különbségek igazolása. A rezisztencia-kialakulás folyamatának magyarázata. 16
6. Irodalom jegyzék Doyle, J. J., and Doyle, J. L. (1990): A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus 12, 13-15. Gartner, H. (1971): Versuche zur Bekämpfung von Botrytis cinerea (Grauschimmel) als Traubenfäule. Mitteilungen Klosterneuburg, 21:3 183-188. Fernández-Ortuno, D., Torés,J. A., De Vicente, A. and Pérez-Garcia, A. (): Field resistance to QoI fungicides in Podosphaera fusca is not supported by typical mutations in the mitochondrial cytochrome b gene. Pest Management Science, 64: 694-702. Fraaije, B. A., Butters, J. A., Coelho, J. M., Jones, D. R. and Hollomon, D. W. (2002): Following the dinamics of strobilurin resistance in Blummeria graminis f. sp. tritici using quantitative allele-specific real-time PCR measurements with the fluorescent dye SYBR Green I. Plant Pathology, 51: 45-54. Fraaije, B. A., Cools, H. J., Funtaine, J., Lovell, D. J., Motteram, J., West, J. S. and Lucas, J. A. (2005): Role of ascospores in further spread of QoI-resistant cytochrome b alleles (G143A) in field populations of Mycosphaerella graminicola. Phytopathology, 95: 933-941. FRAC (1997): Status Report and Recommended Fungicide Resistance Management Guidelines. Global Crop Protection Federation, Belgium. Füzi I. (2007): A biztonság mindenek előtt. Növényvédelmi Tippek (BASF), 1-2 : 32-34. Halleen, F. and Holz, G. (2001): An Overview of the Biology, Epidemiology and Control of Uncinula necator (Powdery Mildew) on Grapevine, with Reference to South Africa. South African Journal for Enolology and Viticulture, 22, 2: 111-121. 17
Ishii, H., Fraaije, B. A., Sugiyama, T., Noguchi, K., Nishimura, K., Takeda, T. Amano, T. and Hollomon D. W. (2001): Occurence and molecular characterization of strobilurin resistance in cucumber powdery mildew and downy mildew. Phytophatology, 91: 1166-1171. Kim, Y. S., Dikson, E. W., Vincelli, P. and Farman, M. L. (2003): Field resistance to strobilurin (Q(o)I) fungicides in Pyricularia grisea caused by mutations in the mitochondrial cytochrome b gene. Phytopathology, 93: 891-900. Miller, T. C. and Gubler, W. D. (2004): Sensitivity of California isolates of Uncinula necator to trifloxystrobin and spiroxamine, and update on triadimefon sensitivity. Plant Diseases, 88: 1205-1212. Redl, H. and Steinkellner, S., (1996) Nachweiss einer sensitivitatsverminderung von Oidium gegenüber DMI-fungiziden im Österreichischen weinbau. Mitteilungen Klosterneuburg, 46:181-188. Scheinpflug, H., (1988): History of DMI fungicides and monitoring for resistance. In: Delph, C.J. (Eds.), Fungicide Resistance In North America. The American Phytophatological Society Press, Minnesota. 77-78. Steva, H., (1992): Resistance de l Oidium de la Vigne (Uncinula necator) aux fongicides inhibiteurs de la biosynthese des sterols. These de doctorat Universite Bordeaux II. Steva, H. and Clerjeau, M., (1990) Cross resistance to sterol biosynthesis inhibitor fungicides in strains of Uncinula necator isolated in France and Portugal. Meded. Fac. Landbouwwet. Rijksuniv. Gent 55: 983-988. Tiemann, R., Berg, D., Kramer, W. and Pontzen, R. (1997): Biochemistry of the new fungicide KWG 4168 (Spiroxamine). Pflanzeschutz Nachrichten. Bayer, 50:29-48. Wong, F. P. and Wilcox, W. F. (2002): Sensitivity to azoxystrobin among isolates of Uncinula necator: Baseline distribution and relationship to myclobutanil sensitivity. Plant Diseases, 86: 394-404. 18
7. Publikációs lista A doktori (Ph. D) értekezéshez kapcsolódó publikációk Tudományos cikkek Taksonyi, P., Kocsis, L., Mátyás, K. and Taller, J. (2012): The effect of Quinone outside Inhibitor fungicides on powdery mildew in grape vineyards in Hungary. Scientia Horticulture. Bírálat alatt. Taksonyi P., Maráczi K. és Kocsis L. (2011): Qoi-fungicidek alkalmazásának hatása a lisztharmat fertőzés kialakulására -2009. Kertgazdaság: 79-85. Taksonyi, P., Tarczal, E., Maráczi, K., Holb, I. és Kocsis, L. (): Powdery mildew infection dependent on weather factors in vineyards near Keszthely in. International Journal of Horticultural Science, 16 (2): 55-59p. Taksonyi P., Füzi I. és Kocsis L. (2009): A szőlő egyes kórokozóinak QoIfungicidekkel szembeni rezisztenciájának kialakulása Magyarországon. Növényvédelem 45 (7): 361-366. Tudományos előadások Taksonyi P., Kocsis, L. (): The powdery mildew infection of a vineyard at Lake Balaton in term of climate conditions. 28th International Horticultural Congress, Lisbon Congress Center aug 22-27,, p. 736-737. Taksonyi, P., Kocsis, L. (): The powdery mildew infection of a vineyard at Lake Balaton in term of climate conditions in. IHC Lisboa august 22-27. Abstracts Volume II S16.306, 736. Taksonyi P., Maráczi K., Traczal E.(2009): Változó időjárási tényezők hatása a Keszthely környéki szőlőültetvények lisztharmat fertőzöttségére. 1 Szőlő és klíma konferencia, Kőszeg,2009. április. 24-25. 19
Taksonyi P. Kocsis L.(2009): Miért érdemes tudni, hogy mi az a QoI-rezisztencia? Metszési Bemutató Szakmai Nap, Keszthely, 2009. március. 20. Taksonyi P., Kocsis L. (2009): QoI-fungicidek alkalmazása Cserszegtomajon. Növényvédelmi fórum, Keszthely, 2009. február. Taksonyi P., Kadlicskó S.,Kocsis L., Gabi G. (): A szőlő előrejelzésre alapozott környezetkímélő növényvédelme a szekszárdi borvidéken. Növényvédelmi fórum, Keszthely,. január 30-február1. Taksonyi P., Kocsis L. (): A szőlő növényvédelmében alkalmazott természetes eredetű fungicidek és azokból származó mesterséges vegyületek történeti áttekintése. 50. Jubileumi Georgikon Napok, Keszthely,. szeptember 25-26. p. 142. A doktori (Ph. D) értekezéshez nem kapcsolódó publikációk Kocsis, L., Taksonyi, P., Tarczal, E. (): The impact of climate change on grape production. Hungarian Agricultural Research 19(2):15-18. Taksonyi P. (2009): A szőlő ültetésének módjai és folyamata. Kertészet és Szőlészet, 2009.február. E. Tarczal, M. Kállay, Z. Varga, P. Taksonyi and L. Kocsis, (2009): Rootstock-scion interactions and correlations between vine vigor and grape quality. American Journal of Enology and Viticulture, 60(3): 408A-408A. L. Kocsis, É Baracsi Horváthné, K. Maráczi, P. Taksonyi, E. Tarczal, (2009): The impact of climate change in grape and ornimental production, Climate change: challange for training of applied plant scientists, Symposium and Training Course III: Impact of Climate Change on Corp Production, Martonvásár, 2009.09.07-11. 20