METALLEZIMEK SZERKEZETI ÉS FUKCIÁLIS MDELLEZÉSE ÁTMEETIFÉM-KMPLEXEKKEL Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Paksi Zoltán Szegedi Tudományegyetem Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék SZEGED 2008
METALLEZIMEK SZERKEZETI ÉS FUKCIÁLIS MDELLEZÉSE ÁTMEETIFÉM-KMPLEXEKKEL Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Paksi Zoltán Témavezetı: Konzulens: Dr. Gajda Tamás, egyetemi tanár Dr. Jancsó Attila, egyetemi tanársegéd Szegedi Tudományegyetem Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék SZEGED 2008
BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŐZÉSEK Régóta ismert, hogy az élı szervezetek számára bizonyos fémek létfontosságú jelentıséggel bírnak, míg a fémek egy másik része már igen kis koncentrációban is komoly veszélyt jelenthet valamennyi szervezetre. A fémek és vegyületeik fontos szerepet játszanak az élet szempontjából alapvetı fontosságú folyamatokban. Számos egyéb funkció mellett hidrolitikus és redoxi-folyamatokat katalizáló enzimek kofaktoraiként szerepelhetnek, s így részt vesznek a biomolekulák szintézisében. A fémionok biológiai hatásmechanizmusának felderítése nem képzelhetı el az enzimekben betöltött szerepük ismerete nélkül. Ez a terület napjaink bioszervetlen kémiai kutatásainak fı iránya, s ennek egy lehetısége a metalloenzimek modellezése kis molekulatömegő modellvegyületek segítségével. A modellkomplexek a makromolekuláknál jóval egyszerőbbek, így könnyebben kezelhetık, egyszerőbben vizsgálhatók. A biomimetikus fémkomplexek használata ugyanakkor lehetıvé teszi egy-egy részfolyamat vagy egy-egy szerkezeti motívum sajátságainak tanulmányozását is, ami a natív rendszerek esetében sokszor lehetetlen. Végül, de nem utolsósorban, hatékony modellrendszerek segítségével lehetıvé válhat a gyakorlatban is alkalmazható mesterséges enzimek kifejlesztése. Az enzimutánzó fémkomplexekkel kapcsolatos kutatások céljai meglehetısen különbözıek lehetnek. Különbséget teszünk szerkezeti, illetve funkcionális modellezés között. A metalloenzimek szerkezeti modellezése alatt a metalloproteinek aktív centrumát utánzó modellvegyületek kifejlesztését értjük, melyek a természetes enzimek redoxi, mágneses, spektrális vagy egyéb sajátságainak, illetve az azokat megszabó tényezık feltárására irányul. A funkcionális modellek részletes vizsgálata elısegítheti a metalloenzimek szerepének, az aktív centrum mőködésének jobb megismerését, illetve a gyakorlatban is használható katalizátor kifejlesztését. A funkcionális modellezés során nem feltétlenül törekszünk a kérdéses metalloenzim aktív centrumának lemásolására, bár általában a jó szerkezeti egyezés magában hordozza a kiemelkedı enzimszerő mőködés lehetıségét is. A metalloenzimek és metalloproteinek aktív centrumának modellezéséhez rendelkezésre álló lehetıségekben közös, hogy a fémion körül a natív rendszerhez hasonló környezet kialakítása a cél. Ez megtörténhet olyan szintetikus (nem peptid) ligandumok segítségével, melyekben a donorcsoportok nem vagy nem teljesen azonosak a natív ligandumokkal, de azok térbeli elrendezıdése hasonló geometriai viszonyokat teremt. Egy másik lehetıség olyan peptidek tervezése, melyek az eredetinél jóval rövidebb szekvenciában 2
tartalmazzák a natív donorcsoportokat. Végül lehetséges a natív fehérje fémkötı szekvenciáját tartalmazó peptidek alkalmazása is. A jelen értekezésben olvasható munka három fı részre oszlik, melyekben az aktív centrum modellezésére irányuló, elıbb említett, módszerek mindegyike magtalálható. Az elsı részben egy ötfogú, aszimmetrikus, centrális karboxilátcsoportot tartalmazó salen szár- mazék a bhbdpa (, -bisz(2-hidroxibenzil)-2,3- diamino-propánsav) (1. ábra) vas(iii)- és réz(ii)- komplexeinek oldatkémiai sajátságait vizsgáltuk. A ligandum karboxilátcsoportja jelentıs változást eredményezhet az egyes részecskék szerkezetében és stabilitásában az analóg salent (,'-etilénbisz- + + 2 2 1. ábra A t anulmányozott bhbdpa ligandum szerkezete (szalicilidénimin)) tartalmazó rendszerek megfelelı részecskéihez képest valamint kétmagvú részecskék kialakulását is lehetıvé teszi. Célunk e ligandum egymagvú komplexei révén a protokatekuát 3,4-dioxigenáz és a galaktóz oxidáz aktív centrumainak szerkezeti modellezése volt. Ugyanakkor a bhbdpa kétmagvú komplexek a binukleáris karboxiláthidas centrumok új modelljei lehetnek. A második és harmadik részben réz(ii) tartalmú oxidáz enzimek szerkezeti és mőködési modellezését tőztük ki célul. Ehhez, a natív enzimben található fehérjék hisztidinben gazdag aktív centrumát modelleztük több imidazolgyőrőt tartalmazó peptid ligandumok segítségével. Munkám ezen része során egy, kettı vagy akár három fémion megkötésére alkalmas multihisztidin-petidek réz(ii)- ill. cink(ii)komplexeit vizsgáltuk. Az Ac-is-is-Gly-is- (hhgh) tetrapetid (2. a ábra) kiválasztásánál célunk az volt, a 3 C b 2 S 2 2 2. ábra A tanulmányozott hhgh (a) és hgd (b) peptidek szerkezete 3
hogy kizárólag csak imidazol donorcsoportokon keresztül megvalósuló, multihisztidin környezetet biztosítsunk a központi fémionok körül semleges p-n, ami alkalmas lehet a fent említett oxidáz enzimek natív centrumának mind szerkezeti, mind funkcionális modellezésére. Az 2 -is-gly-asp-is-met-is-asn-is-asp-thr-lys- (hgd) ligandum (2. b ábra) a aemophilus ducreyi baktériumból izolált Cu,Zn-SD enzim -terminális 11 aminosavjával azonos peptidszekvencia. A feltételezések szerint ez az -terminális rész szerepet játszik a réz(ii) felvételében és megtartásában, elısegítve ezzel a baktérium szuperoxid gyökök elleni védekezésének hatékonyságát. Munkánk során, fenti feltételezés alátámasztására, vizsgáltuk e ligandum réz(ii)- és cink(ii)komplexeit, abból a célból, hogy információt nyerjünk e peptid fémkötı sajátságairól. Emellett, a Római egyetemen, rekonstitúciós vizsgálatokat végeztek a natív fehérjének az -terminális 25 aminosavat nem tartalmazó változatával, a fenti peptid jelenlétében. Ezzel szándékunk az volt, hogy közelebb jussunk az -terminális résznek az enzim mőködésében betöltött szerepének tisztázásához. A kísérletek során nagy hangsúlyt fektettünk a képzıdı komplexek oldategyensúlyi sajátságainak és oldatszerkezetének meghatározására. Ezek ismeretében, elıre meghatározott körülmények közt, szuperoxid diszmutáz valamint pirokatechin oxidáz aktivitás vizsgálatokat végeztünk, abból a célból, hogy összefüggést találjunk a részecskék már megismert oldatkémia sajátságai és enzimutázó képessége között. Az fent említett három rendszer között a biomimetikus modellezés, mint kísérleti stratégia teremt szorosabb kapcsolatot. ALKALMAZTT VIZSGÁLATI MÓDSZEREK Az oldategyensúlyi vizsgálatok során p-potenciometriás titrálások és p-függı ESR mérések alapján számítottuk ki a képzıdı részecskék összetételét és stabilitási állandóik számértékét. A rendszerekben elıforduló egyes komplexek szerkezetét, a p-függı UV-Vis, CD, ESR és MR spektroszkópiai módszerekkel tanulmányoztuk. A hhgh és hgd rendszerekben potenciálisan enzimutánzó vegyületek szuperoxid diszmutáz valamint pirokatechin oxidáz aktivitását tesztreakciókkal vizsgáltuk. Emellett a hgd esetében rekonstitúciós vizsgálatokat is végeztek, a Római Egyetemen, e peptidszekvenciának natív enzimben betöltött szerepének jobb megismeréséhez. 4
ÚJ TUDMÁYS EREDMÉYEK A bhbdpa renszerek 1. Eredményeink szerint 1:1 fém-ligandum arány mellett ez az ötfogú ligandum rendkívül nagy stabilitású komplexeket alakít ki mind réz(ii)-, mind vas(iii)ionokkal. 2. Az ESR és az UV-Vis mérések arra utalnak, hogy a [Cu 2 L], [CuL] és [CuL] részecskék kialakulása során mikroszkopikus komplexképzıdési folyamatok játszónak le, melyek kötési izomerek kialakulását eredményezik. Kétszeres réz(ii) feleslegnél p 4 felett képzıdik a kétmagvú [Cu 2 L] komplex, azonban p 5 körül már csapadék válik le az oldatból. Figyelembe véve a {,Ph } koordinációjú fémionok közötti gyenge spin-spin csatolást, azokat valószínőleg nem köti össze karboxiláthíd. 3. Ekvimoláris vas(iii) jelenlétében {,Ph,C }, {2,2Ph,C } és {2,2Ph,C, } koordinációjú komplexek dominálnak az oldatban. A kétszeres mennyiségő vas(iii)iont tartalmazó oldatban, p 4 és 6 között, az [Fe 2 () 3 L] részecske dominál, amelyben µ-karboxiláto-µ-hidroxohíd köti össze a központi fémionokat. Tudomásunk szerint a bhdbpa az elsı olyan ötfogú ligandum, amely vízoldható kétmagvú vas(iii)komplexeket képez. A hhgh rendszerek 4. A fiziológiás p-tartományban képzıdı {3 im } és {3 im, } koordinációjú [CuL] és [Cu()L] komplexek említésre méltó sajátsága, hogy a legtöbb hisztidin tartalmú peptiddel ellentétben, itt a ligandum csak a három imidazolcsoportján keresztül koordinálódik a fémionhoz. Az amidnitrogének koordinációja csak p 8 fölött jellemzı a rendszerben. Az ilyen multihisztidin peptidek egy teljesen új utat nyithatnak a II-es típusú rézproteinek modellezésben. 5. Cink(II)ionok jelenlétében p 7 körül csapadékképzıdést tapasztaltunk. A [ZnL] részecskében a cinktartalmú fehérjékben gyakori {3 im } típusú koordináció valósul meg, azonban esetünkben még ez sem képes oldatban tartani a cink(ii)ionokat. 6. A semleges p-tartományban képzıdı komplexek kiemelkedı SD-aktivitással rendelkeznek ([CuL] IC 50 = 0,13 µm és a [Cu()L] IC 50 = 0,15 µm). 5
7. Megállapítottuk, hogy a p 8 körül képzıdı [Cu 1 L] részecske, pontosabban az ebbıl kialakuló [CuL(dtbc)] terner komplex igen hatékonyan katalizálja a pirokatechin oxidációját oxigén jelenlétében. Ismereteink szerint ez volt az elsı példa arra, hogy réz(ii)-peptid komplexek is alkalmasak lehetnek réztartalmú oxidázok funkcionális modellezésére. A hgd rendszerek 8. A réz(ii)-hgd rendszerben különbözı protonáltsági állapotú egy-, két- és hárommagvú komplexek képzıdnek. Ekvimoláris oldatban az { 2,3 im } koordinációjú [CuL] komplex van jelen a semleges p-tartományban. Az amid-nitrogének deprotonálódása csak p 8 felett játszódik le. Fémfelesleg esetén számos izomer komplex kialakulására van lehetıség. A p 9,5 körül domináns [Cu 2 3 L] és [Cu 3 5 L] komplexekben valószínőleg { 2,2,C + im,2, im } ill. { 2,2,C + im,2, im + im,2,c=} típusú koordináció alakul ki. 9. Cink(II) jelenlétében a semleges p-tartományban a lizin ε-aminocsoportján protonált, igen nagy stabilitású [ZnL] komplex képzıdik. 2D MR vizsgálataink szerint a fémion a 1 is, 3 Asp, 4 is, 5 Met és 6 is alegységeket érintı { 2,3 im,s Met,C Asp} típusú koordinációval bír. p 8 körül a [ZnL()] részecske dominál az oldatban. A fémion megkötésében nyolc donorcsoport/atom vehet részt ( 2,4 im,s Met,C Asp, ), így valószínőleg több koordinációs izomer képzıdik, melyek viszonylag gyors cserében állnak egymással. 10. Az egyensúlyi adatokból meghatározható p = 7,4-nél az ún. látszólagos disszociációs kötési állandó (K D,M = Σ[ x L][M 2+ free]/σ[m x L], K D,Zn = 1,6 10 9 M, K D,Cu = 5,0 10 12 M), melyek hasonlóak az e fémionok transzportjában résztvevı fehérjék K D értékeihez. Ez a rendkívül nagy fémkötı képesség egyrészt megerısíti az -terminális alegység chaperoning szerepét a réz(ii) felvételében, másrészt hasonló szerepet vet fel a cink(ii) esetén is. 11. Eredményeink szerint a [CuL] részecske igen jelentıs SD utánzó képességgel bír (IC 50 = 0,19 µm), ami az enzim -terminális részének multifunkciós szerepére utalhat. 6
KÖZLEMÉYEK Az értekezés anyagához kapcsolódó közlemények 1. A. Jancsó, Z. Paksi, S. Mikkola, A. Rockenbauer, T. Gajda Iron(III)- and copper(ii) complexes of an asymmetric, pentadentate salen-like ligand bearing a pendant carboxylate group Journal of Inorganic Biochemistry, 99, 7 (2005) 1480-1489 IF: 2,654 2. A. Jancsó, Z. Paksi,. Jakab, B. Gyurcsik, A. Rockenbauer, T. Gajda Solution chemical properties and catecholase-like activity of the copper(ii)-ac-is-is- Gly-is- system, a relevant functional model for copper containing oxidases Dalton Transactions, 19 (2005)3187-3194 IF: 3,012 3. Z. Paksi, A. Jancsó, F. Pacello,. agy, A. Battistoni, T. Gajda Copper and zinc binding properties of the -terminal histidine-rich sequence of aemophilus ducreyi Cu,Zn superoxide dismutase Journal of Inorganic Biochemistry (közlésre elfogadva) IF: 2,654 Összesített impakt faktor: 8,32 A szerzı egyéb közleményei 1. Zs. Árkosi, Z. Paksi, L. Korecz, T. Gajda, B. enry, A. Rockenbauer Reinvestigation of the copper(ii) carcinine equilibrium system: two-dimensional EPR simulation and MR relaxation studies for determining the formation constants and coordination modes Journal of Inorganic Biochemistry, 98, 12, (2004) 1995-2005 IF: 2,654 2. J. T. Kiss, K. Felföldi, Z. Paksi, I. Pálinkó Structure-forming properties of 3-furylpropenoic acid derivatives in solution and in the solid state Journal of Molecular Structure, 651-653, (2003) 253-258 IF: 1,495 3. E. Talabér, Z. Paksi, I. Pálinkó Intermolecular hydrogen bonding interactions between α-phenyl furylcinnamic acid stereoisomers studied by semiempirical quantum chemical method Journal of Molecular Structure: TECEM, 620, 1(2003) 37-41 IF: 1,016 Konferencia elıadások és poszterek 1. A. Jancsó, Z. Paksi, I.. Jakab, B. Gyurcsik, A. Rockenbauer., T. Gajda Catecholase-like activity and solution chemical properties of the copper(ii) complex of a multihistidine tetrapeptide, a functional model for copper containing oxidases 2 nd International IMBG Meeting on Metals in Biocatalysis Autrans (2006. szeptember 24-27) Franciaország Poszter 7
Metalloenzimek szerkezeti és funkcionális modellezése 2. Z. Paksi, A. Jancsó,. Jakab, B. Gyurcsik, A. Rockenbauer, T. Gajda Solution chemical properties and catecholase-like activity of the copper(ii)-ac-is-is- Gly-is- system, a relevant functional model for copper containing oxidases EURBIC 8 Aveiro (2006. július 2-6) Portugália Poszter 3. Paksi Z., Jancsó A., Rockenbauer A., Gajda T. Equilibrium and solution structural studies of the iron(iii)- and copper(ii) complexes of a novel pentadentate asymmetric salen-derivative XL. Komplexkémiai Kollokvium, Dobogókı (2005. Május 18-20) Magyarország 4. T. Gajda, I.. Jakab, Z. Paksi, B. Gyurcsik Metallopeptides mimicking the structure and/or function of metalloenzymes International Symposium on Metals, Environment and ealth Szklarska Poreba (2004. június 24-27) Lengyelország 5. I.. Jakab, Z. Paksi, B. Gyurcsik, M. Gyır, T. Gajda II-es típusú rézfehérjék szerkezeti és funkcionális modellezése multihisztidin peptidek segítségével XXXIX. Komplexkémiai Kollokvium Gárdony (2004. május 26-28) Magyarország 6. Paksi Z., Jakab., Gyurcsik B., Rockenbauer A., Gajda T. Multihisztidin peptidek réz(ii) és cink (II) komplexeinek oldatkémiai vizsgálata és DSsel való kölcsönhatása XXXIX. Komplexkémiai Kollokvium Gárdony (2004. május 26-28) Magyarország 7. Z. Paksi, T. Gajda, A. Jancsó Equilibrium and solution structural studies on the copper(ii) complexes of a new, unsymmetric binucleating ligand Vth International Symposium: Young People and Multidisciplinary Research, Romania Serbia & Muntenegru Ungaria, ovember 6 7, Timisoara Temesvár (2003.november 6.) Románia 8. Paksi Z., Gajda T., Jancso A. Két új aszimmetrikus ligandum réz(ii)komplexeinek egyensúlyi, oldatszerkezeti és foszfoészteráz aktivitás vizsgálata XXVI. Kémiai Elıadói apok (KE) Szeged (2003. október 27-29) Magyarország 8